JP5162095B2 - マイクロチップ、核酸抽出用のキット及び核酸の抽出方法 - Google Patents
マイクロチップ、核酸抽出用のキット及び核酸の抽出方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5162095B2 JP5162095B2 JP2005504072A JP2005504072A JP5162095B2 JP 5162095 B2 JP5162095 B2 JP 5162095B2 JP 2005504072 A JP2005504072 A JP 2005504072A JP 2005504072 A JP2005504072 A JP 2005504072A JP 5162095 B2 JP5162095 B2 JP 5162095B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- microbeads
- microchip
- acid extraction
- fine channel
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims description 43
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims description 43
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims description 43
- 238000000605 extraction Methods 0.000 title claims description 27
- 239000011325 microbead Substances 0.000 claims description 61
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 49
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 23
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims description 23
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 21
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 9
- 239000006087 Silane Coupling Agent Substances 0.000 claims description 6
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 claims description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 3
- DCFKHNIGBAHNSS-UHFFFAOYSA-N chloro(triethyl)silane Chemical compound CC[Si](Cl)(CC)CC DCFKHNIGBAHNSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M sodium iodide Chemical class [Na+].[I-] FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 7
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 6
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 6
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 125000001309 chloro group Chemical group Cl* 0.000 description 4
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 3
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 3
- 239000012756 surface treatment agent Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000001459 lithography Methods 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 235000009518 sodium iodide Nutrition 0.000 description 2
- 150000003613 toluenes Chemical class 0.000 description 2
- PYJJCSYBSYXGQQ-UHFFFAOYSA-N trichloro(octadecyl)silane Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC[Si](Cl)(Cl)Cl PYJJCSYBSYXGQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005046 Chlorosilane Substances 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- KOPOQZFJUQMUML-UHFFFAOYSA-N chlorosilane Chemical compound Cl[SiH3] KOPOQZFJUQMUML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- LIKFHECYJZWXFJ-UHFFFAOYSA-N dimethyldichlorosilane Chemical compound C[Si](C)(Cl)Cl LIKFHECYJZWXFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005530 etching Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 239000010813 municipal solid waste Substances 0.000 description 1
- 239000002102 nanobead Substances 0.000 description 1
- 238000000879 optical micrograph Methods 0.000 description 1
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 229910000077 silane Inorganic materials 0.000 description 1
- -1 silane compound Chemical class 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004381 surface treatment Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
- B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
- B01L3/502746—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by the means for controlling flow resistance, e.g. flow controllers, baffles
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J19/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J19/0093—Microreactors, e.g. miniaturised or microfabricated reactors
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
- B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
- B01L3/502707—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by the manufacture of the container or its components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00781—Aspects relating to microreactors
- B01J2219/00783—Laminate assemblies, i.e. the reactor comprising a stack of plates
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
- B01L2200/06—Fluid handling related problems
- B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
- B01L2200/0668—Trapping microscopic beads
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
- B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
- B01L2300/0816—Cards, e.g. flat sample carriers usually with flow in two horizontal directions
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2400/00—Moving or stopping fluids
- B01L2400/08—Regulating or influencing the flow resistance
- B01L2400/084—Passive control of flow resistance
- B01L2400/086—Passive control of flow resistance using baffles or other fixed flow obstructions
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Physical Or Chemical Processes And Apparatus (AREA)
Description
【技術分野】
本発明は、マイクロチップ、核酸抽出用のキット及び核酸の抽出方法に関する。
本出願は、日本国において２００３年３月２４日に出願された日本特許出願番号２００３−０８１６０５を基礎として優先権を主張するものであり、この出願は参照することにより、本出願に援用される。
【背景技術】
従来、ガラス等の基板表面にリソグラフィー等の微細加工技術によって深さ１００μｍ、幅５００μｍ程度までの大きさの溝を形成して、この溝を液体や気体の微細流路とし、化学反応、生化学反応、溶媒抽出、気液分離、更にはこれらに基づく微量成分の化学分析や非接触光学分析等を可能としたマイクロチップ技術が知られている。
このマイクロチップ技術については、本出願の発明者らによって、微細流路内に反応担体としてのマイクロビーズを挿入し、かつ微細流路内にダム形状の堰止め部を設けるようにした方策も提案されている（文献１）。
近年の分子遺伝子や分子生物学の進展とその医療等への応用の拡大に伴って、液体試料中からの核酸の抽出が大変に重要な課題になっていることから、マイクロチップ技術を核酸の抽出に利用することが検討されてきており、これまでにも、シリカビーズを用いる方法やシリカマイクロピラーを用いる方法、シリカフィルタを用いる方法等が提案されている（文献２−４）。
しかしながら、これまでのマイクロチップ技術においては、例えばシリカマイクロピラーやシリカフィルタを用いた核酸抽出の方法では高いコストで、汚れた場合に交換できないという基本的な問題があり、また、これまでのシリカ等のマイクロビーズを用いる方法においては、微細流路内への注入のために大きな圧力が必要であってビーズの充填が容易ではなかった。
そして、マイクロビーズをダム形状の堰止め部により堰止める従来の方法においては、液体試料の流れに澱みが発生しやすく、シリカ等のマイクロビーズの輸送を円滑に行うことが難しくなることがあるという問題があった。
また、従来では、ガラス、石英等をマイクロチップ基板として、微細流路を形成した場合には、流路内にゴミが生じやすく、しかもその除去が難しい場合があるという問題もあった。
以下、関連文献を示す。これらの文献は参照することにより、本出願に援用される。
１：Ｋ．Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７２，１１４４−１１４７（２０００）
２：Ｌ．Ｃｅｒｉｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏ ＴＡＳ ２００２ ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，Ｎａｒａ，ｐｐ．１７５−１７７
３：Ｊ．Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏ ＴＡＳ ２００２ ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，Ｎａｒａ，ｐｐ．２２４−２２６
４：Ｑ．Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，，（２００２）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏ ＴＡＳ ２００２ ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，Ｎａｒａ，ｐｐ．１９８−２００
【発明の開示】
そこで、上述のような従来技術の問題を解消するために、本発明の目的は、核酸の抽出に有効であるだけでなく、各種の反応担体としても有用なマイクロビーズを用いるマイクロチップ技術として、低コストに作製、調製することができ、流体試料の流れの澱みの発生が抑えられ、マイクロビーズの注入、充填、輸送を円滑に簡便に行うことができ、更にはゴミの発生も抑えることのできる新しい技術のマイクロチップと、これを用いる新しい核酸抽出方法を提供することである。
上述の目的を達成するために、本発明に係るマイクロチップは、上下基板の接合面に設けられた溝部によって微細流路が形成されており、微細流路には、その上基板の溝部内の突起部と下基板の溝部内の突起部とが対向することにより、微細流路の断面の上下又は上下左右の中央部に流路断面が縮小された隙間部が設けられている。また、隙間部は、上下基板の突起部の少なくとも一方を可動とすることによりその断面の大きさが可変とされてもよい。
また、本発明に係る核酸抽出用のキットは、上述のマイクロチップと、表面水酸基を持つマイクロビーズとを備える。この表面水酸基を持つマイクロビーズは、直径１０μｍ以下のシリカマイクロビーズ、中空のシリカマイクロビーズ及び樹脂マイクロビーズのうちの少なくとも１種であってもよい。内壁面に表面水酸基を持つマイクロチップ微細流路は、その表面水酸基が表面処理剤により被覆処理されてもよい。この表面処理剤は、トリアルキルハロゲノシランを主成分とするシランカップリング剤である。
更に、本発明に係る核酸の抽出方法は、上述の核酸抽出用のキットを用い、マイクロチップの微細流路内のマイクロビーズの表面に被処理液中の核酸を吸着させる。更に、核酸の吸着は、カオトロピックイオンの存在下に行ってもよい。
【図面の簡単な説明】
図１は、マイクロチップを模式的に例示した分解斜視図である。
図２Ａ及び図２Ｂは、図１のＡ及びＢ方向からの隙間部３１の断面図である。
図３Ａ〜３Ｃは、隙間部３１の他の例を示した断面図である。
図４Ａ及び図４Ｂは、更に、別の隙間部３１の例を示した断面図である。
図５は、実施例としてのＤＮＡの吸着について例示した光学顕微鏡写真の模式図である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明に係るマイクロチップ、核酸抽出用のキット及び核酸の抽出方法の実施の形態について、図面を参照して説明する。
図１及び２は、本発明に係るマイクロチップの部分的な構造を模式的に示すものであり、図１は、下の基板１と上の基板２が分離された状態を示しており、図２は、上下の基板１、２が接合した状態での微細流路３に設けられた隙間部３１について、図１の矢印Ａ及びＢの方向から見た部分断面を示している。
例えば、図１及び図２に示すマイクロチップにおいては、上下基板１、２の接合面に設けられた溝部１１、２１によって微細流路３が形成されている。そして、微細流路３には、その断面の上下の中央部に流路断面が縮小された隙間部３１が設けられている。
より具体的には、この図１及び図２の例の場合には、上下の基板１、２の各溝部１１、２１が対向することで微細流路３が形成されるとともに、各溝部１１、２１内に設けた突起部１２、２２が対向することによって隙間部３１が形成されるようにしている。
隙間部３１については、微細流路３の断面の中央部であればよく、図２に例示したスリット状の開口のように、上下の中央部だけでなく、例えば図３Ａに模式的に示すように、左右の中央部でも、あるいは図３Ｂに示すように、上下左右の中央部でもよい。もちろん、この隙間部３１の断面形状も各種であってよく、例えば図３Ｃに示すように、断面円形等の各種のものであってよい。これらの形状については、マイクロチップの溝部１１、２１及び突起部１２、２２を形成するための微細加工の手段やその条件、更には、微細流路内に注入するマイクロビーズの種類や大きさ等を考慮して決めることができる。
そして、隙間部３１の形成については、上下の基板１、２の各々の溝部１１、２１内に設けた突起部１２、２２によるものでなくてもよい。例えば図４に示すように、微細流路３そのものは、例えば下側の基板１に設けた溝部１１によって形成し、上側の基板２は、そのカバー板として存在させ、この微細流路３の構造において、上側の基板２に設けた突起部２３を溝部１１に挿入し、このものを溝部１１内の突起部１２と対向させることによって隙間部３１を形成することも可能である。
もちろん、隙間部３１については、以上の突起部１２、２２、２３による構成以外に様々であってよい。
また、これらの突起部１２、２２、２３は、基板１、２のリソグラフィーエッチング等による微細加工によって形成するだけでなく、例えばポリマの硬化による形成等の手段によるものとしてもよい。更に微細流路３に対しての外部からの微小部材の作用、更には、微細流路３そのものの変形等の手段によって隙間部３１を形成してもよい。
いずれの場合であっても、本発明に係るマイクロチップにおいては、微細流路３や隙間部３１の作製、調製を簡便に、低コストで行うことができ、しかも、微細流路３の断面の中央部に隙間部３１を設けることによって、微細流路３内にマイクロビーズを注入する場合に、液体や気体等の流体の流れの澱みの発生を抑え、マイクロビーズの注入を円滑に、しかも簡便に行うことを可能とするとともに、マイクロビーズの堰止めも可能とする。
微細流路３に設けられる隙間部３１については、このようにマイクロビーズを用いるものとしては、その断面の大きさが微細流路３内に注入したマイクロビーズを堰止めすることのできるものとする。また、この隙間部３１については、例えば上述の突起部、あるいはこれと同様の機能を有する部材等を可動とし、その断面の大きさを可変とすることも考慮される。断面の大きさを可変とした隙間部３１においては、微細流路３内のマイクロビーズを堰止めした後に、その断面を大きく拡大して、マイクロビーズを下流域に移流させることを可能とする。通常、マイクロビーズの排出のためには、注入とは逆方向に排出しなければならないが、この断面可変の隙間部３１によれば、注入と同じ順方向に排出することが可能になる。
例えば、上述のような本発明に係るマイクロチップにおいては、その利用目的や対象物の種類、性質に応じて、微細流路３内に試料物質や不純物、ゴミ等が付着しないように、その内壁面を表面処理剤で修飾することができる。例えば、ガラスや石英等から作製されたマイクロチップの場合には、通常、微細流路３の内壁表面には表面水酸基が存在し、この表面水酸基が核酸等と結合して、核酸等の物質の抽出、分離等を難しくすることがある。このような場合には、表面処理剤によって表面水酸基を被覆して不活化させることが有効である。本発明に係るマイクロチップは、マイクロビーズと組み合わせることによって特徴のある化学合成、あるいは分析用のキットとして極めて有用なものとなる。特に、本発明では、このようなキットとして、以上のようなマイクロチップと、表面水酸基を持つマイクロビーズとを備える核酸抽出用のキットを提供する。
そして、この場合の表面水酸基を持つマイクロビーズとしては、直径１０μｍ以下のシリカマイクロビーズ、中空のシリカマイクロビーズ、及び表面に水酸基が付与されたポリスチレン等の樹脂製のビーズが好適なものとして示される。直径が１０μｍ以上のシリカマイクロビーズの場合には、その比重の大きさによって微細流路３での輸送が困難である。
また、本発明の核酸抽出用のキットでは、微細流路内壁面に表面水酸基を持つものに対しては、この表面水酸基をシランカップリング剤で被覆処理することが好ましい。
なかでも、ハロゲン原子を一個有するトリアルキルハロゲノシラン、すなわち一般式が、
で表わされる化合物を用いたシランカップリング剤が好ましい。ここで、式中のＲ１、Ｒ２及びＲ３は、同一又は別異なアルキル基を示し、Ｘは、塩素原子等のハロゲン原子を示す。塩素原子等のハロゲン原子を２個以上有するシラン化合物の場合には、反応基であるハロゲン原子が内壁表面の水酸基と反応するだけでなく、分子相互の重合反応等によってゴミを生成させることがあるため、その使用には制約がある。
核酸抽出の方法としては、例えば図１及び図２のマイクロチップの例において、液導入口部４からマイクロビーズ含有液を注入して、微細流路３においてその隙間部３１で堰止め、次いで液導入口部５より試料を導入してマイクロビーズに核酸を吸着させる。残余の液は排出口部６より排出する。この吸着によって核酸が抽出されることになる。吸着された核酸は、脱着液の導入によってマイクロビーズより脱着させることができる。そして、この核酸抽出は、カオトロピックイオンの存在下に行うことが好適でもある。
本発明によって、簡便に、そして高効率で、核酸の抽出が可能とされる。
以下に実施例を示し、更に詳しく説明する。もちろん、以下の実施例によって発明が限定されるものではない。
実施例１．マイクロビーズの輸送
中央部に堰止め構造を有する直径５０μｍ、長さ６０ｍｍの微細流路を有するガラス製マイクロチップを用意した（図１）。微細流路の上方と下方の両側に突起部によるダム形状の堰止め構造の隙間部を形成した。微細流路の中央の隙間部は上下に２μｍ、左右に５０μｍのスリット状であった。微細流路の片方の口を注入口、他方を排出口とし、注入口に液貯めを設け、排出口にマイクロチューブを接続した。排出口のマイクロチューブにはシリンジポンプを接続し、シリンジポンプの動作によって液貯めに注入した液体が吸引され、微小流路中に注入できる実験システムを組み立てた。ここで、純水に懸濁したマイクロビーズを液貯めに注入し、マイクロビーズの微小流路中での輸送を光学顕微鏡を用いて観察した。マイクロビーズとして、シリカマイクロビーズ（直径１０μｍ以下）、シリカマイクロビーズ（直径１０μｍ以上）、中空のシリカマイクロビーズ（直径２〜２０μｍ）、表面に水酸基を付加したポリスチレンマイクロビーズ（直径２０μｍ）を用意した。毎分１０μｌの流速で吸引した。シリカマイクロビーズ（直径１０μｍ以上）以外のマイクロビーズはすべて微細流路内を良好に輸送され、堰止め構造の隙間部の直前部分にビーズのカラムを形成することができた。他方、直径１０ミクロンよりも大きなシリカマイクロビーズで、同様な実験を行ったところ、微小流路の途中で輸送が止まり、カラムの形成が不十分であった。特に、中空のシリカマイクロビーズと表面に水酸基を付加したポリスチレンマイクロビーズは、シリカナノビーズ（直径が１μｍ以下のビーズ）並みに輸送が良好であった。
シリンジポンプに純水を入れ、微細流路に注入したところ、シリカマイクロビーズ（直径１０μｍ以上）以外のマイクロビーズは、微細流路中を輸送され、液貯めに排出されることができた。
実施例２．微小流路の内壁の表面修飾処理
ガラスや石英等から作製したマイクロチップの場合には、微細流路の内壁表面への核酸の付着を防ぐため、微細流路の内壁の表面水酸基を被覆する必要がある。表面水酸基の被覆には、アルキル基と反応基を持つシランカップリング剤等による表面修飾処理が広く利用されている。したがって、微小流路の内壁処理もシランカップリング剤を用いて表面修飾処理を施せばよい。しかしながら、通常用いられているｏｃｔａｄｅｃｙｌｔｒｉｃｈｌｏｒｏｓｉｌａｎｅは、表面修飾のための反応基である塩素基を３つ持ち、微細流路の内壁の表面水酸基と反応するだけでなく、分子同士の重合により高分子を形成する。したがって、ｏｃｔａｄｅｃｙｌｔｒｉｃｈｌｏｒｏｓｉｌａｎｅの分子同士が反応し、高分子化することによってゴミを生じる。微細流路でなく、スライドガラスのような平板な基板の表面修飾処理では生じたゴミは溶媒で洗い流すことができ、問題は生じない。しかしながら、微細流路の内壁の処理では生じたゴミを容易には洗い流すことができない。微細流路内に堰止め構造が設けられている場合は特に取り除くのが難しい。微細流路中に残ったゴミは、微細流路中での液体やビーズの輸送の障害となるばかりでなく、核酸の吸着過程にも支障となる。また、反応基である塩素基が２つであるｄｉｃｈｌｏｒｏｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌａｎｅも広く用いられているが、沸点が低く（７０°Ｃ）、揮発性が高いために安全性が低い上に、反応基が２つであるため、分子同士の重合による高分子化を完全には防ぐことができない。
そこで、反応基が単数で原理的に高分子化せず、沸点が高く揮発性が低いことにより安全性が高く、常温で液体の扱いやすい表面修飾処理剤を検討した。例えばｔｒｉｅｔｙｌｃｈｌｏｒｏｓｉｌａｎｅは、反応基部位である塩素基が１つであり、原理的に高分子化をしない。加えて、沸点が１４５°Ｃ、融点が−５０°Ｃであるため、常温で揮発性が低く、液体であるため、ｔｏｌｕｅｎｅ等の溶媒への希釈が容易であり、扱いやすい。
ｔｒｉｅｔｈｙｌｃｈｌｏｒｏｓｉｌａｎｅ又はｏｃｔａｄｅｃｙｌｔｒｉｃｈｌｏｒｏｓｉｌａｎｅを用いて微細流路の内壁の表面修飾処理を行った。脱水ｔｏｌｕｅｎｅを溶媒として用い、各々の５％溶液を調製した。実施例１．で述べた実験システムを用いて、両者を比較した。調製された溶液を液貯めに注入し、シリンジポンプで吸引することにより、微細流路中に溶液を注入した。流量は毎分１０μｌとし、５０μｌの溶液を注入し、表面修飾を行った。そして、脱水ｔｏｌｕｅｎｅを５０μｌ以上注入し、表面処理後の微細流路を洗浄した。その洗浄中の微細流路を光学顕微鏡で観察した。ｏｃｔａｄｅｃｙｌｔｒｉｃｈｌｏｒｏｓｉｌａｎｅでは微細流路内にゴミを生じたが、ｔｒｉｅｔｈｙｌｃｈｌｏｒｏｓｉｌａｎｅでは生じなかった。ｔｒｉｅｔｈｙｌｃｈｌｏｒｏｓｉｌａｎｅでは更に濃度を１０％に上げ、同様の処理を試した。ゴミは生じなかった。
実施例３．微細流路内での核酸の抽出
実施例１．で述べた実験システムを用いて核酸の吸着を試した。微細流路の内壁表面は１０％ｔｒｉｅｔｈｙｌｃｈｌｏｒｏｓｉｌａｎｅを用いて実施例２．で述べたとおりに行った。核酸としてＣｏｌＥ１ＤＮＡを用いた。カオトロピックイオン溶液として飽和ヨウ化ナトリウム水溶液を用いた。実施例１．で述べたマイクロビーズ０．２ｇを１ｌの割合で、ヨウ化ナトリウム溶液中に懸濁し、２５μｌを液貯めから微細流路中に注入し、カラムを形成させた。溶媒としてヨウ化ナトリウムを用い、１％ＤＮＡ溶液を調製し、液貯めから微細流路内に注入した。次に、ＤＮＡの蛍光染色色素であるＳＹＢＲＧｒｅｅｎ Ｉ溶液を液貯めから微細流路内に注入した。微細流路を光学顕微鏡にて観察したところ、図５に示すように、シリカマイクロビーズ４１のカラム部４２のみが蛍光を発していることが確認された。実施例１．で用いたシリカマイクロビーズ４１にＤＮＡが吸着することが確かめられた。カラム部４２以外の微細流路からは蛍光は見られず、微細流路の内壁表面へのＤＮＡの吸着が生じないことも確認された。
実施例１．で述べた実験システムを用いて核酸の吸着と脱着を試した。実験システムは上述と同様とした。微細流路中に実施例１．で述べたマイクロビーズを注入し、カラムを形成した後、核酸を注入した。核酸としてはラムダＤＮＡを用いた。マイクロビーズへのラムダＤＮＡの吸着を光学顕微鏡を用いて確認した。６０°Ｃ以上の温純水を用意し、液貯めより微細流路に注入した。マイクロビーズからラムダＤＮＡの脱着を確認した。
以上より、核酸のマイクロビーズへの吸着と脱着が確認されたことにより、核酸の抽出を微細流路中で実現できることがわかった。
なお、本発明は、図面を参照して説明した上述の実施例に限定されるものではなく、添付の請求の範囲及びその主旨を逸脱することなく、様々な変更、置換又はその同等のものを行うことができることは当業者にとって明らかである。
【産業上の利用可能性】
以上詳しく説明したとおり、発明によって、核酸の抽出に有効であるだけでなく、各種の反応担体としても有用なマイクロビーズを用いるマイクロチップ技術として、低コストに作製、調製することができ、流体試料の流れの澱みの発生が抑えられ、マイクロビーズの注入、充填、輸送を円滑に簡便に行うことができ、更にはゴミの発生も抑えることのできる新しい技術手段とこれを用いる新しい核酸抽出方法を提供することができる。
本発明は、マイクロチップ、核酸抽出用のキット及び核酸の抽出方法に関する。
本出願は、日本国において２００３年３月２４日に出願された日本特許出願番号２００３−０８１６０５を基礎として優先権を主張するものであり、この出願は参照することにより、本出願に援用される。
【背景技術】
従来、ガラス等の基板表面にリソグラフィー等の微細加工技術によって深さ１００μｍ、幅５００μｍ程度までの大きさの溝を形成して、この溝を液体や気体の微細流路とし、化学反応、生化学反応、溶媒抽出、気液分離、更にはこれらに基づく微量成分の化学分析や非接触光学分析等を可能としたマイクロチップ技術が知られている。
このマイクロチップ技術については、本出願の発明者らによって、微細流路内に反応担体としてのマイクロビーズを挿入し、かつ微細流路内にダム形状の堰止め部を設けるようにした方策も提案されている（文献１）。
近年の分子遺伝子や分子生物学の進展とその医療等への応用の拡大に伴って、液体試料中からの核酸の抽出が大変に重要な課題になっていることから、マイクロチップ技術を核酸の抽出に利用することが検討されてきており、これまでにも、シリカビーズを用いる方法やシリカマイクロピラーを用いる方法、シリカフィルタを用いる方法等が提案されている（文献２−４）。
しかしながら、これまでのマイクロチップ技術においては、例えばシリカマイクロピラーやシリカフィルタを用いた核酸抽出の方法では高いコストで、汚れた場合に交換できないという基本的な問題があり、また、これまでのシリカ等のマイクロビーズを用いる方法においては、微細流路内への注入のために大きな圧力が必要であってビーズの充填が容易ではなかった。
そして、マイクロビーズをダム形状の堰止め部により堰止める従来の方法においては、液体試料の流れに澱みが発生しやすく、シリカ等のマイクロビーズの輸送を円滑に行うことが難しくなることがあるという問題があった。
また、従来では、ガラス、石英等をマイクロチップ基板として、微細流路を形成した場合には、流路内にゴミが生じやすく、しかもその除去が難しい場合があるという問題もあった。
以下、関連文献を示す。これらの文献は参照することにより、本出願に援用される。
１：Ｋ．Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７２，１１４４−１１４７（２０００）
２：Ｌ．Ｃｅｒｉｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏ ＴＡＳ ２００２ ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，Ｎａｒａ，ｐｐ．１７５−１７７
３：Ｊ．Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏ ＴＡＳ ２００２ ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，Ｎａｒａ，ｐｐ．２２４−２２６
４：Ｑ．Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，，（２００２）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏ ＴＡＳ ２００２ ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，Ｎａｒａ，ｐｐ．１９８−２００
【発明の開示】
そこで、上述のような従来技術の問題を解消するために、本発明の目的は、核酸の抽出に有効であるだけでなく、各種の反応担体としても有用なマイクロビーズを用いるマイクロチップ技術として、低コストに作製、調製することができ、流体試料の流れの澱みの発生が抑えられ、マイクロビーズの注入、充填、輸送を円滑に簡便に行うことができ、更にはゴミの発生も抑えることのできる新しい技術のマイクロチップと、これを用いる新しい核酸抽出方法を提供することである。
上述の目的を達成するために、本発明に係るマイクロチップは、上下基板の接合面に設けられた溝部によって微細流路が形成されており、微細流路には、その上基板の溝部内の突起部と下基板の溝部内の突起部とが対向することにより、微細流路の断面の上下又は上下左右の中央部に流路断面が縮小された隙間部が設けられている。また、隙間部は、上下基板の突起部の少なくとも一方を可動とすることによりその断面の大きさが可変とされてもよい。
また、本発明に係る核酸抽出用のキットは、上述のマイクロチップと、表面水酸基を持つマイクロビーズとを備える。この表面水酸基を持つマイクロビーズは、直径１０μｍ以下のシリカマイクロビーズ、中空のシリカマイクロビーズ及び樹脂マイクロビーズのうちの少なくとも１種であってもよい。内壁面に表面水酸基を持つマイクロチップ微細流路は、その表面水酸基が表面処理剤により被覆処理されてもよい。この表面処理剤は、トリアルキルハロゲノシランを主成分とするシランカップリング剤である。
更に、本発明に係る核酸の抽出方法は、上述の核酸抽出用のキットを用い、マイクロチップの微細流路内のマイクロビーズの表面に被処理液中の核酸を吸着させる。更に、核酸の吸着は、カオトロピックイオンの存在下に行ってもよい。
【図面の簡単な説明】
図１は、マイクロチップを模式的に例示した分解斜視図である。
図２Ａ及び図２Ｂは、図１のＡ及びＢ方向からの隙間部３１の断面図である。
図３Ａ〜３Ｃは、隙間部３１の他の例を示した断面図である。
図４Ａ及び図４Ｂは、更に、別の隙間部３１の例を示した断面図である。
図５は、実施例としてのＤＮＡの吸着について例示した光学顕微鏡写真の模式図である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明に係るマイクロチップ、核酸抽出用のキット及び核酸の抽出方法の実施の形態について、図面を参照して説明する。
図１及び２は、本発明に係るマイクロチップの部分的な構造を模式的に示すものであり、図１は、下の基板１と上の基板２が分離された状態を示しており、図２は、上下の基板１、２が接合した状態での微細流路３に設けられた隙間部３１について、図１の矢印Ａ及びＢの方向から見た部分断面を示している。
例えば、図１及び図２に示すマイクロチップにおいては、上下基板１、２の接合面に設けられた溝部１１、２１によって微細流路３が形成されている。そして、微細流路３には、その断面の上下の中央部に流路断面が縮小された隙間部３１が設けられている。
より具体的には、この図１及び図２の例の場合には、上下の基板１、２の各溝部１１、２１が対向することで微細流路３が形成されるとともに、各溝部１１、２１内に設けた突起部１２、２２が対向することによって隙間部３１が形成されるようにしている。
隙間部３１については、微細流路３の断面の中央部であればよく、図２に例示したスリット状の開口のように、上下の中央部だけでなく、例えば図３Ａに模式的に示すように、左右の中央部でも、あるいは図３Ｂに示すように、上下左右の中央部でもよい。もちろん、この隙間部３１の断面形状も各種であってよく、例えば図３Ｃに示すように、断面円形等の各種のものであってよい。これらの形状については、マイクロチップの溝部１１、２１及び突起部１２、２２を形成するための微細加工の手段やその条件、更には、微細流路内に注入するマイクロビーズの種類や大きさ等を考慮して決めることができる。
そして、隙間部３１の形成については、上下の基板１、２の各々の溝部１１、２１内に設けた突起部１２、２２によるものでなくてもよい。例えば図４に示すように、微細流路３そのものは、例えば下側の基板１に設けた溝部１１によって形成し、上側の基板２は、そのカバー板として存在させ、この微細流路３の構造において、上側の基板２に設けた突起部２３を溝部１１に挿入し、このものを溝部１１内の突起部１２と対向させることによって隙間部３１を形成することも可能である。
もちろん、隙間部３１については、以上の突起部１２、２２、２３による構成以外に様々であってよい。
また、これらの突起部１２、２２、２３は、基板１、２のリソグラフィーエッチング等による微細加工によって形成するだけでなく、例えばポリマの硬化による形成等の手段によるものとしてもよい。更に微細流路３に対しての外部からの微小部材の作用、更には、微細流路３そのものの変形等の手段によって隙間部３１を形成してもよい。
いずれの場合であっても、本発明に係るマイクロチップにおいては、微細流路３や隙間部３１の作製、調製を簡便に、低コストで行うことができ、しかも、微細流路３の断面の中央部に隙間部３１を設けることによって、微細流路３内にマイクロビーズを注入する場合に、液体や気体等の流体の流れの澱みの発生を抑え、マイクロビーズの注入を円滑に、しかも簡便に行うことを可能とするとともに、マイクロビーズの堰止めも可能とする。
微細流路３に設けられる隙間部３１については、このようにマイクロビーズを用いるものとしては、その断面の大きさが微細流路３内に注入したマイクロビーズを堰止めすることのできるものとする。また、この隙間部３１については、例えば上述の突起部、あるいはこれと同様の機能を有する部材等を可動とし、その断面の大きさを可変とすることも考慮される。断面の大きさを可変とした隙間部３１においては、微細流路３内のマイクロビーズを堰止めした後に、その断面を大きく拡大して、マイクロビーズを下流域に移流させることを可能とする。通常、マイクロビーズの排出のためには、注入とは逆方向に排出しなければならないが、この断面可変の隙間部３１によれば、注入と同じ順方向に排出することが可能になる。
例えば、上述のような本発明に係るマイクロチップにおいては、その利用目的や対象物の種類、性質に応じて、微細流路３内に試料物質や不純物、ゴミ等が付着しないように、その内壁面を表面処理剤で修飾することができる。例えば、ガラスや石英等から作製されたマイクロチップの場合には、通常、微細流路３の内壁表面には表面水酸基が存在し、この表面水酸基が核酸等と結合して、核酸等の物質の抽出、分離等を難しくすることがある。このような場合には、表面処理剤によって表面水酸基を被覆して不活化させることが有効である。本発明に係るマイクロチップは、マイクロビーズと組み合わせることによって特徴のある化学合成、あるいは分析用のキットとして極めて有用なものとなる。特に、本発明では、このようなキットとして、以上のようなマイクロチップと、表面水酸基を持つマイクロビーズとを備える核酸抽出用のキットを提供する。
そして、この場合の表面水酸基を持つマイクロビーズとしては、直径１０μｍ以下のシリカマイクロビーズ、中空のシリカマイクロビーズ、及び表面に水酸基が付与されたポリスチレン等の樹脂製のビーズが好適なものとして示される。直径が１０μｍ以上のシリカマイクロビーズの場合には、その比重の大きさによって微細流路３での輸送が困難である。
また、本発明の核酸抽出用のキットでは、微細流路内壁面に表面水酸基を持つものに対しては、この表面水酸基をシランカップリング剤で被覆処理することが好ましい。
なかでも、ハロゲン原子を一個有するトリアルキルハロゲノシラン、すなわち一般式が、
核酸抽出の方法としては、例えば図１及び図２のマイクロチップの例において、液導入口部４からマイクロビーズ含有液を注入して、微細流路３においてその隙間部３１で堰止め、次いで液導入口部５より試料を導入してマイクロビーズに核酸を吸着させる。残余の液は排出口部６より排出する。この吸着によって核酸が抽出されることになる。吸着された核酸は、脱着液の導入によってマイクロビーズより脱着させることができる。そして、この核酸抽出は、カオトロピックイオンの存在下に行うことが好適でもある。
本発明によって、簡便に、そして高効率で、核酸の抽出が可能とされる。
以下に実施例を示し、更に詳しく説明する。もちろん、以下の実施例によって発明が限定されるものではない。
実施例１．マイクロビーズの輸送
中央部に堰止め構造を有する直径５０μｍ、長さ６０ｍｍの微細流路を有するガラス製マイクロチップを用意した（図１）。微細流路の上方と下方の両側に突起部によるダム形状の堰止め構造の隙間部を形成した。微細流路の中央の隙間部は上下に２μｍ、左右に５０μｍのスリット状であった。微細流路の片方の口を注入口、他方を排出口とし、注入口に液貯めを設け、排出口にマイクロチューブを接続した。排出口のマイクロチューブにはシリンジポンプを接続し、シリンジポンプの動作によって液貯めに注入した液体が吸引され、微小流路中に注入できる実験システムを組み立てた。ここで、純水に懸濁したマイクロビーズを液貯めに注入し、マイクロビーズの微小流路中での輸送を光学顕微鏡を用いて観察した。マイクロビーズとして、シリカマイクロビーズ（直径１０μｍ以下）、シリカマイクロビーズ（直径１０μｍ以上）、中空のシリカマイクロビーズ（直径２〜２０μｍ）、表面に水酸基を付加したポリスチレンマイクロビーズ（直径２０μｍ）を用意した。毎分１０μｌの流速で吸引した。シリカマイクロビーズ（直径１０μｍ以上）以外のマイクロビーズはすべて微細流路内を良好に輸送され、堰止め構造の隙間部の直前部分にビーズのカラムを形成することができた。他方、直径１０ミクロンよりも大きなシリカマイクロビーズで、同様な実験を行ったところ、微小流路の途中で輸送が止まり、カラムの形成が不十分であった。特に、中空のシリカマイクロビーズと表面に水酸基を付加したポリスチレンマイクロビーズは、シリカナノビーズ（直径が１μｍ以下のビーズ）並みに輸送が良好であった。
シリンジポンプに純水を入れ、微細流路に注入したところ、シリカマイクロビーズ（直径１０μｍ以上）以外のマイクロビーズは、微細流路中を輸送され、液貯めに排出されることができた。
実施例２．微小流路の内壁の表面修飾処理
ガラスや石英等から作製したマイクロチップの場合には、微細流路の内壁表面への核酸の付着を防ぐため、微細流路の内壁の表面水酸基を被覆する必要がある。表面水酸基の被覆には、アルキル基と反応基を持つシランカップリング剤等による表面修飾処理が広く利用されている。したがって、微小流路の内壁処理もシランカップリング剤を用いて表面修飾処理を施せばよい。しかしながら、通常用いられているｏｃｔａｄｅｃｙｌｔｒｉｃｈｌｏｒｏｓｉｌａｎｅは、表面修飾のための反応基である塩素基を３つ持ち、微細流路の内壁の表面水酸基と反応するだけでなく、分子同士の重合により高分子を形成する。したがって、ｏｃｔａｄｅｃｙｌｔｒｉｃｈｌｏｒｏｓｉｌａｎｅの分子同士が反応し、高分子化することによってゴミを生じる。微細流路でなく、スライドガラスのような平板な基板の表面修飾処理では生じたゴミは溶媒で洗い流すことができ、問題は生じない。しかしながら、微細流路の内壁の処理では生じたゴミを容易には洗い流すことができない。微細流路内に堰止め構造が設けられている場合は特に取り除くのが難しい。微細流路中に残ったゴミは、微細流路中での液体やビーズの輸送の障害となるばかりでなく、核酸の吸着過程にも支障となる。また、反応基である塩素基が２つであるｄｉｃｈｌｏｒｏｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌａｎｅも広く用いられているが、沸点が低く（７０°Ｃ）、揮発性が高いために安全性が低い上に、反応基が２つであるため、分子同士の重合による高分子化を完全には防ぐことができない。
そこで、反応基が単数で原理的に高分子化せず、沸点が高く揮発性が低いことにより安全性が高く、常温で液体の扱いやすい表面修飾処理剤を検討した。例えばｔｒｉｅｔｙｌｃｈｌｏｒｏｓｉｌａｎｅは、反応基部位である塩素基が１つであり、原理的に高分子化をしない。加えて、沸点が１４５°Ｃ、融点が−５０°Ｃであるため、常温で揮発性が低く、液体であるため、ｔｏｌｕｅｎｅ等の溶媒への希釈が容易であり、扱いやすい。
ｔｒｉｅｔｈｙｌｃｈｌｏｒｏｓｉｌａｎｅ又はｏｃｔａｄｅｃｙｌｔｒｉｃｈｌｏｒｏｓｉｌａｎｅを用いて微細流路の内壁の表面修飾処理を行った。脱水ｔｏｌｕｅｎｅを溶媒として用い、各々の５％溶液を調製した。実施例１．で述べた実験システムを用いて、両者を比較した。調製された溶液を液貯めに注入し、シリンジポンプで吸引することにより、微細流路中に溶液を注入した。流量は毎分１０μｌとし、５０μｌの溶液を注入し、表面修飾を行った。そして、脱水ｔｏｌｕｅｎｅを５０μｌ以上注入し、表面処理後の微細流路を洗浄した。その洗浄中の微細流路を光学顕微鏡で観察した。ｏｃｔａｄｅｃｙｌｔｒｉｃｈｌｏｒｏｓｉｌａｎｅでは微細流路内にゴミを生じたが、ｔｒｉｅｔｈｙｌｃｈｌｏｒｏｓｉｌａｎｅでは生じなかった。ｔｒｉｅｔｈｙｌｃｈｌｏｒｏｓｉｌａｎｅでは更に濃度を１０％に上げ、同様の処理を試した。ゴミは生じなかった。
実施例３．微細流路内での核酸の抽出
実施例１．で述べた実験システムを用いて核酸の吸着を試した。微細流路の内壁表面は１０％ｔｒｉｅｔｈｙｌｃｈｌｏｒｏｓｉｌａｎｅを用いて実施例２．で述べたとおりに行った。核酸としてＣｏｌＥ１ＤＮＡを用いた。カオトロピックイオン溶液として飽和ヨウ化ナトリウム水溶液を用いた。実施例１．で述べたマイクロビーズ０．２ｇを１ｌの割合で、ヨウ化ナトリウム溶液中に懸濁し、２５μｌを液貯めから微細流路中に注入し、カラムを形成させた。溶媒としてヨウ化ナトリウムを用い、１％ＤＮＡ溶液を調製し、液貯めから微細流路内に注入した。次に、ＤＮＡの蛍光染色色素であるＳＹＢＲＧｒｅｅｎ Ｉ溶液を液貯めから微細流路内に注入した。微細流路を光学顕微鏡にて観察したところ、図５に示すように、シリカマイクロビーズ４１のカラム部４２のみが蛍光を発していることが確認された。実施例１．で用いたシリカマイクロビーズ４１にＤＮＡが吸着することが確かめられた。カラム部４２以外の微細流路からは蛍光は見られず、微細流路の内壁表面へのＤＮＡの吸着が生じないことも確認された。
実施例１．で述べた実験システムを用いて核酸の吸着と脱着を試した。実験システムは上述と同様とした。微細流路中に実施例１．で述べたマイクロビーズを注入し、カラムを形成した後、核酸を注入した。核酸としてはラムダＤＮＡを用いた。マイクロビーズへのラムダＤＮＡの吸着を光学顕微鏡を用いて確認した。６０°Ｃ以上の温純水を用意し、液貯めより微細流路に注入した。マイクロビーズからラムダＤＮＡの脱着を確認した。
以上より、核酸のマイクロビーズへの吸着と脱着が確認されたことにより、核酸の抽出を微細流路中で実現できることがわかった。
なお、本発明は、図面を参照して説明した上述の実施例に限定されるものではなく、添付の請求の範囲及びその主旨を逸脱することなく、様々な変更、置換又はその同等のものを行うことができることは当業者にとって明らかである。
【産業上の利用可能性】
以上詳しく説明したとおり、発明によって、核酸の抽出に有効であるだけでなく、各種の反応担体としても有用なマイクロビーズを用いるマイクロチップ技術として、低コストに作製、調製することができ、流体試料の流れの澱みの発生が抑えられ、マイクロビーズの注入、充填、輸送を円滑に簡便に行うことができ、更にはゴミの発生も抑えることのできる新しい技術手段とこれを用いる新しい核酸抽出方法を提供することができる。
Claims (6)
- 上下基板の接合面に設けられた溝部によって微細流路が形成されるマイクロチップであって、
上記微細流路には、上記上基板の溝部内の突起部と上記下基板の溝部内の突起部とが対向することにより、該微細流路の断面の上下又は上下左右の中央部に流路断面が縮小された隙間部が設けられ、
上記微細流路の内壁面は、トリアルキルハロゲノシランを主成分とするシランカップリング剤で修飾されており、
上記隙間部は、上記上下基板の突起部の両方を可動とすることによりその断面の大きさが可変とされていることを特徴とするマイクロチップ。 - 上記隙間部の断面の大きさは、上記微細流路内に挿入したマイクロビーズを堰止めする大きさであることを特徴とする請求項１記載のマイクロチップ。
- 請求項１又は２に記載のマイクロチップと、
表面水酸基を持つマイクロビーズとを備えている核酸抽出用のキット。 - 上記表面水酸基を持つマイクロビーズは、直径１０μｍ以下のシリカマイクロビーズ、中空のシリカマイクロビーズ及び樹脂マイクロビーズのうちの少なくとも１種であることを特徴とする請求項３記載の核酸抽出用のキット。
- 請求項３又は４記載の核酸抽出用のキットを用いる核酸の抽出方法であって、
マイクロチップの微細流路内のマイクロビーズの表面に被処理液中の核酸を吸着させることを特徴とする核酸の抽出方法。 - カオトロピックイオンの存在下に行うことを特徴とする請求項５記載の核酸の抽出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005504072A JP5162095B2 (ja) | 2003-03-24 | 2004-03-24 | マイクロチップ、核酸抽出用のキット及び核酸の抽出方法 |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003081605 | 2003-03-24 | ||
| JP2003081605 | 2003-03-24 | ||
| JP2005504072A JP5162095B2 (ja) | 2003-03-24 | 2004-03-24 | マイクロチップ、核酸抽出用のキット及び核酸の抽出方法 |
| PCT/JP2004/003998 WO2004086055A1 (ja) | 2003-03-24 | 2004-03-24 | マイクロチップ、核酸抽出用のキット及び核酸の抽出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2004086055A1 JPWO2004086055A1 (ja) | 2006-06-29 |
| JP5162095B2 true JP5162095B2 (ja) | 2013-03-13 |
Family
ID=33094898
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2005504072A Expired - Fee Related JP5162095B2 (ja) | 2003-03-24 | 2004-03-24 | マイクロチップ、核酸抽出用のキット及び核酸の抽出方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8012680B2 (ja) |
| EP (1) | EP1607748B1 (ja) |
| JP (1) | JP5162095B2 (ja) |
| KR (1) | KR20050111785A (ja) |
| CN (1) | CN1764842B (ja) |
| WO (1) | WO2004086055A1 (ja) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006029798A (ja) * | 2004-07-12 | 2006-02-02 | Hitachi Software Eng Co Ltd | 試薬を内蔵した高反応効率生体物質検査チップ |
| WO2006095615A1 (ja) * | 2005-03-07 | 2006-09-14 | Kuraray Co., Ltd. | マイクロチャネルアレイ及び製造方法、並びにこれを用いた血液測定方法 |
| JP4904973B2 (ja) * | 2005-08-08 | 2012-03-28 | ソニー株式会社 | 核酸回収方法、核酸回収装置、並びに核酸供給装置 |
| JP4657084B2 (ja) * | 2005-11-02 | 2011-03-23 | パナソニック株式会社 | 試料分析用ディスク |
| JP2007147456A (ja) * | 2005-11-28 | 2007-06-14 | Seiko Epson Corp | マイクロ流体システム、試料分析装置、及び標的物質の検出または測定方法 |
| WO2008002882A2 (en) | 2006-06-26 | 2008-01-03 | Blood Cell Storage, Inc. | Device and method for extraction and analysis of nucleic acids from biological samples |
| JP4848896B2 (ja) * | 2006-08-31 | 2011-12-28 | 横河電機株式会社 | マイクロチップ |
| JP4297148B2 (ja) * | 2006-09-22 | 2009-07-15 | ソニー株式会社 | 核酸回収装置及び核酸回収方法 |
| WO2009117167A1 (en) | 2008-01-02 | 2009-09-24 | Blood Cell Storage, Inc. | Devices and processes for nucleic acid extraction |
| KR100945129B1 (ko) * | 2008-03-17 | 2010-03-02 | 고정문 | 디앤에이 정제용 칩 및 이를 이용한 정제 방법 |
| WO2009150583A1 (en) * | 2008-06-10 | 2009-12-17 | Koninklijke Philips Electronics N.V. | Diagnostic device |
| KR101563687B1 (ko) | 2008-09-02 | 2015-11-09 | 삼성전자주식회사 | 표적 분자 분리를 위한 미세유동 카트리지, 분리장치, 및 이를 이용한 표적 분자 분리 방법 |
| US8891084B2 (en) * | 2009-07-07 | 2014-11-18 | Sony Corporation | Microfluidic device |
| US8629264B2 (en) | 2011-05-19 | 2014-01-14 | Blood Cell Storage, Inc. | Gravity flow fluidic device for nucleic acid extraction |
| KR101428578B1 (ko) * | 2012-05-21 | 2014-08-12 | 한국과학기술원 | 미소입자 선택적 포획-회수 장치 |
| CN108031457B (zh) * | 2017-12-22 | 2020-11-17 | 深圳逗点生物技术有限公司 | 一种吸附核酸的复合材料及其制备方法、吸附核酸的装置 |
| IL263582A (en) * | 2018-12-09 | 2020-06-30 | Vbact Ltd | A system for photographing and monitoring flows |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0824600A (ja) * | 1994-07-11 | 1996-01-30 | Tokuyama Corp | ガラス多孔質膜 |
| WO2001032930A1 (en) * | 1999-11-04 | 2001-05-10 | California Institute Of Technology | Methods and apparatuses for analyzing polynucleotide sequences |
| WO2001038865A1 (en) * | 1999-11-26 | 2001-05-31 | The Governors Of The University Of Alberta | Apparatus and method for trapping bead based reagents within microfluidic analysis systems |
| JP3220158B2 (ja) * | 1994-11-14 | 2001-10-22 | トラスティーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ペンシルベニア | 分析対象物質の確定及び処理のためのメソ規模の試料前処理装置及びシステム |
| JP2002503331A (ja) * | 1995-12-05 | 2002-01-29 | ガメラ バイオサイエンス コーポレイション | 機内に搭載された情報科学を備えた超微量液体素子工学システムにおいて液体移動を推進するために求心性加速を使用するための装置及び方法 |
| JP2002532715A (ja) * | 1998-12-16 | 2002-10-02 | キュラゲン コーポレイション | 空間的且つ時間的に変動する電場による荷電粒子の分離 |
Family Cites Families (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2513608C2 (de) * | 1975-03-27 | 1982-08-05 | Degussa Ag, 6000 Frankfurt | Verfahren zur Hydrophobierung von Kieselsäuren und Silikaten mit Organosilanen |
| JPH03220158A (ja) | 1990-01-23 | 1991-09-27 | Sumitomo Pharmaceut Co Ltd | 光学活性カルバサイクリン誘導体の製造方法 |
| US5587128A (en) * | 1992-05-01 | 1996-12-24 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Mesoscale polynucleotide amplification devices |
| US5726026A (en) | 1992-05-01 | 1998-03-10 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | Mesoscale sample preparation device and systems for determination and processing of analytes |
| US5641400A (en) * | 1994-10-19 | 1997-06-24 | Hewlett-Packard Company | Use of temperature control devices in miniaturized planar column devices and miniaturized total analysis systems |
| US20010055812A1 (en) | 1995-12-05 | 2001-12-27 | Alec Mian | Devices and method for using centripetal acceleration to drive fluid movement in a microfluidics system with on-board informatics |
| US5900481A (en) * | 1996-11-06 | 1999-05-04 | Sequenom, Inc. | Bead linkers for immobilizing nucleic acids to solid supports |
| US6270970B1 (en) * | 1999-05-14 | 2001-08-07 | Promega Corporation | Mixed-bed solid phase and its use in the isolation of nucleic acids |
| US6272939B1 (en) * | 1999-10-15 | 2001-08-14 | Applera Corporation | System and method for filling a substrate with a liquid sample |
| SE0001790D0 (sv) * | 2000-05-12 | 2000-05-12 | Aamic Ab | Hydrophobic barrier |
| AU2001290879A1 (en) * | 2000-09-15 | 2002-03-26 | California Institute Of Technology | Microfabricated crossflow devices and methods |
| US6743516B2 (en) * | 2000-09-29 | 2004-06-01 | Guardian Industries Corporation | Highly durable hydrophobic coatings and methods |
| US7378280B2 (en) * | 2000-11-16 | 2008-05-27 | California Institute Of Technology | Apparatus and methods for conducting assays and high throughput screening |
| SE0004350D0 (sv) | 2000-11-27 | 2000-11-27 | Patrick Griss | System och metod för tillförlitliga passiva ventiler och gas volym dosering |
| US7060171B1 (en) * | 2001-07-31 | 2006-06-13 | Caliper Life Sciences, Inc. | Methods and systems for reducing background signal in assays |
| CN1304589C (zh) * | 2001-12-07 | 2007-03-14 | 清华大学 | 利用固相载体从生物粒子中分离核酸的方法 |
| US20040011650A1 (en) * | 2002-07-22 | 2004-01-22 | Frederic Zenhausern | Method and apparatus for manipulating polarizable analytes via dielectrophoresis |
-
2004
- 2004-03-24 JP JP2005504072A patent/JP5162095B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2004-03-24 US US10/550,302 patent/US8012680B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-03-24 KR KR1020057017815A patent/KR20050111785A/ko not_active Application Discontinuation
- 2004-03-24 EP EP04722945.5A patent/EP1607748B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-03-24 CN CN2004800082843A patent/CN1764842B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2004-03-24 WO PCT/JP2004/003998 patent/WO2004086055A1/ja active Application Filing
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0824600A (ja) * | 1994-07-11 | 1996-01-30 | Tokuyama Corp | ガラス多孔質膜 |
| JP3220158B2 (ja) * | 1994-11-14 | 2001-10-22 | トラスティーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ペンシルベニア | 分析対象物質の確定及び処理のためのメソ規模の試料前処理装置及びシステム |
| JP2002503331A (ja) * | 1995-12-05 | 2002-01-29 | ガメラ バイオサイエンス コーポレイション | 機内に搭載された情報科学を備えた超微量液体素子工学システムにおいて液体移動を推進するために求心性加速を使用するための装置及び方法 |
| JP2002532715A (ja) * | 1998-12-16 | 2002-10-02 | キュラゲン コーポレイション | 空間的且つ時間的に変動する電場による荷電粒子の分離 |
| WO2001032930A1 (en) * | 1999-11-04 | 2001-05-10 | California Institute Of Technology | Methods and apparatuses for analyzing polynucleotide sequences |
| WO2001038865A1 (en) * | 1999-11-26 | 2001-05-31 | The Governors Of The University Of Alberta | Apparatus and method for trapping bead based reagents within microfluidic analysis systems |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US8012680B2 (en) | 2011-09-06 |
| CN1764842A (zh) | 2006-04-26 |
| KR20050111785A (ko) | 2005-11-28 |
| EP1607748A4 (en) | 2012-05-30 |
| US20060234241A1 (en) | 2006-10-19 |
| JPWO2004086055A1 (ja) | 2006-06-29 |
| CN1764842B (zh) | 2012-01-11 |
| WO2004086055A1 (ja) | 2004-10-07 |
| EP1607748A1 (en) | 2005-12-21 |
| EP1607748B1 (en) | 2013-05-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5162095B2 (ja) | マイクロチップ、核酸抽出用のキット及び核酸の抽出方法 | |
| JP6744304B2 (ja) | ナノピラー・アレイを使用してエンティティを分別する方法 | |
| CN101169403B (zh) | 一种微流控芯片及其制备和应用 | |
| US8945478B2 (en) | Microfabricated devices with coated or modified surface and method of making same | |
| JP4464393B2 (ja) | ポリ電解質を含む高分散相エマルジョン発泡体 | |
| US9835539B2 (en) | Biopolymer separation using nanostructured arrays | |
| JP2002536640A (ja) | 微小流体導入の際のマルチチャネル制御 | |
| JP2007534313A (ja) | 核酸精製チップ | |
| CN105536747B (zh) | 一种智能响应液相色谱填料及其制备方法 | |
| JP6698076B2 (ja) | 生物高分子を分離するための吸着剤 | |
| WO2018232167A1 (en) | Nucleic acid extraction and purification cartridges | |
| KR20150087183A (ko) | 모놀리식 컬럼의 제조 방법 | |
| Song et al. | Emerging nanoporous materials for biomolecule separation | |
| JP4297148B2 (ja) | 核酸回収装置及び核酸回収方法 | |
| Nabesawa et al. | Low-pressure plasma-etching of bulk polymer materials using gas mixture of CF4 and O2 | |
| JP4410040B2 (ja) | マイクロ流体制御機構およびマイクロチップ | |
| Zhong et al. | Fabrication of two‐weir structure‐based packed columns for on‐chip solid‐phase extraction of DNA | |
| CN200982977Y (zh) | 一种用于集成固相萃取柱的微流控芯片 | |
| Morikawa et al. | Fabrication of hydrophobic nanostructured surfaces for microfluidic control | |
| US8557564B2 (en) | Method of separating microorganism using nonplanar solid substrate and device for separating microorganism using the same | |
| EP3141298A1 (en) | Polymeric microfluidic device for nucleic acid purification fabricated via plasma micro-nanotexturing | |
| JP2007106626A (ja) | 多孔質シリカ複合材の製造方法およびそれを用いた電気浸透流ポンプ | |
| Belder et al. | Coating of powder‐blasted channels for high‐performance microchip electrophoresis | |
| CN115003415A (zh) | 用于下一代测序库制备的微流控珠粒捕获装置和方法 | |
| Fernández‐Abedul et al. | Improving the separation in microchip electrophoresis by surface modification |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070228 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090825 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20091021 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20100608 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100908 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20100921 |
|
| A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20110107 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20121029 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20121217 |
|
| R151 | Written notification of patent or utility model registration |
Ref document number: 5162095 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20151221 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20151221 Year of fee payment: 3 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |