JP5166441B2 - 癌治療用イミダゾリジノニルアミノピリミジン化合物 - Google Patents

Description

本発明は、イミダゾリジノニルアミノピリミジン化合物に関する。

Ｐｌｋ１は、ポロボックス領域として公知のホスホセリン／トレオニン結合ドメインによって特徴づけられる、プロテインキナーゼの小ファミリーに属する。Ｐｌｋ１は、細胞周期の調節において中心的役割を果たす。Ｐｌｋ１の機能は、特に、有糸分裂（癌細胞が分裂する段階）の開始、進行及び脱出を制御すると考えられる。したがって、癌細胞においてＰｌｋ１を妨害することにより、それらの分裂又は有糸分裂が防止される。

ビンカアルカロイド（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））、タキソイド（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））及びトポイソメラーゼＩＩ阻害剤（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標））などの、有糸分裂を妨害する強力な抗癌剤が同定されている。ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）は、２６Ｓプロテオゾームを阻害する抗癌剤である。しかしながらこれらの薬剤は、分裂しない通常の細胞にも顕著な副作用を生じさせる。Ｐｌｋ阻害剤は分裂細胞を特異的に標的とするため、望ましくない毒性を回避することができる。

Ｐｌｋ１阻害剤は、従来技術において公知である。例えば特許文献１：国際公開第０６／０６６１７２号を参照のこと。更に特許文献２：国際公開第０６／０２１５４８号は、Ｐｌｋ１阻害剤として、特定のジヒドロプテリジノン類似体（例えばＢＩ−２５３６）を開示している。最近では、ＢＩ−２５３６は第２フェーズの臨床試験が行われているが、それは高いクリアランス（ＣＬ＞１０００ｍＬ／分）を示し、またヒトの腫瘍抑制への投与に限定されている。改良された薬効又は薬物動態特性を有する、更なるＰｌｋ１阻害化合物に対するニーズが今なお存在する。経口投与可能なＰｌｋ１阻害剤を提供することもまた有利である。

国際公開第０６／０６６１７２号パンフレット 国際公開第０６／０２１５４８号パンフレット

本発明は、Ｐｌｋ１の阻害による癌の治療に使用できる、新規なイミダゾリジノニルアミノピリミジン化合物の提供に関する。これらの化合物の幾つかは、特許文献１：国際公開第０６／０６６１７２号で開示される化合物を凌ぐ効力を有すると考えられる。更に、これらの化合物の中の幾つかは、ＢＩ−２５３６よりも改善された薬物動態特性を有すると考えられる。更に、試験された本発明の化合物が有する経口バイオアベイラビリティのため、これらの化合物の中の幾つかは経口投与できるものと考えられる。

本発明は、式Ｉの化合物

（式中、Ｒ^１は水素、ヒドロキシ基、ヒドロキシメチル基、ハロ基、メチル基、フルオロメチル基、Ｃ_１−Ｃ_２アルコキシ基、アミノ基又はメチルアミノ基であり、
Ｒ^２は水素、ハロ基又はシアノ基であり、
Ｒ^３は水素又はハロ基であり、
但しＲ^１、Ｒ^２及びＲ^３のうちの少なくとも１つが水素であり、
Ｒ^４は水素、ハロ基又はメチル基である）、
又はその薬理学的に許容できる塩の提供に関する。

本発明は、哺乳動物における、肺非小細胞癌、食道癌、口咽頭癌、胃癌、黒色腫、皮膚扁平上皮癌、胸部癌、卵巣癌、子宮内膜癌、結腸直腸癌、神経膠腫、神経膠芽腫、甲状腺癌、頸部癌、膵臓癌、前立腺癌、肝芽腫及び非ホジキンリンパ腫からなる群から選択される癌を治療する方法であって、かかる治療を必要とする哺乳動物に有効量の式Ｉの化合物又はその薬理学的に許容できる塩を投与するステップを有してなる方法の提供に関する。

本発明はまた、薬理学的に許容できる賦形剤、担体又は希釈剤との組み合わせで、式Ｉの化合物又はその薬理学的に許容できる塩を含んでなる医薬組成物の提供に関する。

本発明はまた、薬剤の調製用の、式Ｉの化合物又はその薬理学的に許容できる塩の提供に関する。更に本発明は、哺乳動物における、肺非小細胞癌、食道癌、口咽頭癌、胃癌、黒色腫、皮膚扁平上皮癌、胸部癌、卵巣癌、子宮内膜癌、結腸直腸癌、神経膠腫、神経膠芽腫、甲状腺癌、頸部癌、膵臓癌、前立腺癌、肝芽腫及び非ホジキンリンパ腫からなる群から選択される癌の治療用薬剤の調製への、式Ｉの化合物又はその薬理学的に許容できる塩の提供に関する。更に本発明は、肺非小細胞癌、食道癌、口咽頭癌、胃癌、黒色腫、皮膚扁平上皮癌、胸部癌、卵巣癌、子宮内膜癌、結腸直腸癌、神経膠腫、神経膠芽腫、甲状腺癌、頸部癌、膵臓癌、前立腺癌、肝芽腫及び非ホジキンリンパ腫からなる群から選択される癌の治療に適する医薬組成物であって、１つ以上の薬理学的に許容できる賦形剤、担体又は希釈剤との組み合わせで、式Ｉの化合物又はその薬理学的に許容できる塩を含んでなる組成物の提供に関する。

本発明はまた、次式の化合物

（式中、Ｒ^１は水素、ヒドロキシ基、ハロ基、メチル基、Ｃ_１−Ｃ_２アルコキシ基、アミノ基又はメチルアミノ基であり、
Ｒ^２は水素、ハロ基又はシアノ基であり、
Ｒ^３は水素又はハロ基であり、
Ｒ^４は水素、ハロ基又はメチル基であり、
但しＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３及びＲ^４のうちの少なくとも２つが水素であり、
Ｒ^５は水素、ハロ基又はメチル基である）、
又はその薬理学的に許容できる塩の提供に関する。

上記の式において使用する一般的な化学用語は、それらの通常の意味で用いる。例えば、用語「（Ｃ_１−Ｃ_２）アルコキシ基」とは、メトキシ基及びエトキシ基を意味する。「ハロ基」という用語は、フルオロ基、クロロ基、ブロモ基及びヨード基を意味する。

当業者であれば、本発明の化合物のほとんど又は全てが塩を形成できることを理解するであろう。本発明の化合物はアミンであり、したがって、多くの無機酸及び有機酸のうちのいずれかと反応して、薬理学的に許容できる酸付加塩を形成する。かかる薬理学的に許容できる酸付加塩及びそれらを調製するための一般的な方法論は公知技術である。例えば、Ｐ．Ｓｔａｈｌら、ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＡＬＴＳ： ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，ＳＥＬＥＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＵＳＥ，（ＶＣＨＡ／Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００２）、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅら、“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ，“Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ ６６，Ｎｏ．１，Ｊａｎｕａｒｙ １９７７を参照のこと。好適な式Ｉの化合物は、
ａ）Ｒ^１が水素又はメチル基である。
ｂ）Ｒ^２が水素又はハロ基である。
ｃ）Ｒ^３が水素又はハロ基である。
ｄ）Ｒ^４がハロ基である。
ｅ）Ｒ^４がメチル基である。
ｆ）Ｒ^４が水素である。
ｇ）Ｒ^１が水素であり、Ｒ^２がクロロ基であり、Ｒ^３が水素であり、かつＲ^４が水素である。
ｈ）Ｒ^１がメチル基であり、Ｒ^２が水素であり、Ｒ^３がフルオロ基であり、かつＲ^４がフルオロ基である。並びに、
ｉ）Ｒ^１がメチル基であり、Ｒ^２が水素であり、Ｒ^３がフルオロ基であり、かつＲ^４がメチル基である。

（反応式）当業者であれば、本発明の化合物の置換基の全てが、化合物の合成に使用される特定の反応条件を許容できるわけではないことを認識するであろう。これらの部分は、合成経路上のいかなるタイミングで導入してもよく、又はそれらを必要に応じて保護し、更に脱保護してもよい。当業者であれば、保護基が本発明の化合物の合成経路中のいかなる工程においても除去できることを認識するであろう。窒素及び酸素の保護基を導入し、除去する方法は公知である。例えば、Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，３^ｒｄ Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｃｈａｐｔｅｒ ７（１９９９）を参照のこと。更に当業者であれば、多くの場合、それらの基を導入する順序は特定のものに限定されないことを認識するであろう。本発明の化合物の調製に必要となるステップの特定の順序は、合成される特定の化合物、開始化合物及び置換された基の相対的な不安定に依存しうる。

本発明の化合物は、後述する少なくとも２つの変形化合物を用いることにより調製できる。特に明記しない限り、以下の反応式中の全ての置換基は、上記で定義したとおりであり、また適切な試薬は当該技術分野で公知であり一般的に用いられている。反応式２において、Ｙはハロ基であり、Ｚはホウ酸である。

式（１）の化合物は、２−（アミノエチル）−１，３−ジヒドロ−イミダゾール−オン（２）と反応して、求核置換反応を経て式（５）の化合物となる。かかる反応は、適切な溶媒（例えばｎブタノール、ジオキサン、Ｎ−メチルピロリジン−２−オン（ＮＭＰ）など）中で実施される。一般に、上記の反応は、油浴又はマイクロ波反応器を用いて、約１２０℃〜１５０℃の温度で実施される。この反応の典型的な化学量論は、式（３）の化合物に基づくものであり、約２当量の２−（アミノエチル）−１，３−ジヒドロ−イミダゾール−オンが用いられる。アミン塩基（例えばトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンなど）が使用可能である。

式（３）の化合物を、スズキ反応において、塩基（例えば炭酸ナトリウム、炭酸カリウムなど）の存在下で、適切なパラジウム触媒（例えばテトラキス（トフェニルホスフィン）パラジウム（０）、［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）など）を使用して、式（４）の化合物と反応させる。かかる反応は、適切な溶媒（例えばＴＨＦ、ジオキサン、水など）中で実施される。一般に、上記の反応は、油浴又はマイクロ波反応器を用いて、約１００℃〜１５０℃の温度で実施される。

任意のステップにおいて、本発明の化合物の薬理学的に許容できる塩が形成される。かかる塩の形成は、当該技術分野で公知で一般に行われている。

当業者に自明のように、式（１）及び（３）の化合物は、周知の、当該技術分野で周知の確立された手順を用いることにより、本願明細書に記載された方法と同様の方法で容易に調製できる。例えば、式（１）の化合物は、任意に置換されたピリジニル化合物と、任意に置換されたベンゾチオフェニル化合物とを、上記の通り、スズキカップリング法によりカップリングして調製することができる。得られるスズキ付加物を、公知技術の方法によりホウ素化し、更に、上記と同様のスズキカップリング法により、任意に置換されたハロゲン化ピリミジンとカップリングする。式（３）の化合物は、公知技術の方法により、任意に置換されたベンゾチオフェニル化合物をホウ素化し、更に、得られるホウ酸／エステルに対して、求核芳香族置換反応によって２−（アミノエチル）−１，３−ジヒドロ−イミダゾール−オン（２）を付加することにより調製される。また、式（１）又は（３）の化合物の調製に必要なステップは、式（１）又は（３）の部分化合物と、式（２）及び／又は式（４）の化合物との反応を含む、いかなる順序によっても実施できることは認識されており、その後、炭素−炭素結合の形成、カップリング反応などを実施することにより、本発明の化合物が得られる。

本発明を、以下の実施例及び調製例で更に詳細に示す。これらの実施例及び調製例は、例示のみを目的とするものであり、いかなる形であれ本発明を限定することを目的とするものでもない。特に明記しない限り、実施例及び調製例において使用する用語は、それらの通常の意味を有する。下記に例示される化合物は、ＣｈｅｍＤｒａｗ（登録商標）（Ｖｅｒｓｉｏｎ １０）を使用して命名した。

調製１：２−ベンゾ［ｂ］チオフェン−７−イル−４，４，５，５−テトラメチル−［１，３，２］ジオキサボラン：
７−ブロモ−ベンゾ［ｂ］チオフェン（４２６ｍｇ、２ｍｍｏｌ）ビス（ピナコラト）ジボロン（７５６ｍｇ、３ｍｍｏｌ）、［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）のジクロロメタンとの錯体（１：１）（８１ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）、酢酸カリウム（２９４ｍｇ、３ｍｍｏｌ）を、フラスコ内のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（１０ｍＬ）中で混合した。混合物を５分間窒素でバブリングした。フラスコを密封し、１００℃で４時間油浴中で加熱した。混合物をクロロホルム／イソプロパノール（３／１）で希釈した。飽和塩化ナトリウム水溶液で溶液を洗浄した。硫酸ナトリウム上で溶液を乾燥させた。真空中で溶液を濃縮し、暗色残渣を得た。カラムクロマトグラフィ（ヘキサン〜２０％の酢酸エチル／ヘキサン）で精製し、無色の固体として標題化合物（３４２ｍｇ、６６％）を得た。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ２６１［Ｍ＋１］^＋。

調製２：ベンゾ［ｂ］チオフェン−７−ホウ酸：
撹拌機を備えた１２Ｌのモートンフラスコ内の、無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（４０００ｍＬ）中に、７−ブロモベンゾ［ｂ］チオフェン（３００ｇ、１．４１ｍｍｏｌ）及びトリイソプロピルボレート（４０３．６ｇ、２．１５ｍｍｏｌ）を添加し、窒素雰囲気下、ドライアイス／アセトン浴内で−７０℃に冷却した。内部温度が−６７．５℃より低い温度に維持される速度で、ｎ−ブチルリチウム（ヘキサン中１．６Ｍ、７１４ｇ、１．６８ｍｍｏｌ）を滴加した。添加終了後、反応混合物をこの温度で１時間撹拌した。冷却浴槽を取り外し、４Ｌの水を徐々に添加した。溶液のｐＨがｐＨ＝２付近になるまで、濃ＨＣｌ（７５ｍＬ）を添加した。スラリーを１時間撹拌した。混合物に充分な量の５Ｎ ＮａＯＨ水溶液を添加し、約ｐＨ＝１２のｐＨに調整した。層を分離させ、水性層を保存した。有機層を４Ｌのメチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテルで希釈し、１Ｌの５Ｎ ＮａＯＨ水溶液で抽出した。層を分離させた。水性層を前の水性抽出物と混合した。更にメチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル（４Ｌ）で水性層を洗浄した。層を分離させ、撹拌機を備えた１２Ｌの３口の丸底フラスコ中に水性層を移した。溶液を氷水浴で＋５℃に冷却した。溶液のｐＨがｐＨ＝２付近になるまで、徐々に濃ＨＣｌを添加した。混合物を３０分間撹拌し、得られる固体を濾取した。漏斗内の固体を２Ｌの水で２回洗浄し、３０分間空気乾燥させた。５０℃で真空オーブン内に固体を置き、真空下で一晩乾燥させた。２Ｌのｎ−ヘプタンで乾燥固体を３０分間スラリー化することにより、黄色の着色を除去した。再度固体を濾取し、３０分間空気乾燥させ、４０℃で一晩真空乾燥させ、白色固体として標題化合物（１８８．８ｇ、７５％）を得た。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ） δ７．８６（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ），７．４９−７．５７（ｍ，２Ｈ），７．３０−７．３９（ｍ，２Ｈ）。

調製３：（６−フルオロ−ピリジン−３−イル）−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
マグネチックスターラー、熱電対で制御された加熱マントル、濃縮器及び窒素雰囲気を備えた、１００ｍＬの３口の丸底フラスコを準備した。５−アミノ−２−フルオロ−ピリジン（５ｇ、４４．６ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ（５０ｍＬ）４−ジメチルアミノピリジン（５４９ｍｇ、４．５ｍｍｏｌ、１０モル％）及びジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ジカーボネート（１０．７ｇ、４９ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を５０℃で４時間加熱した。冷却し、真空中で濃縮した。残留物をジクロロメタン／水に溶解させ、濾過した。濾過液を分離漏斗へ移し、ジクロロメタン層を分離させた。硫酸ナトリウム上でジクロロメタンを乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。シリカ上でクロマトグラフィを行い、１０％イソプロパノール／９０％ジクロロメタンのイソクラティック混合液で抽出し、黄褐色の透明な油状物として標題化合物（１．６４ｇ、１７％）を得た。真空乾燥して凝固させた。ＭＳ（ＥＩ）ｍ／ｚ２６１ Ｍ^＋。

調製４：（２−フルオロ−ピリジン−３−イル）−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
適切な出発原料を使用し、（６−フルオロ−ピリジン−３−イル）−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルの調製に基本的に従い、標題化合物を調製した。ＧＣＭＳ（ＥＩ）ｍ／ｚ２１２ Ｍ^＋。

調製５：Ｎ−（４−ヨード−ピリジン−３−イル）−２，２−ジメチル−プロピオンアミド：
マグネチックスターラー、熱電対、ドライアイス／アセトン浴槽、窒素雰囲気及び滴下漏斗を備えた２５０ｍＬの３口の丸底フラスコを準備した。２，２−ジメチル−Ｎ−ピリジン−３−イル−プロピオンアミド（３．０ｇ、１６．８ｍｍｏｌ）、ジエチルエーテル（６７ｍＬ）、テトラメチレンジアミン（４．６８ｇ、６．０８ｍＬ、４０．３ｍｍｏｌ）を添加した。反応液を−７８℃に冷却した。１０分にわたり、ガラスシリンジにより、ｎ−ブチルリチウム（ヘキサン中の２．５Ｍの溶液、１６．２ｍＬ、４０．３ｍｍｏｌ）を徐々に添加した。反応液を２時間かけて−１３℃に昇温させた。反応液を−７８℃に冷却した。滴下漏斗を介して反応液にヨード液（８．５ｇ、２０ｍＬのＴＨＦ中、３３．６ｍｍｏｌ）を添加し、−６８℃で２．５時間混合した。飽和ＮＨ_４Ｃｌ水溶液（４０ｍＬ）を添加し、反応をクエンチした。酢酸エチル（１００ｍＬ）で抽出し、水性相を廃棄した。飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）及び飽和塩化ナトリウム水溶液で有機層を洗浄した。硫酸ナトリウム上で有機相を乾燥させ、濾過した。真空中で濃縮し、茶色の油状物を得た。シリカ（８０ｇ）上でクロマトグラフィを行い、１００％ジクロロメタン〜７０％酢酸エチル／３０％ジクロロメタンの勾配で溶出し、標題化合物（１．１９ｇ、２３％）を得た。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ３０５［Ｍ＋１］＋

適切な出発原料を使用して、Ｎ−（４−ヨード−ピリジン−３−イル）−２，２−ジメチル−プロピオンアミドの調製に基本的に従い、以下の化合物を調製した。

調製８：３−メトキシメトキシ−ピリジン
ＴＨＦ（２０．６ｍＬ）及びジメチルホルムアミド（３４．４ｍＬ）中に３−ヒドロキシピリジン（７ｇ、７４ｍｍｏｌ）を溶解させ、−１５℃に冷却した。カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（８．３ｇ、７４ｍｍｏｌ）を添加し、−１５℃で３０分間撹拌した。４０分間にわたり、混合液にクロロメチルメチルエーテル（５．８１ｍＬ、７７ｍｍｏｌ）を滴加して処理した。添加終了後、更に−１５℃で１時間混合物を撹拌した。氷浴を取り除き、混合液を徐々に１５℃に加温した。混合液を飽和塩化ナトリウム水溶液に注入し、１０分間激しく撹拌した。得られる溶液を、酢酸エチルで３度にわたり抽出した。有機抽出液を合わせ、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。それ以上精製せずに、得られる生成物を使用した。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ８．４２（ｄ，Ｊ＝３Ｈｚ，１Ｈ），８．２８（ｄ，Ｊ＝５Ｈｚ，１Ｈ），７．３７−７．４２（ｍ，１Ｈ），７．２１−７．２７（ｍ，１Ｈ），５．２０（ｓ，２Ｈ），３．４９（ｓ，３Ｈ）。

調製９：２−クロロ−５−メトキシメトキシ−ピリジン
水素化ナトリウム（３．７ｇ、９３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５０ｍＬ）中に懸濁させ、４５分にわたり、ＤＭＦ（２０ｍＬ）中に２−クロロ−５−ヒドロキシピリジン（１０ｇ、７７ｍｍｏｌ）を含有する溶液を滴加した。室温で１．５時間、得られる溶液を撹拌した。４５分間にわたり、クロロメチルメチルエーテル（６．６ｍＬ、８６ｍｍｏｌ）を滴加した。室温で１２時間、得られる混合液を撹拌した。混合液を酢酸エチル、水及び飽和塩化ナトリウム水溶液で希釈した。有機溶液を分離し、水で３回、飽和塩化ナトリウム水溶液で１回洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。３３０ｇのシリカゲル上のカラムクロマトグラフィにより、ヘキサン〜３０％の酢酸エチル／ヘキサンの勾配で２０分溶出させることにより粗生成物を精製し、次に３０％の酢酸エチル／ヘキサンに３０分間保持し、透明な油状物として標題化合物（１０．８ｇ、８１％）を得た。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ１７４．０［Ｍ＋１］^＋。

２−クロロ−５−メトキシメトキシ−ピリジンで使用したのと同様の方法に従い、以下の中間体を調製した。

調製１１：２−クロロ−４−ヨード−５−メトキシメトキシ−ピリジン
ＴＨＦ（３００ｍＬ）中の２−クロロ−５−メトキシメトキシ−ピリジン（１０．８ｇ、６２ｍｍｏｌ）の溶液に、ｔｅｒｔ−ブチルリチウム（ペンタン中の１．７Ｍ、７２ｍＬ、１２３ｍｍｏｌ）を、−７０℃で１０分間にわたり、滴加した。−７０℃で３０分間、得られる溶液を撹拌した。３０分間にわたり、ＴＨＦ（１５０ｍＬ）中にヨウ素（２３ｇ、９２ｍｍｏｌ）を含有する溶液を滴加した。−７０℃で１時間、得られる溶液を撹拌した。氷浴を取り除き、反応液を室温に加温した。混合液を酢酸エチル及び水で希釈して、相分離させた。酢酸エチルで２回、水性相を抽出した。有機抽出液を合わせ、チオ硫酸ナトリウム水溶液で２回、水で１回、飽和塩化ナトリウム水溶液で１回洗浄し、硫酸ナトリウムを通じて乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。得られる固体をヘキサンで粉末状にした。減圧濾過により固体を回収し、ヘキサンで固体を洗浄した。真空下で固体を乾燥させ、茶色の固体として標題化合物（１０．８ｇ、５８％）を得た。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ８．０８（ｓ，１Ｈ），７．９８（ｓ，１Ｈ），５．４３（ｓ，２Ｈ），３．４０（ｓ，３Ｈ）。

２−クロロ−４−ヨード−５−メトキシメトキシ−ピリジンの手順に基本的に従い、以下の中間体を調製した。

調製１３：６−クロロ−４−ヨード−ピリジン−３−オール
ＴＨＦ（４０ｍＬ）中の２−クロロ−４−ヨード−５−メトキシメトキシ−ピリジン（８．１ｇ、２７ｍｍｏｌ）の溶液を、３Ｎ ＨＣｌ（６１ｍＬ）で処理した。得られる混合液を６０℃で３時間加熱した。室温に混合液を冷却し、飽和重炭酸ナトリウム水溶液を徐々に添加し、ｐＨを７に合わせた。混合液を、酢酸エチルで３回抽出した。有機抽出液を合わせ、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮し、茶色の固体として標題化合物（６．８ｇ、９８％）を得た。それ以上精製せずに使用した。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ− ｄ_６）δ１１．０４（ｓ，１Ｈ），７．８１−７．８７（ｍ，２Ｈ）。

基本的に６−クロロ−４−ヨード−ピリジン−３−オールにおける手順を使用し、以下の中間体を調製した。

調製１５：２−クロロ−５−エトキシ−４−ヨード−ピリジン
ジメチルホルムアミド（５０ｍＬ）中に６−クロロ−４−ヨード−ピリジン−３−オール（４．９ｇ、１９ｍｍｏｌ）及び炭酸カリウム（８．０ｇ、５８ｍｍｏｌ）を含有する溶液を、ヨウ化エチル（４．７ｍＬ、５８ｍｍｏｌ）で処理した。６０℃で３時間加熱した。混合液を室温に冷却し、濾過した。混合液を酢酸エチルで希釈し、１０％のクエン酸水溶液で洗浄した。水溶液を合わせ、酢酸エチルで更に２回抽出した。有機抽出液を合わせ、水で３回、飽和塩化ナトリウム水溶液で１回洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮し、茶色の固体として標題化合物（５．１ｇ、９３％）を得た。それ以上精製せずに使用した。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ８．００（ｓ，１Ｈ），７．９３（ｓ，１Ｈ），４．１８（ｑ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ），１．３５（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，３Ｈ）。

調製１６：４−ベンゾ［ｂ］チオフェン−７−イル−２−クロロ−ピリジン
フラスコ中で、７−ブロモ−ベンゾ［ｂ］チオフェン（１．７ｇ、１２ｍｍｏｌ）、２−クロロ−４−（４，４，５，５−テトラメチル−［１，３，２］ジオキサボラン−２−イル）−ピリジン（１．６ｇ、７ｍｍｏｌ）、［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）のジクロロメタンとの錯体（１：１）（２８５ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）、２−（ジ−ｔｅｒｔ−ブチルホスフィノ）ビフェニル（６３ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）、炭酸ナトリウム（２Ｍ、８ｍＬ、１６ｍｍｏｌ）及びＴＨＦ（２０ｍＬ）を混合した。１００℃で３時間、混合液を加熱した。混合液をクロロホルム／イソプロパノール（３／１）で希釈した。飽和塩化ナトリウム水溶液で溶液を洗浄した。硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶液を真空中で濃縮し、暗色残渣を得た。カラムクロマトグラフィ（ジクロロメタン〜２０％のＴＨＦ／ジクロロメタン）で精製し、黄色の固体として標題化合物（１．１４ｇ、６６％）を得た。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ２４６［Ｍ＋１］^＋。

ＤＭＳＯを使用し、４−ベンゾ［ｂ］チオフェン−７−イル−２−クロロ−ピリジンで使用したのと同様の方法に従い、以下の化合物を調製した。

調製１８：４−ベンゾ［ｂ］チオフェン−７−イル−２−フルオロ−５−メチル−ピリジン
フラスコ中で、２−フルオロ−４−ヨード−５−メチル−ピリジン（３５５ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）、２−ベンゾ［ｂ］チオフェン−７−イル−４，４，５，５−テトラメチル−［１，３，２］ジオキサボラン（２８２ｍｇ、１．８ｍｍｏｌ）、［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）のジクロロメタンとの錯体（１：１）（６１ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）、２−（ジ−ｔｅｒｔ−ブチルホスフィノ）ビフェニル（１３ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）、炭酸ナトリウム（２Ｍ、１．５ｍＬ、３ｍｍｏｌ）及びＴＨＦ（１０ｍＬ）を混合した。油浴中で１００℃で３時間、混合液を加熱した。混合液をクロロホルム／イソプロパノール（３／１）で希釈した。飽和塩化ナトリウム水溶液で溶液を洗浄した。硫酸ナトリウム上で乾燥させた。真空中で濃縮させ、暗色残渣を得た。カラムクロマトグラフィ（２０％の酢酸エチル／ヘキサン）で精製し、黄色の油状物として標題化合物（３００ｍｇ、８２％）を得た。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ２４４［Ｍ＋１］^＋。

適切な出発原料を使用し、４−ベンゾ［ｂ］チオフェン−７−イル−２−フルオロ−５−メチル−ピリジンの調製に基本的に従い、以下の中間体を調製した。

調製２４：４−ベンゾ［ｂ］チオフェン−７−イル−３−メトキシメトキシ−ピリジン：溶液Ａ：
ｔｅｒｔ−ブチルリチウム（ペンタン中の１．７Ｍ、１０ｍＬ、１８ｍｍｏｌ）を滴加し、ジエチルエーテル（９０ｍＬ）中の３−メトキシメトキシ−ピリジン（２．５ｇ、１８ｍｍｏｌ）の溶液を、−７０℃で１０分にわたり処理した。−７０℃で４０分間混合液を撹拌し、５分間にわたり、ＴＨＦ（１０ｍＬ）中のトリイソプロピルボレート（５ｍＬ、２２ｍｍｏｌ）の溶液を滴状添加した。−７０℃で１時間混合液を撹拌し、氷浴を取り除き、混合液を徐々に室温に加温した。

溶液Ｂ：
１，４−ジオキサン（３０ｍＬ）中に、７−ブロモ−ベンゾ［ｂ］チオフェン（３．８ｇ、１８ｍｍｏｌ）、２−（ジ−ｔｅｒｔ−ブチルホスフィノ）ビフェニル（２６８ｍｇ、０．９０ｍｍｏｌ）、［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）のジクロロメタンとの錯体（１：１）（７３２ｍｇ、０．９０ｍｍｏｌ）を含有する溶液を、２Ｍの炭酸ナトリウム水溶液（７２ｍＬ、３６ｍｍｏｌ）で処理した。溶液Ａが室温に達した後、溶液を８０℃まで加熱した。１０分間にわたり溶液Ａを滴加して、溶液Ｂを処理した。混合溶液を８５℃で５時間加熱した。混合液を室温に冷却し、酢酸エチル及び水で希釈した。水及び飽和塩化ナトリウム水溶液で有機相を洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。１２０ｇのシリカゲル上のカラムクロマトグラフィで、ジクロロメタン〜酢酸エチル勾配で溶出して粗生成物を精製し、開始原料の３−メトキシメトキシ−ピリジンを若干含む標題化合物（３．８ｇ）を得た。それ以上精製せずに生成物を使用した。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ８．６８（ｓ，１Ｈ），８．４２（ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ，１Ｈ），７．８８（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ），７．３３−７．５０（ｍ，５Ｈ），５．１２（ｓ，２Ｈ），３．３６（ｓ，３Ｈ）。

調製２５：２−クロロ−４−［７−（２−クロロ−ピリジン−４−イル）−ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イル］−ピリミジン
５００ｍＬの丸底フラスコにおいて、窒素雰囲気下で、ＴＨＦ（１５０ｍＬ）中の４−ベンゾ［ｂ］チオフェン−７−イル−２−クロロ−ピリジン（１３ｇ、５３．１ｍｍｏｌ）とトリイソプロピルボレート（２０ｇ、１０６ｍｍｏｌ）の溶液を−７０℃に冷却した。冷却した溶液に、３０分間にわたり、リチウムジイソプロピルアミド（ＴＨＦ中の２Ｍ、５３ｍＬ、１０６ｍｍｏｌ）を徐々に添加した。冷却浴中で更に１時間、混合液を連続的に撹拌した。上記の混合液を、２，４−ジクロロ−ピリミジン（１２ｇ、１０６ｍｍｏｌ）、［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）のジクロロメタン（１：１）との錯体（２．２ｇ、５３ｍｍｏｌ）及び炭酸ナトリウム（３５ｍＬ、３Ｍ、１０６ｍｍｏｌ）を含有するＴＨＦ（１５０ｍＬ）の還流溶液に、３０分間にわたり徐々に移した。更に１時間還流した。混合液を室温に冷却し、５００ｍＬのクロロホルム／イソプロパノール（３／１）及び２００ｍＬの水で希釈した。得られる固体を濾過して回収し、クロロホルム／イソプロパノール／水混合液を保存した。ジクロロメタンで固体を洗浄し、真空下でそれを乾燥させた。クロロホルム／イソプロパノール／水混合液の層を分離させた。水及び飽和塩化ナトリウム水溶液で有機相を洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空中で濃縮し、茶色の残渣を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィ（ジクロロメタンの１０％のメタノール）によって残渣を精製し、更なる生成物を得た。２つの生成物を合わせ、標題化合物（１３ｇ、６８％）ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ３５８［Ｍ＋１］^＋を得た。

適切な出発原料を使用して、２−クロロ−４−［７−（２−クロロ−ピリジン−４−イル）−ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イル］−ピリミジンの調製に基本的に従い、以下の中間体を調製した。

調製３９：４−［２−（２−クロロ−５−フルオロ−ピリミジン−４−イル）−ベンゾ［ｂ］チオフェン−７−イル］−ピリジン−３−オール
ＴＨＦ（１０ｍＬ）中に２−クロロ−５−フルオロ−４−［７−（３−メトキシメトキシ−ピリジン−４−イル）−ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イル］−ピリミジン（４ｇ、１０ｍｍｏｌ）を含有する溶液を、５Ｎ ＨＣｌ（３ｍＬ）で処理した。室温で６時間、混合液を撹拌した。真空中で反応液を濃縮し、飽和重炭酸ナトリウム水溶液及びジクロロメタンで希釈した。層を分離させ、各層を濾過した。有機相から得た固体を、ジクロロメタンで洗浄し、黄褐色の固体として標題化合物（３００ｍｇ）を得た。水性層から得た固体を水で洗浄し、乾燥させ、黄褐色の固体として標題化合物（３００ｍｇ）を得た。これらの固体を合わせ、黄褐色の固体として標題化合物（６００ｍｇ、１７％）を得た。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ３５８［Ｍ＋１］^＋。

調製４０：２−クロロ−４−［７−（３−エトキシ−ピリジン−４−イル）−ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イル］−５−フルオロ−ピリミジン：
４−［２−（２−クロロ−５−フルオロ−ピリミジン−４−イル）−ベンゾ［ｂ］チオフェン−７−イル］−ピリジン−３−オール（１００ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）及び炭酸セシウム（１００ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（１ｍＬ）溶液を、ヨウ化エチル（４４ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）で処理した。室温で１２時間、混合液を撹拌した。混合液を酢酸エチルで希釈し、溶液を水で３回、飽和塩化ナトリウム水溶液で１回洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。１２ｇのシリカゲル上のカラムクロマトグラフィを用い、ジクロロメタン〜酢酸エチルの勾配で溶出することにより粗生成物を精製し、茶色の固体として標題化合物（４８ｍｇ、４５％）を得た。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ３８６［Ｍ＋１］^＋。

調製４１：２−クロロ−５−フルオロ−４−［７−（３−メトキシ−ピリジン−４−イル）−ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イル］−ピリミジン
適切な出発原料を使用して、２−クロロ−４−［７−（３−エトキシ−ピリジン−４−イル）−ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イル］−５−フルオロ−ピリミジンの調製に基本的に従い、標題化合物を調製した。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ３７２［Ｍ＋１］^＋。

調製４２：１−｛２−［４−（７−ブロモ−ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イル）−５−フルオロ−ピリミジン−２−イルアミノ］−エチル｝−イミダゾリジン−２−オン
１，４−ジオキサン（６５０ｍＬ）中で、１−（２−アミノエチル）−２−イミダゾロン（１００ｇ、７７４ｍｍｏｌ）を、４−（７−ブロモ−ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イル）−２−クロロ−５−フルオロ−ピリミジン（９０ｇ、２６２ｍｍｏｌ）と混合し、窒素雰囲気下で３時間、撹拌しながら９０℃に加熱した。反応液を室温に冷却した。濾過し、水（３×５００ｍＬ）及びジエチルエーテル（５００ｍＬ）で固体を洗浄した。５０℃で真空乾燥させ、黄色の固体として標題化合物（５９．２ｇ、５２％）を得た。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ４３６［Ｍ＋１］^＋。

適切な出発原料を使用して、１−｛２−［４−（７−ブロモ−ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イル）−５−フルオロ−ピリミジン−２−イルアミノ］−エチル｝−イミダゾリジン−２−オンの調製に基本的に従い、以下の中間体を調製した。

調製４６：５−ブロモメチル−２−フルオロ−４−ヨード−ピリジン
フラスコにおいて、２−フルオロ−４−ヨード−ピコリン（１０．０ｇ、４２．１９ｍｍｏｌ）、Ｎ−ブロモスクシンイミド（９．７６ｇ、５４．８５ｍｍｏｌ）、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（３．４６ｇ、２１．１０ｍｍｏｌ）及び無水ＣＣｌ_４（１００ｍＬ）を混合した。窒素雰囲気下で１６時間、７０℃で加熱した。室温に冷却した。ジクロロメタンで希釈し、水及び飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。層を分離させ、硫酸マグネシウム上で有機層を乾燥させた。真空中で濃縮し、粗生成物を得た。カラムクロマトグラフィ（１％〜１５％の酢酸エチル／ヘキサン）で精製し、標題化合物（８．２７ｇ、６２％）を得た。ＭＳ（ＥＩ）ｍ／ｚ３１５Ｍ^＋。

調製４７：１−（２−｛５−フルオロ−４−［７−（４，４，５，５−テトラメチル−［１，３，２］ジオキサボラン−２−イル）−ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イル］−ピリミジン−２−イルアミノ｝−エチル）−イミダゾリジン−２−オン
フラスコ中、１−｛２−［４−（７−ブロモ−ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イル）−５−フルオロ−ピリミジン−２−イルアミノ］−エチル｝−イミダゾリジン−２−オン（５．５ｇ、１２．６ｍｍｏｌ）、ビス（ピナコラト）ジボロン（３．８４ｇ、１５．３ｍｍｏｌ）、（１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）−フェロセン）ジクロロパラジウム（ＩＩ）（１．０ｇ、１．３ｍｍｏｌ）、酢酸カリウム（２．５ｇ、２５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（８０ｍＬ）中で混合した。混合液を１０分間窒素でバブリングした。フラスコを密封し、油浴中に入れ、８５℃で一晩加熱した。混合液をクロロホルム／イソプロピルアルコール（３／１）で希釈した。飽和塩化ナトリウム水溶液で上記溶液を洗浄した。硫酸ナトリウム上でそれを乾燥させた。真空中で溶液を濃縮し、暗色残渣を得た。カラムクロマトグラフィ（ヘキサン〜２０％の酢酸エチル／ヘキサン〜１０％のメタノール／ジクロロメタン）で残渣を精製し、茶色の固体（５ｇ、８２％）として生成物を得た。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ４８４［Ｍ＋１］^＋。

調製４８：（６−フルオロ−４−ヨード−ピリジン−３−イル）−メタノール
５−ブロモメチル−２−フルオロ−４−ヨード−ピリジン（０．９ｇ、２．８５ｍｍｏｌ）、ニトロメタン（１５ｍＬ、２７８ｍｍｏｌ）、銀テトラフルオロボレート（７２１ｍｇ、３．７ｍｍｏｌ）及びジメチルホルムアミド（５ｍＬ）を、丸底フラスコ中で混合した。室温で一晩、混合液を撹拌した。混合液に炭酸ナトリウム（１．８１ｇ、１７．１ｍｍｏｌ）及びメタノール（１０ｍＬ）を添加した。更に４時間室温で撹拌した。反応混合液をクロロホルムで希釈し、水及び飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を水性層から分離し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させた。濾過後、真空中で有機溶媒を蒸発させ、粗生成物を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィ（１０％のメタノール／ジクロロメタンで溶出）により粗生成物を精製し、所望の生成物（０．６ｇ、８３％）を得た。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ２５４［Ｍ＋１］^＋。

調製４９：２−フルオロ−５−フルオロメチル−４−ヨード−ピリジン
窒素雰囲気下で、丸底フラスコ中、（６−フルオロ−４−ヨード−ピリジン−３−イル）−メタノールのジクロロメタン（２５ｍＬ）溶液に、ジエチルアミノサルファトリフルオライド（８９２ｍｇ、４ｍｍｏｌ）を滴加し、次に０〜５℃でエタノール（０．３ｍＬ）を添加した。混合液を３時間撹拌した。反応混合液を飽和炭酸水素ナトリウム溶液に注入した。クロロホルムで生成物を抽出し、水及び飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を水性層から分離し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させた。濾過後、真空中で有機溶媒を蒸発させ、粗生成物を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィ（１０％のメタノール／ジクロロメタン）で粗製物を精製し、標題化合物（０．３２ｇ、５３％）を得た。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ２５６［Ｍ＋１］^＋。

実施例１：１−（２−｛４−［７−（２−クロロ−ピリジン−４−イル）−ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イル］ピリミジン−２−イルアミノ｝エチル）イミダゾリジン−２−オン

圧力容器中で、２−クロロ−４−［７−（２−クロロ−ピリジン−４−イル）−ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イル］−ピリミジン（９ｇ、２５．１ｍｍｏｌ）と２−（アミノエチル）−１，３−ジヒドロ−イミダゾール−オン（６．４ｇ、５０．２ｍｍｏｌ）とを、ｎ−ブタノール（２００ｍＬ）中で混合した。１２０℃で５時間、油浴中で混合液を加熱した。混合液をクロロホルム／イソプロパノール（３／１）で希釈した。飽和塩化ナトリウム水溶液で溶液を洗浄した。硫酸ナトリウム上でそれを乾燥させた。真空中で溶液を濃縮し、暗色残渣を得た。カラムクロマトグラフィ（ジクロロメタン〜１０％のメタノール／ジクロロメタン）で精製し、黄色の固体として標題化合物（９ｇ、９３％）を得た。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ４５１［Ｍ＋１］^＋。

適切な出発原料を使用して、１−（２−｛４−［７−（２−クロロ−ピリジン−４−イル）−ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イル］ピリミジン−２−イルアミノ｝−エチル）−イミダゾリジン−２−オンの調製に基本的に従い、以下の実施例を調製した。

実施例１２：１−（２−（５−クロロ−４−（７−（ピリジン−４−イル）ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）エチル）イミダゾリジン−２−オン

１−｛２−［４−（７−ブロモ−ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イル）−５−クロロ−ピリミジン−２−イルアミノ］−エチル｝−イミダゾリジン−２−オン（８１．６ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）、ピリジン−４−ホウ酸（３６．８ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）及び重炭酸ナトリウム（１８．１ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を、水（１ｍＬ）及びＤＭＳＯ（１ｍＬ）の混合液中で混合した。テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（１０．４ｍｇ、０．００９ｍｍｏｌ）を添加した。マグネチックスターラーで撹拌しながら、１５０℃で１５分間、混合液を放射線照射した。強力なカチオン交換（ＳＣＸ）（１０ｇ）カラム上に、粗反応混合液を注いだ。メタノール（４０ｍＬ）中に２Ｎアンモニアを含有する溶液で、所望の生成物を溶出し、減圧下で濃縮した。逆相クロマトグラフィ（３０〜９０％の勾配、８０ｍＬ／分で１１分間、３０×１００ｍｍ、５ｍｍ、Ｃ_１８ＭＳ Ｘｔｅｒｒａ（登録商標）カラム、溶媒Ａ：０．０１Ｍの重炭酸アンモニウム水溶液、溶媒Ｂ：アセトニトリル）で精製し、標題化合物（２０．４ｍｇ、２５．１％）を得た。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ４５１［Ｍ＋１］^＋。

実施例１３：１−（２−｛５−クロロ−４−［７−（５−クロロ−２−フルオロピリジン−４−イル）−ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イル］ピリミジン−２−イルアミノ｝エチル）イミダゾリジン−２−オン

マイクロ波バイアルにおいて、ＴＨＦ（３ｍＬ）及び水（１．５ｍＬ）中で、１−｛２−［４−（７−ブロモ−ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イル）−５−クロロ−ピリミジン−２−イルアミノ］−エチル｝−イミダゾリジン−２−オン（５００ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）、５−クロロ−２−フルオロピリジン−４−ホウ酸（５７８ｍｇ、３．３ｍｍｏｌ）、［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）とジクロロメタン（１：１）との錯体（９０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）、２−（ジ−ｔｅｒｔ−ブチルホスフィノ）ビフェニル（２０ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）及び炭酸ナトリウム（３５０ｍｇ、３．３ｍｍｏｌ）を混合した。混合液を５分間窒素でバブリングした。混合液を１００℃で１０分間加熱した。真空中で、有機層を濃縮して乾固させた。得られた固体をジクロロメタン／メタノール中でスラリー化し、カラムクロマトグラフィ（１％ ２Ｎアンモニア／メタノール溶液／ジクロロメタン〜１０％ ２Ｎアンモニア／メタノール溶液／ジクロロメタン）で精製し、標題化合物を得た。更なる精製のため、ＤＭＳＯ中に生成物を溶解させ、逆相カラムでクロマトグラフィ精製し（５０％アセトニトリル／水（０．０３％のＨＣｌを含有）〜９５％アセトニトリル／水（０．０３％のＨＣｌを含有））、標題化合物（１４６ｍｇ、２６％）を得た。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ５０３［Ｍ＋１］^＋。

適切な出発原料を使用して、１−（２−｛５−クロロ−４−［７−（５−クロロ−２−フルオロピリジン−４−イル）ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イル］−ピリミジン−２−イルアミノ｝エチル）イミダゾリジン−２−オンの調製に基本的に従い、以下の実施例を調製した。

実施例２４：４−（２−（２−（２−（２−オキソイミダゾリジン−１−イル）エチルアミノ）ピリミジン−４−イル）ベンゾ［ｂ］チオフェン−７−イル）ピコリノニトリル

１−（２−｛４−［７−（２−クロロ−ピリジン−４−イル）−ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イル］−ピリミジン−２−イルアミノ｝−エチル）−イミダゾリジン−２−オン（１００ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）、シアン化亜鉛（５１ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（１０ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）、１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）−フェロセン（６ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）を、ＤＭＳＯ（６ｍＬ）中で混合した。１００℃で４時間、混合液を加熱した。混合液を室温に冷却し、シリカカラム上へロードした。１０％メタノール／ジクロロメタンでカラムから溶出させ、黄色の油状物として標題化合物（０．７ｇ、７２％）を得た。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ４４２［Ｍ＋１］^＋。

実施例２５：１−（２−｛４−［７−（３−アミノ−ピリジン−４−イル）ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イル］−５−フルオロピリミジン−２−イルアミノ｝エチル）イミダゾリジン−２−オン

Ｎ−｛４−［２−（２−クロロ−５−フルオロ−ピリミジン−４−イル）−ベンゾ［ｂ］チオフェン−７−イル］−ピリジン−３−イル｝−２，２−ジメチル−プロピオンアミド（３３０ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）、２−（アミノエチル）−１，３−ジヒドロ−イミダゾロン（３８６ｍｇ、３．０ｍｍｏｌ）及び１，４−ジオキサン（６ｍＬ）を、キャップ付バイアル中で混合し、８５℃で４時間加熱した。真空中で濃縮した。ジクロロメタン及び水で混合液を希釈した。水で有機溶液を洗浄した。硫酸ナトリウム上で有機溶液を乾燥させた。濾過し、真空中で溶液を濃縮し、暗色残渣を得た。カラムクロマトグラフィ（ジクロロメタン〜７％のメタノール／ジクロロメタン）で精製し、Ｎ−［４−（２−｛５−フルオロ−２−［２−（２−オキソ−イミダゾリジン−１−イル）−エチルアミノ］−ピリミジン−４−イル｝−ベンゾ［ｂ］チオフェン−７−イル）−ピリジン−３−イル］−２，２−ジメチル−プロピオンアミドを得た。

４０ｍＬのセプタムキャップ付バイアル中に、中間体アミドを移した。マグネチックスターラーバーを加え、バイアルに水（２０ｍＬ）及び濃Ｈ_２ＳＯ_４（５ｍＬ）を添加した。油浴中で、９０℃で５時間バイアルを加温した。反応液を室温に冷却し、ＳＣＸ（１０ｇ）カラムを通過させた。水／メタノール（１：１）、次に１００％メタノール、次にジクロロメタン／メタノール（１：１）で溶出させ、最後に上記生成物をメタノール中１０％ ２Ｍアンモニア／９０％ジクロロメタンで溶出させた。真空中で濃縮した。シリカ（８０ｇ）上でクロマトグラフィを行い、０％〜１０％ ２Ｍのアンモニア／メタノール溶液／ジクロロメタンの勾配で溶出させた。４２℃で２時間、真空オーブン中で乾燥させ、金色の固体として標題化合物（１９２．６ｍｇ、４８％）を得た。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ４５０［Ｍ＋１］^＋。

適切な出発原料を使用して、１−（２−｛４−［７−（３−アミノ−ピリジン−４−イル）ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イル］−５−フルオロピリミジン−２−イルアミノ｝−エチル）イミダゾリジン−２−オンの調製に基本的に従い、以下の実施例を調製した。

実施例２９：１−（２−｛４−［７−（５−アミノ−２−フルオロピリジン−４−イル）ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イル］ピリミジン−２−イルアミノ｝エチル）イミダゾリジン−２−オン

｛４−［２−（２−クロロ−ピリミジン−４−イル）−ベンゾ［ｂ］チオフェン−７−イル］−６−フルオロ−ピリジン−３−イル｝−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（８１３ｍｇ、１．７７ｍｍｏｌ）、２−（アミノエチル）−１，３−ジヒドロ−イミダゾール−オン（９１９ｍｇ、７．１１ｍｍｏｌ）及び１，４−ジオキサン（２２ｍＬ）を、キャップ付バイアル中で混合し、７０℃で１５時間加熱した。真空中で濃縮した。ジクロロメタン及び水で混合液を希釈した。水で有機溶液を洗浄した。硫酸ナトリウム上で有機溶液を乾燥させた。濾過し、真空中で溶液を濃縮し、暗色残渣を得た。カラムクロマトグラフィ（ジクロロメタン〜酢酸エチル）で精製し、［６−フルオロ−４−（２−｛２−［２−（２−オキソ−イミダゾリジン−１−イル）−エチルアミノ］−ピリミジン−４−イル｝−ベンゾ［ｂ］チオフェン−７−イル）−ピリジン−３−イル］−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを得た。

［６−フルオロ−４−（２−｛２−［２−（２−オキソ−イミダゾリジン−１−イル）−エチルアミノ］−ピリミジン−４−イル｝−ベンゾ［ｂ］チオフェン−７−イル）−ピリジン−３−イル］−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルをジクロロメタン中に溶解させ、真空中で濃縮し、シリカゲル（１０ｇ）上へ吸着させた。高真空下で２４時間乾燥させた。丸底フラスコ中にシリカゲルを入れ、高真空下で２時間、温度制御された油浴中で９８〜９９℃に加熱した。室温に冷却した。１０％ ７Ｎアンモニア／メタノール／９０％のジクロロメタンにより、シリカゲルから生成物を抽出した。真空中で濃縮した。シリカ上でクロマトグラフィを行い、１００％ジクロロメタン〜７％ ２Ｎアンモニア／メタノール／９３％ジクロロメタンの勾配によって溶出させ、標題化合物（６５．２ｍｇ、８．２％）を得た。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ４５０［Ｍ＋１］^＋。

実施例３０：１−（２−｛４−［７−（３−アミノ−２−フルオロピリジン−４−イル）ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イル］ピリミジン−２−イルアミノ｝エチル）イミダゾリジン−２−オン

適切な出発原料を使用して、１−（２−｛４−［７−（５−アミノ−２−フルオロ−ピリジン−４−イル）−ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イル］−ピリミジン−２−イルアミノ｝−エチル）−イミダゾリジン−２−オンの調製に基本的に従い、標題化合物を調製した。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ４５０［Ｍ＋１］^＋。

実施例３１：１−（２−｛５−フルオロ−４−［７−（２−フルオロ−５−ヒドロキシメチル−ピリジン−４−イル）ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イル］ピリミジン−２−イルアミノ｝エチル）イミダゾリジン−２−オン

圧力反応チューブ内の５ｍＬのジオキサン中で、１−（２−｛５−フルオロ−４−［７−（４，４，５，５−テトラメチル−［１，３，２］ジオキサボラン−２−イル）−ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イル］−ピリミジン−２−イルアミノ｝−エチル）−イミダゾリジン−２−オン（１２０ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）、（６−フルオロ−４−ヨード−ピリジン−３−イル）−メタノール（１００ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）、（１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン）パラジウム（ＩＩ）塩化物（１０．１４ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）、２−（ジ−ｔｅｒｔ−ブチルホスフィノ）ビフェニル（２ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）及び炭酸ナトリウム（２Ｍ、０．２ｍＬ、０．４ｍｍｏｌ）を混合した。油浴中で、１００℃で一晩、混合液を加熱した。混合液を室温に冷却し、クロロホルム−イソプロピルアルコール（３／１）で希釈した。飽和塩化ナトリウム水溶液で有機相を洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮し、油状の残渣を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィ（１０％のメタノール／ジクロロメタン）で粗製物を精製し、標題化合物（２５ｍｇ、２１％）を得た。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ４８３［Ｍ＋１］^＋。

実施例３２：１−（２−｛５−フルオロ−４−［７−（２−フルオロ−５−（フルオロメチル）ピリジン−４−イル）ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イル］ピリミジン−２−イルアミノ｝エチル）イミダゾリジン−２−オン

密封された圧力反応チューブ内の５ｍＬのジオキサン中で、１−（２−｛５−フルオロ−４−［７−（４，４，５，５−テトラメチル−［１，３，２］ジオキサボラン−２−イル）−ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イル］−ピリミジン−２−イルアミノ｝−エチル）−イミダゾリジン−２−オン（１２０ｍｇ、２４８．２６μｍｏｌ）、２−フルオロ−５−フルオロメチル−４−ヨード−ピリジン（１００ｍｇ、３９２．１５μｍｏｌ）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（１１．３７ｍｇ、１２．４１μｍｏｌ）、トリシクロヘキシルホスフィン（２．０９ｍｇ、７．４５μｍｏｌ）、リン酸カリウム（１０５．３９ｍｇ、４９６．５１μｍｏｌ）を混合した。油浴中で、１００℃で３時間、混合液を加熱した。ＬＣ−ＭＳは４８５でピークを示した。反応混合液を室温に冷却し、クロロホルム−イソプロピルアルコール（３／１）で希釈した。飽和塩化ナトリウム水溶液で有機溶液を洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮し、粗製物を得た。フラッシュクロマトグラフィ（１０％のメタノール／ジクロロメタン）で粗製物を精製し、標的生成物（７０ｍｇ、５８．２％）を得た。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ４８５［Ｍ＋１］^＋。

アッセイ：
Ｐｌｋ１は、多くのヒトの腫瘍、例えば肺非小細胞癌、食道癌、口咽頭癌、胃癌、黒色腫、皮膚扁平上皮癌、胸部癌、卵巣癌、子宮内膜癌、結腸直腸癌、神経膠腫、神経膠芽腫、甲状腺癌、頸部癌、膵臓癌、前立腺癌、肝芽腫及び非ホジキンリンパ腫において過剰に発現することが示されている。更に、Ｐｌｋ１発現は、肺非小細胞癌、食道癌、口咽頭癌、黒色腫、結腸直腸癌、肝芽腫及び非ホジキンリンパ腫の予後において重要な意味を有する（Ｓｔｒｅｂｈａｒｄｔ，Ｋ及びＡ．Ｕｌｌｒｉｃｈ（２００６）．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ ６（４）：３２１−３０）。Ｐｌｋ１でリン酸化された基質は、中心体の成熟、有糸分裂の開始、姉妹染色分体分離及び細胞質分裂を調整することにより、有糸分裂の進行を調整する（Ｅｃｋｅｒｄｔ及びＳｔｒｅｂｈａｒｄｔ ２００６、Ｓｔｒｅｂｈａｒｄｔ及びＵｌｌｒｉｃｈ ２００６、ｖａｎ ｄｅ Ｗｅｅｒｄｔ，Ｂ．Ｃ．及びＲ．Ｈ．Ｍｅｄｅｍａ（２００６）．Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ５（８）：８５３−６４）。抗体注入、ドミナントネガティブなＰｌｋ１の発現、及びアンチセンスｍＲＮＡによる抑制を使用したＰｌｋ１機能の阻害により、単極のスピンドルの生成及び有糸分裂後期の停止が生じ、それにより、腫瘍細胞系では有糸分裂細胞死に至るが、通常の形質転換されない初代細胞系では可逆的なＧ２停止が生じる。

更に、Ｐｌｋがラブドイド腫瘍の治療において有用であることが報告されている（Ｍｏｒｏｚｏｖ Ａ．ら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．１３（１６）：４７２１−３０，（Ａｕｇ１５，２００７））。

ＢＩ−２５３６は、ＨＣＴ１１６、Ａ５４９及びＮＣＩＨ４６０ネズミ異種移植片を使用した前臨床モデルにおいて、活性を示すことが報告されている（Ｂａｕｍ，Ａ．，Ｐ．Ｇａｒｉｎ−Ｃｈｅｓａら、（２００６）．＃Ｃ１９１ Ｉｎ ｖｉｖｏ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＢＩ ２５３６，ａ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｔｏｔｉｃ ｋｉｎａｓｅ ＰＬＫ１，ｉｎ ａ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ．ＡＡＣＲ−ＮＣＩ−ＥＯＲＴＣ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔａｒｇｅｔｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”，Ｐｈｉｌｉｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）。

以下のアッセイの結果から、本発明の化合物が抗癌剤として有用であることが証拠される。

Ｐｌｋ１の発現及び精製：
ヒトＰｌｋ１ ｃＤＮＡ（Ｉｎｃｙｔｅ（アクセス番号：ＮＭ＿００５０３０）など、多くの給源から得られる）を、その１つの末端において、Ｈｉｓ_６タグ（例えばＣ末端ＦＬＡＧ−Ｈｉｓ_６タグ）を発現するポリヌクレオチド配列と直接連結し、適切な発現ベクター（例えばｐＦａｓｔＢａｃ（商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社））に挿入し、適切な系（例えばｘＰｌｋｋ１の場合、Ｙｕｅ−Ｗｅｉ Ｑｉａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２，１７０１（１９９８）により報告されたのと同様のバキュロウイルス）にトランスフェクションすることができる。ウイルス発現システムを用いる場合、ウイルス（例えばＰｌｋ１−Ｆｌａｇ−Ｈｉｓ_６タグポリヌクレオチド構築物を担持するバキュロウイルス）を、培養した適切な宿主細胞（例えばＳｆ９細胞）に感染させる。Ｐｌｋ１−Ｆｌａｇ−Ｈｉｓ_６タグ融合タンパク質の充分量が発現したとき（例えば感染後約４６時間）には、培養組織を充分な時間（例えば３時間）オカダ酸（０．１μＭ）で処理するべきである。Ｐｌｋ１−Ｆｌａｇ−Ｈｉｓ_６タグ融合タンパク質は、金属親和性樹脂（例えばＴＡＬＯＮ（商標）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｃａｔａｌｏｇ＃ ６３５５０３）を使用して、公知の方法で、細胞ペレットから精製する。精製したＰｌｋ１−Ｆｌａｇ−Ｈｉｓ_６タグ融合タンパク質を、使用直前まで、少量を含むアリコートとして、−８０℃で、適切な溶媒（例えば１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１０％のグリセロール（ｐＨ７．５））中に保存する。精製したＰｌｋ１−Ｆｌａｇ−Ｈｉｓ_６タグ融合タンパク質の同定を、ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化法）により確認する。

ＧＳＴ−Ｃｄｃ２５Ｃ（１−２０６）の発現及び精製：
ヒトＣｄｃ２５Ｃ ｃＤＮＡ（Ｉｎｃｙｔｅ（登録番号：ＡＹ４９７４７４）など、あらゆる適切な給源から得られる）を、あらゆる簡便な発現系において発現させることができ、その後、Ｂｉｎ Ｏｕｙａｎｇら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１８，６０２９−６０３６（１９９９）に記載の方法と同様の公知の方法で精製できる。１つの便利な系では、ヒトＣｄｓ２５ＣのｃＤＮＡが導入されたｐＧＥＸ−２Ｔベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）で形質転換した大腸菌ＢＬ２１を１８℃で一晩増殖させ、１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを使用して発現を誘導させることを行う。発現されたＧＳＴ−Ｃｄｃ２５Ｃ（１−２０６）（Ｐｌｋ１の基質）を、グルタチオンセファロース（登録商標）４Ｂで精製し、少ない量のアリコートとして、適切な溶液（例えば１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５））中で−８０℃で保存することができる。

Ｐｌｋ１阻害アッセイ：
Ｐｌｋ１キナーゼ反応液は、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）、１．０ｍＭのジチオスレイトール、５．０μＭのＡＴＰ、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．０１％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、０．４μＣｉの^３３Ｐ−ＡＴＰ及び０．０６μｇ／μＬのＧＳＴ−Ｃｄｃ２５ｃ（１−２０６）ペプチドを含むバッファ中に、Ｐｌｋ１−Ｆｌａｇ−Ｈｉｓ_６タグ融合酵素（０．２ｎｇ／μＬ）を含有する。化合物を、ＤＭＳＯ中の１０ｍＭのストックとして調製する。化合物を、２０％のＤＭＳＯで１：３で連続的に希釈して１０点からなる濃度反応曲線を作成し、その後反応混合液で１：５で希釈し（４％の最終ＤＭＳＯ濃度中、２０μＭ〜０．００１μＭの最終濃度）、化合物の活性を測定する。室温で６０分間反応を実施し、次に１０．０％のＨ_３ＰＯ_４を６０μＬ添加してクエンチする。１０．０％のＨ_３ＰＯ_４ ３０μＬで事前に湿らせた９６ウェルホスホセルロースフィルタープレートに、反応混合液（８５μＬ）を移し、室温で２０〜３０分間インキュベートし、次に０．５％のＨ_３ＰＯ_４で３回洗浄する。ウェルを乾燥させ、その後ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ（商標）２０（Ｐａｃｋａｒｄ社）を４０μＬ添加し、次にＷａｌｌａｃ ＭＩＣＲＯＢＥＴＡ（登録商標）Ｊｅｔで計測する。それを基に、１０点における濃度反応データからの阻害値（％）を、例えば４−パラメータロジスティック方程式により、ＡＣＴＩＶＩＴＹ ＢＡＳＥ（商標）ソフトウェア（ＩＤＢＳ）を使用して分析する。得られる曲線に代入し、ＩＣ_５０絶対値を算出する。例示される全ての化合物は、３．６の最小有意比（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｒａｔｉｏ（ＭＳＲ））で、１００ｎＭ未満のＩＣ_５０を示す。例えば、実施例１３は約２３ｎＭのＩＣ_５０を示す。

ｐＨＨ３（Ｓ１０）、有糸分裂細胞及びＤＮＡ含量のアッセイ：
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手したＨｅＬａ細胞を、９６ウェルのＢｅｃｋｍａｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＢＩＯＣＯＡＴ（商標）プレート上に、２００細胞／ウェルで播き、３７℃、５％のＣＯ_２条件で２４時間、１０％のＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含有するＭＥＭ（最小必須培地（例えばＧＩＢＣＯ社、カタログ＃１１０９５））中でインキュベートする。１０点の、０．５μＭ〜０．００９８μＭの投与量範囲にわたる化合物（０．２５％のＤＭＳＯ中）を培地に添加し、細胞を処理する。２３時間化合物に曝露した後、細胞を固定（例えばＰＲＥＦＥＲ（商標）固定化剤［Ａｎａｔｅｃｈ ＬＴＤ．社、カタログ＃４１４］で３０分間処理）し、次にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の０．１％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ１００で１５分間浸透化させる。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次に５０μｇ／ｍＬ ＲＮＡｓｅで消化する。１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳで１：５００希釈した、一次抗体であるホスホヒストンＨ３（Ｕｐｓｔａｔｅ社、Ｃａｔ＃０６−５７０）を細胞に添加し、４℃で一晩インキュベートする。ＰＢＳで３回洗浄した後、室温で１時間、Ａｌｅｘａ４８８で標識した二次的抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ＃Ａ１１００８）で細胞をインキュベートする。再びＰＢＳで３回洗浄し、次に１５μＭのヨウ化プロピジウム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社、カタログ＃Ｐ３５６６）を添加し、３０分間核を染色する。蛍光プレートをＡＣＵＭＥＮ ＥＸＰＬＯＲＥＲ（商標）［レーザースキャン蛍光マイクロプレートサイトメーター（４８８ｎｍのアルゴンイオンレーザによる励起、及び複数の光電子倍増管による検出を含む）（ＴＴＰ ＬＡＢＴＥＣＨ ＬＴＤ製）］でスキャンし、ホスホヒストンＨ３、ＤＮＡ含量及び有糸分裂細胞を測定する（ＤＮＡの凝集として測定する）。画像分析は、細胞からの蛍光シグナルに基づき、異なる部分集団から細胞を同定することにより行う。ｐＨＨ３（Ｓ１０）陽性細胞は、閾値を上回る５００〜５３０ｎｍの平均強度により同定される。ヨウ化プロピジウム／ＤＮＡからの６５５〜７０５ｎｍの総強度を用いて、個別の細胞（２Ｎ〜４ＮのＤＮＡ含量の細胞）及び細胞周期にある部分集団（２Ｎ細胞、４Ｎ細胞）を同定する。５７５〜６４０ｎｍのピークの強度を用いて、ほぼ４Ｎの状態の細胞の有糸分裂を同定するための標識として用いられるＤＮＡ凝集を同定する。アッセイ結果を、各同定された部分集団のパーセンテージ、ｐＨＨ３（％）、２Ｎ（％）、４Ｎ（％）、有糸分裂（％）及び総細胞数として算出する。ＥＣ_５０を、ＡＣＴＩＶＩＴＹ ＢＡＳＥ（商標）を使用して、結果ごとに４パラメータロジスティック曲線に代入して決定する。ＰＨＨ３（ｓ１０）、ＤＮＡ含量及び有糸分裂において得られたＥＣ_５０は、各々２．６、２．４及び２．５のＭＳＲを示す。例えば実施例１３は、ｐＨＨ３（ｓ１０）ＥＣ_５０＝４２ｎＭ（ｎ＝２）、ＤＮＡ含量ＥＣ_５０＝４０ｎＭ（ｎ＝２）、及び有糸分裂ＥＣ_５０＝４５ｎＭ（ｎ＝１）を示す。

抗増殖アッセイ：
細胞増殖に対する化合物の効果は、当該技術分野で公知の細胞及び細胞増殖法を使用して測定できる（Ｒｏｂｅｒｔ Ｃ．Ｓｑｕａｔｒｉｔｏら，Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，５８，１０１−１０５，（１９９５））。例えば、ＨＣＴ１１６細胞（ＡＴＣＣから入手できる）を、９６ウェルプレート中に〜２０００細胞／ウェルで播き、３７℃の湿潤ＣＯ_２インキュベータ内で一晩かけて付着させることができる。２０〜２４時間インキュベートした後、半対数的に連続的に希釈した化合物を添加し、プレートをインキュベータに戻す。適切な時間（例えば７２時間）曝露した後、周知の方法を使用して細胞増殖を推定する。１つの方法においては、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（商標）などのテトラゾリウム塩を１０μＬ、細胞プレートに添加する。適切な時間色素へ曝露した後、蛍光（５３０ｎｍの励起、５８０ｎｍの放出）を測定する。得られるＩＣ_５０は３．１のＭＳＲである。例えば実施例１３は１１ｎＭ（ｎ＝３）のＩＣ_５０を示す。

本発明の化合物は好ましくは、様々な経路で投与される医薬組成物として製剤化される。最も好ましくは、かかる組成物は経口投与用である。かかる医薬組成物及びその調製方法は公知技術である。ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ：ＴＨＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＹ（Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏら編，１９^ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，１９９５）を参照のこと。

式Ｉの化合物は通常、広い投与量範囲において効果的である。例えば、１日あたりの投与量は通常、約０．０１〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重（好ましくは０．１〜２０ｍｇ／ｋｇの体重）の範囲である。若干の例においては、上記の範囲の下限値以下の投与量レベルでも十分過ぎる効果を示すこともあり、他の場合には、より多くの投与量を用いても有害な副作用を起こさないこともあるため、上記の投与量範囲は、いかなる形であれ本発明の範囲を限定するものではない。化合物の実際の投与量は、治療しようとする症状、選択された投与経路、実際に投与される１つ以上の化合物、個々の患者の年齢、体重及び反応、並びに患者の症状の重篤度などの関連する状況を考慮し、医師により決定されることが理解されよう。

Claims (3)

1. 次式の化合物：
   

   

   （式中、Ｒ^１は水素、ヒドロキシ基、ヒドロキシメチル基、ハロ基、メチル基、フルオロメチル基、Ｃ_１−Ｃ_２アルコキシ基、アミノ基又はメチルアミノ基であり、
   Ｒ^２は水素、ハロ基又はシアノ基であり、
   Ｒ^３は水素又はハロ基であり、
   但しＲ^１、Ｒ^２及びＲ^３のうちの少なくとも１つが水素であり、
   Ｒ^４は水素、ハロ基又はメチル基である）、
   又はその薬理学的に許容できる塩。
2. 薬理学的に許容できる担体、希釈剤又は賦形剤との組み合わせで、請求項１の化合物又はその薬理学的に許容できる塩を含んでなる医薬組成物。
3. 肺非小細胞癌、食道癌、口咽頭癌、胃癌、黒色腫、皮膚扁平上皮癌、胸部癌、卵巣癌、子宮内膜癌、結腸直腸癌、神経膠腫、神経膠芽腫、甲状腺癌、頸部癌、膵臓癌、前立腺癌、肝芽腫及び非ホジキンリンパ腫からなる群から選択される癌を治療するための、請求項１の化合物又はその薬理学的に許容される塩を含んでなる医薬組成物。