JP5209415B2 - Ｃｏ２インキュベータのオゾン滅菌方法 - Google Patents

Description

本発明は、各種細胞の保存や培養に用いられるＣＯ _２ インキュベータのオゾン滅菌方法に関し、ＣＯ _２ インキュベータの完全な滅菌を可能にするとともに、滅菌に際してのＣＯ _２ インキュベータ内保管物質の安全、および滅菌ガスの漏出による危険を防止することを目的とする。

従来医療分野における手術用医療器具や医薬品容器の滅菌手段として、手術用医療器具や医薬品容器の使用の前後においてアルコールで払拭し、あるいは１４０℃程度の高温滅菌を施し、あるいはＵＶ照射により滅菌することが知られている。また手術用医療器具や医薬品容器を滅菌するための滅菌室内にプロパンガスを混入させた有毒な酸化エチレンガスなどのエチレンオキシド、あるいはホルマリンガスを用いることも知られている。

しかし滅菌室内にプロパンガスを混入させた有毒な酸化エチレンガスやホルマリンガスを用いる場合には、滅菌後に残留ガスを除去するための洗浄装置を別途必要とし、また洗浄装置を用いたとしても有害な残留ガスの完全な除去が困難であるなどの問題があるために、最近では経時的に自動消滅する性質のオゾンガスを用い、滅菌対象物を収納した圧力容器内を減圧し、オゾン発生装置と上記の圧力容器内とを循環するようにしたオゾンガスを上記の圧力容器内に噴出させることにより滅菌対象物を滅菌し、滅菌後に圧力容器外に除去するようにしたもの（特開平９−２７１５１２号公報参照）が開発された。

また医療器具等の滅菌対象物を収容した滅菌装置内にオゾンラインと滅菌フィルターを設けたエアレーションラインとをそれぞれ接続し、エアレーションラインの滅菌フィルター上流側とオゾンライン間にバイパスラインを接続することにより、バイパスラインを介してオゾンガスを直接に滅菌フィルター側に流して滅菌処理するようにしたもの（特開２００１−３４０４３２号公報参照）も知られている。

さらに各種の細胞や菌類等の微生物の培養をするためのインキュベータのチャンバー内を滅菌するために、チャンバーとの間に三方切替弁１１を介してＣＯ_２ボンベを接続するとともに、チャンバーの所要位置に、中間にガス循環用ポンプ、ＣＯ_２センサ、Ｏ_２センサ、オゾンセンサを介在させた循環ラインを接続し、該循環ライン途中の三方切替弁１６にオゾン分解装置を備えた排気ラインを接続することにより、培養終了時に三方切替弁１１をオゾン発生装置がチャンバー内に連通するように切り替えてオゾンガスをチャンバー内に導入・充満させてチャンバー内面および内部雰囲気を滅菌した後につぎの培養を行わせるようにしたもの（特開２００４−２６７０６４号公報参照）も知られている。

さらに部屋単位でクリーンルームを構成し、その室内全体にわたりオゾンガスを充満させて滅菌することも知られている。
特開平９−２７１５１２号公報 特開２００１−３４０４３２号公報 特開２００４−２６７０６４号公報

しかしながら各種の細胞や菌類等の微生物の培養をするためのＣＯ_２インキュベータの場合においては、培養終了時毎にＣＯ_２インキュベータ内の完全な滅菌をおこなう必要がある。とくに細胞の培養をおこなう場合においては培養前にＣＯ_２インキュベータの庫内の無菌状態を確認する必要があり、一般的には例えば庫内に寒天培地を入れて一定時間静置した後に菌の有無を確認する作業を必要とする。

この場合に前記した特許文献３のようなオゾンガス循環による滅菌手段、すなわちＣＯ_２インキュベータの外部に三方切替弁を介してＣＯ_２ボンベを接続するとともに、これとは別に中間にガス循環用ポンプ、ＣＯ_２センサ、Ｏ_２センサ、オゾンセンサを介在させた循環ラインを接続し、しかも該循環ライン途中の三方切替弁１６にオゾン分解装置を備えた排気ラインを接続することにより、培養終了時に三方切替弁１１をオゾン発生装置がチャンバー内に連通するように切り替えてオゾンガスをチャンバー内に導入・充満させてチャンバー内面および内部雰囲気を滅菌した後につぎの培養を行わせるようにした場合においては、つぎのような問題が生じ易い。

つまり現在使用されているＣＯ_２インキュベータは完全な気密構造ではないために、経時的に自動消滅する性質があるとはいえ、培養室内からＣＯ_２インキュベータの外部にオゾンガスが漏れ出して危険であること、またオゾンがＣＯ_２インキュベータ内の隅々まで均等に行きわたらないこともあり、ＣＯ_２インキュベータ内の滅菌の機能が必ずしも十分とはいえない。またＣＯ_２インキュベータを使用する場合に、事前にインキュベータの外面をアルコールやエタノールを浸み込ませた布片や不織布などにより丁寧に払拭する必要があり、ＣＯ_２インキュベータを用いる際においては細心の注意を払って、インキュベータの内外部にわたる完全な滅菌を施す必要がある。

さらに部屋単位でクリーンルームを構成し、その室内全体にわたりオゾンガスを充満させて滅菌するためには多量のオゾンガスを必要とするばかりでなく、作業員におよぼす危険性、とくにクリーンルーム内の作業員の存否確認が難しく、また室外へのガス漏れのおそれもあり、しかもクリーンルーム内に設置された各種の機器類の酸化が危惧されるなど、あまり有効な手段ではない。

そこで本発明においては、ＣＯ_２インキュベータの完全無菌化を可能にし、とくにＣＯ_２インキュベータ内に送り込んだオゾンの外部への漏れがなく、しかも庫内でのオゾンの均等循環を可能とし、またオゾン濃度を常時連続的に管理可能とし、さらにオゾン滅菌作業後のオゾンガスを取り出して中和消失させるだけでなく、滅菌作業後のＣＯ_２インキュベータの残存菌の有無を十分に確認する手段を備えるようにしたものである。

具体的には、ＣＯ_２インキュベータを気密に覆う滅菌テントを介し、外部からＣＯ_２インキュベータ内にオゾンガスを送り込んで内部循環させる第一次滅菌手段と、ＣＯ_２インキュベータ内を循環するオゾンガスを順次排出して滅菌テント内を循環させる第二次滅菌手段と、滅菌テント内の循環オゾンガスを外部に取り出して中和消失させる手段とからなるＣＯ_２インキュベータのオゾン滅菌方法に関し、またオゾン測定器によりオゾンガス残留濃度を測定した後、サンプリングボックス内で残存汚染菌の有無を確認するようにしたＣＯ_２インキュベータのオゾン滅菌方法に関する。

本発明のＣＯ_２インキュベータのオゾン滅菌方法は、ＣＯ_２インキュベータの全体を気密に覆う滅菌テントによりＣＯ_２インキュベータを覆うとともに、滅菌テント内に連通させた一方のチューブ接続部を介してＣＯ_２インキュベータ内にオゾンガスを圧送循環させてＣＯ_２インキュベータ内の第一次滅菌をおこなうとともに、次いでＣＯ_２インキュベータ内のオゾンガスを滅菌テント内に排出循環させてＣＯ_２インキュベータの外周面について第二次滅菌するようにしたために、既設の部屋単位でクリーンルームを構成し、その室内全体にわたりオゾンガスを充満させて滅菌する場合に比して最小限の規模で、しかも比較的少量のオゾンガスによりＣＯ_２インキュベータの全体を完全に滅菌することができる。

しかも第一次滅菌時にＣＯ_２インキュベータ内に送り込んだオゾンガスが漏れても滅菌テント内にとどまるために危険がなく、またＣＯ_２インキュベータの内部のみならず第二次滅菌としてＣＯ_２インキュベータの外面の滅菌をも実施することができるために、ＣＯ_２インキュベータの使用の前後における滅菌を略完全に実施することができる。

またＣＯ_２インキュベータの内外を滅菌した後オゾンガスを滅菌テント外に排出し中和させる手段と、ＣＯ_２インキュベータ内のオゾンガス濃度を測定する手段、および第一次滅菌前、又は第二次滅菌後の循環オゾンガス排出後に、外部からＣＯ_２インキュベータ内に無菌エアを送り込んでＣＯ_２インキュベータの内外部の残存汚染菌を検出する手段を有するために、排出オゾンを速やかに中和して消失させることができるばかりでなく、ＣＯ_２インキュベータの内外における完全無菌化を実現することができる。

またＣＯ_２インキュベータ内に圧送したオゾンガスの濃度を常時監視することができ、これによってＣＯ_２インキュベータ内のオゾンガス濃度を常にチェックして必要に応じてオゾンガスを追送し、あるいは濃度を下げるなどのオゾンガス濃度の微細な調整、およびＣＯ_２インキュベータの使用前、あるいは滅菌作業完了後の残存菌の確認が容易となる。

以下において本発明の内容を図１以下にあらわした実施例をもとに説明をする。図において、１はＣＯ_２インキュベータの全体を気密に覆う滅菌テント、１４および９はチューブ接続部、１８はオゾン供給源、２０は濾過フィルターであってエアーポンプ２１とともに無菌エア供給源を構成している。さらに２３はオゾンガス濃度を測定するためのオゾン測定器、２６はオゾン中和手段である活性炭フィルター、２８はオゾンガス濃度を測定するためのオゾン濃度測定器、３０はサンプリングボックスをそれぞれあらわしている。

滅菌テント１は、厚手のポリエチレン、塩化ビニールその他の樹脂をはじめとし、オゾンガスを透過させない機能を有したシートをもって、ＣＯ_２インキュベータの全体を、正面部２、左右の両側面部３（図では反対側の側面部の表示を省略している）、天井部４、背面部（図示省略）等により余裕をもって気密に覆うことができる形態および大きさの小部屋状に構成される。

滅菌テント１の大きさについては、上記したようにＣＯ_２インキュベータの全体をいくぶん余裕をもって気密に覆うことができる小部屋状の大きさでよいが、ＣＯ_２インキュベータの全体積に対し、あまり余裕がない容積であると、ＣＯ_２インキュベータの外面との間の隙間が少なくなりオゾンガスの循環性が十分に得られないのでＣＯ_２インキュベータの全体積に対し、少なくとも１．３倍以上の容積を備えるのが好ましい。

また滅菌テント１の容積がＣＯ_２インキュベータの全体積に比してあまり大き過ぎてもオゾンガスの使用量が増大してコスト高となるばかりでなく滅菌作業の効率が低下し、また設置面積が増大するところから、本発明者らの種々の実験結果によればせいぜいＣＯ_２インキュベータの全体積の４倍以下であるのが好ましく、さらに３倍以下であればより一層好ましいことが明らかとなった。なお滅菌テント１の正面部２、左右の側面部３、および背面部の各裾部分はＣＯ_２インキュベータ１１の設置されている床面に気密に接するように構成される必要がある。

なおこの場合に、必要であれば図示しない気密ファスナー〔例えば「アクアシール」（ＹＫＫ(株)）（以下同じ）〕により上記した正面部２、左右の側面部３、および背面部の各裾部分に接続される底面シートを用いることができ、この場合にはあらかじめ底面シートを床面上に敷設した状態で、その上にＣＯ_２インキュベータ１１を設置する必要がある。

さらに滅菌テント１の正面部２は床面近くの部分を残して左右両側端近くの切り込みにより開口部５を形成し、上端近くの部分を残し、左右両側端近くの切り込み縁７からこれにつづく下部水平切り込み縁に沿って取り付けた気密ファスナー７ａにより正面部２の開口部５を開放し、もしくは閉塞可能にする正面部開閉シート６が設けられている。また図１において１０は紐や細いロープ状のものを引き通して滅菌テント１の全体をＣＯ_２インキュベータ１１の天面より浮上させるべく吊るためのブラケットをあらわしている。

さらに該正面部開閉シート６の下方部には、該正面部開閉シート６を気密ファスナー７ａにより閉じた際に、ＣＯ_２インキュベータ１１の正面側の開閉扉１２および操作盤１３の下方部に正面側に突出させて取り付けられたところの、ＣＯ_２インキュベータ１１の内部に連通するチューブ接続部１４ａ・１４ｂに合致してチューブ接続部１４ａ・１４ｂの突出先端部を気密に滅菌テント１の外方に突出させることができる気密穴８ａ・８ｂが形成されている。なおこの気密穴８ａ・８ｂには、好ましくはチューブ接続部１４ａ・１４ｂの外周面に圧接可能なパッキン部材を嵌装させてもよい。

なおＣＯ_２インキュベータ１１の下部に、一端を内部に連通させて取り付けたチューブ接続部１４ａ・１４ｂについては、チューブ接続部１４ａ又は１４ｂのいずれか一方だけでよいが、チューブ接続部の接続部分に破損等の不具合を生じた場合に備えて本実施例においては予備のチューブ接続部が備えられ、通常使用されているチューブ接続部９ａ以外の予備の接続部９ｂについてはその開口部において密栓してある。

また滅菌テント１の正面部２の上端部近くには一端を滅菌テント１の内部に連通させたチューブ接続部９ａ・９ｂが外方に向けて突出されている。この場合に通常使用されるチューブ接続部は９ａ又は９ｂのいずれか一方だけでよいが、チューブ接続部の接続部分に破損等の不具合を生じた場合に備えて予備のチューブ接続部が備えられ、通常使用されているチューブ接続部９ａ以外の予備の接続部９ｂについてはその開口部において密栓してある。なお１２ａはＣＯ_２インキュベータ１１の正面側開閉扉１２の上方に形成したところのＣＯ_２インキュベータ１１内に通じる排気孔をあらわしている。

一方チューブ接続部１４ａにはチューブ１５が接続され、このチューブ１５の途中には三方弁１６および１７を介してオゾン供給源１８が取り付けられている。なお本実施例ではオゾン供給源として汎用のオゾン発生器（例えばエコデザイン(株)「ＥＤ−ＯＧ−ＡＰ１」）が用いられている。また途中の三方弁１６にはチューブ１９を介して濾過フィルター２０およびエアポンプ２１が取り付けられ、この濾過フィルター２０およびエアーポンプ２１により無菌エア供給源を構成している。

なお上記した濾過フィルター２０については、本実施例においてはMillipore製のMillex-FG（ポアサイズ：０．２２μｍ）のものが使用される。また三方弁１７にはチューブ２２を介してオゾン濃度を測定するためのオゾン測定器２３が取り付けられている。なおこの場合のオゾン測定器２３としては例えばＮＫサイエンティフックの「ＵＶー１００」が用いられる。

さらにチューブ接続部９ａにはチューブ２４を介してオゾン中和手段である活性炭フィルター２６が設けられている。またチューブ２４の途中には三方弁２５および３１が介在され、一方の三方弁２５にはチューブ２７を介してオゾン濃度を測定するためのオゾン測定器（ポンプ内蔵）２８が取り付けられ、また他方の三方弁３１にはチューブ２９を介してサンプリングボックス３０が取り付けられている。

サンプリングボックス３０は、ＣＯ_２インキュベータ１１の内外部を循環したガス内に残存菌が混入しているか否かをテストすることによりＣＯ_２インキュベータ１１の開閉扉１２を開閉したり、あるいは別途滅菌確認手段を設置するなどの手法を必要とせずにＣＯ_２インキュベータ１１の内部および外部の無菌化を安全かつ確実に確認するための装置である。

ここで用いられるサンプリングボックス３０については、具体例を挙げればチューブ２９と接続した小さな有蓋の箱内を、あらかじめアルコールを含ませた脱脂綿により拭くなどの方法により滅菌して無菌空間とした箱内に、寒天等の培地、あるいは液体培地、フィルム状の培地等、無菌の培地を備えておき、チューブ２９よりサンプリングボックス３０内に設置されている無菌の培地に排気ガスを吹き付けることにより、排出循環ガス中に残存菌が残留していた場合には菌が培地に付着する。この培地を一定時間観察することにより菌が付着している場合には菌の繁殖が確認され、また菌の繁殖がみられない場合には残存菌が存在しないことが確認できる。

ＣＯ_２インキュベータ１１の使用に際し、あるいは使用後においてＣＯ_２インキュベータ１１内の滅菌を実施する場合においては、滅菌テント１をもってＣＯ_２インキュベータを気密に覆い、ＣＯ_２インキュベータ１１内にオゾンガスを入れて一定時間滅菌をおこなうとともに、その後ＣＯ_２インキュベータ内のオゾンガスをＣＯ_２滅菌テント１内に排出してインキュベータの外周部に循環させてＣＯ_２インキュベータの内外部を共に十分に滅菌するとともに、その後無菌エアを送り込んでオゾンガスを強制排出・消滅させた後に無菌テストを実施することを可能にしたものである。

上記した実施例の構成において、以下に滅菌作業の具体的な手順をあらわす。なおこの場合に予めＣＯ_２インキュベータ１１の全体を滅菌テント１をもって気密に覆う必要がある。

〔無菌テスト〕
ＣＯ_２インキュベータ１１の使用に際し、図２に示したように、三方弁１６を操作し、三方弁１７側を閉止するとともに、チューブ１９をチューブ１５に連通させた状態にて、エアポンプ２１を起動させて大気を吸気し、これを濾過フィルター２０を通して無菌化したエアをチューブ接続部１４ａからＣＯ_２インキュベータ１１内に送り込んでＣＯ_２インキュベータ１１内に無菌エアを十分に循環させる。

さらに無菌化したエアを送り続けると、ＣＯ_２インキュベータ１１内に循環していたエアが上方の排気孔１２ａから順次排出されて滅菌テント１の内部（ＣＯ_２インキュベータ１１の外面）を循環する。その後三方弁２５を操作してチューブ２７側を遮断するとともに、三方弁３１を操作して活性炭フィルター２６側のチューブ２４を閉鎖し、チューブ２９をチューブ２４に連通させた状態において、ＣＯ_２インキュベータ１１の上方のチューブ接続部９ａから排出されたエアをチューブ２４およびチューブ２９を介し、サンプリングボックス３０内に排気して排気ガス中の菌の存在の有無を確認する。なおこの無菌テストはＣＯ_２インキュベータ１１の使用後において実施する場合も同様である。

〔滅菌操作〕
滅菌操作については、図３において三方弁１６および１７を操作してチューブ１９との連絡を遮断するとともに、オゾン発生器１８をチューブ１５を介してＣＯ_２インキュベータ１１のチューブ接続部１４ａに連通させた後、オゾン発生器１８を作動させて発生したオゾンをＣＯ_２インキュベータ１１の下部よりＣＯ_２インキュベータ１１内に送り込み、内部を十分に循環させる（第一次滅菌）。

オゾンをさらに送り続けることにより、ＣＯ_２インキュベータ１１内のオゾンガス圧が次第に高まり、図４にあらわしたように自動的に上方の排気孔１２ａから順次排出されて滅菌テント１の内部（ＣＯ_２インキュベータ１１の外面）を循環する（第二次滅菌）。この第一次滅菌と第二次滅菌とによりＣＯ_２インキュベータ１１の内部と外周面の両方の滅菌作業がおこなわれる。

上記の滅菌過程において必要に応じてオゾンの濃度を測定することもできる。この場合には三方弁１７を介してチューブ１５をチューブ２２とも連絡させてチューブ１５を通過するオゾンガスをチューブ２２を介してオゾン測定器２３に導き、チューブ１５を流れるオゾンの濃度を測定し、濃度が不足または過剰であればオゾン発生器１８の稼動を加減して調整することができる。

オゾン滅菌操作には主にＣＴ値が用いられ、オゾン濃度はＰＰＭ×ｍｉｎであらわすことができる。滅菌作業の完了に至る想定オゾン濃度については、例えばＣＴ：１０，０００以上に設定し、ＣＴ値：１０，０００を超えたら滅菌完了とみる。なおこの場合に使用される滅菌測定手段としては、例えばケミカルインジケータ（例えばオゾンインジケータ）が用いられ、これをＣＯ_２インキュベータ１１の内部複数個所に設置して逐次確認することができる。

なお滅菌測定手段としては、このほかにもバイオロジカルインジケータを用いることができるが、この場合においては使用に際して湿度を上げる必要があり、またＣＴ値を確認する際にいちいちＣＯ_２インキュベータ１１の内部から外部に取り出す必要があるために、その際の菌の付着が疑われる場合もあるのであまり好ましくはない。

〔オゾン排出〕
オゾンの排出は図５にあらわしたように、三方弁１６を操作して三方弁１７側を遮断するとともに、チューブ１９をチューブ１５に連通させ、エアポンプ２１を起動させて吸気エアを濾過フィルター２０を通過させることにより無菌化したエアを下部のチューブ接続部１４ａからＣＯ_２インキュベータ１１内に圧送する。

さらに無菌化エアを注入し続けると無菌化エアはＣＯ_２インキュベータ１１内に残存するオゾンガスを伴って順次自動的に上方の排気孔１２ａから滅菌テント１内に排出され、滅菌テント１内を循環して滅菌テント１内の残存オゾンガスをも伴って順次上方のチューブ接続部９ａより外部に排出され、これを継続することにより次第にＣＯ_２インキュベータ１１内および滅菌テント１内の残存オゾンガスが排出されていく。

なおこの過程において、随時三方弁２５を介して連通されてるチューブ２７により排出ガスをオゾン測定器２８内に導くことによりオゾン濃度を測定してオゾンガスの残存量を測定することができ、これによってオゾンガスの濃度が外気と同等になったときにオゾンガスの排出を確認することができる。

無菌エアの注入により順次排出されるＣＯ_２インキュベータ１１内および滅菌テント１内の残存オゾンガスは、三方弁２５および３１を通過してチューブ２４により活性炭フィルター２６内に送り込まれ、ここで中和された後排出される。

〔滅菌確認検査〕
ＣＯ_２インキュベータ１１の使用後においては使用前の無菌テストと同様の手法により滅菌の確認作業をおこなう。すなわち、上記した図２のように、三方弁１６を操作して三方弁１７方向のチューブ１５を遮断し、さらに三方弁２５を操作してオゾン測定器２８方向のチューブ２７を遮断するとともに、三方弁３１を操作して活性炭フィルター２６方向のチューブ２４を遮断した状態とし、この状態においてエアポンプ２１により吸気したエアを濾過フィルター２０を介して無菌化したエアを継続的にチューブ１９および１５を介して下部のチューブ接続部１４ａよりＣＯ_２インキュベータ１１の内部および外部（滅菌テント１内）に循環させ、さらに滅菌テント１の上方のチューブ接続部９ａより外部に排出させ、チューブ２４および２９を介してサンプリングボックス３０内に送り込み、排気ガス中の菌の存在の有無を確認する（図５参照）。

なお、上記した〔無菌テスト〕〔滅菌操作〕〔オゾン排出〕〔滅菌確認検査〕の各作業時における三方弁１６・１７・２５・３１の操作についてはその都度手作業により実行し、あるいは特に図示はしないが、予め決められたパターンによる電子的記憶回路に従って電気的に作動させることも可能である。

本発明の一実施例であるＣＯ_２インキュベータのオゾン滅菌手段として用いられる滅菌テントの概略をあらわした全体斜視図。 図１の滅菌テントを中心とした本発明のＣＯ_２インキュベータのオゾン滅菌システム全体の概略をあらわした説明図（無菌テストおよび滅菌確認検査時）。 図１の滅菌テントを中心とした本発明のＣＯ_２インキュベータのオゾン滅菌システム全体の概略をあらわした説明図（ＣＯ_２インキュベータ内の第一次滅菌）。 図１の滅菌テントを中心とした本発明のＣＯ_２インキュベータ内オゾン滅菌システム全体の概略をあらわした説明図〔ＣＯ_２インキュベータ内部（第一次）および外部（第二次）滅菌〕。 図１の滅菌テントを中心とした本発明のＣＯ_２インキュベータのオゾン滅菌システム全体の概略をあらわした説明図（オゾン排出）。

符号の説明

１ 滅菌テント
２ 正面部
３ 左右の両側面部
４ 天井部
５ 開口部
６ 正面部開閉シート
７ 切り込み縁
７ａ 気密ファスナー
８ａ 気密穴
８ｂ 気密穴
９ａ チューブ接続部
９ｂ チューブ接続部
１０ ブラケット
１１ ＣＯ_２インキュベータ
１２ 開閉扉
１２ａ 排気孔
１３ 操作盤
１４ａ チューブ接続部
１４ｂ チューブ接続部
１５ チューブ
１６ 三方弁
１７ 三方弁
１８ オゾン発生器
１９ チューブ
２０ 濾過フィルター
２１ エアポンプ
２２ チューブ
２３ オゾン測定器
２４ チューブ
２５ 三方弁
２６ 活性炭フィルター
２７ チューブ
２８ オゾン測定器
２９ チューブ
３０ サンプリングボックス
３１ 三方弁

Claims (4)

1. ＣＯ_２インキュベータを気密に覆った滅菌テントを介し、外部からＣＯ_２インキュベータ内にオゾンガスを送り込んで内部循環させる第一次滅菌手段と、ＣＯ_２インキュベータ内を循環するオゾンガスを順次排出して滅菌テント内を循環させる第二次滅菌手段と、滅菌テント内の循環オゾンガスを外部に取り出して中和消失させる手段とからなるＣＯ_２インキュベータのオゾン滅菌方法。
2. 外部からＣＯ_２インキュベータ内に無菌エアを送り込んでＣＯ_２インキュベータ内および滅菌テント内の残存ガスを排出し、オゾン測定器によりオゾンガス残留濃度を測定してオゾン排出確認後、サンプリングボックス内で残存汚染菌の有無を確認するようにした請求項１に記載のＣＯ_２インキュベータのオゾン滅菌方法。
3. サンプリングボックス内での残存汚染菌の有無確認がＣＯ_２インキュベータ内からの排出ガスを無菌空間内に設置された培地に吹き付けて菌の増殖の有無を確認するものであるところの請求項２に記載のオゾン滅菌方法。
4. ＣＯ_２インキュベータを覆う滅菌テントの大きさが、ＣＯ_２インキュベータの全体積の４倍以下の容量であるところの請求項１〜３の何れか１に記載のオゾン滅菌方法。

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