JP5294194B2

JP5294194B2 - 脳血管性認知症の治療薬

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Publication number: JP5294194B2
Application number: JP2008098675A
Authority: JP
Inventors: 正博川原; 豊定金; 敬子木葉; 哲也永田
Original assignee: JUNSEI EDUCATIONAL INSTITUTION
Current assignee: JUNSEI EDUCATIONAL INSTITUTION
Priority date: 2008-04-04
Filing date: 2008-04-04
Publication date: 2013-09-18
Anticipated expiration: 2028-04-04
Also published as: JP2009249335A

Description

本発明は、亜鉛の神経毒性を低下させることで、脳血管性認知症の予防や改善を可能とする脳血管性認知症治療剤、および該治療剤を含有する飲食物、補助食品に関する。

超高齢化社会の到来に伴い、老人性認知症の患者数の増加が加速的に進んでいる。このような老人性認知症には様々な原因があるとされているが、特に、脳梗塞や脳出血が原因で引き起こされる「脳血管性認知症」は、老人性認知症の重大原因とされている。脳血管性認知症は、脳虚血、脳梗塞などの血管性障害によって脳の血流に異常が生じた結果、周囲の神経細胞に細胞死が生じ、最終的に記憶の脱落、学習障害などの痴呆症状（認知症）が生じる疾患である。

脳血管性認知証の予防や治療には、脳虚血後の神経細胞死を抑制することが有効である。現在、脳虚血発作後にエダラボンなどのフリーラジカル除去剤を脳虚血発作直後に投与することや、発作後の低体温療法が、予防や治療に有効とされている。この神経細胞死の抑制に関して記載された非特許文献１から６について、以下に詳述する。

非特許文献１、２には、脳虚血後の神経細胞死メカニズムにおいて、亜鉛が重要な役割を果たしていることが記載されている。亜鉛は、人体にとって必須元素であり体内のいたるところで検出されるが、特に脳に多く存在する。脳内では、脳虚血により侵されやすい海馬・大脳皮質に高濃度に見られ、シナプス小胞内に亜鉛イオンとして存在している。この非特許文献１、２では、神経細胞の興奮時にグルタミン酸と共にシナプス間隙に亜鉛イオンが放出されることにより、亜鉛イオンが培養神経細胞の神経細胞死を引き起こすことが明らかにされている。更に、脳虚血後の海馬神経細胞内で神経細胞死と並行して亜鉛の異常蓄積が生じていることも示されている。

非特許文献３には、亜鉛の特異的なキレーターであるＣａＥＤＴＡ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−Ｎ,Ｎ,Ｎ,Ｎ−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄ, ｃａｌｃｉｕｍ）を、虚血前の実験動物に前投与することによって、虚血後の神経細胞死が抑制され、脳梗塞の悪化が抑制されることが記載されている。これらの研究結果により、亜鉛が脳虚血後の神経細胞死に関わっていることは一般に認知されてきている。

非特許文献４には、亜鉛による培養神経細胞死をピルビン酸とオキサロ酢酸が抑制することが記載されている。更に、非特許文献５には、ピルビン酸を脳内投与することで、脳虚血後の神経細胞死を抑制できることが記載されている。また、非特許文献６には、低血糖状態による脳神経細胞死を、ピルビン酸とαケトグルタル酸が抑制することが報告されている。これらの研究は、ピルビン酸などの有機酸が脳神経細胞死を抑制する効果があることを示唆している。

また、特許文献１には、本発明者らがヒトの脳内にある生理的な物質であるカルノシンにも、亜鉛による神経細胞死を抑制する効果を見出したことが記載されている。生体内でカルノシンは、筋肉中に大量に存在し、例えば、鶏肉や魚類の赤身に多く含まれているとされている。さらに、これまでに本発明者らは、クエン酸やイソクエン酸が、亜鉛による神経細胞死を抑制する効果を見出している。これらの酸は果物などに大量に存在する有機酸の一種である。

コウジェイワイ（Koh， J.Y.）、他５名、"ザロールオブジンクインセレクティブニューロナルデスアフタートランジェントグローバルセレブラルイスケミア（The role of zinc in selective neuronal death after transient global cerebral ischemia.)"、「サイエンス（Science）」、１９９６年５月、２７２巻、Ｐ１０１３−１０１６リージェイエム（Lee, J.M）、他５名、"ジンクトランスロケーションアクセレイトインフラクションアフターマイルドトランジェントフォカルイスケミア（Zinc translocation accelerates infarction after mild transient focal ischemia.）"、「ニューロサイエンス（Neuroscience）、２００２年１月、１１５巻、Ｐ８７１−８７８カルデロンエー（Calderone, A）、他６名、"レイトカルシウムイーディーティーエーレスキューズヒポキャムパルシーエーワンニューロンズフロムグローバルイスケミアインデュースドデス（Late calcium EDTA rescues hippocampal CA1 neurons from global ischemia-induced death.）"、「ジャーナルオブニューロサイエンス（J. Neurosci.）」、２００４年１１月、２４巻、Ｐ９９０３−９９１３クリスチァンティー（Christian, T）、他３名、"ジンクインディースドコーティカルニューロナルデス：コントリビューションオブエナジーフェイリヤーアトリビュータブルトゥーロスオブエヌエーディープラスアンドインヒビションオブグリコライジズ）"、「ジャーナルオブニューロサイエンス（J. Neurosci.）」、２０００年５月、２０巻、Ｐ３１３９−３１４６リージェイエム（Lee, J.M）、他２名、"プロテクションバイピルベイトアゲインストトランジェントフォレブレインイスケミアインラッツ（Protection by Pyruvate against Transient Forebrain Ischemia in Rats.）"、ジャーナルオブニューロサイエンス（J. Neurosci.）」、２００１年１０月、２１巻、ＲＣ１７１，Ｐ１−６スーエスダブリュー（Suh, S.W.）、他４名、"ピルベイトアドミニスターアフターシビアハイポグリセミアレディースニューロナルデスアンドコーグニティブイムペアメント（Pyruvate Administered After Severe Hypoglycemia Reduces Neuronal Death and Cognitive Impairment）"、「ダイアベティス（Diabetes）」、２００５年５月、５４巻、Ｐ１４５２−１４５８特開２００７−３１４４６７号公報

亜鉛による神経細胞死を抑制する成分または飲食物を探し出すことは、脳血管性認知症の予防または改善に繋がる成分または飲食物を同定することに繋がる。これまでに、亜鉛による神経細胞死を抑制する物質として、上述したようにＣａＥＤＴＡ、ピルビン酸、オキサロ酢酸、クエン酸、イソクエン酸、カルノシンが発見されている。

ＣａＥＤＴＡは、様々な金属をキレートする作用のため生体内で毒性を発揮する。このため、認知症を予防または改善する薬剤としては実用性に乏しい。ピルビン酸、オキサロ酢酸、クエン酸、イソクエン酸は生体内にもある化合物であり、安全性は高いといえるが、それらを主要成分とする脳血管性認知症治療剤および該治療剤を含有する飲食物は現存しない。カルノシンは鶏肉中または魚肉中に大量に存在するために、脳血管性認知症治療剤および該治療剤を含有する飲食物として期待されるが、そのような製品も現存していない。また、虚血時の治療薬として使用されているフリーラジカル除去剤は、虚血発作後直ぐの投与が必要であり、予防する効果はない。従って、認知症の老人数が激増する社会にあっては、予防や治療のために、長期にわたり、虚血後の神経細胞死を予防することができる安全な薬剤、飲食品や、機能食品が必要であるが、これまで開発されておらず、強く望まれている。

そこで本発明は、長期にわたり安全に使用することができる脳血管性認知症の治療剤および該治療剤を含有する飲食物、補助食品を提供することを目的とする。

本発明者らは、マウス視床下部由来のＧＴ１−７細胞を使用し、亜鉛による神経細胞死を抑制する物質をスクリーニングした結果、いくつかの魚介類の水抽出液に神経細胞死抑制活性があることを見出した。そして、その成分を単離、同定し、活性成分がヒスチジンであることを突き止めた。本発明者らは、亜鉛による神経細胞死の抑制には、ヒスチジンおよびヒスチジンをＮ末端にもつ化合物が有効であるという新しい知見に基づき、本発明に至った。

すなわち、本発明の脳血管性認知症の治療薬は、Ｄ−ヒスチジンを有効成分とすることを特徴とする。
ここで、「脳血管性認知症の治療薬」とは服用することで脳血管性認知症に罹るのを予防する効果と、脳血管性認知症の症状を改善する効果のいずれか一方、あるいは両方の効果を持つ物質を意味する。なお、前記ヒスチジンは、Ｄ体である、Ｄ−ヒスチジン（ヒスチジンをＮ末端にもつ化合物におけるヒスチジンを含む）は、Ｌ体である、Ｌ−ヒスチジンに比べて酵素分解を受けにくく、生体内で長い時間、十分な活性を発現するのに必要な濃度を保つことができるため好適である。

また、本発明の脳血管性認知症の治療剤において、ヒスチジンおよびヒスチジンをＮ末端にもつ化合物は魚介類由来であることが望ましい。魚介類はヒスチジンとヒスチジンをＮ末端にもつ化合物を大量に含み、容易に経口摂取しやすく、予防や改善を促進させることができる。

また、脳血管性認知症の治療剤を含有する飲食物、または補助食品は、通常の食事あるいはサプリメントとして摂食できるため、継続的に脳血管性認知症の治療剤の摂取が必要な場合に特に好ましく使用できる。
ここで、補助食品とは、特定の保健の目的が期待できることを表示した食品であって、身体の生理学的機能などに影響を与える保健機能成分を含み、有効性および安全性を個別商品ごとに国によって審査される特定保健用食品、並びに病者用食品等の特別用途食品などを示す。

本発明の脳血管性認知症の治療剤、該治療剤を含有する脳血管性認知症の飲食物、および補助食品は、ヒスチジンおよび／またはヒスチジンをＮ末端にもつ化合物を有効成分とすることで、脳血管性認知症の予防または改善に、日常的に長期にわたり安全に使用することができる。

本発明の実施の形態に係る脳血管性認知症の治療剤（以下、単に「治療剤」ともいう）、この治療剤を含有する飲食物（以下、「治療剤含有飲食物」ともいう）、または補助食品（以下、「治療剤含有補助食品」ともいう）で使用されるヒスチジンおよびヒスチジンをＮ末端にもつ化合物は、天産物を出発物質として精製されたもの、天産物を利用して発酵法で得られたもの、化学的に合成されたもののいずれであってもよい。出発物質や製造プロセス等に制約されるものではない。ヒスチジンおよびヒスチジンをＮ末端にもつ化合物は、塩の形態であってもよい。また、ヒスチジンおよびヒスチジンをＮ末端にもつ化合物は、必ずしも単離される必要はなく、これらが有効量含まれていれば脳血管性認知症に対する予防や改善の効果が発揮され、例えば魚の煮汁液などを使用することができる。ただし、この例に限定されるものではなく、ヒスチジンおよび／またはヒスチジンをＮ末端にもつ化合物が有効量含まれていれば、これら以外の種々の魚介類が利用できるし、さらに魚介類に限定されるものでもない。

上記治療剤は、通常の経口投与または非経口投与に使用されるものならどのような剤形でも良いし、食品の形態をなして経口摂取されるものであってもよい。経口投与または非経口投与に利用される剤形としては、例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、腸溶剤、トローチ、内用液剤、外用液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、注射液、輸液、経管流動食、点鼻剤、点眼剤、点耳剤、座剤、シップ剤、吸入剤または軟膏剤を、使用目的に応じて任意に選択できる。固形製剤に当たっては、目的に応じて主薬に賦形剤、結合材、崩壊剤、潤沢剤、矯味剤、安定化剤などの補助剤を用いたり、防湿・矯味の観点から糖衣やフィルムコーティングしてもよい。もとより、ヒスチジン、ヒスチジンをＮ末端にもつ化合物およびそれらの塩の形態は、上記剤形の処方に適するものが自由に選択される。

脳血管性認知症の治療剤、治療剤含有飲食物または治療剤含有補助食品には、ヒスチジンおよび／またはヒスチジンをＮ末端にもつ化合物、またはそれら塩類が含有され、その他に、タンパク質、糖類、脂肪、微量元素、ビタミン類、乳化剤、香料、あるいは酸味料等が配合されていたりしてもよい。治療剤含有飲食物や治療剤含有補助食品は、自然流動食、経管流動食、半消化栄養食および成分栄養食やドリンク剤等の加工形態とすることもできる。その外にも、固形あるいは液状の食品ないしは嗜好品、例えばパン、麺類、ご飯、菓子類（ビスケット、クッキー、ケーキ、キャンデー、チョコレート、チューインガム、和菓子など）、豆腐およびその加工品などの量産食品、清酒、薬用酒などの発酵食品、みりん、食酢、醤油、味噌、ドレッシング、ヨーグルト、ハム、ベーコン、ソーセージ、マヨネーズ、ジャム、スプレッドなどの畜農食品、かまぼこ、揚げ天、ハンペンなどの水産食品、果汁飲料、清涼飲料、スポーツ飲料、アルコール飲料、果実酒、甘味果実酒、茶などの飲料、として供することもできる。また、脳血管性認知症の治療剤、治療剤含有飲食物、または治療剤含有補助食品を包装する包装体に、この治療剤、治療剤含有飲食物、または治療剤含有補助食品が、認知症を予防・改善する旨の表示を付すことで、利用者に飲食物の機能を広く認知させることができるので、認知症の予防や改善を促進させることができる。包装体は、ビニールや紙などの袋、包み紙や、箱状やキャップの付いたパッケージとすることが可能である。
本実施の形態に係る脳血管性認知症の治療剤、治療剤含有飲食物、または治療剤含有補助食品の製法は、目的、剤形により異なるが、各分野において従来公知に用いられている常法により製造、加工可能である。

脳血管性認知症の予防または改善のために、ヒスチジンおよび／またはヒスチジンをＮ末端にもつ化合物の投与量は、被投与者の年齢、体重、または症状や、投与経路、剤形等により異なる。ヒスチジンについては、必須アミノ酸であり成長期には食品から十分量とることが望まれている。栄養補助食品として、ヒスチジンを含有した製品も販売されており、おおむね一回あたり０．５〜１ｇ程度を、１日に３回程度摂取するように記載されている。このことから、目的とする効果を得るために必要な量でのヒスチジンの使用や、食品中に存在するものからもたらされるヒスチジンの毎日の摂取は、健康に危害をもたらさないことが明らかである。また、既報論文（例えば、Eur. J. Pharm. 2007年2月, 557巻, p236-244）により、動物実験からも、摂取したヒスチジンは血液を介し、脳内に到達することが明らかになっている。ヒスチジンの摂取量あるいは投与量に大きな制限はないが、脳血管性認知症の予防または改善のためには、成人に対して通常、ヒスチジン量として一日当り１００ｍｇ〜１０ｇ、好ましくは一日当り３００ｍｇ〜５ｇとするのがよい。

以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１）
実施例１では、様々な魚介類の水抽出液をメインに、亜鉛の神経細胞死を抑制する活性を検査した。魚介類は宮崎県近郊で取れるものを利用した。魚介類の可食部と非可食部とに分けたのち、エタノールなどの有機溶媒または水を加え、ブレンダー等で破砕したのち、遠心上清部分を集め、凍結乾燥により濃縮・固形化した。また、魚の煮汁は、脱塩後、凍結乾燥により濃縮・固形化した。固形化したそれらの試料を、１００ｍｇに対して１ｍＬの水を加え、よく混和した後、遠心上清を得た。これを０．４５μｍ孔のフィルターで処理したものを試料とした。

不死化視床下部神経細胞（ＧＴ１−７細胞）は常法により培養し、トリプシン酵素により分散させた後、無血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）に加えて５×１０⁵個／ｍＬの濃度にした後、９６穴培養プレート（Ｎｕｎｃ社製）に２００μＬずつ分注したものを炭酸ガスインキュベーター（３７℃、７％ＣＯ₂）にて２４時間培養した。

ＧＴ１−７細胞に、調製した魚介類水抽出液２μＬを投与し、次いで、亜鉛水溶液を３０μＭになるように投与した。亜鉛投与２４時間後に細胞生存率をＷＳＴ−１法により測定した（ｎ＝６）。試薬には、ＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ（同仁化学社製）を用いた。ＷＳＴ−１法は、細胞内のミトコンドリア酵素活性を測定することにより、生存細胞数を測定する簡便かつ正確な測定法である。
各実験では、コントロール（亜鉛および試験試料を加えなかった場合の生存細胞）と、亜鉛のみを添加した場合の生存細胞について、ＷＳＴ−１法による吸光度を測定した。これにより試験試料の抑制活性を示すＷＳＴ−１法の吸光度について、実験日が違っても正確に判断することができる。

亜鉛水溶液（３０μＭ）のみを投与した細胞（図１中のｃｏｎｔ）に比べて、高い吸光度を示すものを神経細胞死抑制活性があると評価した。その結果、図１に示すように様々な魚介類の水抽出液に高い抑制活性があることが見出された。

試験に使用した魚介類、使用部位、目科属、採取年月日、場所、漁業の方法を表１に示す。

（実施例２）
強い抑制活性を示した試料については、顕微鏡により細胞死の様子を確認した。また、試料の調製を再度行い、数回の抑制活性試験を行い、最終的に図１で黒塗りのバーで示した試料（番号：１２Ｗ，１３Ｗ，７９Ｗ，８０Ｗ，８８Ｗ，８９Ｗ，９８Ｗ，１０１Ｗ，ＩＷＡ）について注目することにした。実施例２では、それらサンプル中にあるカルノシンの量を測定した。カルノシンは、特許文献１によれば亜鉛による細胞死を抑制することが明らかになっており、また、カルノシンが魚介類の筋肉中にある程度含まれていることは周知の事実である。まず、実施例１で得た抑制活性が、これら試料に含まれるカルノシンによるものか検証するために、カルノシン量をＨＰＬＣ装置で測定した。

カルノシンを測定するＨＰＬＣ（島津製作所、グラジエントシステム）は、ポーラスグラフィティックカーボンカラム（ＴＨＥＲＭＯＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｃ、φ４．６×１００ｍｍ）を装着した装置を利用し、０．１〜０．５％のトリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル溶液（６〜１０％）を溶離液として使用した。表２に示す１００ｍｇ／ｍＬの試料中に、何ｍＭのカルノシンが含まれるかを測定した。

表２の細胞生存率は、試料と３０μＭの亜鉛を添加したときの生存率を表している。亜鉛のみを添加した場合の細胞生存率は、１０％であった。カルノシン（ｍＭ）の列のＮＤは測定していないことを示している。
カルノシン濃度はコウイカ、スミクイウオ、ウルメイワシで１０ｍＭ以上であったが、細胞培養液に対する投与量は、５％（２００μＬに対して１０μＬ）であるので、これら試料でのカルノシン最終濃度は最大で０．６ｍＭであることが明らかになった。特許文献１によれば、亜鉛による神経細胞死を抑制するには最小でも２ｍＭ以上のカルノシンが必要であるので、これら試料に存在するカルノシン含量は、抑制活性を引き起こすには不十分であることが明らかになった。
この実験から、これら試料がもつ抑制活性はカルノシン以外の成分によるものであると結論した。

（実施例３）
実施例３で、これら試料中の活性成分を単離した。豊富に試料があり、抑制活性も高いウルメイワシの煮汁（ＩＷＡ）を使用して、成分の単離をおこなった。ウルメイワシの煮汁の凍結乾燥品を１００ｍｇ／ｍＬで水に溶解し、その遠心上清を精製出発材料とした。

活性成分の精製はＨＰＬＣ（島津製作所、グラジエントシステム）により行った。検出は２１５ｎｍの紫外吸収を測定し、流速は原則として１ｍＬ／ｍｉｎで行い、ＯＤＳ分取カラムを使用時には５ｍＬ／ｍｉｎとした。カラムは、分取用ＯＤＳカラム（資生堂カプセルパックＵＧ−１２０Ｃ１８、φ２５×２５０ｍｍ）とＴｏｓｏｈＴＳＫ−ＧＥＬＡｍｉｄｏ−８０、φ４．６×２５０ｍｍを使用した。ＯＤＳカラムを使用したＨＰＬＣでは、０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル溶液を０〜３０分でアセトニトリル０％から８０％まで増加するグラジエント条件で溶出した。また、ＴＳＫ−ＧＥＬＡｍｉｄｏ−８０では、０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル溶液を０〜３０分でアセトニトリル１００％から５０％まで減少するグラジエント条件で溶出した。

分離した画分について、次の方法で抑制活性を調べた。不死化視床下部神経細胞（ＧＴ１−７細胞）は常法により培養し、トリプシン酵素により分散させた後、無血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）に加えて５×１０⁵個／ｍＬの濃度にした。９６穴培養プレート（Ｎｕｎｃ社製）に２００μＬずつ分注したものを炭酸ガスインキュベーター（３７℃、７％ＣＯ₂）にて２４時間培養した。ＨＰＬＣで得られた画分を遠心エバポレーターで濃縮後、適当量の水に溶かし、その２μＬをＧＴ１−７細胞に投与し、次いで、亜鉛水溶液を３０μＭになるように投与した。亜鉛投与２４時間後に細胞生存率をＷＳＴ−１法により測定した（ｎ＝６）。試薬には、ＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔを用いた。

ウルメイワシの煮汁（ＩＷＡ）の遠心上清０．３ｍＬを、分取用ＯＤＳカラムで分離し、３０秒ごとに画分を得た。濃縮した各画分について亜鉛の神経細胞死を抑制する活性を調べた結果、図２の点線部分（Ｆｒ１−６）に抑制活性が認められた。これらの画分（ＩＷＡ−Ｃ１８＿１−６）を、数回分取し、凍結乾燥により濃縮した。次にこの画分を、順相系のカラムであるＡｍｉｄｏ−８０で分離した。ピークごとに画分を得て、濃縮した各画分について亜鉛の神経細胞死を抑制する活性を調べた。図３の点線部分（Ｆｒ９）に抑制活性が認められた。この画分（ＩＷＡ−ＡＭ＿９）を数回分取し、凍結乾燥により濃縮した。

（実施例４）
単離した活性成分、ＩＷＡ−ＡＭ＿９について機器分析で成分を同定した。

ＩＷＡ−ＡＭ＿９を少量の３０％アセトニトリル、０．０５％トリフルオロ酢酸溶液に溶解し、質量分析を行った。質量分析計はＥＳＩイオン化装置を取り付けたＬＣＱアドバンス（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用い、ポジティブモードで分析した。
図４に結果を示す。質量電荷比１００〜１０００の間で分析した結果、ｍ／ｚ１５６．１に強度の大きなシグナルを得た。煮汁などに良く含まれる低分子成分の中で、分子量１５５．１を持つ構造として、以下の化学構造を有するヒスチジンが候補となった。

アミノ酸の一つであるヒスチジンが活性成分の候補と考えられたので、次にアミノ酸分析法によりＩＷＡ−ＡＭ＿９に含まれるアミノ酸を分析した。アミノ酸分析は、７−Ｆｌｕｏｒｏ−７−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｆｕｒａｚａｎ（ＮＢＤ−Ｆ）を利用し、蛍光体へ誘導したアミノ酸で行った。ＩＷＡ−ＡＭ＿９を少量の水で溶かし、ＮＢＤ−Ｆと弱アルカリ性下、６０℃、１分間反応させた。反応液のうち２０μＬを、ＯＤＳカラム（資生堂カプセルパックＵＧ−１２０Ｃ１８、φ４．６×１５０ｍｍ）を装着したグラジエントＨＰＬＣで、励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５３０ｎｍで検出した。アセトニトリルと７５ｍＭリン酸を１６と８４の割合で混ぜた溶液を溶離液Ａ、アセトニトリル、メタノール、５０ｍＭリン酸カリウムを２１、３９、４０の割合で混ぜた溶液を溶離液Ｂとして、０−１５分：Ｂ０％、１５−２０分：Ｂ０−８０％、２０−３０分：Ｂ８０−１００％、３０−３５分：Ｂ１００％で分離した。

図５にウルメイワシ煮汁ＩＷＡ−ＡＭ＿９を試料としたアミノ酸分析の結果を示す。なお、図５を含む以下において、アミノ酸類などを以下に示す括弧内の略号で記載することがある。

すなわち、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、ヒスタミン（Ｈｓｔ）、グリシン（Ｇｌｙ）、バリン（Ｖａｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、セリン（Ｓｅｒ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アラニン（Ａｌａ）、プロリン（Ｐｒｏ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、タウリン（Ｔａｕ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、βアラニン（β−Ａｌａ）である。

図５に示すように約２．８分に大きなピークがみられ、標準品との比較によりヒスチジンであることがわかる。約１０．６分にあらわれたピークは、ＮＢＤ−Ｆ試薬に由来するピークであるので、この活性成分にはアミノ酸としてヒスチジンのみが含まれていることが明らかになった。

ところで、生体に含まれるアミノ酸はほとんどがＬ体であるが、ウルメイワシ煮汁は熱をかけて抽出するため、Ｌーヒスチジンだけでなく、その鏡像体であるＤ−ヒスチジンができる可能性がある。アミノ酸のＤ／Ｌ分析を、オルトフタールアルデヒド（ＯＰＡ）とＢＯＣ−Ｌ−システインを利用しておこなった。ＩＷＡ−ＡＭ＿９を少量の水で溶かし、ＯＰＡとＢＯＣ−Ｌ−システインを含んだ溶液中に加え、室温で４分間反応させた。反応溶液のうち２０μＬを、ＯＤＳカラム（ＮｏｖａＰａｋＣ１８、φ３．９×２５０ｍｍ）を装着したＨＰＬＣで、励起波長３４４ｎｍ、蛍光波長４４３ｎｍで検出した。溶離液として、アセトニトリルと０．１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ６．０）を１１対８９で混ぜたものを利用した。

図６（ａ）に示すように、Ｌ−ヒスチジン（Ｌ−Ｈｉｓ）とその鏡像体Ｄ−ヒスチジン（Ｄ−Ｈｉｓ）は、上記のアミノ酸Ｄ／Ｌ分析計で、それぞれ１３．４分と１２．５分に現れた。ＩＷＡ−ＡＭ＿９を試料とした場合、図６（ｂ）に示すように、１３．４分のみにピークが見られ、１２．５分ではピークは見られなかった。この結果は、ＩＷＡ−ＡＭ＿９にはヒスチジンとして、Ｌ体のＬ−ヒスチジンのみが含まれていたことを示している。

（実施例５）
ヒスチジン単品を用い、亜鉛神経細胞死抑制活性の濃度依存性を検査した。Ｌ−ヒスチジン塩酸塩を水で溶解した。不死化視床下部神経細胞（ＧＴ１−７細胞）は常法により培養し、トリプシン酵素により分散させた後、無血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）に加えて５×１０⁵個/ｍＬの濃度にした後、９６穴培養プレート（Ｎｕｎｃ社製）に２００μＬずつ分注したものを炭酸ガスインキュベーター（３７℃、７％ＣＯ₂）にて２４時間培養した。ＧＴ１−７細胞に、調製したヒスチジン溶液を最終濃度で３０μＭ〜５００μＭになるように投与し、次いで、亜鉛水溶液３０μＭを投与した。亜鉛投与２４時間後に細胞生存率をＷＳＴ−１法により測定した（ｎ＝６）。試薬には、ＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔを用いた。図７から明らかなように、ヒスチジン濃度依存的に細胞死は抑制され、３００μＭヒスチジンの添加により、亜鉛による神経細胞死はほぼ完全に抑制された。

実施例６で後述するが、ウルメイワシ煮汁（１００ｍｇ／ｍＬ）には、２５ｍＭのヒスチジンが含まれていることが明らかになっている。ウルメイワシ煮汁を１／５、１／１０と段階希釈し亜鉛の神経細胞死抑制活性を調べた。これら希釈した試料を細胞培養液に加えると、ヒスチジンの最終濃度は、原液で２５０μＭ、１／５希釈液で５０μＭ、１／１０希釈液で２５μＭになる。これを、先のヒスチジン単品の抑制活性のグラフ（図７）に乗せると、黒丸で示す点にプロットされ、ヒスチジン単品の濃度依存性と良く一致する。この結果は、ウルメイワシ煮汁中の抑制活性成分がヒスチジンのみであることを示している。

（実施例６）
図８にウルメイワシ煮汁をアミノ酸分析した結果を示す。図８のアミノ酸分析から、アミノ酸としてヒスチジンのみが大量に含まれていることが明らかになった。１ｍｇ／ｍＬ試料に２５０μＭのヒスチジンが含まれており、ウルメイワシ煮汁乾燥品１ｇあたりに３８ｍｇのヒスチジンが含まれていることが明らかになった。全重量の３．８％がヒスチジンであり、ヒスチジンの単離においてウルメイワシ煮汁乾燥品は有用であると言える。また、標準品との比較により４．５分に現れたピークはタウリンであることが明らかになったが、タウリンは亜鉛による神経細胞死抑制活性を示さない。

（実施例７）
抑制活性を示した他の魚介類抽出液について、アミノ酸分析によりヒスチジン含量を測定した。その結果を表３に示す。

表３の細胞生存率は、試料と３０μＭの亜鉛を添加したときの生存率を表している。亜鉛のみを添加した場合の細胞生存率は、１０％であった。表中のＮＤは測定していないことを示している。
含有ヒスチジン濃度はマアジで一番大きく２８ｍＭ、アオリイカで一番小さく２ｍＭであった。細胞培養液に対する投与量は、５％（２００μＬに対して１０μＬ）である。これら試料を加えたときの最終濃度を示した。マアジで１４００μＭ、アオリイカで１００μＭになった。図７で示したように、ヒスチジンは最終濃度で１００μＭもあれば、亜鉛による神経細胞死を抑制する活性を示すので、測定していないスミクイウオを除いて、活性を示したこれらの試料は含有するヒスチジンによって抑制活性を示したと結論した。

（実施例８）
アミノ酸およびタウリンについて亜鉛の神経細胞死抑制活性を調べた。アミノ酸はグリシン、ヒスチジンを除きすべてＬ体を用いた。各々の単品を水に溶解し、最終濃度が１ｍＭになるように細胞に加えた。不死化視床下部神経細胞（ＧＴ１−７細胞）は常法により培養し、トリプシン酵素により分散させた後、無血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）に加えて５×１０⁵個／ｍＬの濃度にした後、９６穴培養プレート（Ｎｕｎｃ社製）に２００μＬずつ分注したものを炭酸ガスインキュベーター（３７℃、７％ＣＯ₂）にて２４時間培養した。ＧＴ１−７細胞に、調製した各液を最終濃度で１ｍＭになるように投与し、次いで、亜鉛水溶液３０μＭを投与した。亜鉛投与２４時間後に細胞生存率をＷＳＴ−１法により測定した（ｎ＝６）。試薬には、ＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔを用いた。

図９で示すように、Ｌ−ヒスチジンとＤ−ヒスチジンが抑制活性を示した。その他のアミノ酸（システインを除く）には、抑制活性は見られなかった。また、タウリンにも活性は見られなかった。抑制活性はアミノ酸の中でヒスチジンに特異的な現象であることが明らかになった。また、図１０に示すように、Ｌ体とＤ体とでヒスチジンの抑制活性の濃度依存性はほぼ同じであった。

（実施例９）
ヒスチジンによる、亜鉛神経細胞死抑制活性をラット初代培養神経細胞で検査した。
胎齢１８日のラット胎児より大脳皮質を切り出し、パパイン酵素により分散させた後、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭＥＭ（ＤＭＥＭ）培地を加えて、２×１０⁵個／ｍＬの濃度にした。次いで、９６穴培養プレート（Ｎｕｎｃ社製）に２００μＬずつ分注したものを、炭酸ガスインキュベーター（３７℃、７％ＣＯ₂）にて培養した。培養１週間後、培地を無血清培地（ＤＭＥＭ）に置換し、一週間程度培養したものを使用した。用意したラット海馬初代培養神経細胞に、１００ｍＭに調製したＬ−ヒスチジンを１％加え、最終濃度で１ｍＭになるように投与し、次いで、亜鉛水溶液１５０μＭを投与した。亜鉛投与２４時間後に細胞生存率をＷＳＴ−１法により測定した（ｎ＝６）。試薬には、ＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔを用いた。

株化細胞ＧＴ１−７と同様に、図１１に示すように、ラット脳から取り出した初代培養細胞においてもヒスチジンは、亜鉛による神経細胞死を抑制することが確認できた。また、最終濃度１ｍＭのヒスチジンは、ほぼ完全に亜鉛による神経細胞死を抑制した。

（実施例１０）
ヒスチジンの類似体、構成化合物およびヒスチジン含有化合物について、亜鉛の神経細胞死抑制活性が現れる濃度を調べた。
Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジンの他、その類似体としてＬ−ヒスチジンアミド、１−メチル−Ｌ−ヒスチジン、アセチル−Ｌ−ヒスチジンを検査した。また、ヒスチジン側鎖の構造であるイミダゾール、ヒスチジンの分解物としてよく知られるヒスタミンについても検査した。さらに、ヒスチジンを含む化合物として、Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−アラニン、Ｌ−アラニル−Ｌ−ヒスチジン、βアラニル−Ｌ−ヒスチジン（カルノシン）についても検査した。それぞれの単品を水で溶解し、最終濃度が１０ｍＭから０．０５ｍＭになるように培養細胞に加え、抑制活性を調べた。不死化視床下部神経細胞（ＧＴ１−７細胞）は常法により培養し、トリプシン酵素により分散させた後、無血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）に加えて５×１０⁵個/ｍＬの濃度にした後、９６穴培養プレート（Ｎｕｎｃ社製）に２００μＬずつ分注したものを炭酸ガスインキュベーター（３７℃、７％ＣＯ₂）にて２４時間培養した。ＧＴ１−７細胞に、調製した溶液を投与したのち、亜鉛水溶液３０μＭを投与した。亜鉛投与２４時間後に細胞生存率をＷＳＴ−１法により測定した（ｎ＝６）。試薬には、ＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔを用いた。

実施例１０で調べた化合物について、表４に亜鉛の神経細胞死を５０％抑制するのに必要な濃度をまとめた。

結果をまとめると、実施例１０で調べた化合物は、次の３つのグループに分類できる。
第１グループとして、ヒスチジンと同じ抑制活性強度を有する以下の化合物が挙げられる。

Ｌ−ヒスチジン

Ｄ−ヒスチジン

Ｌ−ヒスチジンアミド

Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−アラニン

第２グループとして、カルノシンと同じ抑制活性強度を有する以下の化合物が挙げられる。

１−メチル−Ｌ−ヒスチジン

Ｌ−アラニル−Ｌ−ヒスチジン

βアラニル−Ｌ−ヒスチジン（カルノシン）

第３グループとして、以下の抑制効果のない化合物が挙げられる。

イミダゾール

ヒスタミン

アセチル−Ｌ−ヒスチジン

上記の３つのグループを比較すると、亜鉛による神経細胞死を抑制する活性には、Ｎ末端のアミノ基およびイミダゾール基１位のアミノ基が重要であり、どちらかがメチル化などでふさがれてしまうと、その抑制活性の強度は大きく減少することが明らかになった。これらの結果から、ヒスチジン、その鏡像体、および／またはヒスチジンをＮ末端にもつ化合物が、亜鉛の神経細胞死を強く抑制することが明らかになった。

（実施例１１）
Ｄ−アミノ酸を分解する酵素活性は限定されており、Ｌ−アミノ酸に比べて酵素分解を受けにくいと考えられる。Ｄ−ヒスチジンがＬ−ヒスチジンに比べて、細胞培養液中に長い時間高濃度な状態で存在するかＨＰＬＣで検査した。

Ｌ−ヒスチジンおよびＤ−ヒスチジンを最終濃度１ｍＭになるよう培養細胞に加え、１２時間後のヒスチジンがどれだけ残っているか（残存割合）を評価した結果を表５に示す。

不死化視床下部神経細胞（ＧＴ１−７細胞）は常法により培養し、トリプシン酵素により分散させた後、無血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）に加えて５×１０⁵個/ｍＬの濃度にした後、９６穴培養プレート（Ｎｕｎｃ社製）に２００μＬずつ分注したものを炭酸ガスインキュベーター（３７℃、７％ＣＯ₂）にて２４時間培養したものを用いた。培養液中のヒスチジン量は、アミノ酸分析ＨＰＬＣにより定量した。
Ｄ−ヒスチジンはＬ−ヒスチジンに比べて、培養初期（０−１２時間）での減少量が少ないことが明らかになった。

脳虚血後に脳内で過剰に放出される亜鉛による神経細胞死の抑制に起因する脳血管性認知症の予防または改善に、本発明の脳血管性認知症の治療剤、治療剤含有飲食物、および治療剤含有補助食品は利用可能である。これまで脳血管性認知症に対して抑制活性をもつことが知られているピルビン酸やクエン酸、カルノシンに比べ、本発明でのヒスチジンはより低濃度で抑制活性を発揮する。また、ヒスチジンは生体物質であり安全に広く利用されている。従って、本発明は、長期に及ぶ摂取や投薬が必要とされることの多い脳血管性認知症の予防と改善を、より安全にかつ長期にわたって可能とするのみならず、広く在宅治療の道をも開くものである。

様々な魚介類抽出液による亜鉛の神経細胞死を抑制する活性を示すグラフである。逆相カラムによりウルメイワシ煮汁から活性成分単離の途中経過を示す図である。順相カラムによりウルメイワシ煮汁から活性成分の単離を示す図である。ウルメイワシ煮汁からの活性成分の同定を示す質量分析図である。ウルメイワシ煮汁からの活性成分の同定を示すアミノ酸分析図である。アミノ酸Ｄ／Ｌ分析を示す図であり、（ａ）は標準品、（ｂ）はウルメイワシ煮汁の結果である。ヒスチジン及びウルメイワシ煮汁の亜鉛神経細胞死抑制活性の濃度依存性を示すグラフである。ウルメイワシ煮汁のアミノ酸分析図である。様々なアミノ酸の亜鉛神経細胞死抑制活性を示すグラフである。Ｌ−ヒスチジンとその鏡像体の亜鉛神経細胞死抑制活性の濃度依存性を示すグラフである。ヒスチジンのラット初代培養神経細胞での亜鉛神経細胞死抑制活性を示すグラフである。

Claims

Ｄ体のヒスチジンを有効成分とすることを特徴とする脳血管性認知症治療薬。
前記Ｄ体のヒスチジンが魚介類由来であることを特徴とする請求項１に記載の脳血管性認知症治療薬。