KR100945129B1 - 디앤에이 정제용 칩 및 이를 이용한 정제 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포수가 적은 시료의 DNA를 추출, 분석하기에 적합한 DNA 정제용 칩 및 이를 이용한 정제 방법을 개시한다.

본 발명은 원심분리기 등 고가의 설비를 전혀 사용하지 않도록 함과 아울러 최소화된 규격의 반응 수단과 단순화된 공정으로 DNA를 정제할 수 있도록 한 DNA 정제용 칩 및 이를 이용한 정제 방법을 제공하기 위한 것이다. 이를 위하여 본 발명은 수평면상의 수용공간에 수용된 비드역류 방지턱이 구비된 주입구, 비드의 유출을 방지하는 댐을 구비한 배출구로 된 DNA 정제용 칩을 이용하여 최소화된 공정으로 세포수가 적은 시료에서 DNA의 손실 없이 정제할 수 있도록 한 것이다.

이에 따라, 본 발명은 종래의 방법에서 필수적으로 사용하여야 하는 장비인 원심분리기가 불필요하게 되는 것이어서, 설비가 대폭 간소화될 뿐만 아니라, 극소량의 DNA인 경우에도 정제가 가능하게 되는 것이어서 세포수가 적은 수정란의 DNA의 추출 및 분석이나 법의학 등에서 이용되는 소수의 증거물 등에서의 DNA를 추출 및 정제할 수 있어서 분석을 용이하게 할 수 있게 되는 효과가 있으며, 정제 공정이 극히 단순화되어 작업 효율을 향상시킬 수 있게 되는 유용한 효과가 있다.

DNA 정제용 칩, PDMS (피디엠에스, 폴리메틸렌실록사인)

Description

디앤에이 정제용 칩 및 이를 이용한 정제 방법{Chip for DNA Purification and Purification Method Using There of}

본 발명은 세포수가 적은 시료의 DNA를 정제할 수 있는 DNA 정제용 칩 및 이를 이용한 정제 방법에 관한 것으로, 특히 세포수가 적은 시료의 DNA를 추출, 분석하기에 적합한 DNA 정제용 칩 및 이를 이용한 정제 방법에 관한 것이다.

종래에는 동, 식물 세포에서 추출한 DNA를 정제하기 위하여 유기용매에 파우더 상의 레진을 넣은 용액을 사용하였으며, 이러한 용액은 교반하여 현탁 상태로 한 후 DNA와 혼합하여 레진에 DNA가 부착되도록 한 다음, 원심분리과정을 통하여 레진을 침전시켜 분리되도록 하여 상층액을 버리는 과정을 2회 이상 실시한 후, DNA를 레진으로부터 분리해내기 위한 수용성용매에 넣어 원심 분리한 다음 상층액을 버리고, 침전된 DNA를 얻는 방식으로 정제하였던 것이다.

아울러, 근래에는 이러한 방법을 개선한 DNA를 정제하기 위하여 1회용 컬럼 키트가 널리 활용되고 있으며, 이의 사용법을 도 1에 도시하였다.

이러한 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 실리카 레진을 종이판 상으로 만들고 컬럼의 하부에 고정시키며, 4M의 구아니딘(guanidine) HCl을 포함하는 카오트로픽 염(chaotropic salt) 용액의 존재하에 있는 DNA를 컬럼에 넣은 후 원심분리기에서 회전시키면 용매는 빠져 나가고 DNA가 실리카 표면에 특이성을 가지고 부착된다. 또한, 이를 30% 이상의 에탄올(알콜)을 주성분으로 하는 카오트로픽 염이 포함된 유기용매를 넣고 다시 원심분리기에서 회전시켜 주면 용매가 재차 빠져 나가면서 DNA를 제외한 용매들이 씻겨지며 이와 같이 하여 얻은 컬럼에 70% 알콜을 주성분으로 하는 카오트로픽 염이 포함된 유기용매를 넣어 재차 원심분리를 실시하여 통과된 하층액은 버린 다음 실리카 레진을 새로운 컬럼에 넣고 다시 원심분리를 실시하여 통과된 하층액은 버림으로써 DNA를 청결하게 한다.

이어서 미리 준비된 청결한 튜브에 pH 8.5의 약알칼리 수용성 용매를 넣고, 전술한 과정에서 얻은 실리카 레진 컬럼에 넣은 다음 원심분리를 실시한 후 최종적으로 정제된 DNA를 얻게 되는 것이다.

그러므로, 이상에서 살펴본 종래의 방법은 모두 원심분리기를 이용한 반복적인 교반 및 침전 공정 등을 실시하여야 하므로 작업 능률이 저조하게 될 뿐만 아니라, 원심분리기 및 다수의 컬럼이 필요하게 되는 것이어서 설비비용이 부담스럽게 되는 문제점이 있는 것이다. 아울러, 이러한 종래의 방법에서는 세포가 매우 적은 양인 경우 용매도 적어야 하는 것이나, 작업자가 직접 컬럼에 용매등을 넣어 수조작으로 취급하는 것이므로 컬럼에 담기는 용매의 양이 상대적으로 상당량 이상 되어야 하는 것이어서, 용매에 비하여 전체적인 DNA 양이 매우 적으므로 농도가 매우 낮게 되며, 이에 따라 수정된 난자에서 DNA를 추출하거나 단 하나의 머리카락에서 DNA를 추출하거나 정제하여야 할 경우 등 DNA가 극소량인 경우에는 컬럼을 이용한 지속적인 원심분리 과정에서 DNA손실을 초래하게 된다. 따라서 극소수의 DNA의 경우에는 기존의 방법으로는 정제가 불가능하게 되는 문제점이 발생할 수 있는 것이다.

뿐만 아니라, 이러한 종래의 방법은 공히 작업자가 컬럼 등의 용기에 DNA와 유기용매를 넣고 혼합하는 공정, 컬럼에서 DNA가 부착된 레진에 수용성 용매를 혼합하는 공정을 반복하는 것이어서 작업성이 저조하게 되는 문제점이 있는 것이다.

본 발명의 목적은 이러한 문제점을 해결하기 위하여 최소화된 규격의 반응 수단과 단순화된 공정으로 DNA를 정제할 수 있도록 한 DNA 정제용 칩 및 이를 이용한 정제 방법을 제공함에 있다.

본 발명은 이러한 목적을 달성하기 위하여 수평면상의 수용공간에 수용된 비드역류 방지턱이 구비된 주입구, 비드의 유출을 방지하는 댐을 구비한 배출구로 된 DNA 정제용 칩을 제안한다.

아울러, 본 발명은 피펫을 이용하여 DNA와 유기 용매의 혼합액을 주입구로 주입하면 이는 수용공간에 수용된 비드를 통과하면서 대부분의 유기 용매는 DNA를 비드에 부착시켜 주는 기능을 한 후 배출구로 배출된다. 이러한 과정으로 비드에 DNA가 부착된 다음 비드에 잔존하는 유기용매를 제거하기 위하여 피펫으로 알콜을 주성분으로 하는 용매를 주입구에 주입한다. 이에 따라 알콜이 비드 사이를 통과하면서 잔존하는 유기 용매를 배출구로 배출하게 되는 것이며, 이어서 빈 피펫으로 주입구에 공기를 불어 넣어 잔존해 있는 알콜 성분이 배출구로 배출되거나 증발할 수 있도록 하는 것이다. 이러한 상태에서 피펫을 사용하여 수용성용매를 주입구로 주입한다. 이에 따라 DNA가 비드로부터 분리되고, 배출구로 배출될 수 있는 것이므로, 정제된 DNA를 추출할 수 있게 되는 DNA 정제용 칩을 이용한 정제 방법을 제안한다.

이와 같이 하여 본 발명은 이에 따라, 본 발명은 종래의 방법 1, 2에서 필수적으로 사용하여야 하는 장비인 원심분리기가 불필요하게 되는 것이어서, 설비가 대폭 간소화될 뿐만 아니라,

극소량의 DNA인 경우에도 정제가 가능하게 되는 것이어서 세포수가 적은 수정란의 DNA의 추출 및 분석이나 법의학 등에서 이용되는 소수의 증거물에서의 DNA를 추출 및 정제할 수 있어서 분석을 용이하게 하여 수사에 유력한 증거를 제공할 수 있게 되는 등의 효과가 있다.

또한, 본 발명은 용액을 여러 번 다수의 컬럼으로 이동시키거나 용액을 따라 버리고, 원심분리기에 취부 및 탈거하는 등 많은 수작업이 불필요하게 되어 작업성이 크게 향상되는 것이며, 원심분리기를 사용하는 경우와 같은 전원이 불필요하며, 칩의 크기가 매우 작으므로 시간과 장소에 구애받지 않고 사용할 수 있는 유용한 효과가 있다.

이러한 본 발명을 첨부된 도면을 참조하여 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다. 본 발명에 의한 DNA정제용 칩을 도 2로 보였으며, 도 3에 본 발명에 의한 DNA정제용 칩의 분리 사시도를 보였고, 도 4에 본 발명에 의한 DNA정제용 칩의 평면도를 보였다. 이에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명은 서브스트레이트(SUBSTRATE)에 반도체 제조에 사용되는 포토레지스터를 이용한 식각 등의 방법으로 형성된 수평면상의 수용실(4)의 주입구(2)에 비드(7)역류 방지턱(3)과, 수용실(4)에 수용된 비드(7)와, 비드(7)의 유출을 방지하는 댐(5)을 구비한 배출구(6)를 형성한다. 이와 같이 한 후, 전술한 수용실(4)에 비드(7)를 넣고 그 위를 판체(8)로 덮어서 된 것이다. 이러한 본 발명에 의한 서브스트레이트는 PDMS(Polydimethylsiloxane), PMMA(Polymethyl Methacrylate), PP(Polypropylene)으로 된 것이면 사용가능하며, 판체(8)는 평활도가 높은 투명 유리를 사용하여 밀착되게 함과 아울러, 일련의 과정을 관측할 수 있도록 하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에서는 비드(7)의 재질은 가공이 용이하고 각종 용매에 반응을 일으키지 않는 재질로 하는 것이 바람직하며, 형상은 정원으로 된 것을 사용하여야 한다.

이와 같이 된 본 발명에 의한 DNA정제용 칩을 이용한 정제 방법을 도 5를 참조하여 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명을 실시하기 위하여 피펫을 준비하여야 한다. 이러한 피펫(Pipette)은 실험실에서 널리 사용하는 형태의 것으로, 용량의 눈금이 끝까지 그어져 있어 주입량 오차를 줄일 수 있도록 함으로써 작은 부피의 시료를 정밀하게 다룰 수 있는 형태의 것을 사용할 수 있다.

먼저, 본 발명은 피펫에 DNA와 구아니딘(Guanidine) HCl 등으로 된 유기용매를 넣어 서서히 주입한다.(단계 1)

이때 수용실(4)의 용적은 0.05cc 내지 0.30cc 로 한다. 이러한 상태로 주입된 DNA와 유기 용매의 혼합액은 수용실(4)의 비드(7)를 통과하게 되는 바, 이때 유기 용매는 DNA를 비드(7)에 부착시켜 준 후 배출구(6)로 배출된다.(단계 2) 이러한 과정에서 DNA는 비드(7)와 염다리(salt bridge)로 강력하게 결합되어 있게 되고 용매들만 압력차로 이동하게 되는 것이다. 이와 같이 하여 비드(7)에 DNA가 부착된 다음 비드(7)에 잔존하는 용매를 제거하기 위하여 피펫으로 40% 내지 80%의 알콜을 주성분으로 하는 용매를 주입구(2)로 주입한다.(단계 3)

이에 따라 알콜이 비드(7) 사이를 통과하면서 잔존하는 카오트로픽 유기 용매를 배출구(6)로 배출하게 되는 것이다.(단계 4)

이러한 알콜을 이용한 유기 용매 배출 작업은 필요에 따라 2회 이상 실시할 수도 있는 것이다.

이어서 빈 피펫으로 주입구(2)에 공기를 불어 넣어 잔존하고 있는 알콜 성분이 배출구(6)로 배출되거나 증발하도록 한다.(단계 5)

이러한 배출 작업 역시 필요에 따라 2회 이상 실시할 수도 있는 것이다.

이와 같이 하여 수용실(4)의 비드(7) 표면에는 순수한 DNA만이 부착되어 있는 상태이며, 이러한 상태에서 피펫을 사용하여 멸균수나 트리스(Tris) 등으로 된 수용성 용매를 주입구(2)로 주입하게 되는 것이며,(단계 6)

이에 따라 수용성 용매에 의하여 비드(7)와 DNA의 접착력이 해제되어 DNA가 비드(7)로부터 분리되고, 수용성 용매와 함께 배출구(6)로 배출될 수 있는 것(단계 7)이고, 정제된 DNA만을 선별 수거, 추출함(단계 8)에 의하여 정제된 DNA를 추출할 수 있게 되는 것이다.

실시예

본 실시예에서는 도 2로 도시한 바와 같은 PDMS로 된 DNA정제용 칩의 수용실(4)에 정원으로 된 지르코니아 실리콘으로 된 비드(7)를 넣고 그 위를 유리로 된 판체(8)로 덮어서 된 것을 사용한다.

본 실시예에서는 이러한 DNA정제용 칩의 주입구(2)에 피펫을 사용하여 DNA와 구아니딘 HCl이 함유된 150㎕의 유기용매를 넣는다.(단계 1)

이때 수용실(4)의 용적은 0.3cc 로 한다. 이러한 상태로 주입된 DNA는 구아니딘 HCl이 함유된 유기용매에 의하여 비드(7)와 염다리(salt bridge)로 강력하게 결합되고, 용매들만 압력차로 이동하여 배출되는 것이다.(단계 2) 이와 같이 하여 비드(7)에 DNA가 부착된 다음 비드(7)에 잔존하는 용매를 제거하기 위하여 피펫으 로 알콜 35%, pH 4.0의 초산성분이 포함된 150㎕의 용매를 주입구(2)로 주입한다.(단계 3)

이에 따라 알콜용매가 비드(7) 사이를 통과하면서 잔존하는 유기 용매를 배출구(6)로 배출하게 되는 것이다.(단계 4)

이어서 빈 피펫으로 주입구(2)에 공기를 불어 넣어 잔존하고 있는 알콜 성분이 배출구(6)로 배출되거나 증발하도록 한다.(단계 5)

이와 같이 하여 수용실(4)의 비드(7) 표면에는 순수한 DNA만이 부착되어 있는 상태이며, 이러한 상태에서 피펫을 사용하여 Tris HCl pH 8.5로 된 25㎕의 수용성 용매를 주입구(2)로 주입하게 되는 것이며,(단계 6)

이에 따라 수용성 용매에 의하여 비드(7)와 DNA의 접착력이 해제되어 DNA가 비드(7)로부터 분리되고, 수용성 용매와 함께 배출구(6)로 배출될 수 있는 것(단계 7)이고, 정제된 DNA만을 현미경 작업에 의한 수작업으로 선별 수거, 추출함(단계 8)에 의하여 정제된 DNA를 얻을 수 있게 된다.

도 1은 종래의 1회용 컬럼 키트를 활용한 DNA 정제 공정을 보인 설명도.

도 2는 본 발명에 의한 DNA 정제용 칩을 보인 사시도.

도 3은 본 발명에 의한 DNA 정제용 칩의 분리 사시도.

도 4는 본 발명에 의한 DNA 정제용 칩의 구조를 보인 평면도.

도 5는 본 발명에 의한 DNA 정제용 칩을 이용한 정제 방법을 보인 공정 설명도.

*도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명

1:서브스트레이트 2:주입구 3: 비드 역류 방지턱

4:수용실 5:댐 6:배출구

7:비드 8:판체

Claims (11)

1. 서브스트레이트에 형성된 수용실 일측의 비드 역류 방지턱이 구비된 주입구, 수용실에 수용된 비드 및 수용실 타측의 비드 유출을 방지하는 댐 및 이들을 덮는 판체를 구비하여서 된 배출구로 구성됨을 특징으로 하는 DNA 정제용 칩.
2. 청구항 1에 있어서,

   수용실 및 주입구, 배출구가 설치되는 전술한 서브스트레이트의 소재는 PDMS임을 특징으로 하는 DNA 정제용 칩.
3. 청구항 1에 있어서,

   수용실 및 주입구, 배출구가 설치되는 소재는 전술한 서브스트레이트의 소재는 PMMA임을 특징으로 하는 DNA 정제용 칩.
4. 청구항 1에 있어서,

   전술한 비드는 지르코니아 실리콘으로 제조된 것임을 특징으로 하는 DNA 정제용 칩.
5. 청구항 1에 있어서,

   전술한 비드는 실리카로 제조된 것임을 특징으로 하는 DNA 정제용 칩.
6. 피펫을 이용하여 DNA와 유기 용매의 혼합액을 주입구로 주입하는 단계 1과,

   수용실에 수용된 비드를 통과하면서 유기 용매는 DNA를 비드에 부착시켜 주는 기능을 한 후 배출구로 배출되는 단계 2와,

   비드에 잔존하는 유기용매를 제거하기 위하여 피펫으로 알콜을 주입구에 주입하는 단계 3과,

   알콜이 비드 사이를 통과하면서 잔존하는 유기용매를 배출구로 배출하게 되는 단계 4와,

   빈 피펫으로 주입구에 공기를 불어 넣어 알콜이 배출구로 배출되도록 하는 단계 5와,

   비드에 순수한 DNA만이 부착되어 있는 상태에서 피펫을 사용하여 수용성용매를 주입구로 주입하는 단계 6와,

   주입된 수용성 용매에 의하여 비드와 DNA의 접착력이 해제되어 DNA가 비드로부터 분리되고, 배출구로 배출되는 단계 7와,

   배출되는 정제된 DNA를 추출하는 단계 8로 구성됨을 특징으로 하는 DNA 정제용 칩을 이용한 정제 방법.
7. 청구항 6에 있어서,

   전술한 단계 1의 유기 용매는 Guanidine HCl 성분으로 된 것임을 특징으로 하는 DNA 정제용 칩을 이용한 정제 방법.
8. 청구항 6에 있어서,

   전술한 단계 3의 알콜용매는 pH 4.0 이상에서 pH 5.5사이의 초산성분이 포함된 것임을 특징으로 하는 DNA 정제용 칩을 이용한 정제 방법.
9. 청구항 6에 있어서,

   전술한 단계 1의 유기 용매는 Tris HCl로 된 것으로, 용량은 20㎕ 내지 300㎕로 된 것임을 특징으로 하는 DNA 정제용 칩을 이용한 정제 방법.
10. 청구항 6에 있어서,

    전술한 단계 3의 알콜 용매는 EDTA, 포타슘아세테이트(Potassiumacetate), 암모니움아세테이트(Ammoniumacetate) 중 어느 하나 이상의 성분이 첨가되고 그 용량은 20㎕ 내지 300㎕임을 특징으로 하는 DNA 정제용 칩을 이용한 정제 방법.
11. 청구항 6에 있어서,

    전술한 단계 6의 수용성 용매는 Tris HCl pH 8.0에서 9.0으로 된 것으로, 용량은 5㎕ 내지 50㎕로 함을 특징으로 하는 DNA 정제용 칩을 이용한 정제 방법.

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