JP5264518B2 - マルチマータンパク質およびマルチマータンパク質を作製および使用する方法 - Google Patents
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Description
本願は、出願番号60/306,746(2001年7月19日出願)および出願番号60/335,425(2001年11月30日出願)に対する優先権を主張する。
本発明は、ポリペプチド配列に結合される分子の間でのオリゴマー(例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ペンタマー、ヘキサマー、およびより高い次元のオリゴマー形態)の形成を媒介する操作されたポリペプチド配列に関連する。
マルチマー組換え抗体を作製するいくつかの方法が、報告されており、それらの方法としては、ミニ抗体(Packら、Biotechnology11:1271(1993);Packら、Biochemistry31:1579(1992);Packら、J.Mol.Biol.246:28(1995);Rheinneckerら、J.Immunol.157:2989(1996);およびPluckthunおよびPack、Immunotechnology3:83(1997))、ダイアボディ(diabody)、−トリアボディ(triabody)、−テトラボディ(tetrabody(Hudson PJ、Curr.Opin.Biotech.9:395(1998);Hiadesら、FEBS Lett.409:437(1997);Korttら、Protein Engineering 10:423(1997);およびGallら、FEBS Lett.453:164(1999))、プロテインA融合タンパク質(ItoおよびKurosawa、J.Biol.Chem.268:20668(1993))、ストレプトアビジン−融合タンパク質(Kipriyanovら、Protein Engineering 9:203(1996))、ジスルフィド結合フラグメント(Carterら、Biotechnology 10:163(1992))、化学的に結合したスペーサーと連結したフラグメント(CookおよびWood、J.Immunol.Methods 171:227(1994))または変性および再生によるscFvマルチマーの精製後アセンブリ(Whitlowら、Protein Engineering 7:1017(1994)および米国特許第5,869,620号)が挙げられる。
本発明は、マルチマー形成をもたらし得るポリペプチド配列を含む。1つの実施形態において、マルチマー化ポリペプチドは、配列番号1〜7;配列番号9〜37;および配列番号154〜163に示されるアミノ酸配列から選択される。マルチマー化ポリペプチドはまた、このポリペプチドがマルチマー化しうる限りで、本明細書中で開示される配列と種々の量の配列同一性を有する配列を含む。種々の実施形態において、ポリペプチドは、例えば、配列番号1〜7;配列番号9〜37;配列番号154〜163に示されるマルチマー化ポリペプチドに対して70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上の同一性を有する。
本発明は、上記に加えて、以下の手段を提供する:
(項目1)
配列番号1〜7;配列番号9〜37;および配列番号154〜163に記載のアミノ酸配列から選択される、マルチマー化ポリペプチド。
(項目2)
項目1に記載のマルチマー化ポリペプチドに対して70%以上の同一性を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドが、マルチマー化可能である、ポリペプチド。
(項目3)
項目1に記載のマルチマー化ポリペプチドに対して75%以上の同一性を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドが、マルチマー化可能である、ポリペプチド。
(項目4)
項目1に記載のマルチマー化ポリペプチドに対して80%以上の同一性を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドが、マルチマー化可能である、ポリペプチド。
(項目5)
項目1に記載のマルチマー化ポリペプチドに対して85%以上の同一性を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドが、マルチマー化可能である、ポリペプチド。
(項目6)
項目1に記載のマルチマー化ポリペプチドに対して90%以上の同一性を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドが、マルチマー化可能である、ポリペプチド。
(項目7)
項目1に記載のマルチマー化ポリペプチドに対して95%以上の同一性を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドが、マルチマー化可能である、ポリペプチド。
(項目8)
項目1に記載のマルチマー化ポリペプチドのポリペプチド部分配列であって、該ポリペプチド部分配列が、マルチマー化可能である、ポリペプチド部分配列。
(項目9)
項目2に記載のマルチマー化ポリペプチドであって、該ポリペプチドが、1つ以上のアミノ酸置換を有し、但し、7残基ジッパー反復配列(a.b.c.d.e.f.g)の位置aまたはdの全てが、ロイシン、イソロイシンまたはバリンのいずれかであり、該置換されたポリペプチドが、マルチマー化を与え得る、マルチマー化ポリペプチド。
(項目10)
項目2に記載のマルチマー化ポリペプチドであって、該ポリペプチドが、1つ以上のアミノ酸置換を有し、但し、7残基ジッパー反復配列(a.b.c.d.e.f.g)の位置aまたはdの1つ以上が、ロイシン、イソロイシンまたはバリンのいずれかであり、該置換されたポリペプチドが、マルチマー化を与え得る、マルチマー化ポリペプチド。
(項目11)
項目10に記載のマルチマー化ポリペプチドであって、7残基ジッパー反復配列(a.b.c.d.e.f.g)の位置aまたはdの少なくとも1つが、ロイシン、イソロイシンまたはバリン以外のアミノ酸である、マルチマー化ポリペプチド。
(項目12)
項目10に記載のマルチマー化ポリペプチドであって、該ポリペプチドが、1〜5個のアミノ酸置換を有する、マルチマー化ポリペプチド。
(項目13)
項目2に記載のマルチマー化ポリペプチドであって、該ポリペプチドが、位置b、c、e、fまたはgの位置に、1つ以上のアミノ酸置換を有し、但し、該置換されたポリペプチドが、マルチマー化を与え得る、マルチマー化ポリペプチド。
(項目14)
項目13に記載のマルチマー化ポリペプチドであって、該ポリペプチドが、1〜5個のアミノ酸置換を有する、マルチマー化ポリペプチド。
(項目15)
項目1に記載のマルチマー化ポリペプチドであって、該ポリペプチドが、少なくとも11アミノ酸長の配列を有する、マルチマー化ポリペプチド。
(項目16)
項目1に記載のマルチマー化ポリペプチドであって、該ポリペプチドが、少なくとも15アミノ酸長の配列を有する、マルチマー化ポリペプチド。
(項目17)
項目1に記載のマルチマー化ポリペプチドであって、該ポリペプチドが、少なくとも18アミノ酸長の配列を有する、マルチマー化ポリペプチド。
(項目18)
項目1に記載のマルチマー化ポリペプチドであって、該ポリペプチドが、少なくとも22アミノ酸長の配列を有する、マルチマー化ポリペプチド。
(項目19)
項目1に記載のマルチマー化ポリペプチドであって、該ポリペプチドが、少なくとも27アミノ酸長の配列を有する、マルチマー化ポリペプチド。
(項目20)
項目1に記載のマルチマー化ポリペプチドであって、該ポリペプチドが、少なくとも31アミノ酸長の配列を有する、マルチマー化ポリペプチド。
(項目21)
項目1に記載のマルチマー化ポリペプチドであって、該ポリペプチドが、約125アミノ酸長未満の配列を有する、マルチマー化ポリペプチド。
(項目22)
項目1に記載のマルチマー化ポリペプチドであって、該ポリペプチドが、約100アミノ酸長未満の配列を有する、マルチマー化ポリペプチド。
(項目23)
項目1に記載のマルチマー化ポリペプチドであって、該ポリペプチドが、約75アミノ酸長未満の配列を有する、マルチマー化ポリペプチド。
(項目24)
項目1に記載のマルチマー化ポリペプチドであって、該ポリペプチドが、約50アミノ酸長未満の配列を有する、マルチマー化ポリペプチド。
(項目25)
異種ポリペプチドに融合された、項目1に記載のマルチマー化ポリペプチドを含む、キメラポリペプチド。
(項目26)
項目25に記載のキメラポリペプチドであって、前記マルチマー化ポリペプチドが、前記異種ポリペプチドのアミノ末端に融合される、キメラポリペプチド。
(項目27)
項目25に記載のキメラポリペプチドであって、前記マルチマー化ポリペプチドが、前記異種ポリペプチドのカルボキシ末端に融合される、キメラポリペプチド。
(項目28)
項目25に記載のキメラポリペプチドであって、前記マルチマー化ポリペプチドが、項目1に記載のマルチマー化ポリペプチドに対して50%以上の同一性を有し、該キメラポリペプチドが、マルチマー化を与え得る、キメラポリペプチド。
(項目29)
項目25に記載のキメラポリペプチドであって、前記マルチマー化ポリペプチドが、項目1に記載のマルチマー化ポリペプチドの部分配列であり、該キメラポリペプチドが、マルチマー化を与え得る、キメラポリペプチド。
(項目30)
項目25に記載のキメラポリペプチドであって、前記マルチマー化ポリペプチドが、1つ以上のアミノ酸置換を有し、但し、7残基ジッパー反復配列(a.b.c.d.e.f.g)の位置aおよびdの1つ以上が、ロイシン、イソロイシンまたはバリンのいずれかであり、該キメラポリペプチドが、マルチマー化を与え得る、キメラポリペプチド。
(項目31)
項目25に記載のキメラポリペプチドであって、前記キメラポリペプチドが、約18〜30、30〜50、50〜75、75〜100、100〜150、150〜200、200〜250、250〜500または500〜1000のアミノ酸の配列長を有する、キメラポリペプチド。
(項目32)
項目25に記載のキメラポリペプチドであって、前記異種ポリペプチドが、結合タンパク質、酵素、レセプター、リガンド、核酸結合タンパク質、成長調節因子、分化因子、および走化性因子から選択される、キメラポリペプチド。
(項目33)
項目32に記載のキメラポリペプチドであって、前記結合タンパク質が、抗原結合ポリペプチドを含む、キメラポリペプチド。
(項目34)
項目33に記載のキメラポリペプチドであって、前記抗原結合ポリペプチドが、少なくとも1つの抗体可変ドメインを含む、キメラポリペプチド。
(項目35)
項目34に記載のキメラポリペプチドであって、前記抗体可変ドメインが、ヒトまたはヒト化されている、キメラポリペプチド。
(項目36)
項目33に記載のキメラポリペプチドであって、前記抗原結合ポリペプチドが、単鎖抗体、Fab、Fab’、(Fab’) 2 、またはFv抗体の部分配列を含む、キメラポリペプチド。
(項目37)
項目33に記載のキメラポリペプチドであって、前記抗原結合ポリペプチドが、多特異的または多機能性の抗体を含む、キメラポリペプチド。
(項目38)
項目33に記載のキメラポリペプチドであって、前記抗原結合ポリペプチドが、ICAM−1またはそのエピトープに結合する、キメラポリペプチド。
(項目39)
項目33に記載のキメラポリペプチドであって、前記抗原結合ポリペプチドが、ICAM−1を発現するヒトライノウイルス感染を阻害する、キメラポリペプチド。
(項目40)
項目33に記載のキメラポリペプチドであって、前記抗原結合ポリペプチドが、ヘテロまたはホモのダイマー、トリマー、テトラマーまたはより高次のオリゴマーを形成する、キメラポリペプチド。
(項目41)
項目40に記載のキメラポリペプチドであって、前記ホモダイマー、ホモトリマー、ホモテトラマー、またはより高次のホモオリゴマーを構成するモノマーのK D が、1×10 −7 以下である、キメラポリペプチド。
(項目42)
項目40に記載のキメラポリペプチドであって、前記ホモダイマー、ホモトリマー、ホモテトラマー、またはより高次のホモオリゴマーを構成するモノマーのK D が、1×10 −8 以下である、キメラポリペプチド。
(項目43)
項目25に記載の少なくとも1つのキメラポリペプチドを含む、ホモまたはヘテロのダイマー、トリマー、テトラマーまたはより高次のポリペプチドのオリゴマー。
(項目44)
項目25に記載のキメラポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、前記マルチマー化ポリペプチドと前記異種ポリペプチドとの間にリンカーを含む、キメラポリペプチド。
(項目45)
項目44に記載のキメラポリペプチドであって、前記リンカーが、ヒトアミノ酸配列またはヒト化アミノ酸配列を含む、キメラポリペプチド。
(項目46)
項目44に記載のキメラポリペプチドであって、前記リンカーが、約5〜20アミノ酸のアミノ酸配列を含む、キメラポリペプチド。
(項目47)
項目44に記載のキメラポリペプチドであって、前記リンカーが、約10〜30アミノ酸のアミノ酸配列を含む、キメラポリペプチド。
(項目48)
項目44に記載のキメラポリペプチドであって、前記リンカーが、約25〜50アミノ酸のアミノ酸配列を含む、キメラポリペプチド。
(項目49)
項目44に記載のキメラポリペプチドであって、前記リンカーが、約30〜60アミノ酸のアミノ酸配列を含む、キメラポリペプチド。
(項目50)
項目44に記載のキメラポリペプチドであって、前記リンカーが、約50〜75アミノ酸のアミノ酸配列を含む、キメラポリペプチド。
(項目51)
項目44に記載のキメラポリペプチドであって、前記リンカーが、配列番号43(D30)、配列番号44(D35)、配列番号45(ED)、配列番号46(EDC)、または配列番号47(D63)のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む、キメラポリペプチド。
(項目52)
異種ポリペプチドに融合された、配列番号43(D30)、配列番号44(D35)、配列番号45(ED)、配列番号46(EDC)、または配列番号47(D63)のいずれかに記載のリンカーポリペプチド配列を含む、キメラポリペプチド。
(項目53)
項目52に記載のキメラポリペプチドであって、前記リンカーポリペプチド配列が、配列番号43(D30)、配列番号44(D35)、配列番号45(ED)、配列番号46(EDC)、または配列番号47(D63)のいずれかに記載の部分配列である、キメラポリペプチド。
(項目54)
項目23に記載のキメラポリペプチドを含む、薬学的処方物。
(項目55)
項目25または52に記載のポリペプチドをコードする、核酸。
(項目56)
発現制御エレメントに作動可能に連結された、項目55に記載の核酸を含む、発現カセット。
(項目57)
項目56に記載の核酸を含む、ベクター。
(項目58)
項目56に記載の核酸を含む、細胞。
(項目59)
項目58に記載の細胞であって、該細胞が、細菌細胞、真菌細胞、動物細胞、植物細胞、および昆虫細胞からなる群より選択される、細胞。
(項目60)
項目57に記載の細胞であって、前記動物細胞が、哺乳類である、細胞。
(項目61)
項目1に記載のマルチマー化ポリペプチドをコードする配列を含む、核酸。
(項目62)
発現制御エレメントに作動可能に連結された、項目61に記載の核酸。
(項目63)
異種ポリペプチドをコードする核酸にインフレームで融合した、項目61に記載の核酸。
(項目64)
項目63に記載の核酸であって、リンカー配列をコードする核酸が、項目61に記載の核酸と異種ポリペプチドをコードする核酸との間に位置する、核酸。
(項目65)
項目61に記載の核酸配列を含む、ベクター。
(項目66)
項目65に記載のベクターであって、前記ベクターが、発現ベクターである、ベクター。
(項目67)
項目61に記載の核酸を含む、細胞。
(項目68)
項目67に記載の細胞であって、前記細胞が、細菌細胞、真菌細胞、動物細胞、植物細胞、および昆虫細胞からなる群より選択される、細胞。
(項目69)
項目68に記載の細胞であって、前記動物細胞が、哺乳類である、細胞。
(項目70)
マルチマーの形成を与える、1つ以上の7残基反復配列(a.b.c.d.e.f.g)を含むマルチマー化ポリペプチドを作製する方法であって、該方法が、7残基反復配列(a.b.c.d.e.f.g)を含むポリペプチドを改変する工程を包含し、ここで、位置aまたはdの1つ以上が、ロイシンまたはイソロイシンで置換され、それによって、マルチマー形成を与えるマルチマー化ポリペプチドを作製する、方法。
(項目71)
項目70に記載の方法であって、前記改変ポリペプチドが、トリマー、テトラマー、またはペンタマーを形成するが、未改変ポリペプチドが、ダイマーを形成する、方法。
(項目72)
項目70に記載の方法であって、前記改変ポリペプチドが、未改変ポリペプチドと比較して、マルチマーにおける増加または減少した安定性を有する、方法。
(項目73)
項目70に記載の方法であって、前記改変ポリペプチドが、テトラマーまたはペンタマーを形成するが、未改変ポリペプチドが、ダイマーまたはトリマーを形成する、方法。
(項目74)
ダイマーの形成を与える、7残基反復配列(a.b.c.d.e.f.g)を含むマルチマー化ポリペプチドを作製する方法であって、該方法が、7残基反復配列(a.b.c.d.e.f.g)を改変する工程を包含し、ここで、位置aまたはdが、バリンとロイシンまたはイソロイシンのいずれかとで置換され、それによって、ダイマー形成を与えるマルチマー化ポリペプチドを作製する、方法。
(項目75)
項目74に記載の方法であって、前記未改変ポリペプチドが、トリマーまたはテトラマーまたはペンタマーを形成する、方法。
(項目76)
項目74に記載の方法であって、前記改変ポリペプチドが、未改変ポリペプチドと比較して、マルチマーにおける増加または減少した安定性を有する、方法。
(項目77)
トリマーを形成するキメラポリペプチドを作製する方法であって、該方法が、7残基反復配列(a.b.c.d.e.f.g)を含むマルチマー化ポリペプチドを含むキメラポリペプチドを作製する工程を包含し、ここで、位置aおよびdの1つ以上が、ロイシンまたはイソロイシンのいずれかであり、異種ポリペプチドに融合され、それによって、トリマーを形成するキメラポリペプチドを作製する、方法。
(項目78)
項目77に記載の方法であって、前記未改変ポリペプチドが、ダイマーまたはテトラマーまたはペンタマーを形成する、方法。
(項目79)
項目77に記載の方法であって、前記改変ポリペプチドが、未改変ポリペプチドと比較して、マルチマーにおける増加または減少した安定性を有する、方法。
(項目80)
テトラマーを形成するキメラポリペプチドを作製する方法であって、該方法が、7残基反復配列(a.b.c.d.e.f.g)を含むマルチマー化ポリペプチドを含むキメラポリペプチドを作製する工程を包含し、ここで、位置aおよびdの1つ以上が、ロイシンまたはイソロイシンのいずれかであり、異種ポリペプチドに融合され、それによって、テトラマーを形成するキメラポリペプチドを作製する、方法。
(項目81)
項目80に記載の方法であって、前記未改変ポリペプチドが、ダイマーまたはトリマーまたはペンタマーを形成する、方法。
(項目82)
項目80に記載の方法であって、前記改変ポリペプチドが、未改変ポリペプチドと比較して、マルチマーにおける増加または減少した安定性を有する、方法。
(項目83)
ペンタマーを形成するキメラポリペプチドを作製する方法であって、該方法が、7残基反復配列(a.b.c.d.e.f.g)を含むマルチマー化ポリペプチドを含むキメラポリペプチドを作製する工程を包含し、ここで、位置aおよびdの1つ以上が、ロイシンまたはイソロイシンのいずれかであり、異種ポリペプチドに融合され、それによって、ペンタマーを形成するキメラポリペプチドを作製する、方法。
(項目84)
項目83に記載の方法であって、前記未改変ポリペプチドが、ダイマーまたはトリマーまたはテトラマーを形成する、方法。
(項目85)
項目83に記載の方法であって、前記改変ポリペプチドが、未改変ポリペプチドと比較して、マルチマーにおける増加または減少した安定性を有する、方法。
(項目86)
マルチマーを形成する分子を作製する方法であって、該方法が、7残基反復配列(a.b.c.d.e.f.g)を含むマルチマー化ポリペプチドを含む分子を作製する工程を包含し、ここで、位置aまたはdが、バリンと、ロイシンまたはイソロイシンのいずれかとであり、該分子に融合され、それによって、マルチマーを形成する分子を作製する、方法。
(項目87)
項目86に記載の方法であって、前記分子が、ポリペプチドである、方法。
(項目88)
トリマーまたはテトラマーまたはペンタマーを形成する分子を作製する方法であって、該方法が、7残基反復配列(a.b.c.d.e.f.g)を含むマルチマー化ポリペプチドを分子に連結し、これによって、トリマーまたはテトラマーまたはペンタマーを形成する分子を作製する工程を包含し、ここで、位置aおよびdの1つ以上が、ロイシンまたはイソロイシンのいずれかである、方法。
(項目89)
項目88に記載の方法であって、前記分子が、ポリペプチドである、方法。
(項目90)
7残基反復配列(a.b.c.d.e.f.g)を含むマルチマー化ポリペプチドを同定する方法であって、該方法が、以下:
a)ホモマルチマーまたはヘテロマルチマーの形成を可能にする条件下で、7残基反復配列(a.b.c.d.e.f.g)を含むポリペプチドをインキュベートする工程であって、ここで、位置aおよびdの1つ以上が、ロイシン、イソロイシン、またはバリンのいずれかである、工程;および
b)該ポリペプチドのホモマルチマーまたはヘテロマルチマーの存在をアッセイする工程であって、ホモマルチマーまたはヘテロマルチマーの形成が、7残基反復配列(a.b.c.d.e.f.g)を含むマルチマー化ポリペプチドを同定する、工程、
を包含する、方法。
(項目91)
項目90に記載の方法であって、工程a)の前記ポリペプチドが、7残基反復配列(a.b.c.d.e.f.g)を含むポリペプチドに融合された異種ポリペプチドを含む、方法。
(項目92)
項目91に記載の方法であって、前記ポリペプチドが、前記異種ポリペプチドと前記7残基反復配列(a.b.c.d.e.f.g)を含むポリペプチドとの間にリンカーを含む、方法。
(項目93)
細胞のRSV感染を阻害する方法であって、該方法が、RSVを含む細胞またはRSV感染に感受性の細胞を、細胞のRSV感染を阻害するのに有効な量の、項目36に記載の抗体のヘテロまたはホモのダイマー、トリマー、テトラマーまたはより高次のオリゴマーと接触させる工程を包含する、方法。
(項目94)
項目87に記載の方法であって、前記細胞が、被験体に存在する、方法。
(項目95)
項目88に記載の方法であって、前記被験体が、喘息を有するかまたは喘息の危険にある、方法。
(項目96)
項目87に記載の方法であって、前記細胞が、上皮細胞である、方法。
(項目97)
項目87に記載の方法であって、前記抗体が、ヒト化されている、方法。
(項目98)
項目87に記載の方法であって、前記抗体が、局所的に投与される、方法。
(項目99)
項目87に記載の方法であって、前記抗体が、吸入または鼻腔内によって投与される、方法。
(項目100)
RSV感染の阻害、RSV進行の阻害、または被験体のRSV感染の処置の方法であって、該方法が、RSV感染を有するかまたはRSV感染を有する危険がある被験体に、被験体のRSV感染の阻害、RSV進行の阻害、または被験体のRSV感染の処置に有効な量の、項目38に記載の抗体、あるいは項目38に記載の抗体のヘテロまたはホモのダイマー、トリマー、テトラマーまたはより高次のオリゴマーを投与する工程を包含する、方法。
(項目101)
項目100に記載の方法であって、前記抗体が、ヒト化されている、方法。
(項目102)
項目100に記載の方法であって、前記抗体が、局所的に投与される、方法。
(項目103)
項目100に記載の方法であって、前記抗体が、吸入または鼻腔内によって投与される、方法。
(項目104)
項目100に記載の方法であって、前記被験体が、喘息を有するかまたは喘息の危険にある、方法。
(項目105)
項目100に記載の方法であって、前記被験体が、新生児あるいは1〜5歳、5〜10歳または10〜18歳の間である、方法。
(項目106)
感冒を処置する方法であって、該方法が、感冒を有するかまたは感冒を有する危険にある被験体に、被験体における感冒を処置するのに有効な量の、項目38に記載の抗体、あるいは項目38に記載の抗体のヘテロまたはホモのダイマー、トリマー、テトラマーまたはより高次のオリゴマーを投与する工程を包含する、方法。
(項目107)
項目106に記載の方法であって、前記処置が、HRVによる感染、HRV感染の進行、またはHRV感染の症状を阻害する工程を包含する、方法。
(項目108)
項目106に記載の方法であって、前記抗体が、ヒト化されている、方法。
(項目109)
項目106に記載の方法であって、前記抗体が、局所的に投与される、方法。
(項目110)
項目106に記載の方法であって、前記抗体が、吸入または鼻腔内によって投与される、方法。
(項目111)
項目106に記載の方法であって、前記被験体が、喘息を有するかまたは喘息の危険にある、方法。
(項目112)
項目106に記載の方法であって、前記被験体が、新生児あるいは1〜5歳、5〜10歳または10〜18歳の間である、方法。
本発明は、少なくとも一部、本明細書中で「マルチマー化ポリペプチド」、「マルチマー化ドメイン」または「マルチマー化デバイス」として参照されるマルチマー化をもたらすペプチド配列の同定に基づく。本発明のマルチマー化ポリペプチドは、オリゴマー形成をもたらす。例えば、第二の分子(例えば、異種ポリペプチド配列)に融合される場合、マルチマー化ポリペプチドは、そのポリペプチドの中でのダイマー、トリマー、テトラマー、ペンタマー、もしくはそれより高次のオリゴマーまたはそれらの混合物の形成を容易にする。そのような本発明のマルチマー化ポリペプチドは、種々の診断用途または治療用途において有用である。例えば、結合タンパク質(例えば、抗体のような抗原結合タンパク質)に、マルチマー化ポリペプチドを融合することは、オリゴマー形成を介する抗原結合部位の数を増加させるために用いられ得る。抗原結合部位の数を増加させることは、次いで、抗原に対する抗体のアビディティを増加させ、このことは、任意の治療的または診断的抗体適用において、特に、抗体アビディティを増加させることが望まれるかまたはそれが有利である適用において有用である。完全なヒトマルチマー化抗体またはヒト化マルチマー化した抗体は、非ヒト化抗体と比較して減少したヒトにおける免疫原性を減少するか、または免疫原性が存在しない。
。従って、本発明は、a位置、b位置、c位置、d位置、e位置、f位置およびg位置がマルチマー化状態を変更するように、そしてマルチマー間の結合強度を増加または低下するように改変され得る、マルチマー化ポリペプチドを含む。
a位置またはd位置に導入され得る。マルチマー化状態は、本明細書中に記載されるアッセイを使用して決定され得る(実施例6)。必要に応じて、このヘプタッド反復配列は、位置b、位置c、位置e、位置fおよび位置gでの1つ以上の点変異、付加または欠失で置換され得、この場合、付加変異は、形成されるマルチマーの状態を調節または安定化するように、すなわち形成されるマルチマーの型(例えば、トリマー 対 テトラマー)を変更するようにか、またはマルチマーを形成するモノマーの間の結合強度を調節するように、選択される。従って、1つ以上の位置b、位置c、位置e、位置fおよび位置gは、単独で改変され得るか、または1つ以上のa位置またはd位置での改変と組み合わせて改変され得る。
Harbor Laboratory、1999;Fitzgeraldら、J.A.C.S.117:11075(1995);Gramら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:3576(1992)を参照のこと)。ポリペプチド配列はまた、化学合成機によって作製され得る(例えば、Applied Biosystems、Foster City、CAを参照のこと)。
本発明はさらに、リンカーポリペプチド配列を提供する。本発明のリンカー配列を、異種性ポリペプチドに融合してキメラポリペプチドを形成し得る。1つの実施形態において、リンカーは、免疫グロブリン由来のヒンジ領域の一部分を含み得る。1つの局面において、リンカーは、ヒト免疫グロブリンまたはヒト化免疫グロブリンに由来するか、またはこれらを基に模られる(model)。特定の局面において、リンカー配列は、以下のいずれかに記載されるアミノ酸配列から選択される、免疫グロブリンのヒンジ領域の一部分を含む:配列番号43(D30)、配列番号44(D35)、配列番号45(ED)、配列番号46(EDC)、または配列番号47(D63)。さらに特定の局面において、リンカー配列は、約2〜20アミノ酸、約5〜10アミノ酸、約10〜30アミノ酸、約25〜50アミノ酸、約30〜60アミノ酸、約50〜75アミノ酸のアミノ酸配列を含む。さらに特定の局面において、リンカー配列は、2〜20アミノ酸、約5〜10アミノ酸、約10〜30アミノ酸、約25〜50アミノ酸、約30〜60アミノ酸、約50〜75アミノ酸、約75〜100アミノ酸のアミノ酸配列を含み、そしてこれらは以下のいずれかに記載されるアミノ酸配列を含む:配列番号43(D30)、配列番号44(D35)、配列番号45(ED)、配列番号46(EDC)、または配列番号47(D63)。
本実施例は、マルチマー化ドメイン、リンカー配列およびキメラポリペプチドの設計を記載する。
本実施例は、Mab 1A6由来の抗原結合部位を有する抗ICAMヒト化Fabフラグメントのクローニングを記載する。
(実施例3)
本実施例は、ヒトATFαロイシンジッパードメイン改変体のクローニングを記載する。本実施例はまた、結合したリンカー(ヒンジ)配列を有するヒトATFαロイシンジッパードメイン改変体のクローニングを記載する。
(実施例4)
本実施例は、位置aおよび位置d以外の位置の残基が、本発明のキメラタンパク質のマルチマーの状態に影響し得ることを示す。本実施例はまた、他の配列が、本発明に従って、どのようにして生成され得るのかを示す。
本実施例は、マルチマーFabタンパク質の発現および精製を記載する。マルチマーFabを作製するために、EDヒンジをコードするSacI/EcoRI DNAフラグメント(表5)は、IgDおよび改変ATFαコイルドコイルドメイン(ATFα(1)−LI+S)由来であり、Fab19のCH1コード配列の31末端で、Fab19/Tetプラスミド(図1)にクローニングされる。このプラスミドを、企CFY196と名付けた。
Hepes(pH8.0)で洗浄した。マルチマーFabタンパク質を、リン酸勾配(500mM KCl/50mM Hepes(pH8.0))で溶出した。陽性分画をプールし、TBSに対して透析した。
本実施例は、Fab−ATFαドメイン融合タンパク質のマルチマー状態の特徴付けを記載する。
沈降データはまた、テトラマー間の区別を可能にする。例えば、CFY 192B、CFY 196およびCFY484は、同じaアミノ酸およびdアミノ酸を有し、そして全てが主にテトラマーを形成する。しかし、これらのタンパク質は、配列の他の場所においてバリエーションを生じる。CFY196およびCFY192Bについてのc(s) 対
Sのプロットの調査は、前者が優勢であることを示す。CFY196について当てはめた沈降係数の分布は、CFY192Bについて当てはめた沈降係数の分布よりも狭く、このことは、CFY196について、より均一なテトラマー集団であることを示す(図5)。
沈降データは、細胞ベースの機能アッセイの結果と十分に相関する(例えば、実施例7を参照のこと)。これらのアッセイは、細胞保護能力において、テトラマー化タンパク質が、トリマーより優れていること、そしてトリマー化タンパク質およびテトラマー化タンパク質が、一価のFabよりも高い保護性を提供することを示す。最も均一なテトラマーは、最高の保護性を提供する(図4)。
本実施例は、一価のFab19抗ヒトICAM−1タンパク質および多価のFab19−EDATFαドメイン融合タンパク質の生物学的活性を示す。本実施例はまた、トリマー化Fab19−EDATFαタンパク質およびテトラマー化Fab19−EDATFαタンパク質が、一価のFab19および二価のモノクローナル抗体よりも、HRV感染からのより高い細胞の保護を提供することを示すデータを記載する。
保護効力は、EC50(50%保護を与える抗体の用量)として定量化される。データに基づいて、Fab19のEC50は、76nMである。テトラマータンパク質CFY192BおよびCFY196は、トリマーCFY192BおよびCFY195よりも有効である。ATFαに基づくこの群のマルチマーにおいて、CFY196(Fab19−EDATFα(1)−LI+S)は、最も高い保護(0.73nMのEC50)を示し、これは、一価Fab19タンパク質よりも104倍高い保護である。
この実施例は、本発明の非Fabキメラポリペプチド(チオレドキシン−ATFαLI融合タンパク質)の構成およびマルチマーの特徴を記載する。
この実施例は、本発明の多価ICAM−1結合タンパク質により、RSウイルス(RSV)感染を阻害または処置することを記載する。
この実施例は、2つの異なる結合特異性を含むポリペプチドの構成および発現を記載する。
この実施例は、本発明のマルチマー化ドメインに隣接するアミノ酸が、形成するマルチマーの安定性または緊密性(tightness)を調整するために、どのように改変され得るかを示す。
疎水性コアを拡大することによって、トリマーをより高次のマルチマーに変更し得ることをさらに実証するために、別のコイルドコイルドメインATF−1の文脈でペンタマーを作製した。表10において、ペンタマーを形成するために、ATF1−IIおよび改変体ATF1−IIaの配列を設計する。2つの配列は、下線を付したアミノ酸によって示される位置で異なる。これらのドメインから調製される2つのキメラタンパク質のHPLCによる比較は、このアミノ酸の変更が、ATF1−IIから調製されたトリマータンパク質をより高次のマルチマーに変更したことを示す。
96ウェルEIAプレート(Corning,Inc.)を、0.1M NaHCO3中で、0.1μg/mlで、100μl/ウェルの可溶性ICAM−1(Bender MedSystems)を用いてコーティングした。TBST(50mM Tris(pH8.0)、150mM NaCl、0.05% Tween−20)を用いて洗浄した後、プレートを、1時間、室温で、TBST中の3%無脂肪乳を用いてブロッキングした。TBSTを用いて洗浄した後に、1%無脂肪乳/TBST溶液中に連続的に希釈した抗ICAM−1 Fabサンプル(モノマーまたはマルチマー)を添加し、そして室温で1時間インキュベートした。TBST用いて洗浄した後に、プレートを、2時間、室温で、1%無脂肪乳/TBST中で、1:50,000に希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ICAM−1テトラマー抗体(196TGC−HRP)とともにインキュベートした。プレートをTBSTを用いて徹底的に洗浄し、そして100μl/ウェルの3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン基質溶液(Kirkegaard and Perry Laboratories)を添加した。15分のインキュベーション後、100ml/ウェルの0.12N HClを添加することによって、色の発色を停止させ、そして450nmでウェルの吸光度を、プレートリーダー(ICN)によって測定した。
阻害%=100×(A0−As)/A0
ここで、A0は、サンプルのない参照ウェル(196TGC−HRPのみ)のOD450であり;Asは、希釈されたサンプルからのOD450の読み取り値である。抗ICAM−1抗体の相対的な結合親和性は、トレーサー抗体(TGC−HRP)を50%でブロックするタンパク質の濃度(IC50)によって表された。
この実施例は、本発明に従ってなされ得るさらなる種類のマルチマーペプチドベースの薬物を記載する。
*βトリプターゼ(アレルギー、炎症)
*LFA−1(移植片拒絶)
*CD105、VEGF(黄斑変性、癌)
*IgE(喘息)
*CD154(狼瘡、移植片拒絶)
*CD14(敗血症)
*葉酸レセプターα(フィロウイルス感染、例えば、EbolaウイルスおよびMarburgウイルス)
*ネクチン−1(CD111としても公知)−(ヒトヘルペスウイルス)
*gp120(HIV−1/AIDS)
*IL−6(関節炎)
*IL−5(喘息)
*IL−8(一般的な炎症)
*または任意の他のインターロイキン(一般的な炎症)
*任意の成長因子レセプター(癌)
さらに、すでに開発された治療抗体は、本発明の適用によって増強され得る。例えば、以下が挙げられる:
*抗von Willebrand因子(冠状動脈血栓症)
*抗TNFα(クローン病)
*抗Her−2(乳癌)
*抗CD−3(移植片拒絶)
*抗CD−20(非ホジキンリンパ腫)。
Claims (22)
- 配列番号154に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、マルチマー化を与え得る、ポリペプチド。
- 配列番号154に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、位置1、4、8、11、15、18、22、25および29の1つ以上のアミノ酸がロイシン、イソロイシンまたはバリンのいずれかで置換されており、マルチマー化を与え得る、ポリペプチド。
- 請求項1記載のポリペプチドであって、配列番号154に記載のアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
- 請求項2記載のポリペプチドであって、配列番号154に記載のアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
- 約50アミノ酸長未満の、約75アミノ酸長未満の、約100アミノ酸長未満の、または約125アミノ酸長未満の配列長を有する、請求項1から4のいずれかに記載のポリペプチド。
- 請求項1から5のいずれかに記載のポリペプチドを含み、結合タンパク質、酵素、レセプター、リガンド、核酸結合タンパク質、成長調節因子、分化因子、および走化性因子から選択される異種ポリペプチドに融合された、キメラポリペプチド。
- マルチマー化を与え得る、請求項6に記載のキメラポリペプチド。
- 約30〜50、50〜75、75〜100、100〜150、150〜200、200〜250、250〜500または500〜1000のアミノ酸の配列長を有する、請求項6又は7に記載のキメラポリペプチド。
- 前記結合タンパク質が、ヘテロもしくはホモのダイマー、ヘテロもしくはホモのトリマー、ヘテロもしくはホモのテトラマー、またはより高次のヘテロもしくはホモのオリゴマーを形成する抗原結合ポリペプチドを含む、請求項6から8のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
- 前記抗原結合ポリペプチドが、
(i)少なくとも1つの抗体可変ドメイン、
(ii)単鎖抗体、Fab、Fab'、(Fab')2、もしくはFv抗体の部分配列、または
(iii)多特異的もしくは多機能性の抗体
を含む、請求項9に記載のキメラポリペプチド。 - 前記抗体可変ドメインが、ヒトまたはヒト化されている、請求項10に記載のキメラポリペプチド。
- 前記抗原結合ポリペプチドが、ICAM−1もしくはそのエピトープに結合する、および/またはICAM−1を発現する細胞のヒトライノウイルス感染を阻害する、請求項9に記載のキメラポリペプチド。
- 前記ホモダイマー、ホモトリマー、ホモテトラマー、またはより高次のホモオリゴマーを構成するモノマーのKDが、1×10-7以下または1×10-8以下である、請求項9から10のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、前記ポリペプチドと前記異種ポリペプチドとの間にリンカーを含み、前記リンカーが、約5〜20アミノ酸長、約10〜30アミノ酸長、約25〜50アミノ酸長、約30〜60アミノ酸長、または約50〜75アミノ酸長である、請求項6から13のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
- 前記リンカーが、配列番号43(D30)、配列番号44(D35)、配列番号45(ED)、配列番号46(EDC)、もしくは配列番号47(D63)のいずれかに記載のアミノ酸配列、またはこれらのいずれかの部分配列を含む、請求項14に記載のキメラポリペプチド。
- 前記リンカーが、ヒトアミノ酸配列またはヒト化アミノ酸配列を含む、請求項14に記載のキメラポリペプチド。
- 請求項6から16のいずれかに記載のキメラポリペプチドを含み、細胞のHRV感染の進行、またはHRV感染の症状を阻害するための、医薬組成物。
- 請求項1から5のいずれかに記載のポリペプチドまたは請求項6から16のいずれかに記載のキメラポリペプチドをコードする、核酸。
- 請求項18に記載の核酸を含み、発現制御エレメントに作動可能に連結された、発現カセット。
- 請求項19に記載の発現カセットを含む、ベクター。
- 請求項19に記載の発現カセットを含み、細菌細胞、真菌細胞、動物細胞、植物細胞、および昆虫細胞からなる群より選択される、細胞。
- 前記動物細胞が、哺乳類の細胞である、請求項21に記載の細胞。
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