JP5234654B2 - 生体分子の大型結晶育成のための方法および装置 - Google Patents
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Description
本発明の一態様において、生体分子を蒸気拡散法によって結晶育成させる方法を提供する。本発明の生体分子を結晶育成させる方法は、(a)結晶化溶液中で生体分子の結晶化を行い;(b)結晶化溶液中の生体分子の結晶の成長が遅くなるかまたは停止した後に、添加溶液を結晶化溶液中に供給して、結晶化溶液中の生体分子濃度を上昇させかつ沈殿剤濃度を低下させ;そして(c)結晶化溶液中での生体分子の結晶化をさらに進行させて、結晶育成を継続させる;ことを特徴とする。
Pは結晶化溶液量に対する添加溶液量の比(添加溶液量/結晶化溶液量比)を示し、任意の割合であり、一定値とする;
VC(N)は添加回数N回目の条件Cにおける結晶化溶液の体積である;そして
VD(N)は添加回数N回目の条件Dにおける結晶化溶液の体積である。
本発明においてはまた、上述した方法に従って生体分子を結晶育成させるため、生体分子を蒸気拡散法によって結晶化部において生体分子を結晶育成させる装置もまた提供する。この装置には、(i)結晶化溶液を含む結晶化部とリザーバ溶液を含むウェル容器とを密閉状態で収容する容器;(ii)前記生体分子を含む添加溶液を前記結晶化部へ補充するための供給機構;が備えられる。
育成させるべき生体分子結晶を含む結晶化溶液を保持するための支持台4上の結晶化部2;
蒸気拡散によって結晶化溶液の濃縮を促すためのリザーバ溶液を収容するウェル容器3;および
ウェル容器3を密閉するカバー5;
をその構成要素として具備する。
図3Aまたは図3Bの装置構成に基づいて結晶を育成する手順を以下に示す:
(1) まず、通常の蒸気拡散法やその他の結晶化法を用いて種結晶を作製し、出来るだけ少数(可能であれば1個)の種結晶が入った結晶化溶液を調製する。結晶化溶液の条件(生体分子濃度および沈殿剤濃度)を急激に変化させると種結晶が多数作製される傾向があることから、結晶析出境界線をゆっくりと通過するように条件をゆっくりと変化させるとよい。結晶化溶液及びリザーバ溶液は、図3Aまたは図3Bの支持台4、ウェル容器3、カバー5の構成により、シッティングドロップ蒸気拡散法(もしくはサンドイッチドロップ蒸気拡散法)の様式で密閉する(工程(a));
(2) 顕微鏡観察をしながら結晶の育成を継続的に行い、顕微鏡観察により結晶体積の時間変化や結晶形状の時間変化が無いことを確認できた場合に、結晶化溶液は図2Aおよび図2Bの結晶化相図における条件Cにおいて平衡に達していると判断し(工程(a)の終了)、以下の(3)、(4)の手順により、工程(b)および工程(c)のセットアップを開始する;
(3) ポンプ14での吸引により、添加溶液を蓄積容器17に取り込む。一旦、蓄積容器17内に添加溶液を取り込めば、バルブ16の切り替えにより蓄積容器17を密閉することが出来るので、添加溶液容器13を取り外すことが可能である(図3B);
(4) バルブ16の切り替えにより、送液を結晶化溶液を容器1内の結晶化部2へ供給する方向へ設定し、添加溶液の供給を開始する。蓄積容器17内の添加溶液を、キャピラリー12を通じて、一定の速度で継続的に、容器1の結晶化部2の結晶化溶液へと供給することができる(図3B)。
以下に図2Bの条件に基づいた結晶化溶液の条件変化・体積および添加溶液の液量の計算例を示す。図2Bでは下記の条件を想定している:
(条件A) 沈殿剤濃度CcA=1.5 wt%、生体分子濃度CpA=40 mg/mL;
(条件C) 沈殿剤濃度CcC=3.0 wt%、生体分子濃度CpC=10 mg/mL。
沈殿剤濃度CcA=1.5 wt%、生体分子濃度CpA=40 mg/mL
として一定の濃度の溶液とした。
沈殿剤濃度CcD=2.5 wt%、生体分子濃度CpD=20 mg/mL
となる。
Vadd(1)=0.50μL、VD(1)=1.50μL
となり、添加回数N=2のときは、上記のVC(1)、Vadd(1)、VD(1)を初期値として、(式1)、(式2)、(式5)により再計算し、
VC(2)=1.25μL、Vadd(2)=0.63μL、VD(2)=1.88μL
となる。N=3以降においても、同様の手順で計算を施すと、1回当たりの添加溶液の液量及び結晶化溶液の体積変化は図4Aのようになる。図4Aに示すように、1回当たりの添加溶液の液量と結晶化溶液の体積は指数関数的に増加する。これらの予備的な計算により、最終的な結晶化溶液の体積や添加回数を見積もることが出来る。
本実施例においては、本発明の方法に基づいてニワトリ卵白リゾチームの結晶を育成させる例を示す。ここでは、沈殿剤として塩化ナトリウムを用いた。
VC(1)=5.0μL、CcA=3.0 wt%、CpA=30 mg/mL、CcC=4.0 wt%、CpC=2.5 mg/mL、P=3。
本実施例においては、本発明の方法に基づいてニワトリ卵白リゾチームの結晶を育成させる別の例を示す。ここでも、沈殿剤として塩化ナトリウムを用いた。
VC(1)=5.0μL、CcA=1.5 wt%、CpA=37.5 mg/mL、CcC=3.0 wt%、CpC=7.5 mg/mL、P=0.7。
2:結晶化部
3:ウェル容器
4:支持台
5:カバー
10:供給機構
11:送出手段
12:キャピラリー
13:添加溶液容器
14:ポンプ
15:コンピュータ
16:バルブ
17:蓄積容器
Claims (6)
- 生体分子を蒸気拡散法によって結晶育成させる方法であって、
(a)結晶化溶液中で生体分子の結晶化を行い;
(b)結晶化溶液中の生体分子の結晶の成長が遅くなるかまたは停止した後に、添加溶液を結晶化溶液中に供給して、結晶化溶液中の生体分子濃度を上昇させかつ沈殿剤濃度を低下させ;そして
(c)結晶化溶液中での生体分子の結晶化をさらに進行させて、結晶育成を継続させる;
ことを(a)〜(c)の順に行うことを特徴とする、結晶育成させる方法。 - 工程(a)の後、工程(b)および工程(c)を複数回繰り返す、請求項1に記載の方法。
- 添加溶液が、工程(a)を開始する際の結晶化溶液と同じかまたはそれ以上の生体分子濃度の生体分子を含有する、請求項1または2に記載の方法。
- 添加溶液が、工程(a)を開始する際の結晶化溶液と同じかまたはそれ以下の沈殿剤濃度の沈殿剤を含有する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 生体分子がタンパク質または核酸である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 結晶化溶液量に対する添加溶液量の比(添加溶液量/結晶化溶液量比)が1以下である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
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