JP5405668B2 - イオントラップ質量分析装置および質量分析方法 - Google Patents

Description

本発明はイオントラップ部をもちタンデム質量分析による測定が可能なイオントラップ型質量分析装置、および質量分析方法に関する。

質量分析装置は、試料分子をイオン化し生成したイオンを電場または磁場により質量電荷比に応じて分離し、その量を検出器にて電流値として計測する機器である。試料は、液体クロマトグラフの分離カラムで成分毎に分離され、質量分析装置のイオン化部においてイオン化されて質量分析計に導入される。導入されたイオンは、イオントラップ部において構成された電界中に保持される。イオントラップ部から質量に応じて、もしくはまとめて排出されたイオンは、検出部において検出される。ここで検出されたイオンの質量対電荷比を横軸にとり、イオン強度を縦軸にとったグラフを、ＭＳスペクトル（マススペクトル）と呼ぶ。

ＭＳスペクトルには、試料中に含まれるイオンの質量対電荷比と信号強度の情報が現れており、これから試料成分の構造情報を得ることができる。ペプチド解析を行う場合には、ＭＳスペクトルに表示されているピーク情報から試料中に含まれているペプチド情報を読み取り、専用のデータベース等を用い、コンピュータで解析を行う。解析の精度をあげるためには、ＭＳスペクトルからより多くの構造情報を得ることが必要になる。

しかし、試料中の成分構成が複雑である場合に、異なる構造の成分であっても質量帯電荷比が等しくなった場合には、ＭＳスペクトルから得られる情報からだけではその違いを判別するのに不十分な場合がある。このような場合に、タンデム質量分析（以下、ＭＳ／ＭＳ分析と称する）による測定が行われる（例えば、特許文献１参照）。

ＭＳ／ＭＳ分析では、イオントラップ内にイオンを取り込み、高周波電圧等のエネルギーを印加して目的外のイオンを排除し、選択的に残したイオンを希ガス等の中性分子との衝突乖離などにより乖離させ、分子イオンの結合を壊して分離したイオン（フラグメントイオンと呼ぶ）を測定する手法である。この中性分子との衝突によりイオンを乖離させることを、衝突誘導乖離（ＣＩＤと略す）と呼び、ＭＳ／ＭＳスペクトルを得る。このＭＳ／ＭＳ分析の一連の操作を繰り返し行うことを、その回数に応じてＭＳ２やＭＳ３などと呼ぶ。この操作により生成した特有のフラグメントイオンから、当該試料についてより多くの構造情報を得ることができる。

ＭＳ／ＭＳ分析を実行する上で、乖離を行うイオンが予め明確である場合は、分析者が測定時の条件として設定することが可能である。しかし、タンパク質解析などでは、試料中にどのようなイオンが含まれているのか不明であることが多いので、はじめにＭＳ分析を行い、分析者がそこで取得されたＭＳスペクトルからある条件下で乖離を行うイオンを決定し、決定したイオンに対してＭＳ／ＭＳ分析を行う。これを繰り返すことで測定中の数多くのイオンにおける構造情報を取得することができる。

液体クロマトグラフにおいて、分離カラムにより成分毎に分離された試料は、分離カラムにおける親和性の度合いにより、成分毎に分かれ、順次分離カラムから溶出する。これを質量分析計に導入してＭＳスペクトルを取得するが、特定の質量対電荷比におけるイオン強度を時系列的に並べたグラフをマスクロマトグラムという。

検出された成分が、ある試料中にどれくらい入っているか調べる場合に、この成分の濃度が既知であるサンプルの測定を行い、得られたマスクロマトグラム上の成分のピークの面積や高さに基づいて検量線を作成し、定量計算を行う。近年では、ＭＳ／ＭＳ分析を行ったフラグメントのピークを用いて定量する機能が質量分析計に求められている。

ＭＳスペクトルを取得するためのＭＳ分析を行う上で、イオントラップにおいては、次の操作を行う。質量分析計内に導入されたイオンは、イオントラップ部内に導かれ、イオントラップ部内に形成された電界により捕捉される（アキュムレーション）。この電界を変化させて、イオンをイオントラップ部内から排出（イジェクション）して検出器にて検出する。ＭＳ／ＭＳ分析を実行するためにはイオントラップ部において次の操作を行う。

質量分析計内に導入されたイオンは、イオントラップ部内に導かれ、イオントラップ部内に形成された電界により捕捉される（アキュムレーション）。ここでイオントラップ部内に蓄積されたイオンに対して目的外のイオンを排除し（アイソレーション）、イオントラップ部内に選択的に残ったイオンに対応する高周波電圧等のエネルギーを印加させて衝突誘導乖離を行う（ＣＩＤ）。続いて、イオントラップ部の電界を変化させて、イオンをイオントラップ部内から排出し、検出器にて検出する（イジェクション）。

ＭＳの回数をｎとして、ＭＳｎ分析においては、このアイソレーションとＣＩＤとを、アキュムレーションとイジェクションの間に複数回実行させることにより、目的のイオンを検出することができる。

ＭＳ／ＭＳ分析においては、アイソレーションとＣＩＤに必要な時間があるため、ＭＳ分析に比べてＭＳスペクトルを取得するのに必要な時間が長くなる。一方、クロマトグラムにおけるピークの幅は、分離カラムの性能に依存して一定であり、この時間中に取得できるＭＳスペクトル数は限定されている。

ＭＳ／ＭＳ分析の結果として取得されるＭＳスペクトルのフラグメントイオンは、元の選択したイオン強度に対して小さいイオン強度になる。ＭＳスペクトルから構造情報を取得する際には、ノイズ等の影響をさけるため、信号とノイズとを分ける一定のしきい値を設定し、それ以上のピークから構造情報を取得するようにして、十分な強度のＭＳスペクトルを得ることができる。

また、ＭＳスペクトルからフラグメントパターンを正確に把握するためには、その成分に対して複数回のＭＳ／ＭＳ分析を行い、イオン強度情報を十分なものにすることが望ましく、１成分が溶出している間に複数回のＭＳ／ＭＳ分析を行うことが要求される。またカラムから同じ時間帯に溶出する成分が複数ある場合に、その成分が溶出している間に、複数成分に対してＭＳ／ＭＳ分析を行うことが要求される。

上記のように、ＭＳ／ＭＳ分析を短時間に行うことが要求されているが、ＭＳ／ＭＳ分析においては、アイソレーションおよびＣＩＤの操作が必要になるため、ＭＳ分析と比較して一つのＭＳスペクトルを取得する上でより多くの時間が必要となる。さらに、近年の液体クロマトグラフにおいては、試料を成分毎に分離する分離カラムの性能向上と溶媒消費量の削減を目的として、高速化が図られている。

このような高速な液体クロマトグラフにおいては、１成分が溶出する時間がより短くなっており、１成分が溶出する間に質量分析装置が実行できるＭＳ／ＭＳ分析の回数はより限定されたものになっている。したがって、質量分析装置には、ＭＳ／ＭＳスペクトルを取得するためにかかる時間を短くし、できるだけ多くのＭＳスペクトルを取得することが求められている。

また、ＭＳ／ＭＳ分析を実行する上で、タンパク質解析などで乖離を行う場合、どのようなイオンが試料中に含まれているのか不明である。そのためまずＭＳ分析を行い、そこで取得されたＭＳスペクトルからある条件下で乖離を行うイオンを決定し、決定したイオンに対してＭＳ／ＭＳ分析を行う手法が用いられる。これを繰り返すことで測定中の数多くのイオンにおける構造情報を取得することができる。

この場合にＭＳ分析とＭＳ／ＭＳ分析とでは、分析にかかる時間が異なるため、クロマトグラムのサンプリングピリオドが一定にならず、同じ濃度の成分のピーク面積にばらつきが生じてしまう。同じ成分で同じ濃度のクロマトグラムのピーク面積が異なるのは定量計算を行う上で問題となる。

特開２００８−５８２８１号公報

本発明は、ＭＳ／ＭＳ分析において、フラグメント情報だけのＭＳスペクトルを得るようにして、短時間で分析が可能なイオントラップ質量分析装置を得ることを目的とする。

上記課題を解決するために、本発明の実施態様は、ＭＳ／ＭＳ分析の前後に実行されたＭＳ分析で得られたＭＳスペクトルと、ＭＳ／ＭＳ分析におけるＭＳスペクトルとの差から、目的イオンのフラグメント情報だけのＭＳスペクトルを得るように構成する。

本発明によれば、通常のＭＳ／ＭＳ分析における選択および衝突乖離のステップを含まず、ＭＳ分析と同じ手順でＭＳ／ＭＳスペクトルを得ることができる。これにより、フラグメント情報だけのＭＳスペクトルを得るようにして、短時間で分析が可能なイオントラップ質量分析装置を得ることができる。

イオントラップ質量分析装置の概略構成を示す構成図である。 イオントラップ部における分析制御タイミングを示すタイムチャートである。 フラグメントスペクトルを取得する手順を示すフローチャートである。 フラグメントスペクトルを取得する手順を示すフローチャートである。 処理部のディスプレイに表示される画面の一例を示す画面図である。 処理部に保持されるデータファイルの構成の一部を示す概念図である。 処理部に保持されるデータファイルの構成の一部を示す概念図である。 処理部のディスプレイに表示される画面の一例を示す画面図である。

本発明の実施形態を、図面を参照しながら説明する。

図１は、イオントラップ質量分析装置の概略構成を示す構成図である。分析対象の試料は、液体クロマトグラフの分離カラム等の分離装置１０１で性質の異なる成分毎に分離され、イオン化部１０２においてイオン化され、質量分析計のイオントラップ部１０３に導入される。導入されたイオンは、イオントラップ部１０３において電界中に保持される。制御部１０４は、イオントラップ部１０３にイオンをトラップするためのエネルギーを電圧の形で印加する。このエネルギーの調整により、イオントラップ部１０３からイオンを排出させることができる。排出されたイオンは、検出部１０５において検出される。検出されたイオンのデータは、処理部１０６において所望のデータに加工処理される。
また本構成において、イオントラップ部の前・後に１つまたは複数の、イオンを分離または収束する分析部を設ける構成をとることもできる。

図２は、イオントラップ部１０３における分析制御タイミングを示すタイムチャートであり、横軸は時間ｔ、縦軸は電圧ｖである。また、上から順に、現在の分析の場合の、トラップ部の電極またはＱポールにイオンをトラップするために印加する電圧とイオンを排出するために印加する電圧、本実施例におけるイオンをトラップするために印加する電圧とイオンを排出するために印加する電圧である。通常のＭＳ／ＭＳ分析においては、イオントラップ部１０３内にイオンを導入するアキュムレーション（区間２０１）を実行し、目的イオン以外のイオンを排出するアイソレーション（区間２０２）を実行し、ＣＩＤ（区間２０３）で衝突乖離を行い、イジェクション（区間２０４）においてイオントラップ部１０３から排出される。アイソレーション（区間２０２）とＣＩＤ（区間２０３）のタイミングにおいて、エネルギー（区間２０５）を加え、イオントラップ部１０３からイオンを排出し乖離させる。
イオントラップ部の後段に分析部を設けた構成とする場合は、インジェクション（区間２０４）において、イオンをトラップするために印加する電圧を一定とし、別の電圧をトラップ部に印加することで排出することもできる。

これに対して本発明では、イオントラップ部１０３内にイオンを導入するアキュムレーション（区間２０１）において、エネルギー（区間２０５）を加えて試料からターゲットイオンを乖離させ、イジェクション（区間２０４）を行って、イオントラップからイオンを排出する。乖離させるエネルギー（区間２０５）は、アキュムレーション（区間２０１）と同時に印加されるが、この時間の最初から印加されるようにしてもよい。

図３は、フラグメントスペクトルを取得する手順を示すフローチャートである。最初にＭＳ／ＭＳを行うターゲットイオンを決定するため、ＭＳ分析（ステップ３０１）を行い、ＭＳスペクトル３０２を取得する。ここで得られたＭＳスペクトル３０２から、分析者は、指定された条件下にてターゲットピークイオンを選択し、決定する。次に、決定したターゲットピークイオンに従ってＭＳ／ＭＳ分析（ステップ３０３）を実行する。ここで得られたＭＳスペクトル３０４は、ＭＳにおけるピーク情報とＭＳ／ＭＳ分析におけるピーク情報を含んでいるため、ここからＭＳスペクトル３０２を差し引くことでフラグメント情報のみを含むＭＳスペクトル３０５を得ることができる。以降、この流れを繰り返すことで、連続してＭＳ／ＭＳ分析のＭＳスペクトルを取得することができる。

このように、直前に実行されたＭＳ分析のＭＳスペクトルを差し引いた例を示したが、連続するＭＳスペクトル取得動作に対してイオン量の変化が大きい場合は、直前のＭＳ分析で得たＭＳスペクトルからの変化が大きいため、単純に差し引くだけでは大きな誤差を含むことが考えられる。この様な場合には、フラグメント情報を含むＭＳスペクトルの前後に取得したＭＳ分析のＭＳスペクトルから、フラグメント情報を含むＭＳスペクトルにおけるＭＳ分析のＭＳスペクトルを予測し、フラグメント情報を含むＭＳスペクトルから差し引くことで、フラグメント情報のみのＭＳスペクトルを取得することができる。

図４は、フラグメントスペクトルを取得する手順を示すフローチャートである。はじめに、ＭＳ／ＭＳを行うターゲットイオンを決定するため、ＭＳ分析を行い（ステップ４０１）、ＭＳスペクトル４０２を取得する。ここで得られたＭＳスペクトル４０２から、分析者は指定された条件下にてターゲットピークを決定する。次に、決定されたターゲットに従ってＭＳ／ＭＳ分析を実行する（ステップ４０３）。ここで得られたＭＳスペクトル４０４は、ＭＳにおけるピーク情報と、ＭＳ／ＭＳにおけるピーク情報とを含んでいる。さらに次のターゲットイオンを選択するため、ＭＳ分析を行い（ステップ４０５）、ＭＳスペクトル４０６を取得する。次に、処理部１０６のコンピュータで、ＭＳスペクトル４０２とＭＳスペクトル４０６とからＭＳスペクトル４０７を生成し、ＭＳ／ＭＳスペクトル４０４からＭＳスペクトル４０７を差し引くことで、フラグメント情報のみを含むＭＳスペクトル４０８を得ることができる。以降この手順を繰り返すことで、連続してＭＳ／ＭＳ分析のＭＳスペクトルを取得することができる。

図５は、処理部１０６のディスプレイに表示される画面の一例を示す画面図である。図３，図４において説明したＭＳスペクトル取得において、直前のＭＳ分析のＭＳスペクトルを差し引くか、前後のＭＳ分析から差し引くかは、イオンの変動状態によって決められる。そのため、状況に応じて分析者が切り替えることも想定できる。図５に示す画面で、分析者は、直前のＭＳ分析のＭＳスペクトルを差し引くか、前後のＭＳ分析から差し引くかを選択することができる。

図６，図７は、処理部１０６に保持されるデータファイルの構成の一部を示す概念図である。ＭＳ／ＭＳスペクトル分析は、データ取得と同時に行われる場合と、データ取得後に行われる場合とがある。図６に、データ取得と同時にＭＳ／ＭＳスペクトル分析を行う場合のデータファイルの構成を示す。この場合には、取得したデータファイルには、ＭＳ／ＭＳスペクトルとしてフラグメント情報のみが保存される。図７に、データ取得後にＭＳ／ＭＳスペクトル分析を行う場合のデータファイルの構成を示す。この場合には、取得したデータファイルには、ＭＳスペクトルとフラグメントスペクトルが混在したスペクトルがデータファイルに保存される。このデータと、直前のＭＳスペクトル、もしくは前後のＭＳスペクトルから差し引きを行うことで、図４に示したＭＳスペクトル４０８を得ることができる。

図８は、処理部１０６のディスプレイに表示される画面の一例を示す画面図であり、図６および図７に示したような、ＭＳ／ＭＳスペクトル分析を、データ取得と同時に行うかデータ取得後に行うかを、分析者が選択することができる。

以上述べたように、本発明の実施例によれば、通常のＭＳ／ＭＳ分析における選択および衝突乖離のステップを含まず、ＭＳ分析と同じ手順でＭＳ／ＭＳスペクトルを得ることができる。これにより、フラグメント情報だけのＭＳスペクトルを得るようにして、短時間で分析が可能なイオントラップ質量分析装置を得ることができる。

１０１ 分離装置
１０２ イオン化部
１０３ イオントラップ部
１０４ 制御部
１０５ 検出部
１０６ 処理部

Claims (2)

1. 成分毎に分離された試料をイオン化し、イオントラップ部に導入して電界中に保持し、前記イオンの質量に応じて排出されたイオンを検出してＭＳスペクトル（マススペクトル）を生成する質量分析方法において、
   前記試料の第一のＭＳスペクトルを生成し、
   前記第一のＭＳスペクトル中の選択されたターゲットピークイオンのＭＳ／ＭＳ分析を行って第二のＭＳスペクトルを生成し、
   前記第二のＭＳスペクトル中の選択されたターゲットピークイオンのＭＳ分析を行って第三のＭＳスペクトルを生成し、
   前記第一のＭＳスペクトルと前記第三のＭＳスペクトルとから第四のＭＳスペクトルを生成し、
   前記第四のスペクトルと前記第二のＭＳスペクトルとの差からフラグメント情報のみを含む第五のＭＳスペクトルを生成することを特徴とする質量分析方法。
2. 成分毎に分離された試料をイオン化するイオン化部と、
   前記イオン化部でイオン化された前記イオンを電界中で保持するとともに、該イオンの質量に応じて排出するイオントラップ部と、
   前記イオントラップ部から排出された前記イオンを検出する検出部と、
   前記検出部で検出されたデータに基づいてＭＳスペクトル（マススペクトル）を生成する処理部とを備え、
   前記処理部は、前記試料の第一のＭＳスペクトルを生成し、前記第一のＭＳスペクトル中の選択されたターゲットピークイオンのＭＳ／ＭＳ分析を行って第二のＭＳスペクトルを生成し、前記第二のＭＳスペクトル中の選択されたターゲットピークイオンのＭＳ分析を行って第三のＭＳスペクトルを生成し、前記第一のＭＳスペクトルと前記第三のＭＳスペクトルとから第四のＭＳスペクトルを生成し、前記第四のスペクトルと前記第二のＭＳスペクトルとの差からフラグメント情報のみを含む第五のＭＳスペクトルを生成することを特徴とするイオントラップ質量分析装置。

Images