JP5190886B2

JP5190886B2 - 蛍光顕微鏡

Info

Publication number: JP5190886B2
Application number: JP2008315265A
Authority: JP
Inventors: 康一梶山; 通伸水村; 和重橋本
Original assignee: V Technology Co Ltd
Current assignee: V Technology Co Ltd
Priority date: 2008-12-11
Filing date: 2008-12-11
Publication date: 2013-04-24
Anticipated expiration: 2028-12-11
Also published as: JP2010139675A

Description

本発明は、観察物内部の蛍光物質に励起光を照射して励起させ、蛍光物質で発生する蛍光を観察する蛍光顕微鏡に関し、詳しくは、構造が簡単であると共に、観察物表面近傍で発生する蛍光や励起光の表面反射の影響を軽減して観察物の深部の観察を容易にしようとする蛍光顕微鏡に係るものである。

従来の蛍光顕微鏡は、光源からの光を対物レンズを介して観察物上に導き、観察物内部の蛍光物質が励起されて発生する蛍光を上記対物レンズを介してＣＣＤカメラに導いて観察可能にし、ＣＣＤカメラでの測光及び撮像のタイミングに合わせて制御手段により光源の点灯及び消灯を制御するものとなっていた（例えば、特許文献１参照）。

また、他の蛍光顕微鏡は、多光子励起走査型レーザ顕微鏡であり、パルスレーザ光を出射する光源装置と、光源装置から発せられたパルスレーザ光を標本に照射し、標本において発せられた蛍光を観察する観察装置本体と、標本における観察面の深さに応じて、標本に照射するパルスレーザ光の光量を調節する制御装置とを具備するものとなっている（例えば、特許文献２参照）。
特開２００５−１９５９４０号公報特開２００７−２６３７３０号公報

しかし、このような従来の蛍光顕微鏡において、上記特許文献１に記載の蛍光顕微鏡は、同一の対物レンズを介して光源からの光を観察物上に導くと共に、観察物内部で発生する蛍光をＣＣＤカメラに導くようにしているため、観察物表面近傍で発生する蛍光や光源光の観察物表面における反射の影響を排除することができなかった。したがって、これら観察物表面近傍で発生する蛍光や光源光の表面反射光がノイズとなってＳ／Ｎを劣化させ、観察対象物の深部で発生する微弱な蛍光を容易に検出することができない場合があった。

また、上記特許文献２に記載の多光子励起走査型レーザ顕微鏡は、焦点でのみ蛍光物質を励起することができるため観察物の深部の観察が可能であるが、装置の構造が複雑で大型化することから高価になること、顕微鏡の光軸調整に多大な時間を必要とすること等の問題がある。

そこで、本発明は、このような問題点に対処し、構造が簡単であると共に、観察物表面近傍で発生する蛍光や励起光の表面反射の影響を軽減して観察物の深部の観察を容易にしようとする蛍光顕微鏡を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明による蛍光顕微鏡は、観察物内部の蛍光物質に励起光を照射して励起させ、蛍光物質で発生する蛍光を観察する蛍光顕微鏡であって、前記励起光を発生すると共に、該励起光を凸状シリンドリカルレンズと凹状シリンドリカルレンズとを組み合わせて構成したビーム整形手段によりシート状に整形して前記観察物に照射する励起照明装置と、前記励起光によって励起されて前記観察物内部で発生する蛍光にて、前記シート状の励起光の法線方向に放射された蛍光を観察する観察装置と、を備え、前記観察物は、前記励起照明装置及び観察装置に対して相対的に前記シート状の励起光の法線方向に移動可能にされたものである。

このような構成により、励起照明装置で励起光を発生すると共に、該励起光を凸状シリンドリカルレンズと凹状シリンドリカルレンズとを組み合わせて構成したビーム整形手段によりシート状に整形して観察物に照射し、該励起光によって観察物内部の蛍光物質が励起されて発生する蛍光にて、上記シート状の励起光の法線方向に放射された蛍光を観察装置で観察する。この場合、上記観察物を上記励起照明装置及び観察装置に対して相対的に上記シート状の励起光の法線方向に移動させて蛍光物質の三次元像を観察する。

本発明によれば、観察物表面近傍で発生する蛍光と観察物深部に存在する観察対象の蛍光物質から発生する蛍光とを互いに異なる位置に観察することができる。したがって、従来技術における観察対象の蛍光物質から発生する蛍光が観察物表面近傍で発生する蛍光や励起光の表面反射光と重なって観察しがたいという問題を解消することができ、観察物の深部まで容易に観察することができる。また、シート状の励起光と同一平面内の蛍光物質の断層像を観察することができる。さらに、シート状の励起光の法線に略直交する蛍光物質の複数の断層像を観察することができ、これら複数の断層像に基づいて蛍光物質の三次元像を観察することができる。そして、観察物内部で発生する蛍光にて上記シート状の励起光の法線に略直交する方向に放射された蛍光を観察するように観察装置を配置しただけであるので、構造が簡単であり、従来の励起照明装置及び観察装置を利用して構成することができる。したがって、装置を安価に製造することができる。

以下、本発明の実施形態を添付図面に基づいて詳細に説明する。図１は本発明による蛍光顕微鏡の実施形態の概略構成を示す正面図である。この蛍光顕微鏡は、観察物内部の蛍光物質に励起光を照射して励起させ、蛍光物質で発生する蛍光を観察するもので、励起照明装置１と、観察装置２とを備えて構成されている。

上記励起照明装置１は、励起光を発生して観察物３に照射するものであり、レーザ光源４と、ビーム整形手段５とを備えている。ここで、レーザ光源４は、所定波長の励起光としてのレーザ光Ｌ１を放射するものである。また、ビーム整形手段５は、レーザ光源４から放射された断面円形状のレーザ光Ｌ１を厚みの薄いシート状のレーザ光Ｌ１に整形して射出するもので、凸状シリンドリカルレンズ６と凹状シリンドリカルレンズ７とを組み合わせて構成されている。

観察位置において、上記励起照明装置１の光軸と光軸を略直交させて観察装置２が設けられている。この観察装置２は、レーザ光Ｌ１の照射によって観察物３内部で観察対象の蛍光物質８が励起されて発生するレーザ光Ｌ１の波長と異なる波長の蛍光Ｌ２にて、シート状のレーザ光Ｌ１の法線方向に放射される蛍光Ｌ２を観察するものであり、光軸上に観察物３側から対物レンズ９と結像レンズ１０とをこの順に備えて、励起照明装置１のシート状のレーザ光Ｌ１に照射された蛍光物質８の断層像を観察カメラ１１の二次元撮像面に結像するようになっている。また、観察カメラ１１の前面には、レーザ光Ｌ１の透過を遮断し、蛍光物質８で発生する蛍光Ｌ２を選択的に透過させるバンドパスフィルター１２が設けられている。なお、本実施形態においては、対物レンズ９は、その焦点Ｆが励起照明装置１のシート状のレーザ光Ｌ１と略同一平面内に位置するように設けられている。

次に、このように構成された蛍光顕微鏡の動作について説明する。
レーザ光源４から放射されたレーザ光Ｌ１は、図２（ａ）に示すように、正面視にて、凸状シリンドリカルレンズ６と凹状シリンドリカルレンズ７との組み合わせから成るビーム整形手段５の集光点に集光し、厚みが薄くされる。一方、同図（ｂ）に示すように、平面視においては、レーザ光源４から放射されたレーザ光Ｌ１は、ビーム整形手段５をそのまま通過する。したがって、レーザ光源４から放射された断面円形状のレーザ光Ｌ１は、ビーム整形手段５により厚みの薄いシート状に整形されることになる。

シート状に整形されたレーザ光Ｌ１は、励起照明装置１を射出して観察物３に照射する。さらに、レーザ光Ｌ１は、観察物３内部に侵入し、シート状レーザ光Ｌ１と略同一平面内に存在する蛍光物質８を励起させて蛍光Ｌ２を発生させる。

一方、蛍光物質８がシート状レーザ光Ｌ１に照射されて発生した蛍光Ｌ２は、シート状レーザ光Ｌ１の法線方向に設けられた観察装置２の対物レンズ９内に取り込まれる。このとき、対物レンズ９は、その焦点Ｆがシート状レーザ光Ｌ１と略同一平面内に位置するように設けられているので、対物レンズ９に取り込まれた蛍光Ｌ２は、平行光となって観察カメラ１１側に進行する。そして、結像レンズ１０により、観察カメラ１１の撮像面上に集光される。これにより、シート状レーザ光Ｌ１と略同一平面内の蛍光物質８の断層像が観察カメラ１１によって撮像されることになる。

この場合、図３に示すように、観察カメラ１１の視野Ａ内には、観察対象の蛍光物質８が発生する蛍光Ｌ２以外に、該蛍光物質８の側方にて観察物３の表面近傍に存在する蛍光性物質１３が発生する蛍光Ｌ２も同時に観察されることがある。しかしながら、観察対象の蛍光物質８から発生する蛍光Ｌ２も蛍光性物質１３から発生する蛍光Ｌ２も同一平面内の互いに異なる位置に観察されるため、観察対象の蛍光物質８から発生する蛍光Ｌ２が蛍光性物質１３から発生する蛍光Ｌ２の影響を受けて観察が困難となることはない。したがって、観察カメラ１１に接続された図示省略のモニター画面上で、観察対象の蛍光物質８に注目して観察することができ、観察物３の深部に存在する蛍光物質８の断層像を容易に観察することができる。

このように、本発明の蛍光顕微鏡によれば、従来、観察物３の表面から５０μｍ程度の深さまでしか観察できなかったものが、約４００μｍ以上の深部まで鮮明に観察することができる。

ここで、図１において矢印で示すように、観察物３を励起照明装置１及び観察装置２に対して相対的にシート状のレーザ光Ｌ１の法線方向、即ち観察装置２の光軸方向に移動させれば、観察装置２の光軸に略直交する蛍光物質８の複数の断層像を観察することができる。したがって、これら複数の断層像に基づいて蛍光物質８の三次元像を観察することが可能となる。

なお、上記実施形態においては、シート状のレーザ光Ｌ１を観察物３に照射する場合について説明したが、本発明はこれに限られず、レーザ光Ｌ１を観察物３内の蛍光物質８に集光させてもよい。このとき、レーザ光Ｌ１の集光点と観察装置２の対物レンズ９の焦点Ｆとが合致するように観察装置２を設けるとよい。この場合、観察物３を励起照明装置１及び観察装置２に対して相対的に直交三軸方向に移動させると、蛍光物質８の三次元像を観察することができる。

また、上記実施形態においては、観察装置２がシート状のレーザ光Ｌ１の法線方向に放射された蛍光Ｌ２を観察するように配置された場合について説明したが、本発明はこれに限られず、レーザ光Ｌ１によって励起されて観察物３内部で発生する蛍光Ｌ２にて、励起照明装置１の光軸方向と異なる方向に放射される蛍光Ｌ２が観察可能であれば如何なる位置に配置されてもよい。

そして、上記実施形態においては、レーザ光源４を使用する場合について説明したが、本発明はこれに限られず、ＬＥＤ等の他の光源を使用してもよい。

本発明による蛍光顕微鏡の実施形態の概略構成を示す正面図である。本発明による蛍光顕微鏡に使用されるビーム整形手段の作用を示す説明図であり、（ａ）は正面図、（ｂ）は平面図である。本発明による蛍光顕微鏡の観察装置で観察される蛍光物質及び蛍光性物質の断層像を示す説明図である。

符号の説明

１…励起照明装置
２…観察装置
３…観察物
５…ビーム整形手段
６…凸状シリンドリカルレンズ
７…凹状シリンドリカルレンズ
８…観察対象の蛍光物質
Ｌ１…レーザ光（励起光）
Ｌ２…蛍光

Claims

観察物内部の蛍光物質に励起光を照射して励起させ、蛍光物質で発生する蛍光を観察する蛍光顕微鏡であって、
前記励起光を発生すると共に、該励起光を凸状シリンドリカルレンズと凹状シリンドリカルレンズとを組み合わせて構成したビーム整形手段によりシート状に整形して前記観察物に照射する励起照明装置と、
前記励起光によって励起されて前記観察物内部で発生する蛍光にて、前記シート状の励起光の法線方向に放射された蛍光を観察する観察装置と、
を備え、
前記観察物は、前記励起照明装置及び観察装置に対して相対的に前記シート状の励起光の法線方向に移動可能にされたことを特徴とする蛍光顕微鏡。