EA016177B1

EA016177B1 - Соединения имидазолидинониламинопиримидина для лечения рака

Info

Publication number: EA016177B1
Application number: EA200970615A
Authority: EA
Inventors: Хун-Юй Ли; Харольд Бернс Брукс; Джойс З. Крич; Джеймс Роберт Генри; Мелисса Кейт Слейтер; Янь Ван
Original assignee: Эли Лилли Энд Компани
Priority date: 2006-12-21
Filing date: 2007-12-11
Publication date: 2012-02-28
Also published as: KR101088291B1; CA2671738A1; AU2007334039B2; AU2007334039A1; BRPI0721045A2; US8101628B2; WO2008076704A1; MX2009006634A; ATE479680T1; JP5166441B2; CN101563342B; JP2010513552A; CN101563342A; EA200970615A1; ES2349169T3; EP2125793A1; EP2125793B1; KR20090086114A; US20100076001A1; DE602007008952D1

Abstract

Настоящее изобретение обеспечивает новые соединения имидазолидинониламинопиримидина, которые, как предполагают, можно применять в клинике для лечения рака посредством ингибирования Plk1, где R- водород, гидрокси, галоген, метил, C-Салкокси, амино или метиламино; R- водород, галоген или циано; R- водород или галоген; R- водород, галоген или метил; при условии, что по меньшей мере два из R, R, Rи Rявляются водородами; R- водород, галоген или метил, или фармацевтически приемлемые соли.

Description

Р1к1 принадлежит к небольшому семейству протеинкиназ, характеризующихся связывающим фосфосерин/треонин доменом, известным как домен ро1о Ьох. Р1к1 играет ключевую роль в регуляции клеточного цикла. Предполагают, что помимо других функций Р1к1 регулирует инициацию, прохождение и завершение митоза - стадии, на которой происходит деление раковых клеток. Следовательно, блокирование Р1к1 в раковых клетках предотвращает их деление или митоз.

Были обнаружены эффективные агенты, такие как алкалоиды барвинка (ΝΑνΕΕΒΙΝΕ®), таксоиды (ТАХОТЕКЕ®) и ингибиторы топоизомеразы II (ΑΏΚΙΑΜΥΟΙΝ®), которые препятствуют митозу. νΕΕΟΑΏΕ® является противоопухолевым препаратом, который ингибирует протеосому 268. Однако эти лекарственные средства вызывают значительные побочные эффекты в нормальных неделящихся клетках. Ингибиторы Р1к действуют направленно на делящиеся клетки, что может позволить избежать нежелательной токсичности.

Ингибиторы Р1к1 известны в данной области техники. См., например, ^О 06/066172. Далее в ^О 06/021548 раскрыты определенные аналоги дигидроптеридинона (например, ΒΙ-2536) в качестве ингибиторов Р1к1. В настоящее время ΒΙ-2536 находится на второй фазе клинических испытаний, но имеет высокий клиренс (СБ>1000 мл/мин), и его доза для человека ограничена миелосупрессией. До настоящего времени существует потребность в других соединениях, которые ингибируют Р1к1 и обладают повышенной эффективностью или фармакокинетическими свойствами. Также желательно было бы получить ингибитор Р1к1, подходящий для перорального введения.

Настоящее изобретение обеспечивает новые соединения имидазолидинониламинопиримидина, которые, как предполагают, можно будет применять в клинике для лечения рака посредством ингибирования Р1к1. Считают, что некоторые из этих соединений обладают повышенной эффективностью по сравнению с соединениями, раскрытыми в ^О 06/066172. Кроме того, предполагают, что некоторые из этих соединений обладают улучшенными фармакокинетическими свойствами по сравнению с ΒΙ-2536. Дополнительно, благодаря тому что соединения согласно настоящему изобретению обладают биодоступностью при пероральном введении, предполагают, что некоторые из этих соединений можно вводить перорально.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает соединения формулы Ι

Формула I где К¹ представляет собой водород, гидрокси, гидроксиметил, галоген, метил, фторметил, С1-С₂алкокси, амино или метиламино;

К² представляет собой водород, галоген или циано;

К³ представляет собой водород или галоген;

при условии, что по меньшей мере один из К¹, К² и К³ представляет собой водород; и

К⁴ представляет собой водород, галоген или метил; или фармацевтически приемлемые соли указанных соединений.

Настоящее изобретение обеспечивает способ лечения ракового заболевания, выбранного из группы, состоящей из немелкоклеточного рака легких, рака полости рта и глотки, рака пищевода, рака желудка, меланомы, плоскоклеточного (эпидермоидного) рака кожи, рака молочной железы, рака яичника, рака эндометрия, рака прямой и толстой кишки, нейроглиомы, глиобластомы, карциномы щитовидной железы, рака шейки матки, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, гепатобластомы и неходжкинских лимфом, у млекопитающего, включающий введение нуждающемуся в этом млекопитающему эффективного количества соединения формулы Ι или фармацевтически приемлемой соли такого соединения.

Настоящее изобретение также обеспечивает фармацевтическую композицию, включающую соединение формулы Ι или фармацевтически приемлемую соль указанного соединения, в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, растворителем или наполнителем.

Настоящее изобретение обеспечивает также соединение формулы Ι или фармацевтически приемлемую соль указанного соединения для применения в изготовлении лекарственного средства. Дополнительно изобретение обеспечивает соединение формулы Ι или фармацевтически приемлемую соль такого соединения для применения в изготовлении лекарственного средства для лечения ракового заболевания, выбранного из группы, состоящей из немелкоклеточного рака легких, рака полости рта и глотки, рака

- 1 016177 пищевода, рака желудка, меланомы, плоскоклеточного (эпидермоидного) рака кожи, рака молочной железы, рака яичника, рака эндометрия, рака прямой и толстой кишки, нейроглиомы, глиобластомы, карциномы щитовидной железы, рака шейки матки, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, гепатобластомы и неходжкинских лимфом, у млекопитающего. Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, предназначенную для лечения ракового заболевания, выбранного из группы, состоящей из немелкоклеточного рака легких, рака полости рта и глотки, рака пищевода, рака желудка, меланомы, плоскоклеточного (эпидермоидного) рака кожи, рака молочной железы, рака яичника, рака эндометрия, рака прямой и толстой кишки, нейроглиомы, глиобластомы, карциномы щитовидной железы, рака шейки матки, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, гепатобластомы и неходжкинских лимфом, у млекопитающего и включающую соединение формулы I или фармацевтически приемлемую соль такого соединения в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, растворителем или наполнителем.

Настоящее изобретение также обеспечивает соединения формулы

где К¹ представляет собой водород, гидрокси, галоген, метил, С1-С₂алкокси, амино или метиламино;

К³ представляет собой водород или галоген;

К⁴ представляет собой водород, галоген или метил;

при условии, что по меньшей мере два из К¹, К², К³ и К⁴ представляют собой водород;

К⁵ представляет собой водород, галоген или метил; или фармацевтически приемлемую соль указанного соединения.

Подробное описание изобретения

Общие химические термины, используемые в формулах выше, имеют свои обычные значения. Например, термин (С₁-С₂)алкокси означает метокси и этокси. Термин галоген означает фтор, хлор, бром и йод.

Для специалиста в данной области очевидно, что большинство или все соединения согласно настоящему изобретению могут образовывать соли. Соединения согласно настоящему изобретению являются аминами и, соответственно, реагируют с любыми из множества неорганических и органических кислот с образованием фармацевтически приемлемых солей присоединения кислот. Такие фармацевтически приемлемые соли присоединения кислот и общая методология для их получения хорошо известны в данной области. См., например, Р. 81аЫ, е! а1., ΗΑΝΌΒΟΟΚ ОТ РНАКМАСЕиТ1САЬ 8ЛЬТ8: РКОРЕКТ1Е8, 8Ε1.Ε(ΊΊΟΝ ΑΝΌ ϋ8Ε (УСНЛЖйеу-УСН, 2002); 8.М. Вегде, е! а1., РИагшасеийса1 8а11з, Фоигпа1 о£ РИагшасеийса1 8с1епсез, Уо1. 66, Νο. 1, Фапиагу, 1977.

Предпочтительными являются соединения формулы I, где

a) К¹ представляет собой водород или метил;

b) К² представляет собой 'водород или галоген;

c) К³ представляет собой водород или галоген;

Ф) К⁴ представляет собой галоген;

е) К⁴ представляет собой метил;

ί) К⁴ представляет собой водород;

д) К¹ представляет собой водород, К² представляет собой хлор, К³ представляет собой водород, и К⁴представляет собой водород;

И) К¹ представляет собой метил, К² представляет собой водород, К³ представляет собой фтор, и К⁴представляет собой фтор; и

ί) К¹ представляет собой метил, К² представляет собой водород, К³ представляет собой фтор, и К⁴представляет собой метил.

Схемы

Специалисту в данной области понятно, что не все заместители в соединениях настоящего изобретения будут устойчивы к определенным условиям реакции, применяемым для синтеза соединений. Эти группы можно вводить на подходящем этапе синтеза или их можно защищать с последующим снятием защитных групп, если это необходимо или желательно. Специалисту в данной области понятно, что защитную группу можно удалить на любой удобной стадии синтеза соединений согласно настоящему изо

- 2 016177 бретению. Способы введения и удаления защитных групп для азота и кислорода хорошо известны в данной области: см., например, Сгеепе апй \и!з, Рго1есйуе Огоирз ίη Огцашс 8уп1Нез1з, 3'¹¹ Εά., ,ΙοΙιη \\31еу апй 8опз, Ке\\^; Уогк, СНарБег 7 (1999). Кроме того, специалисту в данной области понятно, что во многих случаях порядок, в котором вводят группы, не является критичным. Конкретный порядок необходимых для получения соединений согласно настоящему изобретению стадий может зависеть от конкретного синтезируемого соединения, исходного соединения и относительной лабильности заместителей.

Соединения согласно настоящему изобретению можно получить путем осуществления по меньшей мере двух описанных ниже вариантов. В схемах ниже все заместители, если не указано иное, совпадают с определенными ранее, а подходящие реагенты хорошо известны и признаны в данной области. На схеме 2 Υ представляет собой галоген, а Ζ представляет собой бороновую кислоту.

Схема 1

Соединения формулы (1) подвергают взаимодействию с 2-(аминоэтил)-1,3-дигидроимидазолоном (2) с образованием соединение формулы (5) в реакции нуклеофильного замещения. Такие реакции проводят в подходящем растворителе, таком как н-бутанол, диоксан, н-метилпиролидин-2-он (НМЛ) и тому подобное. Обычно реакции проводят при температурах примерно от 120 до 150°С с использованием масляной бани или микроволнового реактора. Типичная стехиометрия для этой реакции основана на использовании соединения формулы (3) и примерно 2 экв. 2-(аминоэтил)-1,3-дигидроимидазолона. Можно использовать аминные основания, такие как триэтиламин, диизопропилэтиламин и тому подобное.

Схема 2

(3} й) (Я

Соединение формулы (3) подвергают взаимодействию с соединением формулы (4) в реакции Сузуки с использованием пригодного палладиевого катализатора, такого как тетракис(трифенилфосфин)палладия(0), [1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорпалладия(11) или подобный, в присутствии основания, такого как карбонат натрия, карбонат калия или подобный. Такие реакции проводят в подходящем растворителе, таком как ТГФ, диоксан, вода и тому подобное. Обычно реакции проводят при температурах примерно от 100 до 150°С с использованием масляной бани или микроволнового реактора.

В случае необходимости получают фармацевтически приемлемую соль соединения согласно настоящему изобретению. Образование таких солей хорошо известно и принято в данной области техники.

Понятно, что соединения формул (1) и (3) легко можно получить способами, подобными описанным выше процедурам, которые хорошо известны и общеприняты в данной области техники. Например, соединения формулы (1) получают путем осуществления связывания необязательно замещенного соединения пиридинила с необязательно замещенным соединением бензотиофенила по методу связывания Сузуки, как было описано выше. Полученный аддукт Сузуки боронилируют хорошо известными в данной области методами и затем подвергают реакции связывания с необязательно замещенным галогенидом по методу связывания Сузуки, как было описано выше. Соединения формулы (3) получают путем боронилирования необязательно замещенного соединения бензотиофенила хорошо известными в данной области методами с последующим добавлением 2-(аминоэтил)-1,3-дигидроимидазолона (2) к полученной бороновой кислоте/эфиру по механизму ароматического нуклеофильного замещения. Также следует понимать, что необходимые для получения соединений формулы (1) или (3) стадии можно выполнять в любом порядке, включая осуществление реакции фрагмента соединения формулы (1) или (3) с соединением формулы (2) и/или формулы (4), таким образом, чтобы осуществляемые позже связывание углеродуглеродными связями, реакция связывания и тому подобное обеспечили получение соединения согласно настоящему изобретению.

Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими примерами соединений и

- 3 016177 синтеза. Эти примеры соединений и синтеза являются только иллюстрацией и никоим образом не ограничивают изобретение. Используемые в примерах и вариантах получения термины имеют обычные значения, если не указано иное. Названия соединениям из приведенных ниже примеров присваивали с использованием С11стЭга\\·®. Усгбоп 10.

Получение 1. 2-Бензо[Ь]тиофен-7-ил-4.4.5.5-тетраметил[1,3.2]диоксаборолан.

В колбе соединяли 7-бромбензо[Ь]тиофен (426 мг. 2 мМ). бис(пинаколато)дибор (756 мг. 3 мМ). комплекс [1.1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорпалладия(11) с дихлорметаном (1:1) (81 мг. 0.1 мМ) и ацетат калия (294 мг. 3 мМ) в диметилсульфоксиде (ДМСО) (10 мл). Через смесь в течение 5 мин пропускали азот. Колбу закрывали и нагревали на масляной бане при 100°С в течение 4 ч. Смесь разбавляли хлороформом/изопропанолом (3/1). Раствор промывали насыщенным водным хлоридом натрия. Раствор сушили над сульфатом натрия. Раствор концентрировали в вакууме. в результате получали темный остаток. Очищали путем колоночной хроматографии (от гексана до 20% этилацетата в гексане). в результате получали указанное соединение (342 мг. 66%) в форме бесцветного твердого вещества.

М3 (Е8) т/ζ 261 [М+1]⁺.

Пример синтеза 2. Бензо[Ь]тиофен-7-бороновая кислота.

В колбе Мортона на 12 л. снабженной механической мешалкой. соединяли 7-бромбензо[Ь]тиофен (300 г. 1.41 мМ) и триизопропилборат (403.6 г. 2.15 мМ) в безводном тетрагидрофуране (ТГФ) (4000 мл) и охлаждали смесь в атмосфере азота в ванне со смесью сухой лед/ацетон до -70°С. По каплям добавляли н-бутиллитий (1.6 М в гексане. 714 г. 1.68 мМ) с такой скоростью. чтобы внутренняя температура смеси не поднималась выше -67.5°С. После завершения добавления реакционную смесь оставляли перемешиваться при этой температуре в течение 1 ч. Охлаждающую ванну удаляли и медленно добавляли 4 л воды. Добавляли концентрированную НС1 (75 мл) до достижения рН раствора примерно равного 2. Смесь оставляли для перемешивания в течение 1 ч. Добавляли достаточное количество 5Ν водного ΝαΟΗ и доводили рН смеси примерно до рН 12. Фракции разделяли и сохраняли водную фракцию. Органическую фракцию разбавляли 4 л метил-трет-бутилового эфира и экстрагировали 1 л 5Ν водного ΝαΟΗ. Фракции разделяли. Водную фракцию соединяли с полученным ранее водным экстрактом. Водную фракцию промывали дополнительным количеством метил-трет-бутилового эфира (4 л). Фракции разделяли и переносили водные фракции в 3-горлую круглодонную колбу на 12 л. оснащенную механической мешалкой. Раствор охлаждали до +5°С в ледяной ванне. Медленно добавляли концентрированную НС1 до тех пор. пока рН раствора не достигал примерно рН 2. Смесь перемешивали в течение 30 мин и отфильтровывали полученное твердое вещество. Твердое вещество дважды промывали на воронке 2 л воды и оставляли сушиться на воздухе в течение 30 мин. Вещество помещали в вакуумную печь при 50°С и сушили в вакууме в течение ночи. Желтый цвет убирали путем суспендирования сухого твердого вещества в 2 л нгептана в течение 30 мин. Снова отфильтровывали твердое вещество. сушили на воздухе в течение 30 мин и сушили в вакууме при 40°С в течение ночи. в результате получали указанное соединение (188.8 г. 75%) в форме белого твердого вещества.

Д ЯМР (400 МГц. С1ТО1)) δ 7.86 (д. 1=8 Гц. 1Н). 7.49-7.57 (м. 2Н). 7.30-7.39 (м. 2Н).

Пример синтеза 3. трет-Бутиловый эфир (6-фторпиридин-3-ил)карбаминовой кислоты.

Круглодонную 3-горлую колбу на 100 мл оснащали магнитной мешалкой. термопарой с контролем нагревательной рубашки. холодильником и атмосферой азота. Колбу заполняли 5-амино-2фторпиридином (5 г. 44.6 мМ). ТГФ (50 мл). 4-диметиламинопиридином (549 мг. 4.5 мМ. 10% мкМ) и ди-трет-бутилдикарбонатом (10.7 г. 49 мМ). Смесь нагревали до 50°С в течение 4 ч. Охлаждали и концентрировали под вакуумом. Остаток растворяли в дихлорметане/воде и фильтровали. Фильтрат переносили на делительную воронку и отделяли дихлорметановую фракцию. Дихлорметан сушили над сульфатом натрия. фильтровали и концентрировали в вакууме. При хроматографии на силикагеле элюирование осуществляли изократической смесью 10% изопропанола/90% дихлорметана. в результате получали указанное соединение (1.64 г. 17%) в форме желто-коричневого прозрачного масла. которое затвердевает после вакуумной сушки.

М8 (Е1) т/ζ 261 М⁺.

Пример синтеза 4. трет-Бутиловый эфир (2-фторпиридин-3-ил)карбаминовой кислоты.

Указанное соединение получали. по существу. в соответствии с примером синтеза трет-бутилового эфира (6-фторпиридин-3-ил)карбаминовой кислоты. используя соответствующий исходный материал.

ОСМ8 (Е1) т/ζ 212 М⁺.

Пример синтеза 5. №(4-Иодпиридин-3-ил)-2.2-диметилпропионамид.

Круглодонную 3-горлую колбу на 250 мл оснащали магнитной мешалкой. термопарой. баней из сухого льда/ацетона. атмосферой азота и воронкой для добавления. Заполняли колбу 2.2-диметил-№ пиридин-3-илпропионамидом (3.0 г. 16.8 мМ). диэтиловым эфиром (67 мл). тетраметилендиамином (4.68 г. 6.08 мл. 40.3 мМ). Реакционную смесь охлаждали до -78°С. Медленно в течение более 10 мин через стеклянный шприц добавляли н-бутиллитий (2.5М раствор в гексане. 16.2 мл. 40.3 мМ).

Реакционной смеси позволяли нагреться до -13°С в течение более 2 ч. Реакционную смесь охлаждали до -78°С. В смесь через воронку для добавления добавляли раствор йода (8.5 г. 33.6 мМ в 20 мл ТГФ)

- 4 016177 и перемешивали в течение 2,5 ч при -68°С. Реакцию гасили путем добавления насыщенного водного раствора N11,|С1 (40 мл). Экстрагировали этилацетатом (100 мл) и удаляли водную фазу. Органическую фракцию промывали насыщенным водным раствором тиосульфата натрия (100 мл) и насыщенным водным хлоридом натрия. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и фильтровали. Концентрировали в вакууме, в результате получали продукт в форме коричневого масла. Проводили хроматографию на силикагеле (80 г), элюировали градиентом от 100% дихлорметана до 70% этилацетата/30% дихлорметана, в результате получали указанное соединение (1,19 г, 23%).

М8 (Е8) т/ζ 305 [М+1]⁺.

Следующие соединения получали, по существу, в соответствии с примером синтеза н-(4йодпиридин-3-ил)-2,2-диметилпропионамида, используя соответствующий исходный материал.

Пример синтеза	Название соединения	Физические данные
6	трет-бутиловый эфир (6-фтор-4- йодпиридин-3-ил)карбаминовой кислоты	М3 (ЕЗ) ш/ζ 339 [М+1]⁺
7	трет-бутиловый эфир (2-фтор-4- йодпиридин-3-ил)карбаминовой кислоты	СС-МЗ (ΕΙ) т/ζ 338 М⁺

Пример синтеза 8. 3-Метоксиметоксипиридин.

В ТГФ (20,6 мл) растворяли 3-гидроксипиридин (7 г, 74 мМ) и диметилформамид (34,4 мл) и охлаждали до -15°С. Добавляли трет-бутоксид калия (8,3 г, 74 мМ) и перемешивали при -15°С в течение 30 мин. К смеси по каплям на протяжении более 40 мин добавляли хлорметилметиловый эфир (5,81 мл, 77 мМ). После завершения добавления смесь перемешивали при -15°С в течение еще 1 ч. Ледяную ванну удаляли и оставляли смесь медленно нагреваться до 15°С. Смесь переливали в насыщенный водный хлорид натрия и интенсивно перемешивали в течение 10 мин. Полученный раствор экстрагировали тремя частями этилацетата. Органические экстракты объединяли и промывали насыщенным водным хлоридом натрия, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали в вакууме. Полученный продукт использовали без дальнейшей очистки.

¹Н ЯМР (400 МГц, СЭС1э) δ 8,42 (д, 1=3 Гц, 1Н), 8,28 (д, 1=5 Гц, 1Н), 7,37-7,42 (м, 1Н), 7,21-7,27 (м, 1Н), 5,20 (с, 2Н), 3,49 (с, 3Н).

Пример синтеза 9. 2-Хлор-5-метоксиметоксипиридин.

В суспензию гидрида натрия (3,7 г, 93 мМ) в ДМФ (50 мл) по каплям более 45 мин добавляли раствор 2-хлор-5-гидроксипиридина (10 г, 77 мМ) в ДМФ (20 мл). Полученный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 ч. По каплям в течение более 45 мин добавляли хлорметилметиловый эфир (6,6 мл, 86 мМ). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 ч. Смесь разбавляли этилацетатом, водой и насыщенным водным хлоридом натрия. Органический раствор отделяли и промывали тремя частями воды, одной частью насыщенного водного хлорида натрия, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали в вакууме. Сырой продукт очищали путем колоночной хроматографии с 330 г силикагеля, проводили элюирование градиентом от гексана до 30% этилацетата в гексане более 20 мин и затем держали в 30% этилацетате в гексане в течение 30 мин, в результате получали указанное соединение (10,8 г, 81%) в форме прозрачного масла.

М8 (Е8) т/ζ 174,0 [М+1]⁺.

Следующие промежуточные соединения получали, используя, по существу, способы, сходные со способами, использованными для 2-хлор-5-метоксиметоксипиридина.___________________

Пример синтеза	Название соединения	ЯМР
10	2-фтор-5- метоксиметоксипиридин	^ТН ЯМР (400 МГц, СОС1₃) δ 3,48 (с, ЗН), 5,15 (с, 2Н), 6,85 (дд, Э=3,6 Гц, 7=8,8 Гц, 1Н), 7,47 (м, 1Н), 7,96 (м, 1Н)

Пример синтеза 11. 2-Хлор-4-йод-5-метоксиметоксипиридин.

В раствор 2-хлор-5-метоксиметоксипиридина (10,8 г, 62 мМ) в ТГФ (300 мл) по каплям в течение более 10 мин добавляли трет-бутиллитий (1,7М в пентане, 72 мл, 123 мМ) при -70°С. Полученный раствор перемешивали при -70°С в течение 30 мин. По каплям в течение более 30 мин добавляли раствор йода (23 г, 92 мМ) в ТГФ (150 мл). Полученный раствор перемешивали при -70°С в течение 1 ч. Ледяную ванну удаляли и позволяли реакционной смеси нагреться до комнатной температуры. Смесь разбавляли этилацетатом и водой и выделяли фазы. Водную фазу экстрагировали двумя частями этилацетата. Орга

- 5 016177 нические экстракты объединяли и промывали двумя частями водного тиосульфата натрия, одной частью воды, одной частью насыщенного водного хлорида натрия, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали в вакууме. Полученное твердое вещество растирали с гексаном. Твердое вещество выделяли путем фильтрации под вакуумом и промывали твердое вещество гексаном. Твердое вещество сушили в вакууме, в результате получали указанное соединение (10,8 г, 58%) в форме коричневого твердого вещества.

¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-ф,) δ 8,08 (с, 1Н), 7,98 (с, 1Н), 5,43 (с, 2Н), 3,40 (с, 3Н).

Следующие промежуточные соединения получали, используя, по существу, способ для 2-хлор-4йод-5-метоксиметоксипиридина._____________________________________________________

Пример синтеза	Название соединения	ЯМР
12	2-фтор-4-йод-5- ме т о к симе т оксипиридин	^ХН ЯМР (400 МГц, СОС1₃) δ 3,53 (с, ЗН), 5,23 (с, 2Н) , 7,39 (д, 0=4,0 Гц, 1Н), 7,96 (д, 0=1,6 Гц, 1Н)

Пример синтеза 13. 6-Хлор-4-йодпиридин-3-ол.

Раствор 2-хлор-4-йод-5-метоксиметоксипиридина (8,1 г, 27 мМ) в ТГФ (40 мл) обрабатывали 3Н НС1 (61 мл). Полученную смесь нагревали до 60°С в течение 3 ч. Смесь охлаждали до комнатной температуры и доводили рН до 7 путем медленного добавления насыщенного водного раствора бикарбоната натрия. Смесь экстрагировали тремя частями этилацетата. Органические экстракты объединяли и сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали в вакууме, в результате получали указанное соединение (6,8 г, 98%) в форме коричневого твердого вещества, которое использовали без дальнейшей очистки.

¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-ф,) δ 11,04 (с, 1Н), 7,81-7,87 (м, 2Н).

Следующие промежуточные соединения получали, используя, по существу, способ для 6-хлор-4йодпиридин-3-ола.

Пример синтеза	Название соединения	М3 (ЕЗ) [М+1]⁺
14	6—фтор-4-йодпиридин-3-ол	240

Пример синтеза 15. 2-Хлор-5-этокси-4-йодпиридин.

Раствор 6-хлор-4-йодпиридин-3-ола (4,9 г, 19 мМ) и карбоната калия (8,0 г, 58 мМ) в диметилформамиде (50 мл) обрабатывали этилиодидом (4,7 мл, 58 мМ). Нагревали до 60°С в течение 3 ч. Смесь охлаждали до комнатной температуры и фильтровали. Смесь разбавляли этилацетатом и промывали 10% водным раствором лимонной кислоты. Водные растворы объединяли и экстрагировали двумя дополнительными частями этилацетата. Органические экстракты объединяли и промывали тремя частями воды, одной частью насыщенного водного хлорида натрия, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали в вакууме, в результате получали указанное соединение (5,1 г, 93%) в форме коричневого твердого вещества, которое использовали без дальнейшей очистки.

¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-ф,) δ 8,00 (с, 1Н), 7,93 (с, 1Н), 4,18 (кв., 1=7 Гц, 2Н), 1,35 (т, 1=7 Гц, 3Н).

Пример синтеза 16. 4-Бензо[Ь]тиофен-7-ил-2-хлорпиридин.

В колбе смешивали 7-бромбензо[Ь]тиофен (1,7 г, 12 мМ), 2-хлор-4-(4,4,5,5-тетраметил[1,3,2]диоксаборолан-2-ил)пиридин (1,6 г, 7 мМ), комплекс [1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорпалладия(11) с дихлорметаном (1:1) (285 мг, 0,3 мМ), 2-(ди-трет-бутилфосфино)бифенил (63 мг, 0,2 мМ), карбонат натрия (2М, 8 мл, 16 мМ) и ТГФ (20 мл). Смесь нагревали до 100°С в течение 3 ч. Смесь разбавляли хлороформом/изопропанолом (3/1). Раствор промывали насыщенным водным хлоридом натрия. Сушили над сульфатом натрия. Раствор концентрировали в вакууме, получали темный остаток. Его очищали путем колоночной хроматографии (от дихлорметана до 20% ТГФ в дихлорметане), в результате получали указанное соединение (1,14 г, 66%) в форме желтого твердого вещества.

М8 (Е8) т/ζ 246 [М+1]⁺.

Следующие соединения получали способами, сходными со способом, использованным для 4бензо[Ь]тиофен-7-ил-2-хлорпиридина, с использованием ДМСО.

- 6 016177

Пример синтеза	Название соединения	М3 (ЕЗ) [М+1]⁺	Комментарии
17	4-бензо[Ь]тиофен-7- илпиридин	212	нагревали до 100°С катализатор РсЦРРП₃)₄

Пример синтеза 18. 4-Бензо[Ь]тиофен-7-ил-2-фтор-5-метилпиридин.

В колбе смешивали 2-фтор-4-йод-5-метилпиридин (355 мг, 1,5 мМ), 2-бензо[Ь]тиофен-7-ил-4,4,5,5тетраметил[1,3,2]диоксаборолан (282 мг, 1,8 мМ), комплекс [1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен] дихлор палладия (II) с дихлорметаном (1:1) (61 мг, 0,07 мМ), 2-(ди-трет-бутилфосфино)бифенил (13 мг, 0,04 мМ), карбонат натрия (2М, 1,5 мл, 3 мМ) и ТГФ (10 мл). Смесь нагревали до 100°С в течение 3 ч на масляной бане. Смесь разбавляли хлороформом/изопропанолом (3/1). Раствор промывали насыщенным водным хлоридом натрия. Сушили над сульфатом натрия. Концентрировали в вакууме, получали темный остаток. Очищали путем колоночной хроматографии (20% этилацетат в гексане), в результате получали указанное соединение (300 мг, 82%) в форме желтого масла.

М8 (Е8) т/ζ 244 [М+1]⁺.

Следующие промежуточные соединения получали, по существу, в соответствии с примером синтеза 4-бензо[Ь]тиофен-7-ил-2-фтор-5-метилпиридина, используя соответствующий исходный материал.

Пример синтеза	Название соединения	Физические данные М3 (ЕЗ) т/ζ [М+1]⁺	Комментарии
19	трет-бутиловый эфир (4- бензо[Ь]тиофен-7-ил-6фторпиридин-3- ил)карбаминовой кислоты	345	атмосфера Ν₂
20	4-бензо[Ь]тиофен-7-ил-2- фторпиридин-3-иламин	345	атмосфера Ν₂
21	4-бензо[Б]тиофен-7-ил-2- хлор-5-этоксипиридин	290	атмосфера Ν₂
22	трет-бутиловый эфир (4- испои ί тииу/сп^- < —У1л~и — фторпиридин-3- ил)карбаминовой кислоты	345	Д©ОКСу1Г©Н14^=_ ровали (Ν₂)
23	трет-бутиловый эфир (4- бензо[Ь]тиофен-7- илпиридин-3-ил)ме тил карбаминовой кислоты	325	Деоксигенировали (Ν₂)

Пример синтеза 24. 4-Бензо[Ь]тиофен-7-ил-3-метоксиметоксипиридин.

Раствор А. Раствор 3-метоксиметоксипиридина (2,5 г, 18 мМ) в диэтиловом эфире (90 мл) при -70°С по каплям в течение более 10 мин обрабатывали трет-бутиллитием (1,7М в пентане, 10 мл, 18 мМ). Смесь перемешивали при -70°С в течение 40 мин и по каплям в течение более 5 мин добавляли раствор триизопропилбората (5 мл, 22 мМ) в ТГФ (10 мл). Перемешивали смесь при -70°С более 1 ч, затем удаляли ледяную ванну и позволяли смеси медленно нагреться до комнатной температуры.

Раствор В. Раствор 7-бромбензо[Ь]тиофена (3,8 г, 18 мМ), 2-(ди-трет-бутилфосфино)бифенила (268 мг, 0,90 мМ), комплекса [1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорпалладия(11) с дихлорметаном (1:1) (732 мг, 0,90 мМ) в 1,4-диоксане (30 мл) обрабатывали 2М водным карбонатом натрия (72 мл, 36 мМ). Когда раствор А нагревался до комнатной температуры, раствор В нагревали до 80°С.

К раствору В по каплям в течение более 10 мин добавляли раствор А. Объединенные растворы нагревали до 85°С в течение 5 ч. Смесь охлаждали до комнатной температуры и разбавляли этилацетатом и водой. Органическую фазу промывали водой и насыщенным водным хлоридом натрия, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали в вакууме. Сырой продукт очищали путем колоноч

- 7 016177 ной хроматографии со 120 г силикагеля, элюировали градиентом от дихлорметана до этилацетата, в результате получали указанное соединение (3,8 г), содержащее небольшое количество исходного 3метоксиметоксипиридина. Продукт использовали без дальнейшей очистки.

¹Н ЯМР (400 МГц, СЭС1з) δ 8,68 (с, 1Н), 8,42 (д, 1=4 Гц, 1Н), 7,88 (д, 1=8 Гц, 1Н), 7,33-7,50 (м, 5Н), 5,12 (с, 2Н), 3,36 (с, 3Н).

Пример синтеза 25. 2-Хлор-4-[7-(2-хлорпиридин-4-ил)бензо[Ь]тиофен-2-ил]пиримидин.

В круглодонной колбе на 500 мл до -70°С в атмосфере азота охлаждали раствор 4-бензо[Ь]тиофен7-ил-2-хлорпиридина (13 г, 53,1 мМ) и триизопропилбората (20 г, 106 мМ) в ТГФ (150 мл). К охлажденному раствору постепенно в течение более 30 мин добавляли диизопропиламид лития (2М в ТГФ, 53 мл, 106 мМ). Смесь непрерывно перемешивали в течение еще 1 ч на охлаждающей бане. Смесь постепенно переносили в перемешиваемый раствор 2,4-дихлорпиримидина (12 г, 106 мМ), комплекса [1,1'бис(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорпалладия(11) с дихлорметаном (1:1) (2,2 г, 53 мМ) и карбоната натрия (35 мл, 3М, 106 мМ) в ТГФ (150 мл) на период более 30 мин. Перемешивали с обратным холодильником в течение дополнительного 1 ч. Смесь охлаждали до комнатной температуры и разбавляли 500 мл смеси хлороформ/изопропанол (3/1) и 200 мл воды. Полученное твердое вещество собирали путем фильтрации и обрабатывали смесью хлороформ/изопропанол/вода. Твердое вещество промывали дихлорметаном и сушили в вакууме. Фракции разделяли с использованием смеси хлороформ/изопропанол/вода. Органическую фазу промывали водой и насыщенным водным хлоридом натрия, сушили над сульфатом натрия и концентрировали в вакууме, в результате получали коричневый остаток. Остаток очищали путем колоночной флэш-хроматографии (10% метанол в дихлорметане), в результате получали дополнительный продукт. Обе части объединяли и получали указанное соединение (13 г, 63%).

М8 (Б8) т/ζ 358 [М+1]⁺.

Следующие промежуточные соединения получали, по существу, в соответствии с примером синтеза 2-хлор-4-[7-(2-хлорпиридин-4-ил)бензо[Ь]тиофен-2-ил]пиримидина, используя соответствующий исходный материал. ___________________ ______________________

Пример синтеза	Название соединения	Физические данные М3 (ЕЗ) т/ζ [М+1]⁺	Комментарии
26	2-хлор-5-фтор-4-(7- пиридин-4- илбензо[Ь]тиофен-2- ил)пиримидин	342
27	2-хлор-5-метил-4-(7- пиридин-4- илбензо[Ь]тиофен-2- ил)пиримидин	338
28	2-хлор-5-фтор-4-[7-(2фтор-5-метилпиридин-4ил)-бензо[£>]тиофен-2ил]пиримидин	374
29	2-хлор-4-[7-(2-фтор-5метилпиридин-4-ил)бензо[Ь]тиофен-2-ил]-5ме тилпиримидин	370

- 8 016177

Добавляли

2-(ди-третбутилфосфино) бифенил зо

2-хлор-4-[7-(2-фтор-5метилпиридин-4-ил)бензо[Ь]тиофен-2ил]пиримидин 2-хлор-5-фтор-4-[7-(3метоксиметоксипиридин4-ил)-бензо[Ь]тйофен-2ил]пиримидин

2-хлор-4-[7-(2-хлор-5этоксипиридин-4-ил)бензо[Ь]тиофен-2-ил]-5фторпиримидин трет-бутиловый эфир (4[2-(2-хлорпиримидин-4ил) -бензо [£>] тиофен-7ил]-6-фторпиридин-Зил}карбаминовой кислоты 4- (7бромбензо [£>] тиофен-2ил)-2-хлор-5фторпиримидин

2,5-дихлор-4-[7-(2фтор-5-метилпиридин-4ил) -бензо [£>] тиофен-2ил]пиримидин

4-(7бромбензо[Ь]тиофен-2ил)-2-хлор-5356

402

420

457

343

390

361 хлорпиримидин

4-(7бромбензо[Ь]тиофен-2ил)-2-хлор-5ме тилпиримидин

4-(7бромбензо [£>] тиофен-2ил)-2-хлорпиримидин

340

327

Добавляли

2-(ди-третбутилфосфино) бифенил

ССМ8 (ЕТ) М⁺

Пример синтеза 39. 4-[2-(2-Хлор-5-фторпиримидин-4-ил)бензо[Ъ]тиофен-7-ил]пиридин-3-ол.

Раствор 2-хлор-5-фтор-4-[7-(3-метоксиметоксипиридин-4-ил)бензо[Ъ]тиофен-2-ил]пиримидина (4 г, 10 мМ) в ТГФ (10 мл) обрабатывали 5Н НС1 (3 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 6 ч. Реакционную смесь концентрировали в вакууме и разбавляли насыщенным водным бикарбонатом натрия и дихлорметаном. Фракции разделяли и фильтровали каждую фракцию. Твердое вещество из органической фазы промывали дихлорметаном, в результате получали указанное соединение (300 мг) в форме желто-коричневого твердого вещества. Твердое вещество из водной фракции промывали водой и сушили, в результате получали указанное соединение (300 мг) в форме желто-коричневого твердого вещества. Вещества смешивали, в результате получали указанное соединение (600 мг, 17%) в форме желто-коричневого твердого вещества.

М8 (Е8) т/ζ 358 [М+1]⁺.

Пример синтеза 40. 2-Хлор-4-[7-(3-этоксипиридин-4-ил)бензо[Ъ]тиофен-2-ил]-5-фторпиримидин.

Раствор 4-[2-(2-хлор-5-фторпиримидин-4-ил)бензо[Ъ]тиофен-7-ил]пиридин-3-ола (100 мг, 0,28 мМ) и карбоната цезия (100 мг, 0,28 мМ) в диметилформамиде (1 мл) обрабатывали этилйодидом (44 мг, 0,28 мМ). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 ч. Смесь разбавляли этилацетатом и промывали раствор тремя частями воды и одной частью насыщенного водного хлорида натрия, сушили

- 9 016177 над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали в вакууме. Сырой продукт очищали путем колоночной хроматографии с 12 г силикагеля, элюировали градиентом от дихлорметана до этилацетата, в результате получали указанное соединение (48 мг, 45%) в форме коричневого твердого вещества.

М8 (Ε8) т/ζ 386 [М+1]⁺.

Пример синтеза 41.2-Хлор-5-фтор-4-[7-(3-метоксипиридин-4-ил)бензо[Ъ]тиофен-2-ил]пиримидин.

Указанное соединение получали, по существу, в соответствии с примером синтеза 2-хлор-4-[7-(3этоксипиридин-4-ил)бензо[Ъ]тиофен-2-ил]-5-фторпиримидина, используя соответствующий исходный материал.

М8 (Ε8) т/ζ 372 [М+1]⁺.

Пример синтеза 42. 1-{2-[4-(7-Бромбензо[Ъ]тиофен-2-ил)-5-фторпиримидин-2-иламино]этил}имидазолидин-2-он.

В 1,4-диоксане (650 мл) соединяли 1-(2-аминоэтил)-2-имидазолон (100 г, 774 мМ) и 4-(7бромбензо[Ъ]тиофен-2-ил)-2-хлор-5-фторпиримидин (90 г, 2 62 мМ), смесь нагревали в атмосфере азота до 90°С при перемешивании в течение 3 ч. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры. Твердое вещество отфильтровывали и промывали водой (3x500 мл) и диэтиловым эфиром (500 мл). Сушили в вакууме при 50°С, в результате получали указанное соединение (59,2 г, 52%) в форме желтого твердого вещества.

М8 (Ε8) т/ζ 436 [М+1]⁺.

Следующие промежуточные соединения получали, по существу, в соответствии с примером синтеза 1-{2-[4-(7-бромбензо[Ъ]тиофен-2-ил)-5-фторпиримидин-2-иламино]этил}имидазолидин-2-она, используя соответствующий исходный материал.________________________________________

Пример синтеза	Название соединения	Физические данные М3 (ЕЗ) т/г [М+1]⁺
	1-{2-[4-(7-бромбензо[И]тиофен-
43	2-ил)-5-хлорпиримидин-2иламино]этил}имидазолидин-2-он 1- { 2- [4- (7-бромбензо [£>] тиофен-	454
44	2-ил)-5-метилпиримидин-2иламино]этил}имидазолидин-2-он 1-{2-[4-(7-бромбензо[Б]тиофен-	432
45	2-ил)пиримидин-2- иламино]этил}имидазолидин-2-он	420

Пример синтеза 46. 5-Бромметил-2-фтор-4-йодпиридин.

В колбе объединяли 2-фтор-4-йодпиколин (10,0 г, 42,19 мМ), н-бромсукцинимид (9,76 г, 54,85 мМ), 2,2'-азобисизобутиронитрил (3,46 г, 21,10 мМ) и сушили над СС1₄ (100 мл). Нагревали в течение 16 ч при 70°С в атмосфере азота. Охлаждали до комнатной температуры. Разбавляли дихлорметаном и промывали водой и насыщенным водным хлоридом натрия. Фракции разделяли и сушили органическую фракцию над сульфатом магния. Концентрировали в вакууме, в результате получали сырой продукт. Очищали путем колоночной хроматографии (от 1 до 15% этилацетата в гексане), в результате получали указанное соединение (8,27 г, 62%).

М8 (Εΐ) т/ζ 315 М⁺.

Пример синтеза 47. 1-(2-{5-Фтор-4-[7-(4,4,5,5-тетраметил[1,3,2]диоксаборолан-2-ил)бензо[Ъ]тиофен-2-ил]пиримидин-2-иламино}этил)имидазолидин-2-он.

В колбе объединяли 1-{2-[4-(7-бромбензо[Ъ]тиофен-2-ил)-5-фторпиримидин-2-иламино]этил}имидазолидин-2-он (5,5 г, 12,6 мМ), бис(пинаколато)дибор (3,84 г, 15,3 мМ), (1,1'-бис(дифенилфосфино) ферроцен)дихлорпалладия(П) (1,0 г, 1,3 мМ) и ацетат калия (2,5 г, 25 мМ) в ДМСО (80 мл). Через смесь в течение 10 мин пропускали азот. Колбу закрывали и ставили в масляную баню, где нагревали до 85°С в течение суток. Смесь разбавляли смесью хлороформ/изопропиловый спирт (3/1). Раствор промывали насыщенным водным хлоридом натрия. Сушили ее над сульфатом натрия. Раствор концентрировали в вакууме, в результате получали темный остаток. Очищали остаток путем колоночной хроматографии (гексан 20% этилацетат в гексане 10% метанол в дихлорметане), в результате получали продукт в форме коричневого твердого вещества (5 г, 82%).

М8 (Ε8) т/ζ 484 [М+1]⁺.

Пример синтеза 48. (6-Фтор-4-йодпиридин-3-ил)метанол.

В круглодонной колбе соединяли 5-бромметил-2-фтор-4-йодпиридин (0,9 г, 2,85 мМ), нитрометан

- 10 016177 (15 мл, 2 78 мМ), тетрафторборат серебра (721 мг, 3,7 мМ) и диметилформамид (5 мл). Смесь перемешивали в течение суток при комнатной температуре. В смесь добавляли карбонат натрия (1,81 г, 17,1 мМ) и метанол (10 мл). Перемешивали при комнатной температуре в течение еще 4 ч. Реакционную смесь разбавляли хлороформом и промывали водой и насыщенным водным хлоридом натрия. Органическую фракцию отделяли от водной фракции и сушили над Мд80₄. После фильтрации органический растворитель выпаривали в вакууме, в результате получали сырой продукт. Сырой продукт очищали путем колоночной флэш-хроматографии (элюировали 10% метанолом в дихлорметане), в результате получали желаемый продукт (0,6 г, 83%).

М8 (е8) т/ζ 254 [М+1]⁺.

Пример синтеза 49. 2-Фтор-5-фторметил-4-йодпиридин.

Трифторид диэтиламиносеры по каплям добавляли (892 мг, 4 мМ) в раствор (6-фтор-4-йодпиридин3-ил)метанола в дихлорметане (25 мл) в круглодонной колбе в атмосфере азота и затем добавляли этанол (0,3 мл) при 0-5°С. Смесь перемешивали в течение 3 ч. Реакционную смесь переливали в насыщенный раствор бикарбоната натрия. Продукт экстрагировали хлороформом и промывали водой и насыщенным водным хлоридом натрия. Органическую фракцию отделяли от водной фракции и сушили над Мд80₄. После фильтрации органический растворитель выпаривали в вакууме, в результате получали сырой продукт. Очищали сырой продукт путем колоночной флэш-хроматографии (10% метанол в дихлорметане), в результате получали указанное соединение (0,32 г, 53%).

М8 (Е8) т/ζ 256 [М+1]⁺.

Примеры

Пример 1. 1-(2-{4-[7-(2-Хлорпиридин-4-ил)бензо[Ь]тиофен-2-ил]пиримидин-2-иламино}этил)имидазолидин-2-он.

В выдерживающем давление сосуде соединяли 2-хлор-4-[7-(2-хлорпиридин-4-ил)бензо[Ь]тиофен-2ил]пиримидин (9 г, 25,1 мМ) и 2- (аминоэтил)-1,3-дигидроимидазолон (6,4 г, 50,2 мМ) в н-бутаноле (200 мл). Смесь нагревали на масляной бане до 120°С в течение 5 ч. Смесь разбавляли хлороформом/изопропанолом (3/1). Промывали раствор насыщенным водным хлоридом натрия. Сушили над сульфатом натрия. Раствор концентрировали в вакууме, получали темный остаток. Очищали путем колоночной хроматографии (от дихлорметана до 10% метанола в дихлорметане), в результате получали указанное соединение (9 г, 93%) в форме желтого твердого вещества.

М8 (Е8) т/ζ 451 [М+1]⁺.

Следующие примеры получали, по существу, в соответствии с примером синтеза 1-(2-{4-[7-(2хлорпиридин-4-ил)бензо[Ь]тиофен-2-ил]пиримидин-2-иламино}этил)имидазолидин-2-она, используя соответствующий исходный материал._______________________________________________

Пр.	Название соединения	Структура	Физические данные М5 (ЕЗ) т/ζ [М+1]⁺	Комментарии
2	1- (2-{5-фтор-4- [7-(2-фтор-5метилпиридин-4ил)бензо[Ь]тиофен -2-ил]пиримидин- 2- иламино}этил) имидазолидин-2-он	Н,С^Х ^р	467	Микроволновая обработка, 1,4диоксан-НМП 120°С

- 11 016177

3	1- (2-{4-[7-(2фтор-5метилпиридин-4ил)бензо[Ь]тиофен -2-ил]-5- ме тилпиримидин-2 иламино}этил) имидазолидин-2-он	^ιν'	463	Микроволновая обработка, 1,4диоксан-НМП 120°С
4	1- (2-(4-[7- (2фтор-5метилпиридин-4ил)бензо[Ъ]тиофен -2-ил]пиримидин- 2- иламино}этил) имидазолидин-2-он		449	Добавляли 3 эквивалента триэтиламина
5	1- {2-[5-метил-4- (7-пиридин-4илбензо[Ъ]тиофен- 2- ил)пиримидин-2иламино]этил) ИМИДЗЗОЛИДИН^-'2 ^—ΌΗ	^нс	431	Микроволновая обработка, НМЛ 120°С
6	1- (2-(5-хлор-4[7- (2-фтор-5метилпиридин-4ил)бензо[Ь]тиофен -2-ил]пиримидин- 2- иламино}этил) имидазолидин-2-он	сор	483	Добавляли 3 эквивалента триэтиламина
7	1- {2-[5-фтор-4- (7-пиридин-4илбензо[Ь]тиофен- 2- ил)пиримидин-2иламино]этил) имидазолидин-2-он	СОр ίψ	435	Микроволновая обработка, НМЛ 120°С

- 12 016177

8	1-(2-{4-[7-(3этоксипиридин-4ил)бензо[Ь]тиофен -2-ил]-5фторпиримидин-2иламино}этил) имидазолидин-2-он		479
9	1- (2-(5-фтор-4- (7-(3- гидроксипиридин- 4- ил)бензо[Ь]тиофен -2-ил)пиримидин- 2- иламино)этил) имидазолидин-2-он		451
10	1- (2-{4-[7-(2хлор-5этоксипиридин-4ил)бензо[Ь]тиофен -2-ил]-5фторпиримидин-2- иламино}- этил)имидазолидин -2-он	1	513
11	1- (2-{5-фтор-4- [7-(3- метоксипиридин-4ил)бензо[В]тиофен -2-ил]пиримидин- 2- иламино}этил) имидазолидин-2-он	-г	465

Пример 12. 1-(2-(5-Хлор-4-(7-(пиридин-4-ил)бензо[Ь]тиофен-2-ил)пиримидин-2-иламино)этил)имидазолидин-2-он.

В смеси воды (1 мл) и ДМСО (1 мл) объединяли 1-{2-[4-(7-бромбензо[Ь]тиофен-2-ил)-5хлорпиримидин-2-иламино]этил}имидазолидин-2-он (81,6 мг, 0,18 мМ), пиридин-4-бороновую кислоту (36,8 мг, 0,3 мМ) и бикарбонат натрия (18,1 мг, 0,2 мМ). Добавляли тетракис(трифенилфосфин)палладия(0) (10,4 мг, 0,009 мМ). Смесь облучали при 150°С в течение 15 мин при перемешивании магнитной мешалкой. Сырую реакционную смесь переливали на колонки с сильной катионообменной смолой (КОС) (10 г). Желаемый продукт элюировали 2Н аммиаком в метаноле (40 мл) и концентрировали при пониженном давлении. Очищали путем обратно-фазовой хроматографии (градиент от 30 до 90% при 80 мл/мин в течение 11 мин на колонках 30x100 мм, 5 мм, С₁₈ Μ8 Х1егга®, растворитель А: вода с 0,01М бикарбонатом аммония, растворитель В: ацетонитрил), в результате получали указанное соединение (20,4 мг, 25,1%).

Μ8 (Е8) т/ζ 451 [Μ+1]⁺.

Пример 13. 1-(2-{5-Хлор-4-[7-(5-хлор-2-фторпиридин-4-ил)бензо[Ь]тиофен-2-ил]пиримидин-2иламино}этил)имидазолидин-2-он.

- 13 016177

В микроволновом флаконе в ТГФ (3 мл) и воде (1,5 мл) соединяли 1-{2-[4-(7-бромбензо[Ь]тиофен2-ил)-5-хлорпиримидин-2-иламино]этил}имидазолидин-2-он (500 мг, 1,1 мМ), 5-хлор-2-фторпиридин-4бороновую кислоту (578 мг, 3,3 мМ), комплекс [1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорпалладия(11) с дихлорметаном (1:1) (90 мг, 0,11 мМ), 2-(ди-трет-бутилфосфино)бифенил (20 мг, 0,066 мМ) и карбонат натрия (350 мг, 3,3 мМ). В течение 5 мин через смесь пропускали азот. Смесь нагревали до 100°С в течение 10 мин. Органическую фракцию концентрировали и сушили в вакууме. Полученное из суспензии твердое вещество растворяли в дихлорметане/метаноле и очищали путем колоночной хроматографии (от 1% раствор 2N аммиака/метанола в дихлорметане до 10% раствора 2N аммиака/метанола в дихлорметане), в результате получали указанное соединение. Для дальнейшей очистки продукт растворяли в ДМСО и очищали путем обратно-фазовой колоночной хроматографии (от 50% ацетонитрила в воде (с 0,03% НС1) до 95% ацетонитрила в воде (с 0,03% НС1)), в результате получали указанное соединение (146 мг, 26%).

М8 (Б8) т/ζ 503 [М+1]⁺.

Следующие примеры получали, по существу, в соответствии с примером синтеза 1-(2-{5-хлор-4-[7(5-хлор-2-фторпиридин-4-ил)бензо[Ь]тиофен-2-ил]пиримидин-2-иламино}этил)имидазолидин-2-она, используя соответствующий исходный материал.____________________________________

Пр.	Название соединения	Структура	Физические данные М3 (ЕЗ) т/ζ [М+1]⁺	Комментарии
14	1- (2-{4-[7-(2хлорпиридин-4ил) - бензо [£>] тиофен- 2- ил]-5фторпиримидин2-иламино}этил) имидазолидин-2он		469

- 14 016177

		1-(2-{5-хлор-4- [7-(2- хлорпиридин-4ил) -
	15			-Μ
		бензо[Ь]тиофен-			486
		2-ил]пиримидин-		1 с/
		2-иламино}этил)
		имидазолидин-2-
		он
		1-(2-(4-(7-(5-
		хлор-2-				Очищали
		фторпиридин-4-				путем
		ил) -				хромато-
		бензо[Ь]тиофен-				графии с
	16			ί X /	487
		2-ил]-5-				обращенной
		фторпиримидин-	Ск			фазой,
		2-иламино}этил)		Κ'Ί’		ΟΗ₃ΟΝ и
		имидазолидин-2-				вода
		он
		1-(2-(4-(7-(2-
		хлор-5-				Очищали
		фторпиридин-4-		1		путем
		ил) -				хромато-
		бензо[Ь]тиофен-			графии с
	17			¹	487
		2-ил]-5-		1 /		обращенной
		фторпиримидин-		Οι		фазой,
		2-иламино}этил)				СН₃СЫ и
		имидазолидин-2-				вода
		он
	1-(2-{4-[7-(3-
	хлорпиридин-4-				Очищали
	ил) -		1		путем
	бензо[Ь]тиофен-				хромато-
	2-ил]-5-		[Γ Ζ η		графии с
18				469
	фторпиримидин-				обращенной
		Ох	-Υ?)
	2-		ν		фазой,
	иламино}этил)-				СН₃СЧ и
	имидазолидин-2-				вода
	он
	1-(2-{5-фтор-4-
	[7-(3-				Очищали
	метилпиридин-4-		1 Α / η		путем
	ил) -			хромато-
	бензо[Ь]тиофен-			графии с
19			449
	2-ил]пиримидин-	н,с			обращенной фазой,
	2-
	иламино}э тил)-				СН₃СЫ и
	имидазолидин-2-				вода
	он
	1- (2-{4-[7-(5-
	хлор-2-				Очищали
	фторпиридин-4-		Й		путем
	ил) -				хромато-
	бензо[Ь]тиофен-			483	графии с
20				обращенной
	2-ил]-5-	СК	1 ^Н1^С
	метилпиримидин-	А		фазой,
	2-иламино]этил)				ΟΗ₃ΟΝ и
	имидазолидин-2-				вода
	он

- 15 016177

Пример 24. 4-(2-(2-(2-(2-Оксоимидазолидин-1-ил)этиламино)пиримидин-4-ил)бензо[Ь]тиофен-7-ил) пиколинонитрил.

В ДМСО (6 мл) соединяли 1-(2-{4-[7-(2-хлорпиридин-4-ил)бензо[Ь]тиофен-2-ил]пиримидин-2иламино}этил)имидазолидин-2-он (100 мг, 0,22 мМ), цианид цинка (51 мг, 0,44 мМ), трис(дибензилиденацетон)дипалладия(0) (10 мг, 0,01 мМ) и 1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен (6 мг, 0,01 мМ). Смесь нагревали до 100°С в течение 4 ч. Смесь охлаждали до комнатной температуры и загружали на колонки с силикагелем. Элюировали на колонках 10% метанолом в дихлорметане, в результате получали указанное соединение (0,7 г, 72%) в форме желтого масла.

М8 (Е8) т/ζ 442 [М+1]⁺.

Пример 25. 1-(2-{4-[7-(3-Аминопиридин-4-ил)бензо[Ь]тиофен-2-ил]-5-фторпиримидин-2-иламино} этил)имидазолидин-2-он.

В закрытом флаконе соединяли и нагревали до 85°С в течение 4 ч н-{4-[2-(2-хлор-5фторпиримидин-4-ил)бензо[Ь]тиофен-7-ил]пиридин-3-ил}-2,2-диметилпропионамид (330 мг, 0,75 мМ), 2(аминоэтил)-1,3-дигидроимидазолон (386 мг, 3,0 мМ) и 1,4-диоксан (6 мл). Концентрировали в вакууме.

- 16 016177

Смесь разбавляли дихлорметаном и водой. Органический раствор промывали водой. Органический раствор сушили над сульфатом натрия. Раствор фильтровали и концентрировали в вакууме, в результате получали темный остаток. Очищали путем колоночной хроматографии (от дихлорметана до 7% метанола в дихлорметане), в результате получали ^[4-(2-{5-фтор-2-[2-(2-оксоимидазолидин-1-ил)этиламино]пиримидин-4-ил}бензо[Ь]тиофен-7-ил)пиридин-3-ил]-2,2-диметилпропионамид.

Промежуточное амидное соединение переносили в закрытый мембраной флакон на 40 мл. Добавляли магнит для перемешивания на мешалке и заполняли флакон водой (20 мл) и концентрированной И₂8О₄ (5 мл). Флакон нагревали до 90°С на масляной бане в течение 5 ч. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и проводили через колонку с 8СХ (10 г). Элюировали смесью вода/метанол 1:1, затем 100% метанолом, затем смесью 1:1 дихлорметан/метанол и, наконец, элюировали продукт 10% раствором 2М аммиака в метаноле/90% дихлорметана. Концентрировали в вакууме. При хроматографии на силикагеле (80 г) элюировали градиентом от 0 до 10% раствора 2М аммиака/метанола в дихлорметане. Сушили в вакуумной печи при 42°С в течение 2 ч, в результате получали указанное соединение (192,6 мг, 48%) в форме твердого вещества золотистого цвета.

М8 (Ε8) т/ζ 450 [М+1]⁺.

Следующие примеры получали, по существу, в соответствии с примером синтеза 1-(2-{4-[7-(3аминопиридин-4-ил)бензо[Ь]тиофен-2-ил]-5-фторпиримидин-2-иламино}этил)имидазолидин-2-она, используя

исходный

Пр.	Название соединения	Структура	Физические данные М3 (ЕЗ) т/ζ [М+1]⁺
26	1- (2—{4-[7-(3метиламинопиридин -4- ил) бензо [£>] тиофен -2-ил]пиримидин- 2- иламино}этил) имидазолидин-2-он		446
27	1-(2-{4-[7-(3аминопиридин-4ил)бензо[Ъ]тиофен -2-ил]-5метилпиримидин-2иламино}этил) имидазолидин-2-он	^н’^с	446
28	1- (2-{4-[7-(3- аминопиридин-4ил)бензо[Ь]тиофен -2-ил]пиримидин- 2- иламино}этил)имид азолидин-2-он		432

Пример 29. 1-(2-{4-[7-(5-Амино-2-фторпиридин-4-ил)бензо[Ь]тиофен-2-ил]пиримидин-2-иламино} этил)имидазолидин-2-он.

В закрытом флаконе соединяли и нагревали до 70°С в течение 15 ч трет-бутиловый эфир {4-[2-(2хлорпиримидин-4-ил)бензо[Ь]тиофен-7-ил]-6-фторпиридин-3-ил}карбаминовой кислоты (813 мг, 1,77

- 17 016177 мМ), 2-(аминоэтил)-1,3-дигидроимидазолон (919 мг, 7,11 мМ) и 1,4-диоксан (22 мл). Концентрировали в вакууме. Смесь разбавляли дихлорметаном и водой. Органический раствор промывали водой. Органический раствор сушили над сульфатом натрия. Фильтровали и концентрировали раствор в вакууме, получали темный остаток. Очищали путем колоночной хроматографии (дихлорметан и этилацетат), в результате получали трет-бутиловый эфир [6-фтор-4-(2-{2-[2-(2-оксоимидазолидин-1-ил)этиламино]пиримидин-4-ил}бензо[Ь]тиофен-7-ил)пиридин-3-ил]карбаминовой кислоты.

трет-Бутиловый эфир [6-фтор-4-(2- {2-[2-(2-оксоимидазолидин-1-ил)этиламино] пиримидин-4ил}бензо[Ь]тиофен-7-ил)пиридин-3-ил]карбаминовой кислоты растворяли в дихлорметане и адсорбировали на силикагеле (10 г) путем концентрирования под вакуумом. Сушили под глубоким вакуумом в течение 24 ч. Силикагель помещали в круглодонную колбу и нагревали в масляной бане до контролируемой температуры 98-99°С при глубоком вакууме в течение 2 ч. Охлаждали до комнатной температуры. Продукт экстрагировали на силикагеле 10% 7Ν аммиака в метаноле/90% дихлорметан. Концентрировали в вакууме. Хроматографировали на силикагеле, элюировали градиентом от 100% дихлорметана до 7% 2Ν аммиака в метаноле/93% дихлорметана, в результате получали указанное соединение (65,2 мг, 8,2%).

М8 (Е8) т/ζ 450 [М+1]⁺.

Пример 30. 1-(2-{4-[7-(3-Амино-2-фторпиридин-4-ил)бензо[Ь]тиофен-2-ил]пиримидин-2-иламино} этил)имидазолидин-2-он.

Указанное соединение получали, по существу, в соответствии с примером синтеза 1-(2-{4-[7-(5амино-2-фторпиридин-4-ил)бензо[Ь]тиофен-2-ил]пиримидин-2-иламино}этил)имидазолидин-2-она, используя соответствующий исходный материал.

М8 (Е8) т/ζ 450 [М+1]⁺.

Пример 31. 1-(2-{5-Фтор-4-[7-(2-фтор-5-гидроксиметилпиридин-4-ил)бензо[Ь]тиофен-2-ил]пиримидин-2-иламино} этил)имидазолидин-2-он.

В закрытой выдерживающей давление пробирке в 5 мл диоксана соединяли 1-(2-{5-фтор-4-[7(4,4,5,5-тетраметил-[1,3,2]диоксаборолан-2-ил)бензо[Ь]тиофен-2-ил]пиримидин-2-иламино}этил)имидазолидин-2-он (120 мг, 0,25 мМ), (6-фтор-4-йодпиридин-3-ил)метанол (100 мг; 0,32 мМ), хлорид (1,1'бис(дифенилфосфино)ферроцен)палладия(11) (10,14 мг; 0,01 мМ), 2-(ди-трет-бутилфосфино)бифенил (2 мг, 0,01 мМ) и карбонат натрия (2М, 0,2 мл, 0,4 мМ). Смесь нагревали до 100°С в течение суток в масляной бане. Смесь охлаждали до комнатной температуры, разбавляли смесью хлороформ-изопропиловый спирт (3/1). Органическую фазу промывали насыщенным водным хлоридом натрия, сушили над сульфатом натрия и концентрировали до маслянистого остатка. Сырой продукт очищали путем колоночной флэш-хроматографии (10% метанол в дихлорметане), в результате получали указанное соединение (25 мг, 21%).

М8 (Е8) т/ζ 483 [М+1]⁺.

Пример 32. 1-(2-{5-Фтор-4-[7-(2-фтор-5-(фторметил)пиридин-4-ил)бензо[Ь]тиофен-2-ил]пиримидин-2-иламино} этил)имидазолидин-2-он.

- 18 016177

В закрытой выдерживающей давление пробирке в 5 мл диоксана соединяли 1-(2-{5-фтор-4-[7(4,4,5,5-тетраметил[1,3,2]диоксаборолан-2-ил)бензо[Ь]тиофен-2-ил]пиримидин-2-иламино}этил)имидазолидин-2-он (120 мг, 248,26 мкМ), 2-фтор-5-фторметил-4-йодпиридин (100 мг, 392,15 мкМ), трис(дибензилиденацетон)дипалладий(О) (11,37 мг, 12,41 мкМ), трициклогексилфосфин (2,09 мг, 7,45 мкМ), фосфат калия (105,39 мг, 496,51 мкМ). Смесь нагревали до 100°С в течение 3 ч в масляной бане. ЖХ-МС показала пик при 485. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и разбавляли смесью хлороформ-изопропиловый спирт (3/1).

Органический раствор промывали насыщенным водным хлоридом натрия, сушили над сульфатом натрия и концентрировали, в результате получали сырой продукт. Сырой продукт очищали путем флэшхроматографии (10% метанол в дихлорметане), в результате получали желаемый продукт (70 мг, 58,2%).

М8 (Е8) т/ζ 485 [М+1]⁺.

Тесты

Показано, что Р1к1 экспрессия повышена во многих опухолях человека, таких как немелкоклеточный рак легких, рак ротовой полости и носа, рак пищевода, рак желудка, меланома, рак молочной железы, рак яичника, рак эндометрия, рак прямой и толстой кишки, глиобластома, сосочковая карцинома, рак поджелудочной железы, предстательной железы, гепатобластома и неходжкинские лимфомы. Кроме того, экспрессия Р1к1 имеет прогностическое значение для немелкоклеточного рака легких, рака носоглотки, пищевода, меланомы, гепатобластомы, прямой и толстой кишки и неходжкинских лимфом (8йеЬЬагЛ, К. и А. и11псй (2006). №1игс йе\зе\\'8 Сапсег 6(4): 321-30). Фосфорилированные субстраты Р1к1 регулируют прохождение митоза путем координирования созревания центросом, входа в митоз, разделения сестринских хроматид и цитокинеза (Ескегй! и 81геЬЬагй1 2006; 81геЬЬагй1 ап4 и11псй 2006; уап 4е Аеегй1, В.С. и К..Н. Мейета (2006). Се11 Сус1е 5(8): 853-64). Ингибирование функции Р1к1 путем введения антител, экспрессия доминантной негативной Р1к1 и снижение количества антисмысловой мРНК приводит к возникновению однополярных веретен деления и задержке анафазы, что приводит к смерти митотической клетки в линиях опухолевых клеток, но к обратимой задержке 02 в нормальных нетрансформированных первичных линиях клеток.

Кроме того, существуют сообщения о том, что Р1к можно использовать при лечении рабдоидных опухолей (ΜοΓοζον А., е! а1., Сйшса1 Сапсег йезеагсй. 13 (16):4721-30, (Аид 15, 2007)).

Активность соединения В1-2536 была продемонстрирована в доклинических моделях с использованием ксенографтных опухолей мыши НСТ116, А549 и ИС1Н460 (Вайт, А., Р. Сагт-СЬеза, е! а1. (2006). #С 191 1п νίνο асШйу οί В1 2536, а ро1еп1 ап4 зе1есШе тЫЬйог οί тйойс ктазе РИК1, т а гапде οί сапсег хеподгайз. Международная конференция ААСК.-ИС1-ЕОК.ТС ΜοΚ€·ΐι1πΓ Тагде1з ап4 Сапсег ТЬегареийсз, РЫ1йе1рЫа, РА).

Результаты следующих тестов указывают на то, что соединения согласно настоящему изобретению можно применять в качестве противораковых средств.

Экспрессия и очистка Р1к1.

КДНК Р1к1 человека, которую можно получить из множества источников, таких как 1псу!е (номер доступа: НМ_005030), можно напрямую соединить одним концом с полинуклеотидной последовательностью, экспрессирующей метку Н1з₆, такой как С-концевая метка РИА0-Н1з₆, встроить в подходящий вектор экспрессии, такой как вектор рРаз!Вас™ (1исйгодеп), и трансфецировать в подходящую систему, такую как бакуловирус, подобный описанному в Уие-Мс! Οίππ, е! а1., 8с1епсе 282, 1701 (1998) для хР1кк1. В случае использования вирусной системы экспрессии вирус (например, бакуловирус, несущий полинуклеотидный конструкт Р1к1-Р1ад-Н1з₆ метка), вводили в культуру подходящих клеток-хозяев, таких как клетки 8©. Когда экспрессировалось достаточное количество белка слияния Р1к1-Р1ад-Н1з₆, например, примерно через 46 ч после инфицирования, культуру обрабатывали окадаевой кислотой (0,1 мкМ) в течение достаточного периода времени (например, 3 ч). Белки слияния Р1к1-Р1ад-Н1з₆ очищали от остатков клеток, используя металлоаффинную смолу, такую как ТАИОИ™ (Сй^есЬ, Саййд# 635503), с помощью хорошо известных в данной области техники методов. Очищенные тэги слияния Р1к1-Р1ад-Н1з₆ хранили до использования в подходящей среде, такой как 10 мМ НЕРЕ8, 150 мМ ИаС1, 0,01% ТМТОИ X100, 1 мМ дитиотрейтол (ИТТ), 10% глицерин, рН 7,5, при -80°С в небольших аликвотах. Очищенный белок слияния Р1к1-Р1ад-Н1з₆ идентифицировали методом МАИО1 (матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация).

- 19 016177

Экспрессия и очистка С8Т-Сбс25С(1-206).

Экспрессию кДНК гена Сбс25С человека. которую можно получить из множества источников. таких как 1псу1е (номер доступа: ΑΥ497474). можно осуществить в любой удобной системе экспрессии. после чего произвести очистку посредством хорошо известных методов. аналогичных тем. которые описаны в Βίη Оиуапд с1 а1.. Опсодепе. 18. 6029-6036 (1999). Одна подходящая система включает выращивание в течение ночи при 18°С Е.соб ВЬ21. трансформированной вектором р6ЕХ-2Т (Атегбйаш). в который встроена кДНК гена Сбб25С человека. для индукции экспрессии использовали 1 мМ изопропилбета-Э-тиогалактопиранозид.

Экспрессированный белок С8Т-Сбс25С(1-206). являющийся субстратом для Р1к1. можно очистить с помощью ΟΕυΤΑΤΗΙΟΝΗ 8ЕРНАВО8Е® 4В и хранить в подходящем растворе. таком как 10 мМ НЕРЕ8. 100 мМ №С1. рН 7.5. в небольших аликвотах при -80°С.

Тест на ингибирование Р1к1.

Реакционная смесь с киназой Р1к1 содержит фермент слияния Р1к1-Е1ад-Н18₆ (0.2 нг/мкл) в буфере. содержащем 50 мМ НЕРЕ8. рН 7.3. 1.0 мМ дитиотреитола. 5.0 мкМ АТФ. 10 мМ МдС1₂. 0.01% ΤΡΙΤΟΝ® Х-100. 0.4 мкКюри ³³Р-АТФ и 0.06 мкг/мкл пептида С8Т-Сбс25с (1-206). Использовали соединения в форме 10 мМ исходных растворов в ДМСО. Соединения серийно разбавляли 1:3 в 20% ДМСО для построения кривой концентрация-ответ по 10 точкам. а затем разбавляли 1:5 (от 20 мкМ до итоговых 0.001 мкМ при итоговой концентрации ДМСО 4%) в реакционной смеси для определения активности соединения. Реакцию проводили при комнатной температуре в течение 60 мин и затем прекращали путем добавления 60 мкл 10.0% Н₃РΟ₄. Реакционную смесь (85 мкл) переносили в 96-луночный планшет с фосфоцеллюлозным фильтром. смоченным 30 мкл 10.0% Н₃РО₄. инкубировали при комнатной температуре в течение 20-30 мин и затем 3 раза промывали 0.5% Н₃РΟ₄. Лунки высушивали. а затем добавляли 40 мкл М1сго8с1йТМ20 (Раскагб) и считывали на приборе \Уа11ас МIСΚΟΒЕΤΑ®^еΐ. Значения процентного ингибирования для 10 точек кривой концентрация-ответ затем анализировали. например. с помощью программы ΑСΤIVIΤΥ ВА8Е™ (ΙΌΒ8). используя логистическое уравнение с 4 параметрами. Абсолютные значения 1С₅₀ рассчитали на основании кривой. построенной по экспериментальным точкам. Все приведенные соединения имеют 1С₅₀ менее 100 нМ с минимальным значимым отношением (МЗО) 3.6. Например. соединение из примера 13 имеет 1С₅₀ примерно 23 нМ.

Тест на содержание рНН3(810). клеток в митозе и ДНК.

Клетки НеЬа из Американской коллекции стандартных культур клеток (АТСС) помещали по 200 клеток/лунка в 96-луночные планшеты Весктап О1ск|п5оп ΒΙΟί.ΌΑ^τ™1 и инкубировали в МЕМ (минимальная поддерживающая среда. например. ΟΙΒί,’Ο. каталог #11095) с 10% ФБС (фетальная бычья сыворотка) при 37°С. 5% СΟ₂ в течение 24 ч. Клетки обрабатывали путем добавления соединения (в 0.25% ДМСО) в среду. в 10 дозах дипазона от 0.5 до 0.0098 мкМ. После 23 ч выдержки с соединением клетки фиксировали. например. с помощью фиксатора РКЕРЕК™ |Апа1ес11 ЬТО.. са!а1од # 414] в течение 30 мин. затем разрушали. используя 0.1% ΊΈ.ΠΌΝ® Х100 в растворе фосфатно-солевого буфера (ФСБ) в течение 15 мин. Клетки 3 раза промывали ФСБ. затем расщепляли РНКазой в концентрации 50 мкг/мл. К клеткам добавляли первичное антитело к фосфорилированному гистону Н3 (ир81а1е Са1#06-570). 1:500 в ФСБ с 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) и оставляли на ночь при 4°С. После 3-кратной промывки ФСБ. клетки инкубировали с меченым А1еха488 вторичным антителом (1пуйгодеп са1 # А11008) в течение 1 ч при комнатной температуре. Снова 3 раза промывали ФСБ и затем на 30 мин добавляли 15 мкМ пропидия йодид (Мо1еси1аг РгоЬез са1 # Р3566) для окрашивания ядер. Флюоресценцию планшетов считывали с помощью ΑСυМЕN ЕXР^ΟΚЕΚ™ [лазерный сканирующий флюоресценцию цитометр для микропланшетов (состоит из 488 нм ионного аргонового возбуждающего лазера и фотоумножающей трубки детекции). производится ТТР ЬАВТЕСН ЬТО.]. для определения фосфорилированного гистона Н3. содержания ДНК и доли клеток в митозе по результата определения уплотнения ДНК. Анализ изображения основан на сигналах флюоресценции от клеток для идентификации клеток в разных субпопуляциях. рНН3(810)-положительные клетки идентифицировали по средней интенсивности на 500-530 нм выше порога. Для идентификации индивидуальных клеток (клетки с содержанием ДНК от 2 до 4Ν) и субпопуляций клеточного цикла (клетки 2Ν. клетки 4Ν) использовали общую интенсивность от пропидия иодида/ДНК на 655-705 нм. Максимальную интенсивность на 575-640 нм использовали для идентификации уплотнения ДНК. которую использовали в качестве маркера определения клеток в митозе среди клеток 4Ν. Результаты теста выражаются как процентная доля каждой идентифицированной субпопуляции. % рННЗ. % 2Ν. % 4Ν. % клеток в митозе и общее число клеток. Значение ЕС₅₀ определяли по кривой. аппроксимированной аппроксимации каждого набора результатов 4-параметрической логистической кривой с использованием ΑСΤIVIΤΥ ВА8Е™. Полученные ЕС₅₀ Для РНН3(б10). содержания ДНК и митоза имеют МЗО 2.6. 2.4 и 2.5 соответственно. Например. соединение из примера 13 имеет ЕС₅₀рНН3(б10) = 42 нМ (п=2). ЕС₅₀ содержание ДНК = 40 нМ (п=2) и ЕС₅₀ митотическое = 45 нМ (п=1).

Тест на антипролиферативное действие.

Влияние соединений на пролиферацию клеток можно определить. используя клетки и методы пролиферации клеток. известные в данной области (КоЬей С. 8с.|иа1п1о е1 а1.. 6упесо1одюа1 Οпсо1оду. 58. 101

- 20 016177

105, (1995)). Например, клетки НСТ116, которые можно получить из АТСС, высевали в концентрации ~2000 клеток/лунка в 96-луночный планшет и оставляли в течение суток во влажном СО₂-инкубаторе при 37°С. После 20-24 ч инкубации добавляли серийно разбавленные (полулогарифмическое разбавление) соединения и возвращали планшеты в инкубатор. После выдержки подходящей продолжительности (например, 72 ч) определяли пролиферацию клеток, используя хорошо известные методы. В одном методе в планшет с клетками добавляли 10 мкл соли тетразолия, такой как А1атаг В1ие™. После соответствующей экспозиции в красителе определяли флюоресценцию (возбуждение на 530 нм, испускание на 580 нм). Полученное значение 1С₅₀ имеет МЗО 3,1. Например, соединение из примера 13 имеет 1С₅₀ 11 нМ (п=3).

Соединения согласно настоящему изобретению предпочтительно имеют форму фармацевтических композиций, вводимых рядом различных путей. Наиболее предпочтительны композиции для перорального введения. Подобные фармацевтические композиции и способы их получения хорошо известны в данной области. См., например, КЕМШОТОК 8С1ЕЖЕ ΑΝΌ РКАСТ1СЕ ОЕ РНАКМАСУ (А. Оеппаго, е! а1., ебз., 19^1Ь еб., Маск РиЫЫппц Со., 1995).

Соединения формулы I в целом являются эффективными в широком диапазоне дозировок. Например, дозировка на день обычно находится в пределах от примерно 0,01 до примерно 20 мг/кг массы тела, более предпочтительно от 0,1 до 20 мг/кг массы тела. В некоторых случаях более подходящим может быть уровень дозы, находящийся ниже нижнего предела указанного дипазона, в то время как в других случаях можно применять большие дозы при отсутствии каких-либо нежелательных побочных эффектов, и следовательно указанный диапазон дозировок никоим образом не ограничивает объем настоящего изобретения. Понятно, что количество фактически вводимого соединения будет определено врачом в зависимости от значимых факторов, включая состояние, которое нужно лечить, выбранный путь введения, конкретное вводимое соединение или соединения, возраст, вес и реакцию конкретного пациента и тяжесть симптомов заболевания данного пациента.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Соединение формулы где К¹ представляет собой водород, гидрокси, гидроксиметил, галоген, метил, фторметил, С₁-С₂алкокси, амино или метиламино;

К² представляет собой водород, галоген или циано;

К³ представляет собой водород или галоген;

при условии, что по меньшей мере один из К¹, К² и К³ представляет собой водород; и

К⁴ представляет собой водород, галоген или метил; или фармацевтически приемлемая соль такого соединения.
2. Соединение по п.1, отличающееся тем, что

К¹ представляет собой водород, гидрокси, гидроксиметил, хлор, фтор, метил, фторметил, С₁С2алкокси, амино или метиламино;

К² представляет собой водород, фтор или циано;

К³ представляет собой водород, хлор или фтор;

при условии, что по меньшей мере один из К¹, К² и К³ представляет собой водород; и

К⁴ представляет собой водород, хлор, фтор или метил; или фармацевтически приемлемая соль такого соединения.
3. Соединение по п.1, отличающееся тем, что

К¹ представляет собой водород или метил, фторметил;

К² представляет собой водород или фтор;

К³ представляет собой водород, хлор или фтор;

при условии, что по меньшей мере один из К¹, К² и К³ представляет собой водород; и

К⁴ представляет собой водород, хлор, фтор или метил; или фармацевтически приемлемая соль такого соединения.
4. Соединение по п.1, отличающееся тем, что К¹ представляет собой галоген, К² представляет собой водород, К³ представляет собой галоген и К⁴ представляет собой галоген, или фармацевтически прием

- 21 016177 лемая соль такого соединения.
5. Соединение, выбранное из группы, состоящей из

1-(2-{4-[7-(2-хлорпиридин-4-ил)бензо[Ь]тиофен-2-ил]пиримидин-2-иламино}этил)имидазолидин-2она,

1-(2-{5-фтор-4-[7-(2-фтор-5-метилпиридин-4-ил)бензо[Ь]тиофен-2-ил]пиримидин-2-иламино}этил) имидазолидин-2-она,

1-(2-{4-[7-(2-фтор-5-метилпиридин-4-ил)бензо[Ь]тиофен-2-ил]-5-метилпиримидин-2-иламино}этил) имидазолидин-2-она,

1-(2-{4-[7-(2-фтор-5-метилпиридин-4-ил)бензо[Ь]тиофен-2-ил]пиримидин-2-иламино}этил)имидазолидин-2-она,

1-{2-[5-метил-4-(7-пиридин-4-илбензо[Ь]тиофен-2-ил)пиримидин-2-иламино]этил}имидазолидин-2она,

1-(2-{5-хлор-4-[7-(2-фтор-5-метилпиридин-4-ил)бензо[Ь]тиофен-2-ил]пиримидин-2-иламино}этил) имидазолидин-2-она,

1-{2-[5-фтор-4-(7-пиридин-4-илбензо[Ь]тиофен-2-ил)пиримидин-2-иламино]этил}имидазолидин-2она,

1-(2-{4-[7-(3-этоксипиридин-4-ил)бензо [Ь]тиофен-2-ил]-5-фторпиримидин-2-иламино }этил)имидазолидин-2-она,

1-(2-(5-фтор-4-(7-(3 -гидроксипиридин-4-ил)бензо [Ь]тиофен-2-ил)пиримидин-2-иламино)этил)имидазолидин-2-она,

1-(2-{4-[7-(2-хлор-5-этоксипиридин-4-ил)бензо[Ь]тиофен-2-ил]-5-фторопиримидин-2-иламино} этил)имидазолидин-2-она,

1-(2-{5-фтор-4-[7-(3-метоксипиридин-4-ил)бензо[Ь]тиофен-2-ил]пиримидин-2-иламино}этил)имидазолидин-2-она,

1-(2-(5-хлор-4-(7-(пиридин-4-ил)бензо[Ь]тиофен-2-ил)пиримидин-2-иламино)этил)имидазолидин-2она,

1-(2-{5-хлор-4-[7-(5-хлор-2-фторпиридин-4-ил)бензо[Ь]тиофен-2-ил]пиримидин-2-иламино}этил) имидазолидин-2-она,

1-(2-{4-[7-(2-хлорпиридин-4-ил)бензо[Ь]тиофен-2-ил]-5-фторопиримидин-2-иламино}этил)имидазолидин-2-она,

1-(2-{5-хлор-4-[7-(2-хлорпиридин-4-ил)бензо[Ь]тиофен-2-ил]пиримидин-2-иламино}этил)имидазолидин-2-она,

1-(2-{4-[7-(5-хлор-2-фторпиридин-4-ил)бензо[Ь]тиофен-2-ил]-5-фторопиримидин-2-иламино}этил) имидазолидин-2-она,

1-(2-{4-[7-(2-хлор-5-фторпиридин-4-ил)бензо[Ь]тиофен-2-ил]-5-фторопиримидин-2-иламино}этил) имидазолидин-2-она,

1-(2-{4-[7-(3-хлорпиридин-4-ил)бензо[Ь]тиофен-2-ил]-5-фторопиримидин-2-иламино}этил)имидазолидин-2-она,

1-(2-{5-фтор-4-[7-(3-метилпиридин-4-ил)бензо[Ь]тиофен-2-ил]пиримидин-2-иламино}этил)имидазолидин-2-она,

1-(2-{4-[7-(5-хлор-2-фторпиридин-4-ил)бензо[Ь]тиофен-2-ил]-5-метилпиримидин-2-иламино}этил) имидазолидин-2-она,

1-(2-{4-[7-(2,5-дихлорпиридин-4-ил)бензо[Ь]тиофен-2-ил]-5-фторопиримидин-2-иламино}этил) имидазолидин-2-она,

1-(2-{5-фтор-4-[7-(2-фторпиридин-4-ил)бензо[Ь]тиофен-2-ил]пиримидин-2-иламино}этил)имидазолидин-2-она,

1-(2-{4-[7-(5-хлор-2-фторпиридин-4-ил)бензо[Ь]тиофен-2-ил]пиримидин-2-иламино}этил)имидазолидин-2-она,

4-(2-(2-(2-(2-оксоимидазолидин-1-ил)этиламино)пиримидин-4-ил)бензо[Ь]тиофен-7-ил)пиколинонитрила,

1-(2-{4-[7-(3-аминопиридин-4-ил)бензо [Ь]тиофен-2-ил]-5-фторопиримидин-2-иламино }этил)имидазолидин-2-она,

1-(2-{4-[7-(3-метиламинопиридин-4-ил)бензо[Ь]тиофен-2-ил]пиримидин-2-иламино}этил)имидазолидин-2-она,

1-(2-{4-[7-(3-аминопиридин-4-ил)бензо [Ь]тиофен-2-ил]-5-метилпиримидин-2-иламино }этил)имидазолидин-2-она,

1-(2-{4-[7-(3-аминопиридин-4-ил)бензо[Ь]тиофен-2-ил]пиримидин-2-иламино}этил)имидазолидин2-она,

1-(2-{4-[7-(5-амино-2-фторпиридин-4-ил)бензо[Ь]тиофен-2-ил]пиримидин-2-иламино}этил)имидазолидин-2-она,

1-(2-{4-[7-(3-амино-2-фторпиридин-4-ил)бензо[Ь]тиофен-2-ил]пиримидин-2-иламино}этил)имидазолидин-2-она,

- 22 016177

1-(2-{5-фтор-4-[7-(2-фтор-5-гидроксиметилпиридин-4-ил)бензо[Ь]тиофен-2-ил]пиримидин-2иламино}этил)имидазолидин-2-она и

1-(2-{5-фтор-4-[7-(2-фтор-5-(фторметил)пиридин-4-ил)бензо[Ь]тиофен-2-ил]пиримидин-2иламино}этил)имидазолидин-2-она; или фармацевтически приемлемая соль.
6. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение по пп.1-5 или фармацевтически приемлемую соль указанного соединения в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или наполнителем.
7. Применение соединения по любому из пп.1-5 или фармацевтически приемлемой соли такого соединения для использования при изготовлении лекарственного средства.

Евразийская патентная организация, ЕАПВ

Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2