JP5161254B2 - α−フェトタンパク質Ｉｍｍｕ３１抗体および融合タンパク質ならびにその使用方法 - Google Patents

α−フェトタンパク質Ｉｍｍｕ３１抗体および融合タンパク質ならびにその使用方法 Download PDF

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Description

発明の詳細な説明
１．発明の分野
本発明は、ヒト化、キメラおよびヒトα−フェトタンパク質（ＡＦＰ）抗体、特にヒト化、キメラおよびヒト型の治療用および診断用複合体に関する。詳しくは、本発明は、Ｉｍｍｕ３１抗体、ならびにヒト化、キメラおよびヒト抗体形態を用いて肝細胞癌腫、生殖系細胞腫瘍、およびその他のＡＦＰ産生腫瘍を治療する方法を含む。本発明はまた、少なくとも二つのＩｍｍｕ３１ ＭＡｂもしくはそのフラグメントを含んでなる抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメント、または少なくとも一つのＩｍｍｕ３１ ＭＡｂもしくはそのフラグメントと、該Ｉｍｍｕ３１ ＭＡｂもしくはそのフラグメント以外の、少なくとも一つの第二のＭＡｂまたはそのフラグメントとを含んでなる抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントに関する。このヒト化、キメラおよびヒトＩｍｍｕ３１ ＭＡｂ、そのフラグメント、およびその抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントは、単独で投与してもよいし、診断薬および／または治療薬と複合化させてもよいし、治療用または診断用免疫複合体と組み合わせてもよいし、他の裸の抗体と、または少なくとも一種の治療薬および／または診断薬と組み合わせてもよい。本発明はさらに、ヒト化、キメラおよびヒトＩｍｍｕ３１抗体およびそのフラグメント、抗体融合タンパク質およびそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列、そのＤＮＡ配列を含むベクターおよび宿主細胞、ならびにそのヒト化、キメラおよびヒトＩｍｍｕ３１抗体の作製方法に関する。
２．背景
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、癌に対する臨床現場において幅広い診断上および治療上の可能性を持つ。初期の臨床試験では、癌患者における悪性腫瘍の診断／検出（放射免疫検出：ＲＡＩＤ）および治療（放射免疫療法：ＲＡＩＴ）のための放射性標識ＭＡｂを用い、有望な結果が示されている（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）（Ｉｎｔｌ． Ｊ． Ｏｎｃｏｌ． ３：５−１１； Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １６：２６１−２６４； Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ（１９９３）Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ． ９４：２９７−３１２； Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ（１９９１）Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ．， ３０３：１０７−１１７）。モノクローナル抗体は、裸の形態、または放射性同位元素、薬物、毒素、もしくはプロドラッグ変換酵素などの細胞傷害剤との複合体として、癌の免疫療法において中枢的役割を果たす（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ， １４：５−７）。これらのアプローチは様々なレベルの開発的および臨床的成功をもって鋭意評価中である。裸のＭＡｂは、潜在的に、癌細胞で過剰発現される細胞表面タンパク質と結合した際に、細胞傷害作用を誘導することによって臨床応答を果たし得る。研究から、これらの治療効果は、プログラムされた細胞死（アポトーシス）を介して腫瘍増殖を制御することによるか、または抗腫瘍免疫応答の誘導により達成されたことが示されている（Ｃｒａｇｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １１：５４１−５４７）。
臨床上注目される抗体の大多数はマウスで惹起されたものである。ヒトにおけるマウスＭＡｂの免疫原性の問題は、特に、最大効力を達成するために大用量と反復投与が必要とされる癌治療において、それらの臨床適用の主要な障害となっている。マウスＭＡｂを一回投与した後では、およそ５０％の患者で有意なヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答が検出され；二回以上反復注射した後では９０％を超える患者でＨＡＭＡが生じることが示されている（Ｓｅａｒｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｍｅｄ． ３：１３８−１５０； Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｉｎｔ． Ｊ． Ｒａｄ． Ａｐｐｌ． Ｉｎｓｔｒｕｍ． Ｂ、１６：１２１−１２５； Ｓｈａｗｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １３５：１５３０−１５３５； Ｊａｆｆｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ， ４１：５７２−５７８）。さらに、ヒトにおけるこれらマウスＭＡｂの治療効果は、たとえあるにしても、それらの血清半減期が短いこと、また、補体固定細胞傷害性Ｔ細胞などのヒトエフェクター細胞を補充することができないことにより、さらに小さくなる。分子操作の出現により、現在、その抗原特異性に影響をきたすことなく、抗体の構造を遺伝的に改変してＨＡＭＡ応答を最小化または消失させ、同時にまた、そのエフェクター機能を増強することができる。このようなプロセスはキメラ化およびヒト化と呼ばれる。これらの改変ＭＡｂは臨床上の有用性の増進に不可欠な性質、すなわち、ヒトにおける低い免疫原性、長い血清半減期、およびエフェクター機能の補充能を有することが示されている。
α−フェトタンパク質（ＡＦＰ）は、通常、胎児の血中にだけ有意なレベルで見られる血清タンパク質である。成体の血中では、α−フェトタンパク質の増加は、肝臓の再生、ならびに肝細胞癌腫、肝芽細胞腫、および生殖系細胞腫瘍などの特定の癌腫と関連している。肝細胞癌腫（ＨＣＣまたは悪性肝癌）は世界でも、特にアジア、アフリカの特定の地方に最も多い癌の一つであり、おそらくは肝炎感染の高い頻度に関連して、西洋でも罹患率が上昇している。従って、ＨＣＣおよびその他のこのような癌を治療する新しい方法およびアプローチの開発が依然として必要とされている。
本発明は、マウス、キメラ、ヒト化および完全ヒト抗α−フェトタンパク質抗体およびそのフラグメント、特にモノクローナル抗体（ＭＡｂ）、治療および検出／診断免疫複合体、ならびに少なくとも一種の抗ＡＦＰ抗体またはそのフラグメントを含んでなる融合タンパク質に関する。また、本明細書では、ヒト化、キメラおよび完全ヒト抗ＡＦＰ抗体を用いて癌を診断／検出または治療する方法も開示する。ヒト化、キメラおよび完全ヒト抗ＡＦＰ抗体およびそのフラグメント、ならびに抗体融合タンパク質およびそのフラグメントは、単独で投与してもよいし、治療および／または診断／検出複合体として投与してもよいし、あるいは、治療用免疫複合体と、他の裸の抗体と、または他の治療薬と組み合わせて投与してもよいし、あるいは診断／検出複合体として投与してもよい。
［発明の概要］
本発明は、α−フェトタンパク質（ＡＦＰ）抗原と結合するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）またはそのフラグメントを提供する。好ましくは、以下に定義されるような抗ＡＦＰ抗体またはそのフラグメントは、Ｉｍｍｕ３１抗体またはそのフラグメントである。また、抗ＡＦＰ抗体またはそのフラグメントがキメラ、完全ヒト、マウスもしくはヒト化抗体またはそのフラグメントであっても好ましい。最も好ましくは、ＡＦＰ抗体またはそのフラグメントは、ヒト化抗体またはそのフラグメントである。
ある好ましい実施態様では、ヒト化抗ＡＦＰもしくはＩｍｍｕ３１抗体またはそのフラグメントは、マウス抗ＡＦＰ ＭＡｂの軽鎖および重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）、およびヒト抗体の軽鎖および重鎖可変領域の枠組み構造領域（ＦＲ）、ならびにヒト抗体の軽鎖および重鎖定常領域を含み、このヒト化抗ＡＦＰ ＭＡｂの軽鎖可変領域のＣＤＲは、アミノ酸配列ＫＡＳＱＤＩＮＫＹＩＧを含んでなるＣＤＲ１；アミノ酸配列ＹＴＳＡＬＬＰを含んでなるＣＤＲ２；およびアミノ酸配列ＬＱＹＤＤＬＷＴを含んでなるＣＤＲ３を含んでなり；ヒト化抗ＡＦＰ ＭＡｂの重鎖可変領域のＣＤＲは、アミノ酸配列ＳＹＶＩＨを含んでなるＣＤＲ１；アミノ酸配列ＹＩＨＰＹＮＧＧＴＫＹＮＥＫＦＫＧを含んでなるＣＤＲ２；およびアミノ酸配列ＳＧＧＧＤＰＦＡＹを含んでなるＣＤＲ３を含んでなる。
別の実施態様では、ヒト化抗ＡＦＰもしくはＩｍｍｕ３１抗体またはそのフラグメントは、マウス抗ＡＦＰ抗体またはそのフラグメントのＦＲの対応する位置からの少なくとも一つのアミノ酸置換を含む。好ましくは、このマウス抗ＡＦＰ ＭＡｂまたはそのフラグメント由来のマウスアミノ酸は、図４Ａのマウス重鎖可変領域のアミノ酸残基５、２７、２８、３０、４６、４８、６６、６７および９４からなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸である。また、このマウス抗ＡＦＰ ＭＡｂまたはそのフラグメント由来のマウスアミノ酸は、図４Ｂのマウス軽鎖可変領域のアミノ酸残基４、３９、４８、４９、５８、６９、１００および１０７からなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸であるのも好ましい。最も好ましくは、この抗ＡＦＰ抗体またはそのフラグメントは図１ＢのＩｍｍｕ３１ ＶＫヌクレオチド配列を含んでなる。また、この抗ＡＦＰ抗体またはそのフラグメントが図１ＡのＩｍｍｕ３１ ＶＨヌクレオチド配列を含んでなることも好ましい。
別の実施態様では、ヒト化Ｉｍｍｕ３１抗体またはそのフラグメントは、図５ＢのｈＩｍｍｕ３１ ＶＫヌクレオチド配列を含んでなる。さらに好ましくは、前記Ｉｍｍｕ３１抗体またはそのフラグメントは、図５ＡのｈＩｍｍｕ３１ ＶＨヌクレオチド配列を含んでなる。
別の実施態様は、マウスＩｍｍｕ３１ ＭＡｂの相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト抗体の重鎖可変領域の枠組み構造領域およびヒト抗体の重鎖定常領域とを含んでなるＣＤＲグラフト化ヒト化重鎖であり、このヒト化抗ＡＦＰ ＭＡｂの重鎖可変領域のＣＤＲは、アミノ酸配列ＳＹＶＩＨを含んでなるＣＤＲ１；アミノ酸配列ＹＩＨＰＹＮＧＧＴＫＹＮＥＫＦＫＧを含んでなるＣＤＲ２およびアミノ酸配列ＳＧＧＧＤＰＦＡＹを含んでなるＣＤＲ３を含んでなる。
同様に、マウスＩｍｍｕ３１ ＭＡｂの相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト抗体の軽鎖可変領域の枠組み構造領域およびヒト抗体の軽鎖定常領域とを含んでなるＣＤＲグラフト化ヒト化軽鎖も本明細書においてさらなる実施態様として記載され、このヒト化抗ＡＦＰ ＭＡｂの軽鎖可変領域のＣＤＲは、アミノ酸配列ＫＡＳＱＤＩＮＫＹＩＧを含んでなるＣＤＲ１；アミノ酸配列ＹＴＳＡＬＬＰを含んでなるＣＤＲ２；およびアミノ酸配列ＬＱＹＤＤＬＷＴを含んでなるＣＤＲ３を含んでなる。
好ましい実施態様では、本発明による抗ＡＦＰまたはＩｍｍｕ３１フラグメントは、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’およびＦａｂからなる群から選択される。
また、本明細書では、本発明による抗ＡＦＰもしくはＩｍｍｕ３１ ＭＡｂまたはそのフラグメントのいずれか一つ、あるいは、本発明による抗ＡＦＰもしくはＩｍｍｕ３１抗体またはそのフラグメントのいずれかを含む抗体融合タンパク質またはそのフラグメントを含んでなる抗体成分を含んでなり、該抗体成分が少なくとも一種の診断／検出薬または少なくとも一種の治療薬と結合されている、診断／検出用または治療用免疫複合体も開示される。好ましくは、本発明による免疫複合体の診断／検出薬または治療薬は、炭水化物部分によって該ＭＡｂまたはそのフラグメントに結合されている。
一つの実施態様では、この診断／検出用免疫複合体は、色素原または色素などの少なくとも一種の光活性診断／検出薬；γ、βまたは陽電子放射同位元素など、２０〜１０，０００ｋｅＶの間のエネルギーを有する少なくとも一種の放射性核種；放射線不透過性化合物、常磁性イオン（クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）およびエルビウム（ＩＩＩ）を含む）；または超音波増強剤（ヒト化Ｉｍｍｕ３１またはそのフラグメントと複合化されているリポソームを含む）を含む。放射線不透過性化合物はヨウ素化合物、バリウム化合物、ガリウム化合物およびタリウム化合物からなる群から選択することができる。別の実施態様では、本明細書に記載される診断／検出は手術中、内視鏡的、または血管内での腫瘍検出／診断に用いられる。
また、放射性核種、ホウ素、ガドリニウムもしくはウラン原子、免疫調節剤（サイトカインなど）、幹細胞増殖因子、リンホトキシン（腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など）、造血因子（インターロイキン（ＩＬ）など）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）など）、インターフェロン（ＩＦＮ）（インターフェロン−α、−β、または−γなど）、幹細胞増殖因子（「Ｓ１因子」と呼ばれるものなど）、エリスロポエチン、トロンボポエチン、抗体およびそれらの組み合わせ、サイトカイン、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、酵素、酵素阻害剤、光活性治療薬、細胞傷害剤（抗有糸分裂剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、脈管形成阻害剤、アポトーシス剤、アルカロイド、ＣＯＸ−２阻害剤および抗生物質ならびにそれらの組み合わせなど）、または細胞傷害性毒素（植物毒素、微生物毒素、および動物毒素、ならびにそれらの合成変異体など）、脈管形成阻害剤、異なる抗体およびそれらの組み合わせからなる群から選択される治療薬を含んでなる治療免疫複合体も開示される。好ましい実施態様では、サイトカインはＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、インターフェロン−γ、ＴＮＦ−αおよびそれらの組み合わせからなる群から選択され、放射性核種はオージェ放射核種、β放射核種およびα放射核種（例えば、Ｐ−３２、Ｐ−３３、Ｓｃ−４７、Ｆｅ−５９、Ｃｕ−６４、Ｃｕ−６７、Ｓｅ−７５、Ａｓ−７７、Ｓｒ−８９、Ｙ−９０、Ｍｏ−９９、Ｒｈ−１０５、Ｐｄ−１０９、Ａｇ−１１１、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｐｒ−１４２、Ｐｒ−１４３、Ｐｍ−１４９、Ｓｍ−１５３、Ｔｂ−１６１、Ｈｏ−１６６、Ｅｒ−１６９、Ｌｕ−１７７、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ｒｅ−１８９、Ｉｒ−１９４、Ａｕ−１９８、Ａｕ−１９９、Ｐｂ−２１１、Ｐｂ−２１２、およびＢｉ−２１３、Ｃｏ−５８、Ｇａ−６７、Ｂｒ−８０ｍ、Ｔｃ−９９ｍ、Ｒｈ−１０３ｍ、Ｐｔ−１０９、Ｉｎ−１１１、Ｓｂ−１１９、Ｉ−１２５、Ｈｏ−１６１、Ｏｓ−１８９ｍ、Ｉｒ−１９２、Ｄｙ−１５２、Ａｔ−２１１、Ｂｉ−２１２、Ｒａ−２２３、Ｒｎ−２１９、Ｐｏ−２１５、Ｂｉ−２１１、Ａｃ−２２５、Ｆｒ−２２１、Ａｔ−２１７、Ｂｉ−２１３、Ｆｍ−２５５、Ｂ−１０、Ｇｄ−１５７、Ｕ−２３５、およびそれらの組み合わせ）からなる群から選択される。好ましくは、放射性核種は２０〜１０，０００ｋｅＶの間のエネルギーを有する。
別の実施態様では、抗ＡＦＰもしくはＩｍｍｕ３１抗体またはそのフラグメントと複合化される治療薬は、色素原または色素などの光活性治療薬である。
また、本発明では、ＡＦＰ標的抗原に対して親和性を有する一以上の抗原結合部位と、ハプテン分子に対して親和性を有する一以上のハプテン結合部位を含んでなる、多価多重特異性抗体またはそのフラグメントも提供される。好ましくは、この抗ＡＦＰもしくはＩｍｍｕ３１抗体またはそのフラグメントはヒト化されている。また、この抗体またはそのフラグメントは完全ヒトまたはキメラ化されているのも好ましい。一つの実施態様では、この多価多重特異性抗体またはそのフラグメントは診断／検出薬または治療薬を含んでなる。
また、本発明では、少なくとも二つの抗ＡＦＰ ＭＡｂまたはそのフラグメントを含んでなる抗体融合タンパク質またはそのフラグメントも提供され、該ＭＡｂまたはそのフラグメントは本発明による抗ＡＦＰもしくはＩｍｍｕ３１モノクローナル抗体またはそのフラグメントのいずれかから選択される。同様に、本発明による抗ＡＦＰ抗体またはそのフラグメントの少なくとも一つの第一のＡＦＰ ＭＡｂまたはそのフラグメントと、本発明による抗ＡＦＰ ＭＡｂまたはそのフラグメント以外の少なくとも一つの第二のＭＡｂまたはそのフラグメントとを含んでなる、抗体融合タンパク質またはそのフラグメントも提供される。好ましい実施態様では、第二のＭＡｂは癌腫関連抗体である。別の好ましい実施態様では、抗体融合タンパク質またはそのフラグメントは、その融合タンパク質またはそのフラグメントと結合された診断／検出薬または治療薬を含んでなる。
本発明によれば、被験体において悪性腫瘍を治療する方法であって、該被験体に、単独で、または他の治療および／または診断薬と組み合わせて、医薬上許容されるビヒクル中に調剤された、治療上有効量の本発明による裸のおよび／または複合化された抗ＡＦＰ抗体、融合タンパク質、またはそのフラグメントを投与する工程を含んでなる方法が提供される。好ましくは、この被験体において悪性腫瘍を治療する方法は、該被験体に、医薬上許容されるビヒクル中に調剤された、本発明による治療上有効量の免疫複合体またはそのフラグメントを投与する工程を含んでなる。
同様に、被験体において悪性腫瘍を診断／検出する方法は、該被験体に、医薬上許容されるビヒクル中に調剤された、本発明による診断上有効量の裸のまたは複合化された抗ＡＦＰ抗体、融合タンパク質、またはそのフラグメントを投与する工程を含んでなる。
別の実施態様は、被験体において悪性腫瘍を治療または診断／検出する方法であって、（ｉ）それを必要とする被験体に本発明による抗ＡＦＰ抗体またはそのフラグメントを投与する工程；（ｉｉ）ある量の非結合タンパク質が被験体の血流から除去されるのに十分な時間待つ工程；および（ｉｉｉ）前記被験体に、前記抗体の結合部位と結合する、診断薬、治療薬またはそれらの組み合わせを含んでなる担体分子を投与する工程を含んでなる方法である。
本発明の別の実施態様は、（ａ）本発明による抗ＡＦＰ ＭＡｂまたはそのフラグメント；（ｂ）少なくとも二つの該ＭＡｂまたはそのフラグメントを含んでなる抗体融合タンパク質またはそのフラグメント；（ｃ）本発明による抗体のいずれかのＭＡｂまたはそのフラグメントを含んでなる少なくとも一つの第一のＡＦＰ ＭＡｂまたはそのフラグメントと、本発明による抗ＡＦＰ ＭＡｂまたはそのフラグメント以外の少なくとも一つの第二のＭＡｂまたはそのフラグメントとを含んでなる、抗体融合タンパク質またはそのフラグメント；および（ｄ）本発明による抗体のいずれかのＭＡｂまたはそのフラグメントを含んでなる少なくとも一つの第一のＭＡｂまたはそのフラグメントと、本発明による抗体のいずれかの抗ＡＦＰ ＭＡｂまたはそのフラグメント以外の少なくとも一つの第二のＭＡｂまたはそのフラグメントを含んでなる抗体融合タンパク質またはそのフラグメント［該第二のＭＡｂは、ＣＥＡ、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２（例えば、１７−１Ａ）、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、ＭＵＣ−３、ＭＵＣ−４、ＰＡＭ−４、ＫＣ４、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＢｒＥ３、Ｌｅ−Ｙ、Ａ３、Ｅｐ−ＣＡＭ、Ｔｎ、およびＴｈｏｍｓｏｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、フェリチン、酸性イソフェリチン、Ｇａ７３３、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される］
からなる群から選択される抗ＡＦＰ ＭＡｂまたはそのフラグメントをコードする核酸を含んでなるＤＮＡ配列、および該ＤＮＡ配列を含むベクター、および該ＤＮＡ配列を含む宿主細胞である。他の好適な第二の抗体としては、テネイシン、癌遺伝子、癌遺伝子産物、ＩＬ−６、ＩＧＦ−１、ＩＧＦＲ−１、腫瘍脈管形成抗原（血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、および血管増殖因子）に結合するものが挙げられる。
また、診断／検出薬もしくは治療薬、またはそれらの組み合わせを標的へ送達する方法であって、（ｉ）本発明による抗体、融合タンパク質、またはそのフラグメントのいずれか一つの抗体、融合タンパク質、またはそのフラグメントを含む免疫複合体を含んでなる組成物を用意する工程、および（ｉｉ）それを必要とする被験体に該組成物を投与する工程を含んでなる方法も記載する。好ましくは、この診断／検出薬は少なくとも一種の光活性診断薬（色素原または色素など）、造影剤（常磁性イオン、超音波増強剤、またはヨウ素化合物、バリウム化合物、ガリウム化合物またはタリウム化合物など、Ｘ線またはコンピューター断層撮影法に用いられる放射線不透過性化合物など）を含んでなる。一つの実施態様では、この超音波増強剤はヒト化Ｉｍｍｕ３１またはそのフラグメントを含んでなるリポソームであり、所望によりこのリポソームはガス充填されている。別の実施態様では、この診断／検出薬は好ましくは、γ、βまたは陽電子放射同位元素など、２０〜２，０００ｋｅＶの間のエネルギーを有する放射性核種である。さらに好ましくは、放射性核種はＦ−１８、Ｍｎ−５１、Ｍｎ−５２ｍ、Ｆｅ−５２、Ｃｏ−５５、Ｃｕ−６２、Ｃｕ−６４、Ｇａ−６８、Ａｓ−７２、Ｂｒ−７５、Ｂｒ−７６、Ｒｂ−８２ｍ、Ｓｒ−８３、Ｙ−８６、Ｚｒ−８９、Ｔｃ−９４ｍ、Ｉｎ−１１０、Ｉ−１２０、Ｉ−１２４、Ｃｒ−５１、Ｃｏ−５７、Ｃｏ−５８、Ｆｅ−５９、Ｃｕ−６７、Ｇａ−６７、Ｓｅ−７５、Ｒｕ−９７、Ｔｃ−９９ｍ、Ｉｎ−１１１、Ｉｎ−１１４ｍ、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｙｂ−１６９、Ｈｇ−１９７、およびＴｌ−２０１からなる群から選択される。また、好ましくは、放射線不透過性化合物はバリウム、ジアトリゾエート、エチオド化オイル、クエン酸ガリウム、イオカルム酸、イオセタム酸、ヨーダミド、ヨージパミド、ヨードキサム酸、イオグラミド、イオヘキソール、イオパミドール、イオパン酸、イオプロセム酸、イオセファム酸、イオセル酸、イオスラミドメグルミン、イオセメ酸、イオタスル、イオテトル酸、イオサラム酸、イオトロキシ酸、イオキサグル酸、イオキソトリゾ酸、イポデート、メグルミン、メトリザミド、メトリゾエート、プロピリオドンおよび塩化タリウムからなる群から選択される。
同様に、診断／検出薬もしくは治療薬またはそれらの組み合わせを標的へ送達する方法では、治療薬は、好ましくは、放射性核種、免疫調節剤、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、酵素、酵素阻害剤、光活性治療薬、細胞傷害剤［薬物または毒素（植物、微生物および動物毒素、ならびにそれらの合成変異体を含む）］、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される。好ましくは、前記薬物は抗有糸分裂剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗脈管形成剤、アポトーシス剤、アントラサイクリン、アルカロイド、ＣＯＸ−２−阻害剤および抗生物質薬ならびにそれらの組み合わせ、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソウレア、トリアゼン、葉酸類似体、アントラサイクリン、タキサン、ＣＯＸ−２阻害剤、ピリミジン類似体、プリン類似体、抗生物質、酵素、酵素阻害剤、エピポドフィロトキシン、プラチナ錯体、ビンカアルカロイド、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、エンドスタチン、タキソール、カンプトテシン、ドキソルビシンおよびそれらの類似体、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される。また、好ましくは、前記毒素はリシン、アブリン、アルファトキシン、サポリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌内毒素−Ａ、ブタクサ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒、シュードモナス外毒素、およびシュードモナス内毒素からなる群から選択される。
また、本明細書では、診断／検出薬、治療薬、またはそれらの組み合わせを標的へ送達する方法であって、（ｉ）被験体に本発明による多価多重特異性抗体またはそのフラグメントを投与する工程；（ｉｉ）ある量の非結合タンパク質が被験体の血流から除去されるのに十分な時間待つ工程；および（ｉｉｉ）該被験体に、該抗体の結合部位と結合する、診断／検出薬、治療薬、またはそれらの組み合わせを含んでなる担体分子を投与する工程を含んでなる方法も開示される。好ましくは、この多価多重特異性抗体またはそのフラグメントは、ＡＦＰ標的抗原に対して親和性を有する一以上の抗原結合部位と、ハプテン分子に対して親和性を有する一以上のハプテン結合部位とを含んでなる。好ましくは、この担体分子は抗体の２以上の結合部位と結合する。また、好ましくは、この診断／検出薬または治療薬は、同位元素、色素、色素原、造影剤、薬物、毒素、サイトカイン、酵素、酵素阻害剤、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、増殖因子、放射性核種、および金属からなる群から選択される。
本明細書では、被験体において悪性腫瘍を治療する方法であって、該被験体に、医薬上好適な賦形剤中に調剤された治療上有効量の、（ｉ）抗体もしくはそのフラグメント、または（ｉｉ）抗体融合タンパク質またはそのフラグメントを投与することを含んでなり、ここで、該抗体またはそのフラグメントが少なくとも二つのＭＡｂまたはそのフラグメント、を含み、そのうちのの少なくとも一方は本発明による抗ＡＦＰ ＭＡｂまたはそのフラグメントのいずれかであり、該融合タンパク質またはそのフラグメントは少なくとも一つのＡＦＰ結合部位を含む方法が開示される。好ましい実施態様では、少なくとも一つのＭＡｂまたはそのフラグメントは裸のＭＡｂまたはそのフラグメントである。別の実施態様では、この融合タンパク質はＡＦＰ以外の腫瘍マーカー物質との反応性を有する第二の結合部位を含む。また、この抗ＡＦＰ抗体もしくはそのフラグメント、または抗ＡＦＰ融合タンパク質もしくはそのフラグメントが少なくとも一種の治療薬または診断／検出薬の前、同時、または後に投与されることも記載される。
別の実施態様は、被験体において悪性腫瘍を治療する方法であって、該被験体に、少なくとも二つのＭＡｂまたはそのフラグメントを含んでなる、治療上有効量の抗体またはそのフラグメントを投与することを含む方法であり、このＭＡｂは本明細書に記載され、医薬上好適な賦形剤中に調剤された、抗ＡＦＰ抗体のいずれかから選択されるものである。好ましい実施態様では、少なくとも一つのＭＡｂまたはそのフラグメントは裸のＭＡｂまたはそのフラグメントである。また、この抗ＡＦＰ抗体もしくはそのフラグメント、または抗ＡＦＰ融合タンパク質もしくはそのフラグメントが、少なくとも一種の治療薬および／または診断／検出薬の前、同時、または後に投与されることも記載される。
本明細書に記載の治療方法では、抗ＡＦＰ抗体はヒトよりも下等な霊長類の抗ＡＦＰ抗体、マウスモノクローナル抗ＡＦＰ抗体、キメラ抗ＡＦＰ抗体、ヒト抗ＡＦＰ抗体、およびヒト化抗ＡＦＰ抗体からなる群から選択される。好ましくは、このキメラ、ヒトおよびヒト化抗ＡＦＰ抗体の定常領域およびヒンジ領域はヒトＩｇＧ１の定常領域およびヒンジ領域を含んでなる。また、本明細書に記載の方法では、抗ＡＦＰ抗体もしくはそのフラグメント、または融合タンパク質もしくはそのフラグメントは、該悪性腫瘍により発現される第二の腫瘍マーカーとの反応性を有する第二の複合化抗体が該被験体に投与される前、投与と同時、または投与された後に投与される。
本発明はまた、被験体において悪性腫瘍を診断または検出する方法であって、該被験体に、本発明に記載されているような抗ＡＦＰ ＭＡｂもしくはそのフラグメントまたは融合タンパク質もしくはそのフラグメントを含んでなる、診断上有効量の診断／検出複合体を投与する方法を記載し、ここで、この抗ＡＦＰ ＭＡｂもしくはそのフラグメント、または融合タンパク質もしくはそのフラグメントは医薬上好適な賦形剤中に調剤されており、少なくとも一種の診断／検出薬に結合している。
本発明の別の実施態様は、被験体において癌細胞を治療する方法であって、（ｉ）該被験体に、本発明に記載されているような裸の、または複合化された抗ＡＦＰ ＭＡｂもしくはそのフラグメント、あるいは、裸の、または複合化された抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントを含んでなる、治療上有効量の組成物を投与する工程、（ｉｉ）該抗ＡＦＰ ＭＡｂもしくはそのフラグメントまたは抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントを医薬上好適な賦形剤中に調剤する工程を含んでなる方法である。好ましくは、この抗ＡＦＰ抗体、融合タンパク質、またはそのフラグメントはＩｍｍｕ３１抗体、融合タンパク質、またはそのフラグメントである。所望により、この組成物は、第二の裸の、または複合化された抗体またはそのフラグメント、または裸の、または複合化された抗体融合タンパク質またはそのフラグメントをさらに含んでもよく、これらは、抗ＡＦＰ抗体、融合タンパク質またはそのフラグメントであってもよいし、あるいは、悪性腫瘍により発現される第二の腫瘍マーカーと結合しうるものでもよい。また、この抗ＡＦＰ抗体、抗体融合タンパク質、またはそのフラグメントは、第二の抗体、融合タンパク質、またはそのフラグメントが該被験体に投与される前、投与と同時、または投与された後に投与されることも開示される。この抗ＡＦＰ抗体はまた、治療薬または診断／検出薬の前、同時または後に投与してもよい。
本発明はまた、被験体において悪性腫瘍を診断または検出する方法であって、（ｉ）該被験体由来の検体に対し、本明細書に記載の抗ＡＦＰ ＭＡｂもしくはそのフラグメントまたは抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントを含んでなる組成物を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ診断アッセイを行うことを含んでなる方法を提供する。好ましくは、悪性腫瘍は肝細胞癌腫、肝芽細胞腫または生殖系細胞腫瘍など、ＡＦＰを発現する癌腫である。また、好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ診断アッセイは、免疫アッセイ、ＲＴ−ＰＣＲおよび免疫組織化学法からなる群から選択される。診断アッセイがＲＴ−ＰＣＲまたは免疫アッセイである場合、検体は、好ましくは体液または組織または細胞集団である。診断アッセイが免疫組織化学法または免疫細胞化学法である場合、検体は、好ましくは細胞アリコートまたは組織である。
本発明による方法のいずれにおいても、被験体は、好ましくはヒトまたは家庭用ペットなどの哺乳動物である。
本発明の別の実施態様は、被験体において罹患組織を治療または同定する方法であって、（Ａ）該被験体に、罹患組織関連マーカーと特異的に結合する少なくとも一つのアームと、ターゲッティング可能な複合体と特異的に結合する少なくとも一つの他のアームとを有し、該罹患組織関連マーカーがＡＦＰである、二重特異性抗体または抗体フラグメントを投与する工程；（Ｂ）所望により、該被験体にクリアリング組成物を投与して、該組成物により、非局在抗体または抗体フラグメントを循環から除去する工程；（Ｃ）該被験体に、該二重特異性抗体または抗体フラグメントの少なくとも一つの他のアームにより認識可能な少なくとも一つのエピトープを含む、またはこれを担持する担体部分と、一以上の複合化された治療薬または診断薬とを含んでなる第一のターゲッティング可能な複合体を投与する工程；ならびに（Ｄ）該治療薬が酵素である場合には、被験体にさらに以下のもの：（ｉ）プロドラッグ（該酵素が標的部位でプロドラッグを薬物へ変換し得る場合）；または（ｉｉ）該被験体で解毒されて低毒性の中間体を形成し得る薬物（該酵素が標的部位で該解毒中間体を毒性型へ変換し、それにより該薬物の毒性を高め得る場合）；または（ｉｉｉ）該被験体内で天然のプロセスによって活性化され、低毒性の中間体へ変換されることにより解毒を受けるプロドラッグ（該酵素が標的部位で該解毒中間体を毒性型へ変換し、それにより該薬物の毒性を高め得る場合）；または（ｉｖ）該二重特異性抗体または抗体フラグメントの少なくとも一つの他のアームにより認識可能な少なくとも一つのエピトープを含む、またはこれを担持する担体部分と、プロドラッグとを含んでなる第二のターゲッティング可能な複合体（該酵素が標的部位でプロドラッグを薬物へ変換し得る場合）を投与する工程を含んでなる方法である。好ましくは、標的組織と特異的に結合する少なくとも一つのアームはヒト、キメラもしくはヒト化Ｉｍｍｕ３１抗体、またはヒト、キメラもしくはヒト化Ｉｍｍｕ３１抗体のフラグメントである。また、好ましくは、このターゲッティング可能な複合体は、少なくとも二つのＨＳＧハプテンを含んでなる。好ましくは、この罹患組織は腫瘍であり、より好ましくは、この腫瘍はα−フェトタンパク質（ＡＦＰ）を産生するか、あるいはα−フェトタンパク質（ＡＦＰ）に関連するものである。また、好ましくは、前記Ｉｍｍｕ３１抗体またはそのフラグメントは、ＭＡｂ Ｉｍｍｕ３１のＦｖを含んでなる。
この方法は、前記第一のターゲッティング可能な複合体がプロドラッグを含んでなる場合、前記二重特異性抗体または抗体フラグメントの少なくとも一つの他のアームにより認識可能な少なくとも一つのエピトープを含む、またはこれを担持する担体部分と、該プロドラッグを薬物へと変換し得るか、または該薬物の解毒中間体を毒性型へ変換し得る酵素とを含んでなる第二のターゲッティング可能な複合体を投与することをさらに含んでもよい。好ましくは、このプロドラッグはエピルビシングルクロニド、ＣＰＴ−１１、エトポシドグルクロニド、ダウノマイシングルクロニドおよびドキソルビシングルクロニドからなる群から選択される。また、好ましくは、このターゲッティング可能な複合体は罹患組織を死滅させるのに有用な一以上の放射性同位元素を含んでなる。このターゲッティング可能な複合体は、光増感剤など、一以上の光線力学療法薬を含んでもよい。好ましい実施態様では、この光増感剤はベンゾポルフィリン単酸環Ａ（ＢＰＤ−ＭＡ）、スズエチオプルプリン（ＳｎＥＴ２）、スルホン化アルミニウムフタロシアニン（ＡｌＳＰｃ）およびルテチウムテキサフィリン（Ｌｕｔｅｘ）からなる群から選択される。
本明細書では、哺乳動物においてＡＦＰを発現する腫瘍を検出または治療する方法であって、（Ａ）標的組織と特異的に結合する少なくとも一つのアームと、ターゲッティング可能な複合体と特異的に結合する少なくとも一つの他のアームを含んでなる、有効量の二重特異性抗体または抗体フラグメントを投与する工程（標的組織と特異的に結合する前記一つのアームはＩｍｍｕ３１抗体またはそのフラグメントである）；および（Ｂ）以下のもの：（ｉ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；（ｉｉ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；（ｉｉｉ）Ａｃ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２；
Figure 0005161254
および
Figure 0005161254
からなる群から選択される、ターゲッティング可能な複合体を投与する工程
を含んでなる方法が提供される。
好ましくは、この方法は、前記被験体にクリアリング組成物を投与して、該組成物により、循環からの非局在抗体または抗体フラグメントのクリアランスを高めることをさらに含む。
また、本明細書では、被験体において罹患組織を治療または同定するのに有用なキットであって、（Ａ）標的組織と特異的に結合する少なくとも一つのアームと、ターゲッティング可能な複合体と特異的に結合する少なくとも一つの他のアームとを有する二重特異性抗体または抗体フラグメント（標的組織と特異的に結合する前記一つのアームはＩｍｍｕ３１抗体またはそのフラグメントである）；（Ｂ）該二重特異性抗体または抗体フラグメントの少なくとも一つの他のアームにより認識可能な少なくとも一つのエピトープを含む、またはこれを担持する担体部分と、一以上の複合化された治療薬または診断薬とを含んでなる第一のターゲッティング可能な複合体；および（Ｃ）所望により、非局在抗体および抗体フラグメントを除去するのに有用なクリアリング組成物；および（Ｄ）所望により、前記第一のターゲッティング可能な複合体と複合化された前記治療薬が酵素である場合に、（ｉ）プロドラッグ（該酵素が標的部位でプロドラッグを薬物へ変換し得る場合）；または（ｉｉ）該被験体で解毒されて低毒性の中間体を形成し得る薬物（該酵素が標的部位で、該解毒中間体を毒性型へ変換し、それにより該薬物の毒性を高め得る場合）；または（ｉｉｉ）該被験体内で天然のプロセスによって活性化され、低毒性の中間体へ変換されることにより解毒を受けるプロドラッグ（該酵素が標的部位で、該解毒中間体を毒性型へ変換し、それにより該薬物の毒性を高め得る場合）；または（ｉｖ）該二重特異性抗体または抗体フラグメントの少なくとも一つの他のアームにより認識可能な少なくとも一つのエピトープを含む、またはこれを担持する担体部分と、プロドラッグとを含んでなる第二のターゲッティング可能な複合体（該酵素が標的部位でプロドラッグを薬物へ変換し得る場合）を含んでなるキットが提供される。好ましくは、このターゲッティング可能な複合体は、
（ｉ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；
（ｉｉ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；
（ｉｉｉ）Ａｃ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２；
Figure 0005161254
および
Figure 0005161254
からなる群から選択される。
また、ターゲッティング可能な複合体をスクリーニングする方法であって、（Ａ）該ターゲッティング可能な構築物を、標的組織と関連するマーカー（該マーカーはＡＦＰである）と特異的に結合する少なくとも一つのアームと、該ターゲッティング可能な複合体と特異的に結合する少なくとも一つの他のアームとを有する二重特異性抗体または抗体フラグメントに接触させて混合物とする工程；および（Ｂ）所望により、該混合物をインキュベートする工程；および（Ｃ）該混合物を分析する工程を含んでなる方法も提供される。
別の実施態様は、哺乳動物においてＡＦＰを発現する悪性組織または細胞をイメージングする方法であって、（Ａ）標的組織と関連するマーカー（該マーカーはＡＦＰである）と特異的に結合する少なくとも一つのアームと、ターゲッティング可能な複合体と特異的に結合する少なくとも一つの他のアームとを含んでなる、有効量の二重特異性抗体または抗体フラグメントを投与する工程；および（Ｂ）以下のもの：
（ｉ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；
（ｉｉ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；
（ｉｉｉ）Ａｃ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２；
Figure 0005161254
および
Figure 0005161254
からなる群から選択されるターゲッティング可能な複合体を投与する工程を含んでなる方法である。
本発明はまた、被験体においてＡＦＰを発現する罹患組織を手術中に同定／診断する方法であって、（Ａ）ＡＦＰと特異的に結合する該少なくとも一つのアームと、ターゲッティング可能な複合体と特異的に結合する少なくとも一つの他のアームとを含んでなる、有効量の二重特異性抗体または抗体フラグメントを投与する工程（標的組織と特異的に結合する前記一つのアームはＩｍｍｕ３１抗体またはそのフラグメントである）；および
（Ｂ）以下のもの：
（ｉ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；
（ｉｉ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；
（ｉｉｉ）Ａｃ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２；
Figure 0005161254
および
Figure 0005161254
からなる群から選択されるターゲッティング可能な複合体を投与する工程を含んでなる方法を提供する。
本明細書ではまた、被験体においてＡＦＰを発現する罹患組織を内視鏡的に同定する方法であって、（Ａ）ＡＦＰと特異的に結合する少なくとも一つのアームと、ターゲッティング可能な複合体と特異的に結合する少なくとも一つの他のアームとを含んでなる、有効量の二重特異性抗体または抗体フラグメントを投与する工程（標的組織と特異的に結合する前記一つのアームはＩｍｍｕ３１抗体またはそのフラグメントである）；および（Ｂ）以下のもの：
（ｉ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；
（ｉｉ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；
（ｉｉｉ）Ａｃ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２；
Figure 0005161254
および
Figure 0005161254
からなる群から選択されるターゲッティング可能な複合体を投与する工程を含んでなる方法が提供される。
別の実施態様は、被験体においてＡＦＰを発現する罹患組織を血管内同定する方法であって、（Ａ）ＡＦＰと特異的に結合する少なくとも一つのアームと、ターゲッティング可能な複合体と特異的に結合する少なくとも一つの他のアームとを含んでなる、有効量の二重特異性抗体または抗体フラグメントを投与する工程（標的組織と特異的に結合する前記一つのアームはＩｍｍｕ３１抗体またはそのフラグメントである）；および（Ｂ）以下のもの：
（ｉ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；
（ｉｉ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；
（ｉｉｉ）Ａｃ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２；
Figure 0005161254
および
Figure 0005161254
からなる群から選択されるターゲッティング可能な複合体を投与する工程を含んでなる方法である。
別の実施態様は、好ましくは内視鏡処置、腹腔鏡処置、血管内カテーテル処置、または外科的処置の際に、病変部を検出する方法であって、（Ａ）ＡＦＰ抗原と特異的に結合する第一の抗体結合部位を有し、かつ、ハプテンと特異的に結合する第二の抗体結合部位を有する二重特異性抗体Ｆ（ａｂ）２またはＦ（ａｂ’）２フラグメントを、このような処置を受ける被験体に注射し、該抗体フラグメントを標的部位に付着させる工程；（Ｂ）所望により、この二重特異性フラグメントが注射から約２４時間以内に循環からあまり除去されない場合には、ガラクトシル化抗イディオタイプクリアリング剤を用いて非標的化抗体フラグメントを除去し、そして、標的部位に迅速に局在し、かつ腎臓から除去される二価の標識ハプテンを注射する工程；（Ｃ）最初の注射から４８時間以内に、検出手段を用いて、標的部位における付着標識の上昇レベルの近距離検出によりハプテンの存在を検出し、そして前記処置を行う工程（該検出は造影剤またはサブトラクション剤を使用せずに行われる）を含んでなる方法である。好ましい実施態様では、前記ハプテンは、診断／検出用放射性同位元素、ＭＲＩ画像増強剤または蛍光標識で標識されている。
また、好ましくは手術的処置、血管内処置、腹腔鏡処置または内視鏡処置中の、近距離病変部検出のための方法であって、（Ａ）このような処置を受ける被験体に有効量のＩｍｍｕ３１免疫複合体またはそのフラグメントを非経口注射する工程；（Ｂ）注射から４８時間以内に前記処置を行う工程；（Ｃ）該標識抗体またはそのフラグメントの存在を検出するための検出手段を用いて、接近を受けた被験体内部を近距離でスキャンする工程；および（Ｄ）その検出手段で、このような部位における該標識抗体またはそのフラグメントの上昇レベルを検出することにより、該標識抗体またはそのフラグメントの付着部位を位置づける工程を含んでなる方法も提供される。好ましくは、このＩｍｍｕ３１免疫複合体またはそのフラグメントは、２０〜１，０００ｋｅＶのエネルギーで放出する放射性同位元素を含んでなる。また、好ましくは、この放射性同位元素は、テクネチウム−９９ｍ、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１、ヨウ素−１２３、インジウム−１１１、フッ素−１８、ガリウム−６８およびガリウム−６７からなる群から選択される。別の実施態様では、Ｉｍｍｕ３１免疫複合体またはそのフラグメントは、光活性剤などの非同位元素薬剤を含んでなる。
［発明の具体的説明］
１．概説
本発明は、免疫複合体としての、または他の治療および／または診断薬と複合化されてはいないが、組み合わせた場合に、哺乳動物被験体の治療および／または診断に有用なマウス、ヒト化、キメラおよびヒト抗α−フェトタンパク質（ＡＦＰ）抗体、融合タンパク質、またはそのフラグメントを提供する。ある好ましい実施態様では、この抗ＡＦＰ抗体はＩｍｍｕ３１抗体である。このＩｍｍｕ３１抗体およびそのフラグメントはα−フェトタンパク質抗原と結合する。本明細書において「Ｉｍｍｕ３１」抗体またはフラグメントとは、アミノ酸配列ＳＹＶＩＨを含んでなる重鎖可変領域のＣＤＲ１、アミノ酸配列ＹＩＨＰＹＮＧＧＴＫＹＮＥＫＦＫＧを含んでなる重鎖可変領域のＣＤＲ２、アミノ酸配列ＳＧＧＧＤＰＦＡＹを含んでなる重鎖可変領域のＣＤＲ３、ならびにアミノ酸配列ＫＡＳＱＤＩＮＫＹＩＧを含んでなる軽鎖可変領域のＣＤＲ１、アミノ酸配列ＹＴＳＡＬＬＰを含んでなる軽鎖可変領域のＣＤＲ２およびアミノ酸配列ＬＱＹＤＤＬＷＴを含んでなる軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含んでなる抗体または抗体フラグメントと同じ、ＡＦＰ上のエピトープと結合する任意の抗体またはフラグメントを意味する。
本発明によるＩｍｍｕ３１抗体、融合タンパク質、およびフラグメントはまた、別の複合化または非複合化Ｉｍｍｕ３１抗体、融合タンパク質、またはそのフラグメント、あるいは、複合化または非複合化非Ｉｍｍｕ３１抗体、融合タンパク質、またはそのフラグメントとともに投与してもよい。
本発明によるキメラまたはヒト化抗ＡＦＰ ＭＡｂおよびそのフラグメントは、特定のマウスＣＤＲ、または一を超えるマウスもしくはキメラ抗ＡＦＰ ＭＡｂ由来のマウスＣＤＲの組み合わせを含む。好ましくは、本発明によるキメラおよびヒト化抗ＡＦＰ抗体は、マウスＩｍｍｕ３１抗体由来のＣＤＲを含む。本発明によるＩｍｍｕ３１ ＭＡｂおよびそのフラグメントは、マウス、ヒト化、キメラまたは完全ヒトＭＡｂである。このキメラおよびヒト化抗体は、マウスＩｍｍｕ３１（ｍＩｍｍｕ３１）ＭＡｂのＣＤＲとヒト抗体の軽鎖および重鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。
ある好ましい実施態様では、本発明によるヒト化Ｉｍｍｕ３１ ＭＡｂまたはそのフラグメントは、マウスＩｍｍｕ３１ ＭＡｂのＣＤＲと、ヒト抗体の枠組み構造領域（ＦＲ）およびヒト抗体の軽鎖および重鎖定常領域を含んでなる。好ましくは、このヒト化Ｉｍｍｕ３１ ＭＡｂの軽鎖可変領域のＣＤＲは、アミノ酸ＫＡＳＱＤＩＮＫＹＩＧを含んでなるＣＤＲ１；アミノ酸ＹＴＳＡＬＬＰを含んでなるＣＤＲ２；およびアミノ酸ＬＱＹＤＤＬＷＴを含んでなるＣＤＲ３を含んでなり；また、Ｉｍｍｕ３１ ＭＡｂの重鎖可変領域のＣＤＲは、アミノ酸ＳＹＶＩＨを含んでなるＣＤＲ１；アミノ酸ＹＩＨＰＹＮＧＧＴＫＹＮＥＫＦＫＧを含んでなるＣＤＲ２；およびアミノ酸ＳＧＧＧＤＰＦＡＹを含んでなるＣＤＲ３を含んでなる。
別の実施態様では、このヒト化Ｉｍｍｕ３１ ＭＡｂまたはそのフラグメントは、ｈＩｍｍｕ３１抗体の軽鎖および重鎖可変領域のＦＲに、対応するマウス ＭＡｂのＦＲに由来する少なくとも一つのアミノ酸をさらに含んでもよい。具体的には、このヒト化Ｉｍｍｕ３１ ＭＡｂまたはそのフラグメントは、ｈＩｍｍｕ３１ＶＨとして示されている図５Ａのマウス重鎖可変領域のアミノ酸残基５、２７、２８、３０、４６、４８、６６、６７および９４のうち少なくとも一つ、また、ｈＩｍｍｕ３１Ｖｋとして示されている図５Ｂのマウス軽鎖可変領域のアミノ酸残基４、３９、４８、４９、５８、６９、１００および１０７のうち少なくとも一つを含む。適切な結合を維持するため、またはＡＦＰに対する結合を増強するために必要であれば、この軽鎖および重鎖可変鎖のヒトＦＲ領域に、一以上のマウスアミノ酸配列を維持することができる。より好ましくは、本発明によるヒト化Ｉｍｍｕ３１ ＭＡｂまたはそのフラグメントは図５ＡのｈＩｍｍｕ３１ＶＨおよび図５ＢのｈＩｍｍｕ３１Ｖκを含んでなる。
この関連において、本発明によるキメラＩｍｍｕ３１（ｃＩｍｍｕ３１）ＭＡｂまたはそのフラグメントはマウスＩｍｍｕ３１ ＭＡｂのＣＤＲと、マウスＩｍｍｕ３１ ＭＡｂの軽鎖および重鎖可変領域のＦＲ領域を含んでなる。言い換えれば、このｃＩｍｍｕ３１抗体は親マウス（すなわち、ｍＩｍｍｕ３１）ＭＡｂのＦｖと、ヒト抗体の軽鎖および重鎖定常領域を含んでなり、ここで、このキメラＩｍｍｕ３１ ＭＡｂの軽鎖可変領域のＣＤＲは、アミノ酸ＫＡＳＱＤＩＮＫＹＩＧを含んでなるＣＤＲ１；アミノ酸ＹＴＳＡＬＬＰを含んでなるＣＤＲ２；およびアミノ酸ＬＱＹＤＤＬＷＴを含んでなるＣＤＲ３を含んでなり；また、このキメラＩｍｍｕ３１ ＭＡｂの重鎖可変領域のＣＤＲは、アミノ酸ＳＹＶＩＨを含んでなるＣＤＲ１；アミノ酸ＹＩＨＰＹＮＧＧＴＫＹＮＥＫＦＫＧを含んでなるＣＤＲ２；およびアミノ酸ＳＧＧＧＤＰＦＡＹを含んでなるＣＤＲ３を含んでなる。
より好ましくは、このキメラＩｍｍｕ３１ ＭＡｂまたはそのフラグメントは、マウスＩｍｍｕ３１ ＭＡｂの相補性決定領域（ＣＤＲ）およびマウスＩｍｍｕ３１ ＭＡｂの軽鎖および重鎖可変領域の枠組み構造領域（ＦＲ）と、ヒト抗体の軽鎖および重鎖定常領域を含んでなり、ここで、このキメラＩｍｍｕ３１ ＭＡｂの重鎖および軽鎖可変領域のＣＤＲおよびＦＲは、それぞれｃＩｍｍｕ３１ＶＨおよびｃＩｍｍｕ３１Ｖκで示され、図２Ａおよび２Ｂに示されている。
本発明はまた、少なくとも二つの抗ＡＦＰ ＭＡｂまたはそのフラグメントを含んでなる抗体融合タンパク質またはそのフラグメントを意図する。好ましくは、この抗ＡＦＰ抗体およびそのフラグメントは、本発明によるＩｍｍｕ３１抗体およびそのフラグメントである。また、好ましくは、本発明による抗体融合タンパク質は、異なる抗原に対する特異性を付与するため、一つの抗ＡＦＰ ＭＡｂと一以上の第二のＭＡｂからなり、以下でさらに詳しく説明する。同様に、本発明による抗体融合タンパク質もさらに別の抗体と組み合わせて使用できる。例えば、抗体融合タンパク質は別の抗体との組み合わせ療法において使用でき、この別の抗体は融合タンパク質の前、同時、または後に投与することができ、ＣＥＡ、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２（例えば、１７−１Ａ）、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、ＭＵＣ−３、ＭＵＣ−４、ＰＡＭ−４、ＫＣ４、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＢｒＥ３、Ｌｅ−Ｙ、Ａ３、Ｅｐ−ＣＡＭ、Ｔｎ、およびＴｈｏｍｓｏｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、テネイシン、癌遺伝子、癌遺伝子産物、ＩＬ−６、ＩＧＦ−１、ＩＧＦＲ−１、腫瘍脈管形成抗原（血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、およびその他の血管増殖因子など）、Ｇａ７３３、原発性肝癌のフェリチンおよび酸性イソフェリチン（ＡＩＦ）、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される抗原と反応性がある。
別の好ましい実施態様では、この抗ＡＦＰ抗体は本発明によるＩｍｍｕ３１抗体および抗体融合タンパク質またはそのフラグメントであり、上記のような少なくとも一つの第一のＩｍｍｕ３１ ＭＡｂまたはそのフラグメントおよび少なくとも一つの第二の非Ｉｍｍｕ３１ ＭＡｂまたはそのフラグメントを含んでなる抗体融合タンパク質またはそのフラグメントも含むものとする。好ましくは、この非Ｉｍｍｕ３１抗体またはそのフラグメントは癌腫関連抗体である。より好ましくは、この癌腫関連ＭＡｂはＣＥＡ、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２（例えば、１７−１Ａ）、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、ＭＵＣ−３、ＭＵＣ−４、ＰＡＭ−４、ＫＣ４、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＢｒＥ３、Ｌｅ−Ｙ、Ａ３、Ｅｐ−ＣＡＭ、Ｔｎ、およびＴｈｏｍｓｏｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、テネイシン、癌遺伝子、癌遺伝子産物、ＩＬ−６、ＩＧＦ−１、ＩＧＦＲ−１、腫瘍脈管形成抗原（血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、およびその他の血管増殖因子）、Ｇａ７３３、原発性肝癌のフェリチンおよび酸性イソフェリチン（ＡＩＦ）との反応性を有するＭＡｂ、またはその組み合わせ、さらには本明細書で記載されるＩｍｍｕ３１ ＭＡｂとは異なる抗ＡＦＰ ＭＡｂである。
このヒト化、キメラおよびヒトＩｍｍｕ３１抗体は、肝細胞癌腫、肝芽細胞腫、生殖系細胞腫瘍、およびその他のα−フェトタンパク質（ＡＦＰ）産生腫瘍の治療のためのより優れた治療薬を得るため、ＣＤＲの突然変異ならびにＣＤＲおよび可変領域のその他の配列の操作の結果として、エピトープとの増強された結合親和性を有し得る。抗体の結合特異性、親和性またはアビジティーに対する改良は公知であり、ＷＯ９８／４４００１には親和性成熟として記載されており、この出願は改良方法をまとめているもので、引用することによりその全開示内容が本明細書の一部とされる。
また、エフェクター機能を改良するため、すなわち、アンタゴニストの抗原依存細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および／または補体依存細胞傷害性（ＣＤＣ）を高めるために、本発明による抗体を改変することも望ましい。Ｆｃ領域における一以上のアミノ酸置換またはシステインの導入を行えば、インターナリゼーション能の改良および／または補体媒介細胞死滅作用およびＡＤＣＣの増強が可能である。引用することによりその全開示内容が本明細書の一部とされるＣａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘ． Ｍｅｄ． １７６：１１９１−１１９５（１９９１）およびＳｈｏｐｅｓ， Ｂ．Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８：２９１８−２０２２（１９９２）参照。抗体融合タンパク質は補体溶解およびＡＤＣＣ能の双方の増強を伴う二重のＦｃ領域を持つよう調製することができる。
本発明の別の実施態様は、
（ａ）本明細書に記載のＩｍｍｕ３１ ＭＡｂまたはそのフラグメント；
（ｂ）少なくとも本発明によるＩｍｍｕ３１ ＭＡｂまたはそのフラグメントを含んでなる抗体融合タンパク質またはそのフラグメント；
（ｃ）本明細書に記載のＩｍｍｕ３１ ＭＡｂまたはそのフラグメントを含んでなる少なくとも一つの第一のＭＡｂまたはそのフラグメントと、本明細書に記載のＩｍｍｕ３１ ＭＡｂまたはそのフラグメント以外の少なくとも一種の第二のＭＡｂまたはそのフラグメントを含んでなる抗体融合タンパク質またはそのフラグメント；ならびに
（ｄ）Ｉｍｍｕ３１ ＭＡｂまたはそのフラグメントを含んでなる少なくとも一つの第一のＭＡｂまたはそのフラグメントと、少なくとも一つの第二のＭＡｂまたはそのフラグメントを含んでなる抗体融合タンパク質またはそのフラグメント［ここで、この第二のＭＡｂは、ＣＥＡ、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２（例えば、１７−１Ａ）、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、ＭＵＣ−３、ＭＵＣ−４、ＰＡＭ−４、ＫＣ４、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＢｒＥ３、Ｌｅ−Ｙ、Ａ３、Ｅｐ−ＣＡＭ、Ｔｎ、およびＴｈｏｍｓｏｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、テネイシン、癌遺伝子、癌遺伝子産物、ＩＬ−６、ＩＧＦ−１、ＩＧＦＲ−１、腫瘍脈管形成抗原、例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、およびその他の血管増殖因子など、Ｇａ７３３、原発性肝癌のフェリチンおよび酸性イソフェリチン（ＡＩＦ）に反応性のある癌腫関連ＭＡｂ、またはそれらの組み合わせである］
からなる群から選択されるＭＡｂまたはそのフラグメントをコードする核酸を含んでなるＤＮＡ配列である。
この関連において、本明細書では、これらのＤＮＡ配列を含んでなる発現ベクターも意図する。ヒト化、キメラおよびヒトＩｍｍｕ３１ ＭＡｂまたはその抗体融合タンパク質またはそのフラグメントを作製する上で用いるベクターの場合、これらのベクターはヒト免疫グロブリンの軽鎖および重鎖定常領域とヒンジ領域に関するコード配列、ならびに分泌シグナルペプチドを含む。これらのベクターはさらに、必要であれば、選択された宿主細胞においてＩｇ遺伝子発現を誘導するためのプロモーター／エンハンサーエレメント、およびトランスフェクト細胞の選択のための薬剤耐性マーカーを含む。本明細書において特に有用なベクターは、特にキメラ、ヒト化またはヒト抗体（ＩｇＧなど）を発現させるのに用いる場合は、ＤＨＦＲ（ｐｄＨＬ２など）またはＧＳ−ベクターであり、ここで、このベクターは、ＩｇＧ１の重鎖および軽鎖定常領域およびヒンジ領域をコードする。より好ましくは、この軽鎖および重鎖定常領域およびヒンジ領域はヒトＥＵメラノーマ由来のものであり、所望によりアロタイプの位置の少なくとも一つのアミノ酸残基が別のＩｇＧ１アロタイプに見られるものに置き換わっていてもよく、また、所望により、ＥＵの重鎖のアミノ酸Ｉ２５３（ＥＵナンバリング法に基づく）がアラニンに置き換わっていてもよい。引用することによりその全開示内容が本明細書の一部とされるＥｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ６３： ７８−８５（１９６９）参照。
本発明によるＩｍｍｕ３１ ＭＡｂもしくはそのフラグメントまたは抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列を含む宿主細胞、またはこれらのＤＮＡ配列を含むベクターを含む宿主細胞も本発明に包含される。特に有用な宿主細胞は哺乳動物細胞であり、より具体的には、以下にさらに詳しく記載されるように、Ｓｐ２／０、ＹＢ２／０、ＮＳ０などのメラノーマ細胞系統、およびＤＧ−４４などのＣＨＯである。また、モノクローナル抗体およびその他の融合タンパク質を作製するのに有用なものとして、ＰＥＲ．Ｃ６ヒト細胞系統がある。
また、本発明では、Ｉｍｍｕ３１ ＭＡｂもしくはそのフラグメント、またはＩｍｍｕ３１融合タンパク質もしくはそのフラグメントを発現させる方法であって、（ａ）哺乳動物細胞を、Ｉｍｍｕ３１ ＭＡｂもしくはそのフラグメント、または抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列でトランスフェクトすること、および（ｂ）このＤＮＡ配列でトランスフェクトされた細胞の、Ｉｍｍｕ３１もしくはそのフラグメント、またはＩｍｍｕ３１抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントを分泌するものを培養することを含む方法を意図する。ＭＡｂとマーカーを発現する宿主細胞が容易に選択できるよう、ベクターに選択マーカーを含める既知の技術を使用できる。
本発明はまた、ＡＦＰ発現細胞と結合し、かつ、少なくとも一種の診断／検出薬および／または少なくとも一種の治療薬と結合されている抗ＡＦＰ ＭＡｂもしくはそのフラグメントまたは抗ＡＦＰ融合タンパク質もしくはそのフラグメントを含んでなる、肝細胞をターゲッティングする診断／検出用または治療用免疫複合体も包含する。
ある好ましい実施態様では、この診断／検出用免疫複合体はＩｍｍｕ３１ ＭＡｂもしくはそのフラグメントまたは抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントと、少なくとも一種の診断／検出薬を含んでなる。診断／検出薬の例としては、種々の標識、放射性核種、キレート剤、色素、蛍光化合物、色素原、およびその他のマーカー部分が挙げられる。陽電子放射断層撮影法に有用な放射性核種としては、限定されるものではないが、Ｆ−１８、Ｍｎ−５１、Ｍｎ−５２ｍ、Ｆｅ−５２、Ｃｏ−５５、Ｃｕ−６２、Ｃｕ−６４、Ｇａ−６８、Ａｓ−７２、Ｂｒ−７５、Ｂｒ−７６、Ｒｂ−８２ｍ、Ｓｒ−８３、Ｙ−８６、Ｚｒ−８９、Ｔｃ−９４ｍ、Ｉｎ−１１０、Ｉ−１２０、およびＩ−１２４が挙げられる。有用な陽電子放出放射性核種の総崩壊エネルギーは好ましくは＜２，０００ｋｅＶ、より好ましくは１，０００ｋｅＶ未満、最も好ましくは＜７００ｋｅＶである。γ線検出を用いる診断薬として有用な放射性核種としては、限定されるものではないが、Ｃｒ−５１、Ｃｏ−５７、Ｃｏ−５８、Ｆｅ−５９、Ｃｕ−６７、Ｇａ−６７、Ｓｅ−７５、Ｒｕ−９７、Ｔｃ−９９ｍ、Ｉｎ−１１１、Ｉｎ−１１４ｍ、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｙｂ−１６９、Ｈｇ−１９７、およびＴｌ−２０１が挙げられる。有用なγ線放出放射性核種の崩壊エネルギーは好ましくは２０〜２０００ｋｅＶ、より好ましくは６０〜６００ｋｅＶ、最も好ましくは１００〜３００ｋｅＶである。本発明による診断薬はまた、マンガン、鉄またはガドリニウムなどの造影剤であってもよい。
また、好ましくは、本発明による治療免疫複合体はＩｍｍｕ３１抗体もしくはそのフラグメント、またはＩｍｍｕ３１融合タンパク質もしくはそのフラグメントと、少なくとも一種の治療薬を含んでなる。治療薬の例としては、放射性標識、免疫調節剤、ホルモン、光活性治療薬、細胞傷害剤（薬物であっても毒素であってもい）、およびそれらの組み合わせが挙げられる。本発明において有用な薬物は、抗有糸分裂剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗生物質、アルカロイド、抗脈管形成剤、アポトーシス剤およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、薬学的特性を有する薬物である。より具体的には、これらの薬物はナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソウレア、トリアゼン、葉酸類似体、ＣＯＸ−２阻害剤、ピリミジン類似体、プリン類似体、抗生物質、酵素、エピポドフィロトキシン、プラチナ錯体、ビンカアルカロイド、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、アンタゴニスト、エンドスタチン、タキソール、カンプトテシン、アントラサイクリン、タキサン、およびそれらの類似体、ならびにそれらの組み合わせから選択される。本発明に包含される毒素は、リシン、アブリン、アルファトキシン、サポリン、オンコナーゼ、すなわちリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌内毒素−Ａ、ブタクサ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒、シュードモナス外毒素、およびシュードモナス内毒素からなる群から選択されるものなど、細菌、植物、または動物毒素である。
本発明のために好適な免疫調節剤としては、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、エリスロポエチン、トロンボポエチンおよびそれらの組み合わせが挙げられる。より具体的には、リンホトキシン（腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を含む）、造血因子［インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８）を含む］、コロニー刺激因子［（顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を含む］、インターフェロン（インターフェロン−α、−βまたは−γを含む）および幹細胞増殖因子（「Ｓ１因子」と呼ばれるものを含む）である。
特に有用な治療用免疫複合体は、６０〜７００ｋｅＶの間のエネルギーを有する一以上の放射性標識を含んでなる。このような放射性標識としては、限定されるものではないが、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、５９Ｆｅ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、７５Ｓｅ、７７Ａｓ、８９Ｓｒ、９０Ｙ、９９Ｍｏ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１１１Ａｇ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｈｏ、１６９Ｅｒ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、１９４Ｉｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２１１Ｐｂ、２１２Ｐｂ、２１３Ｂｉ、５８Ｃｏ、６７Ｇａ、８０ｍＢｒ、９９ｍＴｃ、１０３ｍＲｈ、１０９Ｐｔ、１１１Ｉｎ、１１９Ｓｂ、１２５Ｉ、１６１Ｈｏ、１８９ｍＯｓ、１９２Ｉｒ、１５２Ｄｙ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２２３Ｒａ、２１９Ｒｎ、２１５Ｐｏ、２１１Ｂｉ、２２５Ａｃ、２２１ＦＲ、２１７Ａｔ、２１３Ｂｉおよび２５５Ｆｍ、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。他の有用な治療複合体としては、色素原または色素などの光活性治療薬がある。
本発明は特に、ヒト、イヌやネコなどの家庭またはコンパニオンペットをはじめとする哺乳動物などの被験体において、肝細胞癌腫、肝芽細胞腫、生殖系細胞腫瘍、およびその他のＡＦＰ産生腫瘍を治療する方法であって、該被験体に、医薬上許容されるビヒクル中に調剤された、本発明による、治療上有効量の抗ＡＦＰ ＭＡｂまたはそのフラグメントを投与することを含む方法を包含する。好ましくは、この抗ＡＦＰ抗体またはそのフラグメントはＩｍｍｕ３１抗体またはそのフラグメントである。この療法では、治療薬が結合されていない「裸の抗体」を用いる。「裸のＩｍｍｕ３１抗体」の投与は、標的細胞の表面上にある別の抗体と結合するか、もしくはそれと反応性がある、または治療効果があり、本明細書で論じられているＭＡｂのＦｃ部分に、エフェクター機能などの他の機能を有する、治療上有効量の少なくとも一種の他の「裸の抗体」を該被験体に同時または逐次に投与することにより補うことができる。例えば、裸のＩｍｍｕ３１抗体を補うことができる好ましいＭＡｂは、ヒト化、キメラ、ヒトまたはマウス（非ヒト動物の場合）癌腫関連抗体またはそのフラグメントである。このような癌腫関連抗体またはそのフラグメントは好ましくは、ＣＥＡ、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２（例えば、１７−１Ａ）、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、ＭＵＣ−３、ＭＵＣ−４、ＰＡＭ−４、ＫＣ４、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＢｒＥ３、Ｌｅ−Ｙ、Ａ３、Ｅｐ−ＣＡＭ、Ｔｎ、およびＴｈｏｍｓｏｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、テネイシン、 癌遺伝子、癌遺伝子産物、ＩＬ−６、ＩＧＦ−１、ＩＧＦＲ−１、腫瘍脈管形成抗原（血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、およびその他の血管増殖因子など）、Ｇａ７３３、原発性肝癌のフェリチンおよび酸性イソフェリチン（ＡＩＦ）に反応性のあるＭＡｂ、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。
単独または上記で論じた他の裸のＭＡｂまたはそのフラグメントと組み合わせた裸のＩｍｍｕ３１抗体療法はいずれも、医薬上許容されるビヒクル中に調剤された、治療上有効量の、少なくとも一種の治療薬と同時または逐次いずれかの投与によりさらに補うことができる。本明細書で論じたように、治療薬は医薬上許容されるビヒクル中に調剤された、細胞傷害剤、放射性標識、免疫調節剤、ホルモン、光活性治療薬またはそれらの組み合わせを含み得る。
別の治療方法では、単独または上記で論じた他の裸のＭＡｂと組み合わせた裸のＩｍｍｕ３１抗体療法はいずれも、本明細書に記載され、医薬上許容されるビヒクル中に調剤された、治療上有効量の、少なくとも一種の治療用免疫複合体と同時または逐次いずれかの投与によりさらに補うことができる。治療用免疫複合体は、ＣＥＡ、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２（例えば、１７−１Ａ）、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、ＭＵＣ−３、ＭＵＣ−４、ＰＡＭ−４、ＫＣ４、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＢｒＥ３、Ｌｅ−Ｙ、Ａ３、Ｅｐ−ＣＡＭ、Ｔｎ、およびＴｈｏｍｓｏｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、テネイシン、癌遺伝子、癌遺伝子産物、ＩＬ−６、ＩＧＦ−１、ＩＧＦＲ−１、腫瘍脈管形成抗原［血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、およびその他の血管増殖因子など）、Ｇａ７３３、原発性肝癌のフェリチンおよび酸性イソフェリチン（ＡＩＦ）との反応性を有するＭＡｂ、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、少なくとも一種のヒト化、キメラ、ヒトまたはマウス（非ヒト被験体の場合）ＭＡｂを含む。この治療用免疫複合体は、医薬上許容されるビヒクル中に調剤された、細胞傷害剤、放射性標識、免疫調節剤、ホルモン、光活性治療薬またはそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも一種の治療薬と複合化させてもよい。
本明細書に記載されるように、本発明は特に、被験体において肝細胞癌腫、肝芽細胞腫、生殖系細胞腫瘍、およびその他のＡＦＰ産生腫瘍を治療する方法であって、被験体に、本発明による少なくとも二つの抗ＡＦＰ ＭＡｂもしくはそのフラグメントを含んでなる、または本発明による少なくとも一つの抗ＡＦＰ ＭＡｂもしくはそのフラグメントと少なくとも一つの癌腫関連ＭＡｂを含んでなる、治療上有効量の抗体融合タンパク質またはそのフラグメントを投与することを含む方法を包含する。好ましくは、この癌腫関連抗体はＣＥＡ、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２（例えば、１７−１Ａ）、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、ＭＵＣ−３、ＭＵＣ−４、ＰＡＭ−４、ＫＣ４、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＢｒＥ３、Ｌｅ−Ｙ、Ａ３、Ｅｐ−ＣＡＭ、Ｔｎ、およびＴｈｏｍｓｏｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、テネイシン、癌遺伝子、癌遺伝子産物、ＩＬ−６、ＩＧＦ−１、ＩＧＦＲ−１、腫瘍脈管形成抗原（血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、およびその他の血管増殖因子など）、Ｇａ７３３、原発性肝癌のフェリチンおよび酸性イソフェリチン（ＡＩＦ）に反応性のあるＭＡｂ、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。好ましくは、抗ＡＦＰ抗体またはそのフラグメントはＩｍｍｕ３１抗体またはそのフラグメントである。
この治療方法は、該被験体に、医薬上許容されるビヒクル中に調剤された、治療上有効量の少なくとも一種の治療薬を同時または逐次に投与することでさらに補うことができ、ここで、治療薬は好ましくは、医薬上許容されるビヒクル中に調剤された細胞傷害剤、放射性標識、免疫調節剤、ホルモン、光活性治療薬またはそれらの組み合わせである。
さらに、本発明による抗体融合タンパク質およびそのフラグメントは、被験体に、少なくとも一種の治療薬に結合された少なくとも一つのＭＡｂを含んでなる、治療上有効量の治療複合体とともに同時または逐次に投与することができ、ここで、この複合体のＭＡｂ成分は、ＣＥＡ、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２（例えば、１７−１Ａ）、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、ＭＵＣ−３、ＭＵＣ−４、ＰＡＭ−４、ＫＣ４、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＢｒＥ３、Ｌｅ−Ｙ、Ａ３、Ｅｐ−ＣＡＭ、Ｔｎ、およびＴｈｏｍｓｏｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、テネイシン、癌遺伝子、癌遺伝子産物、ＩＬ−６、ＩＧＦ−１、ＩＧＦＲ−１、腫瘍脈管形成抗原［血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、およびその他の血管増殖因子など）、Ｇａ７３３、原発性肝癌のフェリチンおよび酸性イソフェリチン（ＡＩＦ）との反応性を有するＭＡｂ、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、少なくとも一種のヒト化、キメラ、ヒトまたはマウス（非ヒト被験体の場合）ＭＡｂを含んでなる。
この抗体融合タンパク質はそれ自体、少なくとも一種の治療薬と複合化させてもよい。これらの治療薬は二つの異なる治療用放射性標識など、列挙されている異なる薬剤の組み合わせであっても、同じ薬剤の組み合わせであってもよい。
また、被験体において肝細胞癌腫、肝芽細胞腫、生殖系細胞腫瘍、およびその他のＡＦＰ産生腫瘍を診断／検出する方法であって、ヒト、ならびにイヌ、ネコ、ウサギ、モルモットなどの家庭およびコンパニオンペットをはじめとする哺乳動物などの被験体に、ＡＦＰ発現細胞と結合する本発明による抗ＡＦＰ ＭＡｂもしくはそのフラグメントまたは抗ＡＦＰ融合タンパク質もしくはそのフラグメントを含んでなる診断／検出用免疫複合体を投与することを含む方法を包含し、ここで、この抗ＡＦＰ ＭＡｂもしくはそのフラグメントまたは抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントは少なくとも一種の診断／検出薬と結合されている。この抗ＡＦＰ抗体、融合タンパク質、またはそのフラグメントは好ましくはＩｍｍｕ３１抗体、融合タンパク質、またはそのフラグメントである。所望により、この診断／検出用免疫複合体は医薬上許容されるビヒクル中に調剤してもよい。有用な診断薬は本明細書に記載されている。
２．定義
以下の説明において、多数の専門用語が使用されており、以下、本発明の理解を容易にするために定義を示す。
本明細書において抗体とは、全長（すなわち、天然に存在するまたは通常の免疫グロブリン遺伝子フラグメント組換えプロセスにより形成される）免疫グロブリン分子（例えばＩｇＧ抗体）、または抗体フラグメントのような、免疫グロブリン分子の免疫学的に有効な（すなわち、特異的に結合する）部分をいう。
抗体フラグメントとは、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、 Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどのような抗体の部分をいう。構造に関係なく、抗体フラグメントは完全な抗体により認識される同じ抗原と結合する。例えば、抗ＡＦＰモノクローナル抗体フラグメントは、ＡＦＰのエピトープと結合する。「抗体フラグメント」とはまた、特定の抗原に結合して複合体を形成することにより抗体のようにふるまういずれの合成または遺伝子操作タンパク質も含む。例えば、抗体フラグメントとしては、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」フラグメントのような可変領域からなる単離されたフラグメント、軽鎖および重鎖可変領域がペプチドリンカーにより接続されている組換え単鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖタンパク質」）、および超過変領域を模倣したアミノ酸残基からなる最小認識ユニットが挙げられる。
裸の抗体は一般に治療薬と複合化していない抗体である。これは抗体分子のＦｃ部分が、細胞溶解を引き起こす作用をするようメカニズムを設定する補体結合およびＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）のようなエフェクター機能を提供するためである。裸の抗体には、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の双方、ならびにキメラ、ヒト化またはヒト抗体のようなある種の組換え抗体が含まれる。しかし、治療機能のためにはこのＦｃ部分は必要なく、むしろ抗体は細胞周期の休止やアポトーシスなどの他のメカニズムによってその治療作用を果たす可能性がある。
キメラ抗体は、一つの種、好ましくは齧歯類の抗体由来の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む可変ドメインを含み、この抗体分子の定常ドメインはヒト抗体の定常領域に由来する組換えタンパク質である。獣医学領域への適用のためには、このキメラ抗体の定常ドメインは、ネコまたはイヌのような他の種由来のものであってもよい。
ヒト化抗体は、一つの種、例えば齧歯類抗体由来の抗体のＣＤＲが齧歯類抗体の重鎖および軽鎖可変鎖からヒト重鎖および軽鎖可変ドメインに移された組換えタンパク質である。抗体分子の定常ドメインは、ヒト抗体の定常ドメインに由来する。
ヒト抗体は、抗原刺激に応答して特定のヒト抗体を産生するために「操作された」トランスジェニックマウスから得られる抗体である。この技術では、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子座のエレメントが、内在性重鎖および軽鎖遺伝子座が標的破壊されている胚幹細胞株由来のマウス系統に導入される。このトランスジェニックマウスはヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、このマウスをヒト抗体を分泌するハイブリドーマを作製するために使用することができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法は、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ７：１３ （１９９４）， Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６ （１９９４），およびＴａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６：５７９（１９９４）に記載されている。完全ヒト抗体はまた、遺伝子または染色体トランスフェクション法ならびにファージディスプレー技術により構築でき、これらは総て当技術分野で公知である。例えば、非免疫ドナー由来の免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子レパートリーからのｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるヒト抗体およびそのフラグメントの産生に関しては、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５３（１９９０）を参照。この技術では、抗体可変ドメイン遺伝子がフレーム内で糸状バクテリオファージの主要または微量コートタンパク質遺伝子へクローニングされ、機能的抗体フラグメントとしてファージ粒子表面上に提示される。この糸状粒子はファージゲノムの単鎖ＤＮＡコピーを含み、抗体の機能特性に基づいて選択すれば、それらの特性を示す抗体をコードする遺伝子が選択されることになる。このように、ファージはＢ細胞のいくつかの特性を模倣する。ファージディスプレーはさまざまな形式で行うことが可能であり、総説としては例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｈｉｓｗｅｌｌ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：５５６４−５７１ （１９９３）を参照。
ヒト抗体はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化Ｂ細胞により産生させることができる。引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする、米国特許第５，５６７，６１０号明細書および同第５，２２９，２７５号明細書を参照。
治療薬は、個別に、同時にまたは逐次に、抗体部分とともにまたは抗体部分（すなわち抗体、または抗体フラグメント、またはサブフラグメント）と複合化させて投与される分子または原子であり、疾病の治療に有用である。治療薬の例としては、抗体、抗体フラグメント、薬物、毒素、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節剤、キレート剤、ホウ素化合物、光活性薬または色素および放射性同位元素が挙げられる。
診断薬は、抗体部分（すなわち抗体、または抗体フラグメント、またはサブフラグメント）と複合化させて投与される分子または原子であり、その抗原を含む細胞を位置づけることにより疾病の診断に有用である。有用な診断薬としては、限定されるものではないが、放射性同位元素、色素（ビオチン−ストレプトアビジン複合体など）、造影剤、蛍光化合物または分子、および核磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）のための増強剤（例えば、常磁性イオン）などがある。米国特許第６，３３１，１７５号明細書はＭＲＩ技術およびＭＲＩ増強剤に複合化させた抗体の調製について記載しており、その全開示内容は引用することにより本明細書の一部とする。好ましくは、これらの診断薬は放射性同位元素、核磁気共鳴イメージングで使用する増強剤、および蛍光化合物からなる群から選択される。抗体成分に放射性金属または常磁性イオンを付加するためには、イオンを結合させるための多様なキレート基を付着させた長いテールを有する試薬と反応させる必要があろう。このようなテールは、ポリリシン、多糖、または例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル、ビス−チオセミカルバゾン、ポリミキシン、およびこの目的のために有用なことが公知の基といった、キレート基に結合できるペンダント基を有する他の誘導体化または誘導体化可能な鎖であり得る。キレート剤は標準的な化学法を用いて抗体に結合させる。キレート剤は通常、免疫反応性の損失が最小で、凝集および／または内部架橋が最小となる分子との結合を形成し得る基により抗体に連結される。キレート剤を抗体に複合化させるその他の、もっと特殊な方法および試薬は、１９８９年４月２５日出願の「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」と題されたＨａｗｔｈｏｒｎｅの米国特許第４，８２４，６５９号明細書に開示されており、その開示内容は引用することにより本明細書の一部とする。特に有用な金属−キレートの組み合わせとしては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、１８Ｆ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、９９ｍＴｃ、９４ｍＴｃ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏおよび７６Ｂｒのような一般エネルギー範囲６０〜４，０００ｋｅＶの診断用同位元素とともに用いられる２−ベンジルＤＴＰＡならびにそのモノメチルおよびシクロヘキシル類似体が含まれ、ラジオイメージングに用いられる。同じキレート剤がマンガン、鉄およびガドリニウムのような非放射性金属と錯化した場合は、本発明による抗体とともに使用するとＭＲＩに有用である。ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ、およびＴＥＴＡのような大環状のキレート剤は種々の金属および放射性金属とともに、最も詳しくは、それぞれガリウム、イットリウム、および銅などの放射性核種とともに用いられる。このような金属−キレート錯体は、環のサイズを目的の金属にあわせて調整することにより極めて安定にすることができる。大環状ポリエーテルのような他のリング型キレート剤は、ＲＡＩＴのための２２３Ｒａのような、安定に結合する核種を対照とするものであり、本発明に包含される。
免疫複合体は、抗体成分と治療薬または診断薬との複合体である。この診断薬は放射性または非放射性標識、造影剤（磁気共鳴イメージング、コンピューター断層撮影法または超音波診断法など）を含んでもよく、この放射性核種はγ、β、α、オージェ電子、または陽電子放射性同位元素であり得る。
免疫調節剤は、存在すれば、典型的には免疫細胞の増殖を刺激するか、マクロファージ、Ｂ細胞、および／またはＴ細胞など、免疫応答カスケードにおいて活性化される、本発明で定義されたような治療薬である。本明細書に記載される免疫調節剤の例はサイトカインである。当業者ならば、特定のインターロイキンおよびインターフェロンがＴ細胞またはその他の免疫細胞の増殖を刺激するサイトカインの例であることが分かるであろう。
発現ベクターは、宿主細胞中で発現される遺伝子を含んでなるＤＮＡ分子である。通常、遺伝子発現は構成または誘導プロモーター、組織特異的調節エレメントおよびエンハンサーをはじめとする、特定の調節エレメントの制御下に置かれる。このような遺伝子は調節エレメントに「作動可能なように連結されている」といわれる。
組換え宿主は、クローニングベクターまたは発現ベクターのどちらかを含む任意の原核または真核細胞であってもよい。この語はまた、それらの原核または真核細胞、ならびに宿主細胞の染色体もしくはゲノム、または宿主細胞の細胞中にクローニングされた遺伝子を含むように遺伝子操作されたトランスジェニック動物も含む。好適な哺乳動物宿主細胞としては、ＳＰ２／０細胞およびＮＳ０細胞のような骨髄腫細胞、ならびにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ハイブリドーマ細胞株および抗体発現に有用な他の哺乳動物宿主細胞が挙げられる。また、ｍＡｂおよび他の融合タンパク質の発現に特に有用なものはＷＯ ００６３４０３ Ａ２に開示されているヒト細胞株ＰＥＲ．Ｃ６であり、ＣＨＯ、ＣＯＳ、 Ｖｅｒｏ、 ＨｅＬａ、 ＢＨＫおよびＳＰ２などの従来の哺乳動物細胞株に比べて２〜２００倍の組換えタンパク質を産生する。免疫系が改変された特別なトランスジェニック動物は完全なヒト抗体を作製するために特に有用である。
本明細書において、抗体融合タンパク質とは、特異性が同じまたは異なる二以上の同じまたは異なる天然抗体、単鎖抗体もしくは抗体フラグメントのセグメントが連結されている、組換え生産された抗原結合分子である。抗ＡＦＰ融合タンパク質はα−フェトタンパク質結合部位を含んでなる。好ましくは、この抗ＡＦＰ融合タンパク質はＩｍｍｕ３１融合タンパク質である。本発明によるＩｍｍｕ３１融合タンパク質およびそのフラグメントは、アミノ酸配列ＳＹＶＩＨを含んでなる重鎖可変領域のＣＤＲ１、アミノ酸配列ＹＩＨＰＹＮＧＧＴＫＹＮＥＫＦＫＧを含んでなる重鎖可変領域のＣＤＲ２、アミノ酸配列ＳＧＧＧＤＰＦＡＹを含んでなる重鎖可変領域のＣＤＲ３、およびアミノ酸配列ＫＡＳＱＤＩＮＫＹＩＧを含んでなる軽鎖可変領域のＣＤＲ１、アミノ酸配列ＹＴＳＡＬＬＰの軽鎖可変領域のＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＬＱＹＤＤＬＷＴを含んでなる軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含んでなる抗体または抗体フラグメント上の同じＡＦＰエピトープと結合する少なくとも一つのアームを含んでなる。
融合タンパク質の原子価は、この融合タンパク質が抗原またはエピトープに対して有している結合アームまたは結合部位の総数を示し、すなわち、一価、二価、三価または多価などである。抗体融合タンパク質が多価であるということは、抗原に対する結合において複数の相互作用を利用できることを意味し、従って、その抗原に、または異なる抗原に結合する結合力が高まる。特異性は、抗体融合タンパク質がいくつの異なるタイプの抗原またはエピトープに結合できるかを示し、すなわち、一重特異性、二重特異性、三重特異性、多重特異性などである。これらの定義により、例えばＩｇＧのような天然の抗体は、結合腕を二本持つために二価であるといえるが、この抗体は一つのタイプの抗原またはエピトープにしか結合しないので一重特異性である。一重特異性、多価融合タンパク質は、同じ抗原またはエピトープに対して一を超える結合部位を有する。例えば、一重特異性ダイアボディーは同じ抗原との反応性を有する二つの結合部位を有する融合タンパク質である。この融合タンパク質は、異なる抗体成分の多価もしくは多重特異性の組み合わせ、または同じ抗体成分の複数のコピーを含んでもよい。この融合タンパク質はさらに治療薬を含んでもよい。このような融合タンパク質に好適な治療薬の例としては、免疫調節剤（「抗体−免疫調節剤融合タンパク質」）および毒素（「抗体−毒素融合タンパク質」）が挙げられる。好ましい一つの毒素としては、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）であり、好ましくは組換えＲＮアーゼである。
多重特異性抗体は、同時に少なくとも二つの異なる構造の標的、例えば二つの異なる抗原、同じ抗原上の二つの異なるエピトープ、またはハプテンおよび抗原、もしくはエピトープに結合できる抗体である。一つの特異性は、例えばＢ細胞、Ｔ細胞、骨髄性細胞、形質細胞または肥満細胞抗原またはエピトープに対するものであろう。もう一つの特異性は、Ｂ細胞上のＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ４６、ＣＤ８０、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ７４、またはＣＤ２２のような、同じ細胞種上の異なる抗原に対するものであり得る。多重特異性、多価抗体は一を超える結合部位を有する構築体であり、その結合部位は異なる特異性を有する。例えば二重特異性ダイアボディーでは、一つの結合部位は一つの抗原と反応し、もう一方は他の抗原と反応する。
二重特異性抗体は、同時に二つの異なる構造の標的に結合できる抗体である。二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）および二重特異性抗体フラグメント（ｂｓＦａｂ）は、例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、骨髄性細胞、形質細胞および肥満細胞抗原またはエピトープに特異的に結合する少なくとも一つのアーム、および治療薬または診断薬を担持するターゲッティング可能な複合体に特異的に結合する少なくとも一つの他のアームを有する。分子工学技術を用いて種々の二重特異性融合タンパク質を作製できる。一つの形態においては、二重特異性融合タンパク質は二価であり、例えば一つの抗原に対する一つの結合部位を有するｓｃＦｖと第二の抗原に対する単一結合部位を有するＦａｂフラグメントからなる。もう一つの形態においては、この二重特異性融合タンパク質は四価であり、例えば一つの抗原に対して二つの結合部位を有するＩｇＧと第二の抗原に対する二つの同一のｓｃＦｖからなる。
イヌ化またはネコ化抗体は、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）の齧歯類（または他の種）の相補性決定領域が、齧歯類（または他の種）免疫グロブリンの重鎖および軽鎖可変領域から、それぞれイヌまたはネコの免疫グロブリン可変ドメイン中に移されている組換えタンパク質である。
家庭動物は、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ラマ、アルパカおよびブタのような大型動物、ならびにコンパニオン動物を含む。好ましい実施態様においては、家庭動物はウマである。
コンパニオン動物は、ペットとして飼われる動物を含む。これらは主としてイヌおよびネコであるが、モルモット、ハムスター、ラットおよびフェレットのような小型齧歯類、またサルのようなヒトよりも下等な霊長類も含まれる。好ましい実施態様において、コンパニオン動物とはイヌまたはネコである。
３．キメラ、ヒト化およびヒト抗体をはじめとするモノクローナル抗体の作製
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）は特定の抗原に対する抗体の均質な集団であり、その抗体はただ一種の抗原結合部位を含んでなり、抗原決定基上のただ一つのエピトープに結合する。特定の抗原に対する齧歯類モノクローナル抗体は、当業者に公知の方法により得ることができる。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）， ａｎｄ Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）， ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ， ＶＯＬ． １， ｐａｇｅｓ ２．５．１−２．６．７（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９１）［以下「Ｃｏｌｉｇａｎ」］を参照のこと。要するに、マウスに抗原を含む組成物を注射し、血清サンプルを採取して抗体産生を確認し、脾臓を摘出してＢリンパ球を採取し、そのＢリンパ球と骨髄腫細胞を融合させてハイブリドーマを作製し、そのハイブリドーマをクローニングし、抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選択し、抗原に対する抗体を産生するクローンを培養して、その抗体をハイブリドーマ培養物から単離することによりモノクローナル抗体を得ることができる。
ＭＡｂは、ハイブリドーマ培養液から種々の十分確立された技術により単離、精製できる。このような単離技術としては、Ａタンパク質セファロースを用いるアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ ａｔ ｐａｇｅｓ ２．７．１−２．７．１２およびｐａｇｅｓ ２．９．１−２．９．３．を参照。また、Ｂａｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｒｉｎ Ｇ （ＩｇＧ），”ｉｎ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， ＶＯＬ． １０， ｐａｇｅｓ ７９−１０４（Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９２）も参照。
ペプチド骨格に対するＡｂは、周知のＡｂ作製方法により作出する。例えば、免疫適格動物に、フロイントの完全アジュバント中、（ペプチド）ｎ−ＫＬＨ（ここで、ＫＬＨはキーホールリンペット・ヘモシアニンであり、ｎ＝１〜３０である）などの免疫原の注射、次いで、フロイントの不完全アジュバントに懸濁させた同じ免疫原の２回の連続注射を行う。これらの動物に最後の追加抗原の静脈投与を行った後、３日後に脾細胞を採取する。次に、採取した脾細胞をＳｐ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞と融合させ、得られたクローンの培養上清を直接結合ＥＬＩＳＡを用い、抗ペプチド反応性に関して分析する。生じたＡｂの詳細な特異性はもとの免疫原のペプチド断片を用いて分析することができる。これらの断片は自動ペプチド合成装置を用いて容易に作製できる。Ａｂ産生に関しては、融合した細胞系統の選択ができるよう。酵素欠損ハイブリドーマを単離する。また、この技術を用いて、例えば、Ｉｎ（ＩＩＩ）−ＤＴＰＡキレートなどのリンカーを含む一以上のキレートに対して抗体を惹起することができる。Ｉｎ（ＩＩＩ）−ジ−ＤＴＰＡに対するモノクローナルマウス抗体は公知である（Ｂａｒｂｅｔ ‘３９５前記）。
免疫原に対する最初の抗体惹起の後、モノクローナル抗体の可変遺伝子をこれらのハイブリドーマ細胞からクローニングし、その抗体の配列を決定し、次いで組換え技術により作製することができる。マウス抗体および抗体フラグメントのヒト化およびキメラ化は当業者に周知である。例えば、ヒト化モノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンの重鎖および軽鎖可変鎖由来のマウス相補性決定領域をヒト可変ドメインに移し、次いで枠組み構造領域中のヒト残基をマウスの対応物で置換することにより作製する。ある好ましい実施態様では、ヒト化抗ＡＦＰ抗体またはそのフラグメントの枠組み構造領域内のいくつかのヒト残基がそれらのマウス対応物で置換されている。好ましくは、このヒト化抗ＡＦＰ抗体はヒト化Ｉｍｍｕ３１抗体である。ＶＨに関して、二つの異なるヒト抗体に由来する枠組み構造配列の組み合わせを用いることも好ましい。この二つのヒト抗体はＥＵおよびＮＥＷＭであるのがなお好ましい。この抗体分子の定常ドメインはヒト抗体の定常ドメインに由来するものである。ヒト化モノクローナル抗体由来の抗体成分を使用することによってマウス定常領域の免疫原性に伴う潜在的な問題が防げられる。
マウス免疫グロブリン可変ドメインのクローニングのための一般的な技術は、例えば、引用することによりその全開示内容が本明細書の一部とされる、Ｏｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：３８３３ （１９８９）に記載されている。キメラ抗体構築のための技術は当業者に周知である。例えば、Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １３：４６９ （１９９４）は、ＬＬ２モノクローナル抗体、抗ＣＤ２２抗体のＶκおよびＶＨドメインをコードするＤＮＡ配列をそれぞれのヒトκおよびＩｇＧ１定常領域ドメインと組み合わせることでＬＬ２キメラをいかに作製したかが記載されている。この公報はまた、ＬＬ２の軽鎖および重鎖可変領域のヌクレオチド配列、ＶＫおよびＶＨをそれぞれ提供する。ヒト化ＭＡｂを産生する技術は、例えばＪｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２ （１９８６）， Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３ （１９８８）， Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４ （１９８８）， Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：４２８５ （１９９２）， Ｓａｎｄｈｕ， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． １２：４３７ （１９９２），およびＳｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎ． １５０：２８４４ （１９９３）に記載されており、これらはそれぞれ引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする。
本発明による抗体を作製するもう一つの方法は、トランスジェニック家畜の乳汁中での産生によるものがある。例えば、Ｃｏｌｍａｎ， Ａ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｓｙｍｐ．， ６３：１４１−１４７，１９９８； 米国特許第５，８２７，６９０号明細書を参照。なお、双方とも引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする。対をなす免疫グロブリン重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡセグメントをそれぞれ含む二つのＤＮＡ構築物体が調製される。このＤＮＡセグメントを、哺乳動物上皮細胞中で優先的に発現されるプロモーター配列を含む発現ベクターへクローニングする。例としては、限定されるものではないが、ウサギ、ウシおよびヒツジのカゼイン遺伝子、ウシα−ラクトグロブリン遺伝子、ヒツジβ−ラクトグロブリン遺伝子、およびマウスホエー酸タンパク質遺伝子由来のプロモーターが挙げられる。好ましくは、挿入されたフラグメントの３’側に哺乳動物特異的遺伝子由来の同族ゲノム配列が隣接する。これによりポリアデニル化部位および転写安定化配列が提供される。この発現カセットを受精した哺乳動物の卵子の前核に同時注入し、次いでレシピエント雌の子宮に着床させて妊娠させる。出産後、サザン分析により導入遺伝子の存在に関してその後代をスクリーニングする。抗体が存在するためには、重鎖および軽鎖双方の遺伝子が同時に同じ細胞で発現されなければならない。トランスジェニック雌動物から得た乳汁を当技術分野で公知の標準的な免疫学的方法により、該抗体または抗体フラグメントの存在と機能に関して分析する。この抗体は当技術分野で公知の標準的方法により、乳汁から精製することができる。
キメラ抗体は、齧歯類抗体のような一種の動物由来のＣＤＲを含む可変ドメインを含む組換えタンパク質であり、抗体分子の残りの部分、すなわち定常ドメインはヒト抗体に由来する。従って、キメラモノクローナル抗体（ＭＡｂ）はまた、キメラＭＡｂの可変ドメイン中のマウスＦＲ配列を、一以上の異なるヒトＦＲと置換することによりヒト化することができる。具体的には、マウスＣＤＲをマウス免疫グロブリンの重鎖および軽鎖可変鎖からヒト抗体の相当する可変ドメインに転移させる。マウスＣＤＲをヒトＦＲに単に転移させるだけでは、しばしば抗体親和性の低下または損失さえ起こるために、マウス抗体の元の親和性を回復させるためにはさらなる修飾が必要となる。これは、そのエピトープに対して良好な結合親和性を有する抗体を得るために、ＦＲ領域の一以上のいくつかのヒト残基をマウスの相当部分と置換することにより行うことができる。例えば、Ｔｅｍｐｅｓｔ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：２６６（１９９１）およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４ （１９８８）を参照。さらに、ヒト化、キメラおよびヒトＭＡｂの特定のエピトープに対する親和性は、ＣＤＲの突然変異誘発により高めることができ、その結果、より低用量の抗体が突然変異前の高用量の低親和性ＭＡｂと同等の有効性を示し得る。例えば、ＷＯ００２９５８４Ａ１を参照。
ヒト化またはキメラＩｍｍｕ３１抗体との組み合わせ療法に用いる、本発明による完全なヒト抗体、すなわちヒト抗ＡＦＰ ＭＡｂ、または抗ＣＥＡ，抗ＴＡＧ−７２、抗Ｔｎ、抗Ｌｅ（ｙ）、抗ＭＵＣ１、抗ＭＵＣ２、抗ＭＵＣ３、抗ＭＵＣ４、抗ＥＧＦＲ、抗ＨＥＲ２および抗ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）などの他のヒト抗体は、トランスジェニック非ヒト動物から得ることができる。例えば、引用することによりその全開示内容が本明細書の一部とされるＭｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， １５： １４６−１５６ （１９９７）； 米国特許第５，６３３，４２５号参照。例えば、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン遺伝子座を有するトランスジェニックマウスから回収することができる。好ましくは、この抗ＡＦＰ抗体はＩｍｍｕ３１抗体である。このマウス体液性免疫系は、内在する免疫グロブリン遺伝子を不活化し、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することによりヒト化する。ヒト免疫グロブリン遺伝子座は極めて複雑で、多数の離散セグメントを含み、それはヒトゲノムのほぼ０．２％を占める。トランスジェニックマウスが十分な抗体レパートリーを産生できることを保証するには、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子座の大きな部分をマウスゲノムに導入しなければならない。これは、生殖系構造においてヒト重鎖または軽鎖免疫グロブリン遺伝子座のいずれかを含む酵母人工染色体（ＹＡＣ）の形成に始まる段階的なプロセスで達成される。それぞれの挿入配列はほぼ１Ｍｂのサイズなので、ＹＡＣ構築体は免疫グロブリン遺伝子座の重複フラグメントの相同的組換えを必要とする。一つは重鎖遺伝子座、もう一つは軽鎖遺伝子座を含む二つのＹＡＣを、ＹＡＣ含有酵母スフェロプラストとマウス胚幹細胞の融合を通じてマウスに個々に導入する。次いで、胚幹細胞クローンをマウス胚盤胞にマイクロインジェクションする。得られたキメラ雄動物を、生殖細胞系を通じてＹＡＣを伝達する能力に関してスクリーニングし、マウス抗体産生を欠損しているマウスと交配させる。一種はヒト重鎖遺伝子座を含み、もう一種はヒト軽鎖遺伝子座を含む二種のトランスジェニック系統を繁殖させ、免疫感作に応答してヒト抗体を産生する作出する。
また、再配列されていないヒト免疫グロブリン遺伝子も、マイクロ細胞媒介染色体導入（ｍｉｃｒｏｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ） （ＭＭＣＴ）により、マウス胚幹細胞へ導入することができる。例えば、Ｔｏｍｉｚｕｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， １６： １３３（１９９７）参照。この方法論では、ヒト染色体を含むマイクロ細胞をマウス胚幹細胞と融合させる。導入された染色体は安定的に保持され、成体キメラは適切な組織特異的発現を示す。
別法として、本発明による抗体または抗体フラグメントは、コンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーから単離されたヒト抗体フラグメントに由来するものであってもよい。例えば、引用することにより本明細書の一部とされる、Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．， ＭＥＴＨＯＤＳ： Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２： １１９（１９９１）、およびＷｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２： ４３３（１９９４）参照。Ｂ細胞の不死化によるモノクローナル抗体の作製に伴う問題の多くは、ファージディスプレーを用い、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）を操作し、そこで抗体フラグメントを発現させることによって克服することができる。高親和性モノクローナル抗体の回収を保証するためには、コンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーは大きなレパートリーを含んでいなければならない。典型的な戦略では、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成するために、免疫化したマウスのリンパ球または脾細胞から得られたｍＲＮＡを用いる。重鎖および軽鎖の遺伝子をそれぞれＰＣＲにより増幅し、ファージクローニングベクターに連結する。重鎖遺伝子を含むものと軽鎖遺伝子を含むものの二つの異なるライブラリーが生じる。各ライブラリーからファージＤＮＡを単離し、重鎖配列と軽鎖配列をともに連結し、パッケージングしてコンビナトリアルライブラリーを形成する。各ファージは重鎖と軽鎖のｃＤＮＡの無作為なペアを含み、大腸菌の感染時に感染細胞内でこれらの抗体鎖の発現を命令する。目的の抗原を認識する抗体を同定するには、ファージライブラリーをプレーティングし、プラークに存在する抗体分子をフィルターに移す。これらのフィルターを放射性標識した抗原とともにインキュベートした後、洗浄して過剰な非結合リガンドを除去する。オートラジオグラム上の放射性スポットを、その抗原と結合する抗体を含むプラークとして同定する。ヒト免疫グロブリンファージライブラリーを作製するのに有用なクローニングおよび発現ベクターは、例えばＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）から入手できる。
二重特異性ＭＡｂを産生するさらなる最新の方法は、付加的なシスチン残基を有し、より一般的な免疫グロブリンイソ型よりも強く架橋結合している人工的組換えＭＡｂを含む。例えば、ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． １０（１０）：１２２１−１２２５， １９９７を参照。もう一つのアプローチは、二以上の異なる単鎖抗体または必要とされる二重特異性を有する抗体フラグメントセグメントを連結する組換え融合タンパク質を設計することである。例えば、Ｃｏｌｏｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １５：１５９−１６３， １９９７を参照。分子工学技術を用いて様々な二重特異性融合タンパク質を作製できる。一つの形態においては、二重特異性融合タンパク質は一価であり、例えば一つの抗原に対する単一結合部位を有するｓｃＦｖと第二の抗原に対する単一結合部位を有するＦａｂフラグメントからなる。もう一つの形態においては、二重特異性融合タンパク質は二価であり、例えば、一つの抗原に対する二つの結合部位を有するＩｇＧと、第二の抗原に対する二つの結合部位を有する二つのｓｃＦｖからなる。
二以上の異なる単鎖抗体または抗体フラグメントを連結している二重特異性融合タンパク質も、同様の方法で作製する。種々の融合タンパク質を作製するためには組換え法を用いることができる。例えば、ヒト化モノクローナルＩｍｍｕ３抗体由来のＦａｂフラグメントおよびマウス抗ｄｉＤＴＰＡ由来のｓｃＦｖを含んでなる融合タンパク質を作製することができる。ＧＧＧＳのような柔軟なリンカーは、ｓｃＦｖをＩｍｍｕ３１抗体の重鎖の定常領域に結合させる。あるいは、ｓｃＦｖは別のヒト化抗体の軽鎖の定常領域に結合させることができる。重鎖ＦｄのｓｃＦｖとのフレーム内結合のために必要な適当なリンカー配列は、ＰＣＲ反応を介してＶＬおよびＶＫドメインに導入される。次に、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡフラグメントをＣＨ１ドメインをコードするＤＮＡ配列を含む足場ベクターに連結する。これにより得られたｓｃＦｖ−ＣＨ１構築物を切り出して、Ｉｍｍｕ３１抗体のＶＨ領域をコードするＤＮＡ配列を含むベクターに連結する。得られたベクターは、二重特異性融合タンパク質の発現のための哺乳動物細胞のような適当な宿主細胞をトランスフェクトするために使用することができる。
キメラ、ヒト化およびヒト抗ＡＦＰ抗体の作製
本明細書で用いる細胞系統および培養培地はＩｍｍｕ３１ハイブリドーマ細胞およびＳｐ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）を含む。Ｉｍｍｕ３１を産生するモノクローナルハイブリドーマは、α−フェトタンパク質を感作させたマウスから調製した脾細胞をＳＰ２／０Ａｇ１４と融合させることにより得られたものである。これらの細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｌｏｇａｎ， ＵＴ）および抗生物質を添加したハイブリドーマ血清フリー培地（ＨＳＦＭ）（ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）（完全培地）で培養し得る。あるいは、それらは１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， Ｍａｓｓ．）を添加し、１０％のＦＣＳおよび７５μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含むダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（完全ＨＳＦＭ）中、または示されている場合には、抗生物質のみを含むＨＳＦＭ中で培養してもよい。トランスフェクトーマの選択は５００単位／ｍｌのハイグロマイシン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を含む完全ＨＳＦＭ中で行ってもよい。好ましくは、総ての細胞系統を３７℃、５％ＣＯ２中で維持する。
ＶκおよびＶ Ｈ 遺伝子セグメントの獲得
ＶκおよびＶＨ遺伝子セグメントの単離は、当技術分野で公知のいくつかの手段により達成することができる。このような手段の二つが、限定されるものではないが、ＰＣＲクローニングとｃＤＮＡライブラリースクリーニングである。
ＰＣＲクローニング技術は当技術分野で周知である。簡単に説明すると、ＶκおよびＶＨ遺伝子フラグメントのＰＣＲクローニングは以下のようにして行える。Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）などの市販を用い、Ｉｍｍｕ３１ハイブリドーマ細胞系統から全ＲＮＡを単離し得る。次に、ｃＤＮＡサイクルキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、ＲＮＡから第一鎖ｃＤＮＡを逆転写し得る。このプロセスにおいて、５μｇの全ＲＮＡをオリゴｄＴまたはランダムヘキサマープライマー、またはマウスＩｇＧ ＣＨ１特異的プライマーまたはマウスＣｋ特異的プライマーにアニーリングする。このようなプライマーの例としては、それぞれＣＨ１Ｂ（５’−ＡＣＡ ＧＴＣ ＡＣＴ ＧＡＧ ＣＴＧ Ｇ−３’）およびＣｋ３−ＢＨ１（５’−ＧＣＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＧＡ ＣＴＧ ＧＡＴ ＧＧＴ ＧＧＧ ＡＡＧ ＡＴＧ ＧＡＴ ＡＣＡ−３’）が挙げられる。この第一鎖ｃＤＮＡを鋳型として用い、Ｏｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．が記載しているように、ＰＣＲにより、ＶＨおよびＶκ配列を増幅することができる。Ｖκ領域については、ＶＫ１ＢＡＣＫ（５’−ＧＡＣ ＡＴＴ ＣＡＧ ＣＴＧ ＡＣＣ ＣＡＧ ＴＣＴ ＣＣＡ−３’）とＩｇＫＣ３’（５’−ＣＴＣ ＡＣＴ ＧＧＡ ＴＧＧ ＴＧＧ ＧＡＡ ＧＡＴ ＧＧＡ ＴＡＣ ＡＧＴ ＴＧＧ−３’）などのプライマー対を使用できる。ＶＨ領域については、ＶＨ１ＢＡＣＫ（５’−ＡＧＧ Ｔ（Ｃ／Ｇ）（Ａ／Ｃ）Ａ（Ａ／Ｇ）Ｃ ＴＧＣ ＡＧ（Ｃ／Ｇ）ＡＧＴ Ｃ（Ａ／Ｔ）Ｇ Ｇ−３’）とＣＨ１Ｂなどのプライマー対を使用できる。増幅した後、次に、ＶκおよびＶＨフラグメントをゲル精製し、ジデオキシターミネーション法による配列分析用のＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などのクローニングベクター中にクローニングする。次に、免疫グロブリン起原であることが確認された配列を用い、Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ． （Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ， １３：４６９（１９９４））が記載している方法を用いてキメラＡｂ発現ベクターを構築することができる。
ＰＣＲクローニングによりＶκおよびＶＨ遺伝子セグメントを単離するための好ましい別法として、ｃＤＮＡライブラリースクリーニングを用いてもよい。ｃＤＮＡスクリーニング法もまた、当技術分野で周知であるが、要するに、ｃＤＮＡライブラリーは、ｐＳＰＯＲＴベクター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において、マウスＩｍｍｕ３１ハイブリドーマ細胞から抽出したｍＲＮＡから構築することができる。第一鎖ｃＤＮＡは、Ｉｍｍｕ３１ハイブリドーマ由来のｐｌｙ Ａ ＲＮＡをオリゴｄＴプライマー−ＮｏｔＩアダプター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でプライミングすることにより合成できる。第二の合成とＳａｌＩアダプターの付加の後、ｃＤＮＡプールをｃＤＮＡサイズ分画カラムによりサイズ分画すればよい。次に、分画されたｃＤＮＡをｐＳＰＯＲＴベクターに連結し、その後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換すればよい。次に、ライブラリーをプレーティングし、フィルターに移し、増幅させ得る。
ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングは、重鎖および軽鎖に特異的な標識プローブとのハイブリダイゼーションにより行うことができる。例えば、重鎖についてはＭＵＣＨ−１（５’−ＡＧＡ ＣＴＧ ＣＡＧ ＧＡＧ ＡＧＣ ＴＧＧ ＧＡＡ ＧＧＴ ＧＴＧ ＣＡＣ−３’）および軽鎖についてはＭＵＣＫ−１（５’−ＧＡＡ ＧＣＡ ＣＡＣ ＧＡＣ ＴＧＡ ＧＧＣ ＡＣＣ ＴＣＣ ＡＧＡ ＴＧＴ−３’）などの［３２−Ｐ］標識プローブがある。１回目のスクリーニングで陽性のクローンを二反復でプレートに移し、同じプローブで２回スクリーニングする。
ＲＮＡの単離、ｃＤＮＡの合成、および増幅は以下のようにして行うことができる。引用することにより本明細書の一部とされるＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， １９８９）に従い、全細胞ＲＮＡを、全部で約１０７細胞を用い、Ｉｍｍｕ３１ハイブリドーマ細胞系統から調製することができる。第一鎖ｃＤＮＡは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔプレアンプリフィケーションシステム（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， Ｍｄを用いるなど、常法により全ＲＮＡから逆転写することができる。要するに、反応量２０μｌ中、５０ｎｇのランダムヘキサマープライマーを、２μｌの１０×合成バッファー［２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５００ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ］、１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰミックス、２μｌの０．１Ｍ ＤＴＴ、および２００単位のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素の存在下、５μｇのＲＮＡとアニーリングさせることができる。伸張工程はまず室温で１０分間行った後、４２℃で５０分間インキュベートする。この反応は、反応混合物を９０℃で５分間加熱することで終了させることができる。
これらのスクリーニングプローブの合成および標識は、周知の手段により行うことができる。用いる検出系に応じ、プローブの標識は異なる。この目的の多くのキットが市販されている。オリゴヌクレオチドの３２−Ｐ標識の一つの方法として、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ， ＩＬ）およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）を用いた後、カラム精製を行うものがある。
キメラ抗ＡＦＰ抗体の作製
一般に、キメラ抗ＡＦＰ ＭＡｂを作製するには、上記のような方法によりＡＦＰ抗体のＶＨおよびＶκ鎖を得、ＰＣＲにより増幅すればよい。ある好ましい実施態様では、このキメラ抗ＡＦＰ抗体はＩｍｍｕ３１抗体である。このＶκＰＣＲ産物を、ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ， １３：４６９（１９９４）が記載しているようなｐＢＲ３２７に基づく足場ベクター（ＶＫｐＢＲ）にサブクローニングすることができる。ＶＨＰＣＲ産物は、同様のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに基づく足場ベクター（ＶＨｐＢＳ）にサブクローニングできる。プロモーターおよびシグナルペプチド配列とともにＶκ配列とＶＨ配列を含むフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼを用い、これらの足場ベクターから切り出すことができる。Ｖκフラグメント（約６００ｂｐ）を常法により、哺乳動物発現ベクター（例えば、ｐＫｈ）にサブクローニングすることができる。ｐＫｈは、ヒトκ定常領域、Ｉｇエンハンサー、κエンハンサーおよびハイグロマイシン耐性遺伝子のゲノム配列を含む、ｐＳＶｈｙｇに基づく発現ベクターである。同様に、約８００ｂｐのＶＨフラグメントは、ヒトＩｇＧ１定常領域、Ｉｇエンハンサーおよびキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）遺伝子のゲノム配列を含む、ｐＳＶｇｐｔに基づく発現ベクターｐＧ１ｇにサブクローニングすることができる。これら二つのプラスミドは、エレクトロポレーションによりＳｐ２／０−Ａｇ１４細胞などの哺乳動物細胞へ同時トランスフェクトし、ハイグロマイシン耐性に関してスクリーニングすればよい。選択に生き残ったコロニーを拡張し、上清液を、ＥＬＩＳＡ法によりｃＩｍｍｕ３１ ＭＡｂの産生に関してモニタリングする。トランスフェクション効率は約１〜１０×１０６細胞であるのが望ましい。この系では、抗体発現レベルは０．１０〜２．５μｇ／ｍｌの間であると予測される。
あるいは、ＶκおよびＶＨ発現カセットは、改変型足場ベクターＶＫｐＢＲ２およびＶＨｐＢＳ２で構築し、それぞれＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ断片およびＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ断片として切り出し、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４細胞にでの発現の関してＧｉｌｌｅｓ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１ （１９８９）、Ｌｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５：３１０１ （１９９９）およびＬｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ， ８０：２６６０ （１９９７）が記載しているように、ｐｄＨＬ２などの単一の発現ベクターにサブクローニングすることもできる。本明細書において有用な他のベクターとしては、Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２：１０９−１２３ （２０００）に記載されているような、ＮＳ０細胞系統およびＣＨＯ細胞で好ましく発現されるＧＳ−ベクターがある。他の適当な哺乳動物発現系は、Ｗｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｚｎｅｉｍ．−Ｆｏｒｓｃｈ．／Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ． ４８（ＩＩ）， Ｎｒ． ８， ８７０−８８０ （１９９８）に記載されている。
ヒト化抗ＡＦＰ抗体の作製
ある好ましい実施態様では、このヒト化抗ＡＦＰ抗体はヒト化Ｉｍｍｕ３１抗体である。ｈＩｍｍｕ３１ＶκおよびＶＨドメインの配列がデザインされれば、ＰＣＲ反応において鋳型として長い合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、そしてプライマーとして短いオリゴヌクレオチドを用いた遺伝子合成によってＣＤＲエングラフティングを行うことができる。ほとんどの場合、ＶκまたはＶＨドメインをコードするＤＮＡは約３５０ｂｐの長さである。コドンの縮重を利用すれば、Ｖ遺伝子ＤＮＡ配列の中央付近の領域に、コードされるアミノ酸を変化させることなく、独特の制限部位を容易に導入することができる。例えば、ｈＩｍｍｕ３１ＶＨ ドメインに関してはＤＮＡヌクレオチド１６９〜１７４番（アミノ酸５６〜５７番）に、最初にデザインされたアミノ酸配列（図５Ａの配列を参照）を維持しながら、独特のＫｐｎＩ部位を導入することができる。ＫｐｎＩ部位の上流と下流にある二つの長い非重複一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド（〜１５０ｂｐ）は、自動ＤＮＡオリゴヌクレオチド合成装置（Ｃｙｃｌｏｎｅ Ｐｌｕｓ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ， Ｍｉｌｌｉｇｅｎ−Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）により作製することができる。全長ＤＮＡオリゴヌクレオチドの収率は低いと考えられるが、それらはＰＣＲ反応で、二対のフランキングオリゴヌクレオチドにより増幅させることができる。これらのプライマーは、その後の配列構築とサブクローニングを容易にするために必要な制限部位を用いてデザインすることができる。これらオリゴヌクレオチドのプライマーは、得られたＰＣＲ産物がＫｐｎＩ部位でフレーム内連結して、ｈＩｍｍｕ３１ＶＨドメインをコードする全長ＤＮＡを形成するように、ＫｐｎＩ部位に重複配列を含んでいなければならない。これらオリゴのＰＣＲ産物の、ＫｐｎＩ部位における連結、および足場ベクターＶＨｐＢＳのＰｓｔＩＩ／ＢｓｔＥＩＩ部位へのそれらのサブクローニングは単一の三断片連結工程で完了することができる。正しい配列がＶＨｐＢＳへサブクローニングできたことは、まず制限消化分析により分析し、次に、Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７４ ５４６３ （１９７７）に従い、シーケンシング反応により確認することができる。
Ｉｇプロモーター、リーダー配列およびｈＩｍｍｕ３１ＶＨ配列を含む、このＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ断片を足場ベクターから切り出し、ヒトＩｇＧ定常領域、Ｉｇエンハンサーおよびｇｐｔ選択マーカーのゲノム配列を含むｐＳＶｇｐｔに基づくベクターｐＧ１ｇ中の対応する部位にサブクローニングし、最終的な発現ベクターｈＩｍｍｕ３１ｐＧ１ｇを形成することができる。ｈＩｍｍｕ３１Ｖκ配列の構築についても同様の戦略を用いることができる。長いオリゴヌクレオチドのＰＣＲ産物の連結のために選択される制限部位としては、この場合、ＮｓｉＩである。
Ｉｇプロモーター、リーダー配列およびｈＩｍｍｕ３１Ｖκ配列を含むＤＮＡ配列は、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ処理により足場ベクターＶＫｐＢＲから切り出すことができ、ヒトκ鎖定常領域、ハイグロマイシン選択マーカー、Ｉｇおよびκエンハンサーゲノム配列を含む、ｐＳＶｈｙｇに基づくベクターｐＫｈの対応する部位にサブクローニングし、最終的な発現ベクターｈＩｍｍｕ３１ｐＫｈを形成することができる。
この二つのプラスミドを適当な細胞、例えば、骨髄腫Ｓｐ２／０−Ａｇ１４に同時トランスフェクトし、コロニーをハイグロマイシン耐性に関して選択し、上清液を、以下に記載するように、例えばＥＬＩＳＡアッセイによりｈＩｍｍｕ３１抗体の産生に関してモニタリングすることができる。あるいは、ＶκおよびＶＨ発現カセットは、改変型足場ベクターＶＫｐＢＲ２およびＶＨｐＢＳ２で構築し、それぞれＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ断片およびＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ断片として切り出し、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４細胞にでの発現の関してＧｉｌｌｅｓ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１ （１９８９）、Ｌｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５：３１０１ （１９９９）およびＬｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ， ８０：２６６０ （１９９７）が記載しているように、ｐｄＨＬ２などの単一の発現ベクターにサブクローニングすることもできる。本明細書において有用な他のベクターとしては、Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２：１０９−１２３ （２０００）に記載されているような、ＮＳ０細胞系統およびＣＨＯ細胞で好ましく発現されるＧＳベクターがある。他の適当な哺乳動物発現系は、Ｗｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｚｎｅｉｍ．−Ｆｏｒｓｃｈ．／Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ． ４８（ＩＩ）， Ｎｒ． ８， ８７０−８８０ （１９９８）に記載されている。
トランスフェクションおよびＥＬＩＳＡによる抗体分泌クローンのアッセイは次のようにして行うことができる。引用することにより本明細書の一部とされるＣｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４８：１１４９ （１９９２）に従うエレクトロポレーション（ＢｉｏＲａｄ， Ｒｉｃｈｍｏｎｄ， Ｃａｌｉｆ．）による５×１０６個のＳＰ２／０骨髄腫細胞のトランスフェクションには、約１０μｇのｈＩｍｍｕ３１（軽鎖発現ベクター）および２０μｇのｈＩｍｍｕ３１Ｇ１ｇ（重鎖発現ベクター）を用いることができる。トランスフェクション後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２下、９６ウェルマイクロタイタープレートにて完全ＨＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， Ｍｄ．）中で増殖させればよい。選択プロセスは２日後、ハイグロマイシン選択培地（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ．）を最終濃度５００μｇ／ｍｌハイグロマイシンで加えることにより開始することができる。コロニーは通常エレクトポレーション後２〜３週間で出現する。次に、これらの培養物をさらなる分析のために拡張することができる。
クローンのスクリーニングおよび抗体の単離
キメラまたはヒト化重鎖の分泌に関して陽性のトランスフェクトーマクローンはＥＬＩＳＡアッセイにより同定することができる。要するに、トランスフェクトーマ培養物からの上清サンプル（１００μｌ）を、ヤギ抗ヒト（ＧＡＨ）−ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ， Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ， Ｐａ．）をプレコートしたＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートに３反復で添加する。プレートを室温で１時間インキュベートする。洗浄バッファー（０．０５％ポリソルベート２０を含有するＰＢＳ）で３回洗浄することで結合していないタンパク質を除去する。ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ＧＡＨ−ＩｇＧ、Ｆｃフラグメント特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ， Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ， Ｐａ．）をウェルに加える（抗体原液を１０４倍希釈したもの１００μｌ、非結合抗体を最終濃度１．０μｇ／ｍｌまで添加）。１時間インキュベートした後、プレートを通常３回洗浄する。反応溶液［ＰＢＳ中、１６７μｇのオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏ．）、０．０２５％過酸化水素を含有する１００μｌ］をウェルに加える。暗所にて３０分間、発色させる。各ウェルに５０μｌの４Ｎ ＨＣｌ溶液を加えることで反応を停止させた後、自動ＥＬＩＳＡリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｗｉｎｏｏｓｋｉ， ＶＴ）で４９０ｎｍにて吸光度を測定する。次に、無関係なキメラ抗体標品（Ｓｃｏｔｇｅｎ， Ｌｔｄ．， Ｅｄｉｎｂｕｒｇ， Ｓｃｏｔｌａｎｄから入手可能）に対して結合キメラ抗体を測定する。
抗体は細胞培養培地から次のようにして単離することができる。トランスフェクトーマ培養物を血清フリー培地に適用する。キメラ抗体の生産のためには、ＨＳＦＭを用い細胞を回転瓶中５００ｍｌの培養物として細胞を増殖させる。培養物を遠心分子し、上清を０．２μメンブランで濾過する。濾過した培地をＡタンパク質カラム（１×３ｃｍ）に流速１ｍｌ／分で通す。次にこの樹脂を約１０倍カラム量のＰＢＳで洗浄し、１０ｍＭＥＤＴＡを含有する０．１Ｍグリシンバッファー（ｐＨ３．５）を用いて、Ａタンパク質結合抗体をカラムから溶出させる。１．０ｍｌ画分を、１０μｌの３Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．６）の入った試験管に回収し、２８０／２６０ｎｍの吸光度からタンパク質濃度を求める。ピーク画分をプールし、ＰＢＳの対して透析し、例えばＣｅｎｔｒｉｃｏｎ ３０（Ａｍｉｃｏｎ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， Ｍａｓｓ．）を用いて抗体を濃縮する。抗体濃度は上記のようにＥＬＩＳＡにより測定し、その濃度をＰＢＳを用いて約１ｍｇ／ｍｌに調整する。保存のためにはサンプルにアジ化ナトリウム０．０１％（ｗ／ｖ）を加えると便宜である。
キメラ、ヒト化またはヒト抗ＡＦＰ抗体の親和性は直接結合アッセイまたは競合的結合アッセイにより評価し得る。
組換え抗体の改変／至適化
ヒト化の結果として抗体の親和性の低下または消失も起こることがあるので、もとの親和性を回復させるためにはさらなる改変が必要な場合がある。（例えば、引用することにより本明細書の一部とされる、Ｔｅｍｐｅｓｔ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９： ２６６（１９９１）； Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９： １５３４（１９８８））。ｃＩｍｍｕ３１がマウスの対応物のそれに匹敵する結合親和性を示すということからすれば、ｈＩｍｍ３１ｕの原型において、あるとすれば、欠陥デザインが、ｃＩｍｍｕ３１の軽鎖および重鎖をヒト化型のそれに混合および適合させることによって確認することができる。好ましくは、枠組み構造領域におけるいくつかのヒト残基を、それらのマウス対応物で置き換える。また、好ましくは、ＶＨに、ＥＵとＮＥＷＭなどの異なる二つのヒト抗体に由来する枠組み構造配列を用いる。例えば、ＦＲ１−３はＮＥＷＭ由来のＥＵおよびＦＲに起原し得る。
Ａｓｎ結合グリコシル化部位などの他の改変は、通常のオリゴヌクレオチドにより指定される部位特異的突然変異誘発により、キメラ化、ヒト、またはヒト化Ｉｍｍｕ３１抗体に導入することができる。オリゴヌクレオチドにより指定される部位突然変異誘発およびクローニングされたＤＮＡの突然変異誘発のための関連技術の詳細なプロトコールは周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． 前記参照。
例えば、ｈＩｍｍｕ３１Ｖκ（図４Ｂ）の１８番にＡｓｎを導入するには、コドン１８をＡｒｇのＡＧＧから、ＡｓｎのＡＡＣに変更すればよい。これを行うには、チミジンの代わりに少数のウラシルを含む一本鎖ＤＮＡ分子を得るために、好適な大腸菌株（例えば、ｄｕｔ−、ｕｎｇ−）から、抗体軽鎖配列を含む一本鎖ＤＮＡ鋳型を作製する。このようなＤＮＡ鋳型は、Ｍ１３のクローニングにより、またはＳＰプロモーターを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により得ることができる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ＮＹ， １９８７参照。突然変異配列を含むオリゴヌクレオチドを常法により合成し、一本鎖鋳型にアニーリングし、その産物をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼおよびＴ４ ＤＮＡリガーゼで処理し、一本鎖ＤＮＡ分子を生産する。二本鎖ＤＮＡでの野生型Ｅ．（ｄｕｔ＋、ｕｎｇ＋）細胞の形質転換により、突然変異ＤＮＡが効率的に回収される。
あるいは、Ａｓｎ結合グリコシル化部位は、プライマーとして所望の突然変異を含むオリゴヌクレオチド、およびＶｋ鎖の可変領域ＤＮＡクローン を用い、または鋳型として所望の抗体を産生する細胞由来のＲＮＡを用いることで、抗体軽鎖へ導入することができる。また、Ｈｕｓｅ， ｉｎ ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ： Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＧＵＩＤＥ， Ｂｏｅｒｒｅｂａｅｃｋ， ｅｄ．， Ｗ． Ｈ． ＦＲｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．， ｐｐ． １０３−１２０， １９９２も参照。部位指定突然変異誘発は例えばＴＲＡＮＳＦＯＲＭＥＲ（商標）キット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， Ｃａｌｉｆ．）を製造業者の使用説明書に従って用いて行うことができる。
あるいは、グリコシル化部位は、その一つが所望の突然変異を含む、相互にプライミングするオリゴヌクレオチドを有する抗体鎖を合成することにより導入することもできる。例えば、引用することにより本明細書の一部とされる、Ｕｈｌｍａｎｎ， Ｇｅｎｅ ７１： ２９（１９８８）； Ｗｏｓｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ６０： １１５（１９８８）； Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，前記参照。
上の一般的な記載は抗体の軽鎖の１８番のＡｓｎグリコシル化部位の導入について言及したものであるが、当業者ならば、Ａｓｎ結合グリコシル化部位を軽鎖のどこにでも、また、重鎖可変領域にでも導入することができることが分かるであろう。
４．抗体フラグメントの作製
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術により作製し得る。抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖなどの抗体の抗原結合部分である。他の抗体フラグメントとしては、限定されるものではないが、抗体分子のペプシン消化により作製できるＦ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド結合を還元することにより作製できるＦａｂ’フラグメントが挙げられる。あるいは、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ’フラグメントの迅速で容易な同定を可能にするには、Ｆａｂ’発現ライブラリーを構築することができる（Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４６：１２７４−１２８１）。本発明は抗体および抗体フラグメントを包含する。
単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）は、ＶＬドメインおよびＶＨドメインを含んでなる。このＶＬおよびＶＨドメインは組み合わさって標的結合部位を形成している。これらの二つのドメインはペプチドリンカー（Ｌ）によりさらに共有結合されている。ｓｃＦｖ分子は、ＶＬドメインがｓｃＦｖ分子のＮ末端部である場合、ＶＬ−Ｌ−ＶＨ、またはＶＨドメインがｓｃＦｖ分子のＮ末端部である場合、ＶＨ−Ｌ−ＶＬと表される。ｓｃＦｖ分子の作製方法、および好適なペプチドリンカーの設計方法は、米国特許第４，７０４，６９２号、同第４，９４６，７７８号、Ｒ． Ｒａａｇ ａｎｄ Ｍ． Ｗｈｉｔｌｏｗ，“Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈａｉｎ Ｆｖｓ．”ＦＡＳＥＢ Ｖｏｌ ９：７３−８０（１９９５）およびＲ． Ｅ． Ｂｉｒｄ ａｎｄ Ｂ． Ｗ． Ｗａｌｋｅｒ，“Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｒｅｇｉｏｎｓ，”ＴＩＢＴＥＣＨ， Ｖｏｌ ９：１３２−１３７（１９９１）に記載されている。これらの参照文献は引用することにより本明細書の一部とされる。
高親和性ｓｃＦｖを得るには、総て既知のＶＨ、ＶｋおよびＶｌ遺伝子ファミリーに対応するＰＣＲプライマーを用いて、非免疫ヒトドナーからＶ遺伝子を単離することにより、レパートリーの大きなｓｃＦｖライブラリーを構築することができる。例えば、Ｖａｕｇｈｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １４： ３０９−３１４（１９９６）参照。増幅後、ＶｋとＶｌのプールを合わせて一つのプールとする。これらのフラグメントをファージミドベクターに連結する。次に、ｓｃＦｖリンカー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３をファージミドのＶＬフラグメントの上流に連結する。このＶＨおよびリンカー−ＶＬフラグメントを増幅し、ＪＨ領域で構築する。得られたＶＨ−リンカー−ＶＬフラグメントをファージミドベクターに連結する。このファージミドライブラリーは、上記のようのフィルターを用いて、または免疫チューブ（Ｎｕｎｃ； Ｍａｘｉｓｏｒｐ）を用いてパンニングすることができる。感作ウサギのリンパ球または脾細胞に由来するコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーを構築し、Ｐ．パストリス（Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ）においてｓｃＦｖ構築物を発現させることによっても同様の結果を達成することができる。例えば、Ｒｉｄｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １３： ２５５−２６０（１９９５）参照。さらに、適当なｓｃＦｖを単離した後、ＣＤＲ３突然変異誘発およびチェーンシャッフリングなどの親和性成熟プロセスにより、結合親和性がより高く、解離速度がより遅い抗体フラグメントを得ることができる。例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， ７８： １８１−１８８（１９９８）； Ｏｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２： １８１−１９６（１９９６）参照。
抗体フラグメントは、全長抗体のタンパク質加水分解、またはフラグメントをコードするＤＮＡの、大腸菌もしくは他の宿主中での発現により調製することができる。抗体フラグメントは、常法により全長抗体のペプシンまたはパパイン消化により得られる。例えば、抗体フラグメントは抗体をペプシンで酵素的に切断して、Ｆ（ａｂ’）２で示される１００Ｋｄのフラグメントを得ることにより作製することができる。このフラグメントはチオール還元剤、および所望によりジスルフィド結合の切断により生じるスルフヒドリル基の遮断基を用いてさらに切断することができ、５０Ｋｄ Ｆａｂ’一価フラグメントが得られる。あるいは、パパインを用いる酵素的切断により二つの一価Ｆａｂフラグメントと一つのＦｃフラグメントが直接的に生じる。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇの米国特許第４，０３６，９４５号および同第４，３３１，６４７号、ならびにそこに含まれる参照文献に記載されており、これらの特許は引用することによりその全開示内が本明細書の一部とされる。また、Ｎｉｓｏｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ８９：２３０（１９６０）； Ｐｏｒｔｅｒ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ ７３：１１９（１９５９）、Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ ＶＯＬ． １， ｐａｇｅ ４２２（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９６７）、および Ｃｏｌｉｇａｎ ａｔ ｐａｇｅｓ ２．８． １−２．８．１０および２．１０．−２． １０．４．も参照。
抗体フラグメントのもう一つの形態は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲは抗体の可変領域のセグメントであり、抗体が結合するエピトープに対し相補的な構造であり、残りの可変領域よりもさらに変化に富んでいる。従って、ＣＤＲはしばしば超過変領域と呼ばれる。可変領域は三つのＣＤＲを含んでなる。ＣＤＲペプチドは、対象となる抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することにより得られる。このような遺伝子は、例えば抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成するためのポリメラーゼ連鎖反応を用いて調製される。例えば、Ｌａｒｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２：１０６（１９９１）； Ｃｏｕｒｔｅｎａｙ−Ｌｕｃｋ，“Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”ｉｎ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ， ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＡＮＤ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ， Ｒｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）， ｐａｇｅｓ １６６−１７９ （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５）；およびＷａｒｄ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”ｉｎ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ， Ｂｉｒｃｈ ｅｔ ａｌ．， （ｅｄｓ．）， ｐａｇｅｓ １３７−１８５（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． １９９５）参照。
重鎖を分離して一価の軽鎖−重鎖フラグメントを形成し、さらにフラグメントを切断するような抗体を切断する他の方法、または他の酵素学的、化学的または遺伝学的技術も、それらのフラグメントが無傷の抗体により認識される抗原に結合する限り用いてよい。
５．融合タンパク質
本発明による抗体融合タンパク質は二以上の抗体またはそのフラグメントを含んでなり、この融合タンパク質を構成する各々の抗体が治療薬または診断薬を含み得る。言い換えれば、この抗体融合タンパク質またはそのフラグメントは少なくとも第一の抗ＡＦＰ ＭＡｂまたはそのフラグメントと、この抗ＡＦＰ ＭＡｂではない少なくとも一つの第二のＭＡｂまたはそのフラグメントを含んでなる。ある好ましい実施態様では、この抗ＡＦＰ抗体またはそのフラグメントはＩｍｍｕ３１抗体またはそのフラグメントである。好ましくは、第二のＭＡｂは、ＣＥＡ、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２（例えば、１７−１Ａ）、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、ＭＵＣ−３、ＭＵＣ−４、ＰＡＭ−４、ＫＣ４、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＢｒＥ３、Ｌｅ−Ｙ、Ａ３、Ｅｐ−ＣＡＭ、Ｔｎ、およびＴｈｏｍｓｏｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、テネイシン、癌遺伝子、癌遺伝子産物、ＩＬ−６、ＩＧＦ−１、ＩＧＦＲ−１、腫瘍脈管形成抗原［血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、およびその他の血管増殖因子など）、Ｇａ７３３、１７−１Ａ、原発性肝癌のフェリチンおよび酸性イソフェリチン（ＡＩＦ）に対する癌腫関連抗体、またはそれらの組み合わせである。
さらに、抗体融合タンパク質を含んでなる一以上の抗体またはそのフラグメントは少なくとも一種の、結合した治療薬または診断／検出薬を含み得る。なお、これらの診断／検出薬または治療薬は同じである必要はなく、異なる治療薬であってもよく、例えば、同じ融合タンパク質に薬物と放射性同位元素を結合させることができる。特に、ＩｇＧを１３１Ｉで放射性標識し、薬物と結合させることができる。この１３１ＩはＩｇＧのチロシンに導入し、この薬剤をＩｇＧリジンのεアミノ基と結合させることができる。また、治療薬も診断薬も、還元型のＳＨ基および炭水化物側鎖と結合させることができる。
また、好ましくは、本発明による抗体融合タンパク質は少なくとも二つの抗ＡＦＰモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含んでなり、これらはαフェトタンパク質の抗原の、または異なるヒト免疫グロブリン骨格配列（またはＩｇＧ）の異なるエピトープであってもよい。好ましくは、抗ＡＦＰ抗体またはそのフラグメントはＩｍｍｕ３１抗体またはそのフラグメントである。
多重特異性抗体と多価抗体
本発明の別の実施態様は、複合化多価Ｉｍｍｕ３１抗体である。多価、多重特異性薬剤の組成および方法は、引用することによりその全開示内容が本明細書の一部とされる、２００２年１２月２４日に出願されたＲｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，米国特許出願第６０／４３６，３５９号明細書、および２００３年４月２３日に出願された米国特許出願第６０／４６４，５３２号明細書に記載されている。
本発明によるＩｍｍｕ３１抗体およびそのフラグメント、ならびに組み合わせ療法で用いられる異なる特異性を有するその他の抗体は、αフェトタンパク質抗原に対する少なくとも一つの結合部位と、別の抗原に対する少なくとも一つの結合部位を含んでなる多重特異性抗体、または同じエピトープまたは抗原に対する複数の結合部位を含んでなる多価抗体として作製できる。ある好ましい実施態様では、この多重特異性抗体またはそのフラグメントはＩｍｍｕ３１エピトープに対する少なくとも一つの結合部位と、ＡＦＰ抗原ではない少なくとも一つの結合部位を含んでなる。このＩｍｍｕ３１エピトープは、本発明によるＩｍｍｕ３１抗体によって認識されるＡＦＰ抗原上のエピトープである。また、好ましくは、この多重特異性抗体またはそのフラグメントはＩｍｍｕ３１エピトープに対する少なくとも一つの結合部位と、ＡＦＰ抗原上の異なるエピトープに対する少なくとも一つの結合部位を含んでなる。
本発明は、ＡＦＰと特異的に結合する少なくとも一つの結合領域と、罹患細胞マーカーまたはターゲッティング可能な複合体と特異的に結合する少なくとも一つの他の結合領域とを有する二重特異性抗体または抗体フラグメントを提供する。このターゲッティング可能な複合体は、この二重特異性抗体または抗体フラグメントの少なくとも一つの結合領域によって認識される少なくとも一つのエピトープを含んでなる、または担持する担体部分を含んでなる。好ましくは、この二重特異性抗体はＡＦＰ抗原のＩｍｍｕ３１エピトープと結合する。
二重特異性抗体および抗体フラグメントを生産するには、様々な組換え法を使用できる。例えば、二重特異性抗体および抗体フラグメントはトランスジェニック家畜の乳汁中で生産することができる。例えば、Ｃｏｌｍａｎ， Ａ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｓｙｍｐ．， ６３： １４１−１４７， １９９８；米国特許第５，８２７，６９０号明細書参照。それぞれ対となる免疫グロブリン重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡセグメントを含む二つのＤＮＡ構築物を作製する。これらのフラグメントを、哺乳動物上皮細胞で優先的に発現するプロモーター配列を含む発現ベクターにクローニングする。例としては、限定されるものではないが、ウサギ、ウシおよびヒツジのカゼイン遺伝子、ウシα−ラクトグロブリン遺伝子、ヒツジβ−ラクトグロブリン遺伝子、およびマウスホエー酸タンパク質遺伝子由来のプロモーターが挙げられる。好ましくは、挿入されたフラグメントの３’側に哺乳動物特異的遺伝子由来の同族ゲノム配列が隣接する。これによりポリアデニル化部位および転写安定化配列が提供される。この発現カセットを受精した哺乳動物の卵子の前核に同時注入し、次いでレシピエント雌の子宮に着床させて妊娠させる。出産後、サザン分析により両導入遺伝子の存在に関してその後代をスクリーニングする。抗体が存在するためには、重鎖および軽鎖双方の遺伝子が同時に同じ細胞で発現されなければならない。トランスジェニック雌からの乳汁を当技術分野で公知の標準的な免疫学的方法を用いて該抗体または抗体フラグメントの存在と機能に関して分析する。この抗体は当技術分野で公知の標準的方法により、乳汁から精製することができる。
ｂｓＡｂを生産する他の最新の方法としては、一般的な免疫グロブリンイソ型よりも強力にそれらを架橋するように、付加的なシステイン残基を有する操作された組換えＡｂを含む。例えば、ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． １０（１０）：１２２１−１２２５， １９９７参照。もう一つのアプローチとしては、必要な二重特異性を有する二以上の異なる単鎖抗体または抗体フラグメントのセグメントを連結した組換え融合タンパク質を操作するものがある。例えば、Ｃｏｌｏｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １５：１５９−１６３， １９９７参照。様々な二重特異性融合タンパク質が分子工学を用いて作製できる。一つの形態においては、二重特異性融合タンパク質は一価であり、例えば一つの抗原に対する単一結合部位を有するｓｃＦｖと第二の抗原に対する単一結合部位を有するＦａｂフラグメントからなる。もう一つの形態においては、二重特異性融合タンパク質は二価であり、例えば、一つの抗原に対する二つの結合部位を有するＩｇＧと、第二の抗原に対する二つの結合部位を有する二つのｓｃＦｖからなる。
本発明ではまた、抗ＡＦＰ多価抗体またはそのフラグメントも意図される。好ましくは、この抗ＡＦＰ多価抗体またはそのフラグメントは、Ｉｍｍｕ３１多価抗体またはそのフラグメントである。この多価抗体は、第一および第二のポリペプチドの結合により構築される。第一のポリペプチドは、好ましくは免疫グロブリン軽鎖可変領域ドメインである第一の免疫グロブリン様ドメインに共有結合された第一の単鎖Ｆｖ分子を含んでなる。第二のポリペプチドは、好ましくは免疫グロブリン重鎖可変領域ドメインである第二の免疫グロブリン様ドメインに共有結合された第二の単鎖Ｆｖ分子を含んでなる。第一および第二の単鎖Ｆｖ分子は各々、標的結合部位を形成し、第一および第二の免疫グロブリン様ドメインは結合して第三の標的結合部位を形成する。
ＶＬ−Ｌ−ＶＨ立体配置を有する単鎖Ｆｖ分子（ただしＬはリンカー）は、ＶＨ−Ｌ−ＶＬ立体配置を有する別の単鎖Ｆｖ分子と結合し、二価の二量体を形成し得る。この場合、第一のｓｃＦｖのＶＬドメインおよび第二のｓｃＦｖ分子のＶＨドメインは結合して一つの標的結合部位を形成し、一方、第一のｓｃＦｖのＶＨドメインおよび第二のｓｃＦｖのＶＬドメインは結合してもう一方の標的結合部位を形成する。
本発明のもう一つの実施態様は、非共有結合して三つの結合部位を形成し、そのうちの二つが一つの標的に対して親和性を有し、第三の結合部位は作製可能で診断薬および／または治療薬のための担体に結合しているハプテンに親和性を有する、二つの異種ポリペプチド鎖を含んでなるＩｍｍｕ３１二重特異性、三価抗体である。好ましくは、この抗体は二つのＩｍｍｕ３１結合部位と一つのＣＥＡまたはＭＵＣ１結合部位を有する。この二重特異性、三価ターゲッティング剤は二つの異なるｓｃＦｖを有し、第一のｓｃＦｖは短いリンカーにより別の抗体のＶＬドメインに連結された一つの抗体由来の二つのＶＨドメインを含み、第二のｓｃＦｖは短いリンカーにより他の抗体のＶＨドメインに連結された第一の抗体由来の二つのＶＬドメインを含む。ＶＨおよびＶＬドメインから多価、多重特異的薬剤を作製するこれらの方法によれば、一つのＶＨ鎖と一つのＶＬ鎖の非共有結合により多価および多重特異的ないずれの薬物でも作製できるという方法で、宿主生物中でＤＮＡプラスミドから合成された個々の鎖が完全なＶＨドメイン（ＶＨ鎖）または完全なＶＬドメイン（ＶＬ鎖）から構成されることになる。例えば、三価の三重特異性薬剤の形成では、ＶＨ鎖は三つのＶＨドメインのアミノ酸配列からなり、それぞれのドメインは異なる特異性の抗体に由来し、種々の長さのペプチドリンカーにより連結され、またＶＬ鎖は相補的ＶＬドメインからなり、ＶＨ鎖に使用されたものと類似のペプチドリンカーにより連結されている。抗体のＶＨおよびＶＬドメインは逆平行に結合しているため、本発明による好ましい方法では、ＶＬ鎖のＶＬドメインはＶＨ鎖のＶＨドメインとは逆の順序で配置されている。
ダイアボディー、トリアボディーおよびテトラボディー
本発明による抗Ｉｍｍｕ３１抗体およびそのフラグメントはまた、ダイアボディーとも呼ばれる、機能性二重特異性単鎖抗体（ｂｓｃＡｂ）の調製に使用でき、組換え法により哺乳動物細胞中で作製できる。好ましくは、この抗ＡＦＰ抗体またはそのフラグメントは、Ｉｍｍｕ３１抗体またはそのフラグメントである。例えば、引用することにより本明細書の一部とされる、Ｍａｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ９２：７０２１−７０２５，１９９５を参照。例えば、ｂｓｃＡｂは組換え法によりグリシン−セリンリンカーを介して二つの単鎖Ｆｖフラグメントを結合することで作製する。問題の二つの抗体のＶＬ鎖（ＶＬ）およびＶＨ鎖（ＶＨ）ドメインは、標準的ＰＣＲ法により単離される。次に、それぞれのハイブリドーマから得られたｃＤＮＡのＶＬおよびＶＨは二段階の融合ＰＣＲにおいて結合されて単鎖フラグメントを形成する。第一のＰＣＲ工程では（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ１）３リンカーを導入し、第二の工程ではＶＬおよびＶＨアンプリコンを結合させる。次いでそれぞれの単鎖分子を細菌発現ベクターへクローニングする。増幅後に単鎖分子の一つを切り出して問題の第二の単鎖分子を含む他のベクターへサブクローニングする。得られたｂｓｃＡｂフラグメントを真核細胞発現ベクターへサブクローニングする。機能性タンパク質の発現は、そのベクターをチャイニーズハムスター卵巣細胞へトランスフェクトすることにより得られる。二重特異性融合タンパク質も同様の方法で調製される。二重特異性単鎖抗体および二重特異性融合タンパク質は本発明の範囲内に含まれる。
例えば、ヒト化、キメラ、またはヒトまたはマウス抗Ｉｍｍｕ３１モノクローナル抗体を、抗原特異的ダイアボディー、トリアボディー、およびテトラボディーを作製するために使用することができる。この単一特異性ダイアボディー、トリアボディー、およびテトラボディーは選択的に標的抗原に結合し、分子上の結合部位数が増加すると標的細胞に対する親和性が高まり、所望の位置における滞留時間が長くなるのが観察される。ダイアボディーに関しては、５つのアミノ酸残基のリンカーによりヒト化Ｉｍｍｕ３１ ＭＡｂのＶＫポリペプチドに連結されたヒト化Ｉｍｍｕ３１ ＭＡｂのＶＨポリペプチドを含んでなる二つの鎖が利用される。各々の鎖はヒト化Ｉｍｍｕ３１ダイアボディーの１／２を形成する。トリアボディーの場合、ヒト化Ｉｍｍｕ３１ ＭＡｂのＶＫポリペプチドにリンカーは介さずに連結されたヒト化Ｉｍｍｕ３１ ＭＡｂのＶＨポリペプチドを含んでなる三つの鎖が利用される。各々の鎖はｈＩｍｍｕ３１トリアボディーの１／３を形成する。
また、本発明では、ＡＦＰなど、罹患組織に対して反応性のある少なくとも一つのアームと、ターゲッティング可能な構築物に対して反応性のある少なくとも一つの他のアームを有する二重特異性抗体または抗体フラグメントを意図する。好ましくは、二重特異性抗体の一つのアームはＩｍｍｕ３１ エピトープと結合する。このターゲッティング可能な構築物は担体部分と、少なくとも２単位の認識可能なハプテンからなる。認識可能なハプテンの例としては、限定されるものではないが、ヒスタミンスクシニルグリシン（ＨＳＧ）およびイソチオシアン酸フルオレセインが挙げられる。ターゲッティング可能な構築物は罹患組織を治療または同定するのに有用な種々の薬剤と複合化させてもよい。ターゲッティング可能な構築物は多様な構造のものであり得るが、免疫応答の惹起を避けるためだけでなく、ｂｓＡｂターゲッティング方法で用いる場合には迅速なｉｎ ｖｉｖｏクリアランスのためにも選択される。強力な免疫応答の惹起には疎水性薬剤が最良であり、一方、迅速なｉｎ ｖｉｖｏクリアランスのためには親水性薬剤が好ましいことから、疎水性と親水性の間のバランスを確立する必要がある。これは、一つには、多くの有機部分の固有の疎水性を相殺することを目的とした親水性のキレート剤の使用によって達成される。また、例えば、いくつかが疎水性であり、いくつかが親水性であるアミノ酸を含むペプチドなど、反対の溶液特性を有するターゲッティング可能な構築物のサブユニットを選択し得る。ペプチドの他、炭水化物を用いてもよい。
大量のｂｓｃＡｂおよび融合タンパク質は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）発現系を用いて生産することができる。例えば、Ｚｈｅｎｐｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １４： １９２−１９６， １９９６参照。機能的ｂｓｃＡｂが、二つのフラグメントのＶＬおよびＶＨドメインが異なるポリペプチド鎖に存在する二つの「クロスオーバー」ｓｃＦｖフラグメントの、大腸菌での同時発現により再選できる。二つの目的抗体のＶ軽鎖（ＶＬ）およびＶ重鎖（ＶＨ）ドメインは標準的なＰＣＲ法を用いて単離される。次に、このｃＤＮＡを、第一の目的抗体のＶＬドメインのＣ末端が第二の抗体のＶＨドメインのＮ末端にリンカーを介して連結されるように、細菌発現ベクターに連結する。同様に、第二の目的抗体のＶＬドメインのＣ末端が、第一の抗体のＶＨドメインのＮ末端にリンカーを介して連結される。得られた二シストロン性オペロンを、例えばリン酸飢餓により誘導される大腸菌アルカリ性ホスファターゼプロモーターなどの強力なプロモーターの転写制御下に置く。あるいは、一本鎖融合構築物は、ｌａｃプロモーターと、２％グリシンおよび１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有する培地を用い、大腸菌で首尾よく発現されている。例えば、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ６４： ２８６９−２８７４， １９９８参照。大腸菌熱安定性エンテロトキシンＩＩシグナル配列を用い、これらのペプチドを周辺質空間に向ける。分泌されると、この二つのペプチド鎖は会合して、両方の抗原結合特性を有する非共有結合性ヘテロ二量体を形成する。ｂｓｃＡｂは当技術分野で公知の標準的な手順、例えば、ブドウ球菌Ａタンパク質クロマトグラフィーを用いて精製される。
機能的ｂｓｃＡｂｓおよび融合タンパク質もまた、トランスジェニック家畜の乳汁中で生産することができる。例えば、Ｃｏｌｍａｎ， Ａ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｓｙｍｐ．， ６３： １４１−１４７， １９９８；米国特許第５，８２７，６９０号明細書参照。上記のようにして得られたｂｓｃＡｂフラグメントを、哺乳動物上皮細胞で優先的に発現するプロモーター配列を含む発現ベクターにクローニングする。例としては、限定されるものではないが、ウサギ、ウシおよびヒツジのカゼイン遺伝子、ウシα−ラクトグロブリン遺伝子、ヒツジβ−ラクトグロブリン遺伝子、およびマウスホエー酸タンパク質遺伝子由来のプロモーターが挙げられる。好ましくは、挿入されたｂｓｃＡｂの３’側に哺乳動物特異的遺伝子由来の同族ゲノム配列が隣接する。これによりポリアデニル化部位および転写安定化配列が提供される。次に、この発現カセットを受精した哺乳動物の卵子の前核に注入し、次いでレシピエント雌の子宮に着床させて妊娠させる。出産後、サザン分析により導入されたＤＮＡの存在に関してその後代をスクリーニングする。トランスジェニック雌からの乳汁を当技術分野で公知の標準的な免疫学的方法を用いて該ｂｓｃＡｂの存在と機能に関して分析する。このｂｓｃＡは当技術分野で公知の標準的方法を用いて、乳汁から精製することができる。乳汁におけるｂｓｃＡｂのトランスジェニック生産は、大量のｂｓｃＡを得るための効率的な方法を提供する。
機能的ｂｓｃＡｂおよび融合タンパク質はまた、トランスジェニック植物でも生産することができる。例えば、Ｆｉｅｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈ．， １３： １０９０−１０９３， １９９５； Ｆｉｅｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ３： ２０５−２１６， １９９７参照。このような生産により、低コストで大規模な生産と安定で長期的な保存をはじめとするいくつかの利点が得られる。上記のようにして得られたｂｓｃＡｂフラグメントを、このタンパク質を小胞体へと向けるため、プロモーター配列を含み、シグナルペプチド配列をコードする発現ベクターにクローニングする。実施者が発現産物を植物の特定の場所へ向けることができる種々のプロモーターが利用できる。例えば、タバコ植物における偏在発現は強力なカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターを用いて達成でき、一方、器官特異的発現は種子特異的レグミンＢ４プロモーターによって達成できる。この発現カセットを当業者に公知の標準的な方法に従って形質転換する。形質転換はサザン分析によって確認する。トランスジェニック植物を、当技術分野で公知の標準的な免疫学的方法を用い、ｂｓｃＡｂの存在および機能について分析する。このｂｓｃＡｂは、当技術分野で公知の標準的方法を用い、植物組織から精製することができる。
さらに、トランスジェニック植物はｂｓｃＡｂおよび融合タンパク質の長期保存を容易にする。室温で１週間保存した後に、タバコの葉から機能的に活性なｓｃＦｖタンパク質が抽出されている。同様に、室温で１年間保存したトランスジェニックタバコ種子は、ｓｃＦｖタンパク質またはその抗原 結合活性の損失をまったく示さなかった。
機能的ｂｓｃＡｂおよび融合タンパク質はまた、昆虫細胞でも生産できる。例えば、Ｍａｈｉｏｕｚ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２１２： １４９−１６０（１９９８）参照。昆虫に基づく発現系は、均一かつ適切に折りたたまれた大量のｂｓｃＡｂを生産する手段を提供する。バキュロウイルスは昆虫細胞用に広く用いられているベクターであり、組換え抗体分子に首尾よく適用されている。例えば、Ｍｉｌｌｅｒ， Ｌ．Ｋ．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ４２： １７７（１９８８）； Ｂｅｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， １８６： ２４５（１９９５）参照。あるいは、誘導型プロモーターの転写物制御下でｂｓｃＡｂ構築物を含む安定昆虫細胞系統を作出することにより、誘導型発現系を使用することもできる。例えば、Ｍａｈｉｏｕｚ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２１２： １４９−１６０（１９９８）参照。上記のようにして得られたｂｓｃＡｂフラグメントを、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｐｈｉｌａ）メタロチオネインプロモーターおよびヒトＨＬＡ−Ａ２リーダー配列を含む発現ベクターにクローニングする。次に、この構築物をＤ．メラノガスター（Ｄ． ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ） ＳＣ−２細胞へトランスフェクトする。これらの細胞が高い量の銅、亜鉛またはカドミウムに曝されることにより、発現が誘導される。ｂｓｃＡｂの存在および機能は当技術分野で公知の標準的な免疫学的方法を用いて判定される。精製ｂｓｃＡｂは当技術分野で公知の標準的な方法を用いて得られる。
本明細書に記載の二重特異性ダイアボディーは最終的に、その後の診断／検出薬または治療薬の特異的送達のために、Ｉｍｍｕ３１陽性腫瘍をプレターゲッティングするために使用される。これらのダイアボディーは標的抗原に選択的に結合し、親和性を高め、所望の場所における滞留時間を延長する。さらに、抗原と結合していないダイアボディーは体内から迅速に排泄され、正常組織の曝露は最小限に抑えられる。診断／検出薬および治療薬としては、同位元素、薬物、毒素、サイトカイン、ホルモン、増殖因子、複合体、放射性核種および金属が挙げられる。例えば、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）にはガドリニウム金属が用いられる。放射性核種の例としては、２２５Ａｃ、１８Ｆ、６８Ｇａ、６７Ｇａ、９０Ｙ、８６Ｙ、１１１Ｉｎ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、９９ｍＴｃ、９４ｍＴｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１７７Ｌｕ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、３２Ｐ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、７６Ｂｒ、および２１１Ａｔが挙げられる。診断および治療薬としては、特に６０〜４，０００ｋｅＶのエネルギー範囲の他の放射性核種が利用できる。
最近では、二重特異性を有する四価タンデムダイアボディー（ｔａｎｄａｂと呼ばれる）も報告されている（Ｃｏｃｈｌｏｖｉｕｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈｍ （２０００） ６０：４３３６−４３４１）。この二重特異性ｔａｎｄａｂは同一の二つのポリペプチドの二量体であり、それぞれが二つの異なる抗体の四つの可変ドメインを含み（ＶＨ１、ＶＬ１、ＶＨ２、ＶＬ２）、これは自己会合に際してそれぞれの二つの異なる特異性のための二つの可能性のある結合部位の形成を容易にする方向に連結されている。
７．Ｉｍｍｕ３１免疫複合体
本発明による抗ＡＦＰ抗体もしくはそのフラグメント、または抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントはいずれも一以上の治療および／または診断／検出薬と複合化させることができる。一般に、一種の治療薬または診断／検出薬を各抗体または抗体フラグメントに結合させるが、一を超える治療薬または診断薬を同じ抗体、融合タンパク質、またはそのフラグメントに結合させることもできる。このような治療薬または診断／検出薬は診断／検出薬または治療薬を担持するペプチドであってもよい。免疫複合体は抗体成分の免疫反応性を保持し、すなわち、この抗体部分は、複合化した後も、複合化する前とほぼ同等かやや低下した同族抗原結合能を有する。
多様な診断／検出および治療薬が、本発明による抗体、融合タンパク質、またはそのフラグメントと有利に複合化させることができる。ある好ましい実施態様では、診断／検出薬は核イメージング、手術中および内視鏡検査用の放射性同位元素、磁気共鳴イメージングまたは超音波検査用の増強剤、Ｘ線およびコンピューター断層撮影法用の放射線不透過剤および造影剤、ならびに内視鏡蛍光透視法をはじめとする蛍光透視法用の蛍光化合物からなる群から選択される。抗体と複合化させる、または二重特異的プレターゲッティング法で用いる蛍光および放射性薬は、引用することによりその全開示内容が本明細書の一部とされるＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇ 米国特許第５，７１６，５９５号明細書、同第６，０９６，２８９号明細書および米国出願第０９／３４８，８１８号明細書に記載されるような悪性腫瘍などの罹患組織または細胞塊と関連のある標的抗原の内視鏡的、手術中または血管内検出に特に有用であり、特にγ、β、および陽電子放射性核種が用いられる。陽電子放射断層撮影法に有用な放射性核種としては、限定されるものではないが、Ｆ−１８、Ｍｎ−５１、Ｍｎ−５２ｍ、Ｆｅ−５２、Ｃｏ−５５、Ｃｕ−６２、Ｃｕ−６４、Ｇａ−６８、Ａｓ−７２、Ｂｒ−７５、Ｂｒ−７６、Ｒｂ−８２ｍ、Ｓｒ−８３、Ｙ−８６、Ｚｒ−８９、Ｔｃ−９４ｍ、Ｉｎ−１１０、Ｉ−１２０、およびＩ−１２４が挙げられる。
本発明に挙げられた治療薬は、本明細書に記載のように、裸の抗体と別に投与するのにも有用な薬剤である。治療薬としては、例えば、ビンカアルカロイドおよびその他のアルカロイド、アントラサイクリン、エピポドフィロトキシン、タキサン、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗生物質、ＣＯＸ−２阻害剤、抗有糸分裂剤、抗脈管形成剤およびアポトーシス剤、特にドキソルビシン、メトトレキサート、タキソール、ＣＰＴ−１１、カンプトテカン、およびこれらまたは他のクラスの抗癌剤に由来する他のものなどのような化学療法薬が挙げられる。免疫複合体および抗体融合タンパク質の製造のために有用なその他の癌化学療法薬としては、ナイトロジェンマスタード、スルホン酸アルキル、ニトロソウレア、トリアゼン、葉酸類似体、ＣＯＸ−２阻害剤、ピリミジン類似体、プリン類似体、プラチナ錯体、ホルモン、毒素（例えば、ＲＮアーゼ、シュードモナス外毒素）などが挙げられる。好適な化学療法薬は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、１９ｔｈ Ｅｄ．（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ． １９９５）およびＧＯＯＤＭＡＮ ＡＮＤ ＧＩＬＭＡＮ’Ｓ ＴＨＥ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ ＢＡＳＩＳ ＯＦ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ， ７ｔｈ Ｅｄ．（ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ． １９８５）、ならびにこれらの刊行物の改訂版に記載されている。試験薬剤など、他の好適な化学療法薬も当業者に知られている。
シュードモナス外毒素のような毒素も複合化し得るし、あるいは本発明によるＩｍｍｕ３１抗体またはそのフラグメントの免疫複合体の治療薬部分を形成することができる。さらに、この毒素は、裸のＩｍｍｕ３１抗体もしくはそのフラグメント、Ｉｍｍｕ３１融合タンパク質もしくはそのフラグメント、または別の治療薬と複合化したＩｍｍｕ３１抗体もしくはそのフラグメントと組み合わせて用いてもよい。このような複合体または他の融合タンパク質の調製に適切に使用される他の毒素としては、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌内毒素−Ａ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒、シュードモナス外毒素、およびシュードモナス内毒素が挙げられる。例えば、Ｐａｓｔａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ４７：６４１（１９８６）、およびＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇ， ＣＡ−Ａ Ｃａｎｃｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ ４４：４３（１９９４）参照。本発明で用いるのに好適なさらなる毒素は当業者に公知であり、引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする米国特許第６，０７７，４９９号明細書に開示されている。これらは例えば動物、植物および微生物起原であっても、あるいは化学的または組換え的に操作されていてもよい。この毒素は植物、微生物、もしくは動物毒素、またはその合成変異体であってもよい。
サイトカインのような免疫調節剤もまた複合化させ得るし、あるいはＩｍｍｕ３１免疫複合体の治療薬部分を形成することができるし、あるいは本発明によるキメラ、ヒト化またはヒト抗ＡＦＰ抗体、融合タンパク質またはそのフラグメントと複合化させずに投与することができる。本明細書において「免疫調節剤」としては、サイトカイン、幹細胞増殖因子、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのリンホトキシン、ならびにインターロイキン（例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８）、コロニー刺激因子（例えば、顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）および顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ））、インターフェロン（例えば、インターフェロン−α、−βおよび−γ）、「Ｓ１因子」と呼ばれる幹細胞増殖因子、エリスロポエチンおよびトロンボポエチンなどの造血因子が挙げられる。好適な免疫調節剤部分の例としては、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、インターフェロン−γ、ＴＮＦ−αなどが挙げられる。あるいは、被験体に、裸のＩｍｍｕ３１抗体もしくはそのフラグメント、または裸の融合タンパク質もしくはそのフラグメントを与え、サイトカインを個別に投与することができ、このサイトカインは裸のＩｍｍｕ３１抗体もしくはフラグメント、または裸のＩｍｍｕ３１融合タンパク質もしくはそのフラグメントの投与前、同時または投与後に投与することができる。このＩｍｍｕ３１抗体またはもしくはそのフラグメント、または融合タンパク質もしくはそのフラグメントはまた、免疫調節剤と複合化させてもよい。免疫調節剤はまた、異なる抗原と結合する一以上の抗体または抗体フラグメントからなるハイブリッド抗体と複合化させてもよい。このような抗原はまた免疫調節剤であり得る。例えば、ＣＤ４０またはその他の免疫調節剤を、抗体の組み合わせを投与するとともに、または投与する前、または投与した後のいずかに、Ｉｍｍｕ３１抗体またはそのフラグメントと組み合わせて投与してもよい。
さらに、Ｉｍｍｕ３１抗体もしくはそのフラグメント、または融合タンパク質もしくはそのフラグメントは診断イメージングに有用なγ放出放射性核種または陽電子放射核種を含んでなり得る。診断／検出薬の例としては、多様な標識、放射性核種、キレート剤、色素、造影剤、蛍光化合物、色素原、およびその他のマーカー部分が挙げられる。陽電子放射断層撮影法に有用な放射性核種としては、限定されるものではないが、１８Ｆ、５１Ｍｎ、５２ｍＭｎ、５２Ｆｅ、５５Ｃｏ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、８２ｍＲｂ、８３Ｓｒ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、１１０Ｉｎ、１２０Ｉ、および１２４Ｉが挙げられる。有用な陽電子放出放射性核種の総崩壊エネルギーは、好ましくは＜２，０００ｋｅＶ、より好ましくは１，０００ｋｅＶ以下、最も好ましくは＜７００ｋｅＶである。γ線検出に用いる診断薬として有用な放射性核種としては、限定されるものではないが、Ｃｒ−５１、Ｃｏ−５７、Ｃｏ−５８、Ｆｅ−５９、Ｃｕ−６７、Ｇａ−６７、Ｓｅ−７５、Ｒｕ−９７、Ｔｃ−９９ｍ、Ｉｎ−１１１、Ｉｎ−１１４ｍ、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｙｂ−１６９、Ｈｇ−１９７、およびＴｌ−２０１が挙げられる。有用なγ線放出放射性核種の崩壊エネルギーは、好ましくは２０〜２０００ｋｅＶ、より好ましくは６０〜６００ｋｅＶ、最も好ましくは１００〜３００ｋｅＶである。
さらに、罹患組織の治療に好適な放射性核種としては、限定されるものではないが、Ｐ−３２、Ｐ−３３、Ｓｃ−４７、Ｆｅ−５９、Ｃｕ−６４、Ｃｕ−６７、Ｓｅ−７５、Ａｓ−７７、Ｓｒ−８９、Ｙ−９０、Ｍｏ−９９、Ｒｈ−１０５、Ｐｄ−１０９、Ａｇ−１１１、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｐｒ−１４２、Ｐｒ−１４３、Ｐｍ−１４９、Ｓｍ−１５３、Ｔｂ−１６１、Ｈｏ−１６６、Ｅｒ−１６９、Ｌｕ−１７７、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ｒｅ−１８９、Ｉｒ−１９４、Ａｕ−１９８、Ａｕ−１９９、Ｐｂ−２１１、Ｐｂ−２１２、およびＢｉ−２１３、Ｃｏ−５８、Ｇａ−６７、Ｂｒ−８０ｍ、Ｔｃ−９９ｍ、Ｒｈ−１０３ｍ、Ｐｔ−１０９、Ｉｎ−１１１、Ｓｂ−１１９、Ｉ−１２５、Ｈｏ−１６１、Ｏｓ−１８９ｍ、Ｉｒ−１９２、Ｄｙ−１５２、Ａｔ−２１１、Ｂｉ−２１２、Ｒａ−２２３、Ｒｎ−２１９、Ｐｏ−２１５、Ｂｉ−２１１、Ａｃ−２２５、Ｆｒ−２２１、Ａｔ−２１７、Ｂｉ−２１３およびＦｍ−２５５が挙げられる。
好適な診断イメージング同位元素は通常２０〜２，０００ｋｅＶの範囲であるが、好適な治療用放射性核種は通常２０〜１０，０００ｋｅＶの範囲である。例えば、イメージング目的で１８Ｆ、６８Ｇａ、９４ｍＴｃなどの陽電子放射性核種を開示し、引用することにより本明細書の一部とされる、発明者Ｇ．Ｌ．ＧｒｉｆｆｉｔｈｓおよびＷ．Ｊ． ＭｃＢｒｉｄｅの「ターゲッティング剤のガリウム−６８での標識」と題された米国特許出願（米国仮出願番号６０／３４２，１０４号明細書）参照。好適な放射性核種はオージェ放射核種であり、好ましくは１０００ｋｅＶ未満のエネルギーを有する。また、β放射性核種も好ましく、２０〜５０００ｋｅＶの間のエネルギーを有し、またはα放射性核種も好ましく、２０００〜１０，０００ｋｅＶの間のエネルギーを有する。
治療薬または診断／検出薬は、ジスルフィド結合形成を介して還元された抗体成分のヒンジ領域に結合することができる。あるいは、このようなペプチドはＮ−スクシニル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）のようなヘテロ二官能性架橋剤を用いて抗体成分に結合させることができる。Ｙｕ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ５６ ： ２４４（１９９４）。このような結合に関する一般的な技術は当技術分野で周知である。例えば、Ｗｏｎｇ， ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮ ＣＯＮＪＵＧＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＣＲＯＳＳ−ＬＩＮＫＩＮＧ （ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９９１）； Ｕｐｅｓｌａｃｉｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，”ｉｎ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ： ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ， Ｂｉｒｃｈ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）， ｐａｇｅｓ １８７−２３０（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． １９９５）； Ｐｒｉｃｅ， “Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”ｉｎ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ： ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ， ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＡＮＤ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ， Ｒｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）， ｐａｇｅｓ ６０−８４（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５）参照。あるいは、治療薬または診断薬は抗体のＦｃ領域の炭化水素部分を介して複合化させることもできる。この炭化水素基は、チオール基に結合している同じ薬剤の付加量を増大させるためにも使用できるし、あるいはこの炭化水素部分は異なるペプチドに結合するためにも使用できる。
ペプチドを、抗体の炭水化物部分を介して抗体成分と複合化させる方法は当業者に公知である。例えば、Ｓｈｉｈ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ４１： ８３２（１９８８）； Ｓｈｉｈ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ４６： １１０１（１９９０）；およびＳｈｉｈ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，０５７，３１３号参照（なお、これらは総て、引用することによりその全開示内容が本明細書の一部とされる）。この一般法は、酸化された炭水化物部分をを有する抗体成分を、少なくとも一つの遊離アミンを有し、かつ、複数のペプチドが負荷されている担体ポリマーと反応させることを含む。この反応の結果、最初のシッフの塩基（イミン）結合が生じ、これは第二級アミンへと還元することで安定化されて最終的な複合体を形成することができる。
しかし、Ｆｃ領域が存在しない場合、例えば、免疫複合体の抗体成分として用いられる抗体が抗体フラグメントである場合には、なお、診断／検出薬または治療薬を結合させることができる。炭水化物部分は全長抗体または抗体フラグメントの軽鎖可変領域へ導入することができる。例えば、Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５４： ５９１９（１９９５）； Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，４４３，９５３号明細書（１９９５）、Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，米国特許第６，２５４，８６８号明細書（なお、これらは総て、引用することによりその全開示内容が本明細書の一部とされる）参照。操作された炭水化物部分は治療薬または診断薬の結合に用いられる。
ターゲッティング可能な構築物
ターゲッティング可能な構築物は多様な構造のものであり得るが、免疫応答の惹起を避けるためだけでなく、ｂｓＡｂターゲッティング方法で用いる場合には迅速なｉｎ ｖｉｖｏクリアランスのためにも選択される。強力な免疫応答の惹起には疎水性薬剤が最良であり、一方、迅速なｉｎ ｖｉｖｏクリアランスのためには親水性薬剤が好ましいことから、疎水性と親水性の間のバランスを確立する必要がある。これは、一つには、多くの有機部分の固有の疎水性を相殺することを目的とした親水性のキレート剤の使用によって達成される。また、例えば、いくつかが疎水性であり、いくつかが親水性であるアミノ酸を含むペプチドなど、反対の溶液特性を有するターゲッティング可能な構築物のサブユニットを選択し得る。ペプチドの他、炭水化物を用いてもよい。
２個といった少ないアミノ酸残基しか持たないペプチド、好ましくは、キレート剤などの他の部分とも複合化させるならば、２〜１０残基を用いればよい。このリンカーは、好ましくは分子量５０，０００ダルトン未満、有利には約２０，０００ダルトン、１０，０００ダルトンまたは５，０００ダルトン未満（キレート剤中の金属イオンを含む）の低分子量複合体であるべきである。例えば、既知のペプチドＤＴＰＡ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−ＯＨ（ここで、ＤＴＰＡはジエチレントリアミン五酢酸である）は分子のインジウム−ＤＴＰＡ部分に対する抗体を作製するために使用されている。しかし、非インジウム含有分子および適当なスクリーニング工程の使用により、チロシル−リジンジペプチドに対する新しいＡｂが作製できる。より通常には、抗原性ペプチドは、ペプチドＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２（ここで、ＤＯＴＡは１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン四酢酸であり、ＨＳＧは式：
Figure 0005161254
のヒスタミンスクシニルグリシル基である）など、４以上の残基を有する。
この非金属含有ペプチドは免疫原として使用でき、生じたＡｂはＰｈｅ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ骨格に対する反応性に関してスクリーニングされる。
本発明はまた、最終的なｂｓＡｂ／リンカーを用いた場合に、リンカー部分を認識するｂｓＡｂのアームが完全に特異的であることを保証するために、非天然アミノ酸、例えばＤ−アミノ酸の、骨格構造への組み込みを意図する。本発明はさらに、非天然アミノ酸およびペプチドから構築されたものなどの他の骨格構造も意図する。
免疫原として用いるペプチドは、固相支持体と標準的な反復直交脱保護およびカップリング技術を用い、自動ペプチド合成装置で便宜に合成される。後にキレート複合体の形成に用いられるペプチド中の遊離アミノ酸は、アセチル基などの標準的な保護基で遮断するのが好ましい。このような保護基は当業者に公知である。Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｗｕｔｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， １９９９（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．）参照。これらのペプチドは、後にｂｓＡｂ系で用いるために作製する場合、ｉｎ ｖｉｖｏカルボキシペプチダーゼ活性を阻害するために、樹脂から切り離して対応するＣ末端アミドを作製する。
免疫原のハプテンは免疫原性認識部分、例えば、化学ハプテンを含む。化学ハプテン、好ましくはＨＳＧハプテンを用いると、抗体に対するリンカーの高い特異性が示される。これは、ＨＳＧハプテンに対して惹起される抗体が既知であり、適当な二重特異性抗体へと容易に組み込むことができるためである。従って、リンカーと、結合しているハプテンとの結合は抗体または抗体フラグメントに対して特異性が高い。
キレート部分
リンカー部分に親水性キレート部分が存在すれば、迅速なｉｎ ｖｉｖｏクリアランスを保証する助けとなる。親水性の他、キレート剤はそれらの金属結合特性に関して選択され、少なくとも、そのｂｓＡｂエピトープがペプチドの一部であるか、または非キレート化学ハプテンであるようなリンカーでは、金属−キレート複合体の認識はもはや問題ではないので、意のままに荷電される。
ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡまたはＮＯＴＡのようなキレート剤または好適なペプチドに、蛍光分子のような検出可能な標識または、重金属もしくは放射性核種のような細胞傷害剤を結合させることができる。例えば、治療上有用な免疫複合体は、光活性薬または色素を抗体融合タンパク質に結合させることにより得られる。蛍光色素のような蛍光組成物、および他の色素原、または可視光線に感受性のあるポルフィリンのような色素は好適な光線を病巣に当てることにより病巣の検出および治療に使用されてきた。治療においては、これは光照射、光療法または光線力学療法と呼ばれている（Ｊｏｒｉ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， ＰＨＯＴＯＤＹＮＡＭＩＣ ＴＨＥＲＡＰＹ ＯＦ ＴＵＭＯＲＳ ＡＮＤ ＯＴＨＥＲ ＤＩＳＥＡＳＥＳ（Ｌｉｂｒｅｒｉａ Ｐｒｏｇｅｔｔｏ １９８５）； ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇｈ， Ｃｈｅｍ． Ｂｒｉｔａｉｎ ２２：４３０（１９８６））。さらに、光療法を行うためにはモノクローナル抗体が光活性化色素と結合させられてきた。Ｍｅｗ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３０：１４７３（１９８３）；前掲， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４５：４３８０ （１９８５）； Ｏｓｅｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：８７４４ （１９８６）；前掲， Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ． Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ． ４６：８３ （１９８７）； Ｈａｓａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｇ． Ｃｌｉｎ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｓ． ２８８：４７１ （１９８９）； Ｔａｔｓｕｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｓｅｒｓ Ｓｕｒｇ． Ｍｅｄ．９：４２２ （１９８９）； Ｐｅｌｅｇｒｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ ６７：２５２９（１９９１）。しかし、これらの初期の研究には、特に抗体フラグメントまたはサブフラグメントの使用を伴った内視鏡療法の適用は含まれていなかった。従って本発明は、光活性薬または色素を含んでなる免疫複合体の治療的使用を意図する。
特に有用な金属−キレートの組み合わせとしては、放射イメージングおよびＲＡＩＴ用の４７Ｓｃ、５２Ｆｅ、５５Ｃｏ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１１１Ｉｎ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、１６１Ｔｂ、１７７Ｌｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、および２２５Ａｃ併用する２−ベンジル−ＤＴＰＡおよびそのモノメチルおよびシクロヘキシル類似体が挙げられる。同じキレート剤が、Ｍｎ、ＦｅおよびＧｄなどの非放射性金属と錯化されれば、本発明によるｂｓＡｂとともに用いる場合にはＭＲＩ用に使用できる。ＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザ−シクロノナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−三酢酸）、ＤＯＴＡ、およびＴＥＴＡ（ｐ−ブロモアセタミド−ベンジル−テトラエチルアミン四酢酸）などの大環キレート剤は種々の金属および放射性金属、最も詳しくはそれぞれＧａ、ＹおよびＣｕの放射性核種と併用されるものである。
そのリガンドがカルボン酸基またはアミン基などの硬質の塩基性キレート官能基を含むＤＴＰＡおよびＤＯＴＡ型のキレート剤は硬酸陽イオン、特に第ＩＩａ族および第ＩＩＩａ族金蔵陽イオンをキレートするのに最も有効である。このような金属−キレート錯体は、環のサイズを目的の金属にあわせて調整することにより極めて安定にすることができる。大環状ポリエーテルのような他のリング型キレート剤は、ＲＡＩＴのための２２３Ｒａのような、安定に結合する核種を対照とするものであ。ポルフィリンキレート剤は多くの放射性金属と併用することができ、また、ｂｓＡｂ指定免疫光療法用の特定の非放射性金属錯体としても有用である。一を超える種類のキレート剤を複数の金属イオン、例えば、非放射性イオン、診断用放射性核種および／または治療用放射性核種と結合させるために担体と複合化させ得る。特に有用な治療用放射性核種としては、限定されるものではないが、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、９０Ｙ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、２２３Ｒａおよび２２５Ａｃが挙げられる。特に有用な診断／検出用放射性核種としては、限定されるものではないが、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４−１５８Ｇｄおよび１７５Ｌｕが挙げられる。
米国特許第５，７５３，２０６号明細書に開示されているもの、特にチオセミ−カルバゾニルグリオキシルシステイン（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）およびチオセミカルバジニル−アセチルシステイン（Ｔｓｃａ−Ｃｙｓ）キレート剤などのキレート剤は、軟塩基リガンド、特に硫黄またはリン含有リガンドと強固に結合されるＴｃ、Ｒｅ、Ｂｉおよびその他の遷移金属、ランタニドおよびアクチニドの軟酸陽イオンと結合するために有利に用いられる。それは、一を超える種類のキレート剤とペプチドを結合するのに有用であり、例えば、いわゆるＩｎ（ＩＩＩ）陽イオンのためのＤＴＰＡまたは同様のキレート剤、およびＴｃ陽イオンのためのチオール含有キレート剤、例えば、Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓがある。ジ−ＤＴＰＡハプテンに対する抗体は既知であり（Ｂａｒｂｅｔ ‘３９５、前記）、標的抗体と容易に複合化してｂｓＡｂが形成されるので、放射性同位元素をターゲッティングするためのプレターゲッティングプロトコールにおいて放射性同位元素と結合させるための非放射性ジＤＴＰＡキレート剤およびその他のキレート剤とともにペプチドハプテンを使用することができる。このようなペプチドの一例としては、Ａｃ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ−）−ＮＨ２がある。このペプチドはＩｎ（ＩＩＩ）とともに予め負荷した後、９９−ｍ−Ｔｃ陽イオンで標識し、このＩｎ（ＩＩＩ）イオンはＤＴＰＡにより優先的にキレート化され、このＴｃ陽イオンはチオール含有Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓと優先的に結合する。このＤＴＰＡ基をＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡなどの他の硬酸キレート剤に置き換えることもでき、それらに特異的なＭＡｂが、抗ジ−ＤＴＰＡ ＭＡｂを作製するのに用いられるものと同様の技術を用いて生産され得る。
二つの異なる硬酸または軟酸キレート剤を、陽イオンの大きさの違い、キレート環の幾何学および陽イオンの好ましい錯イオン構造により、二つの異なる硬酸または軟酸陽イオンに優先的に結合する、例えばキレート環の大きさの異なるリンカーへ組み込むことができる。これにより二種類の異なる金属が（その一方または双方が放射性であるか、またはＭＲＩ増強のために有用である）、プレターゲッティングされたｂｓＡｂにより結果として補足されるリンカーへと組み込み可能となる。
好ましいキレート剤としては、ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡおよびＴｓｃｇならびにそれらの組み合わせが挙げられる。これらのキレート剤は次の構築物：
（ａ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；
（ｂ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；
（ｃ）Ａｃ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２；
Figure 0005161254
および
Figure 0005161254
に例示されるようなキレート剤−ペプチド複合体モチーフに組み込まれている。
上記のキレート剤−ペプチド複合体（ｄ）および（ｅ）は６８Ｇａと結合することが示されており、よって、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）の適用において有用である。
キレート剤は以下の実施例でさらに詳しく述べられる標準的な化学法を用いてリンカー部分と複合化される。要するに、ペプチドＡｃ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ−）−ＮＨ２の合成は、ペプチド合成装置にて、まず、Ａｌｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨをＲｉｎｋアミド樹脂に結合させることにより行った。本明細書で用いる保護基の略号「Ａｌｏｃ」および「Ｆｍｏｃ」はアリルオキシカルボニルおよびフルオレニルメチルオキシカルボニル基をさす。次に、このＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨおよびＴｓｃＧを、標準的なＦｍｏｃ自動合成プロトコールを用い、リジンの側鎖に付加して次のペプチド：Ａｌｏｃ−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ｒｉｎｋ樹脂を形成した。その後、このＡｌｏｃ基を除去した。このペプチド合成を合成装置で続け、次のペプチド：（Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−）−ｒｉｎｋ樹脂を製造した。Ｎ末端のアシル化の後、側鎖Ａｌｏｃ保護基を除去した。次に、得られたペプチドを活性化したＮ−トリチル−ＨＳＧ−ＯＨで、カイザー試験を用いて樹脂がアミンに関し陰性の結果を示すまで処理した。Ｋａｒａｃａｙ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． １１：８４２−８５４（２０００）参照。Ａｃ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ−）−ＮＨ２の合成、ならびにＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２、およびＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２の合成は以下にさらに詳細に記載されている。
金属キレートの製造
キレート剤−ペプチド複合体は固体として長期間保存することができる。それらは金属結合反応関して単位用量で計量することができ、固体、水溶液もしくは半水溶液、凍結溶液または凍結乾燥調製物のいずれかとして単位用量で保存することができる。それらは公知の手順によってラベルすることができる。典型的には、硬酸陽イオンは通常の塩の溶液として導入され、硬酸キレート剤およびおそらくは軟酸キレート剤により取り込まれる。しかし、その後、軟酸陽イオンを加えれば、軟酸キレート剤によりその結合に至り、そこにキレート化されている可能性のある硬酸陽イオンが解離する。例えば、過剰量の非放射性１１１ＩｎＣｌ３の存在下でさえ、９９ｍ−Ｔｃ（Ｖ）グルコヘプトネートまたはＴｃ陽イオンによる標識化がｉｎ ｓｉｔｕ生成し、塩化スタンナンおよびＮａ９９ｍ−ＴｃＯ４が軟酸キレート剤に定量的に先行する。 １８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１３Ｂｉおよび二価または三価陽イオンのＭｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｐｂ、Ｃｕ、Ｃｄ、Ａｕ、Ｆｅ、Ａｇ（一価）、ＺｎおよびＨｇなどの他の軟酸陽イオン、特に６４Ｃｕおよび６７Ｃｕなど（そのいくつかは放射免疫診断法または放射免疫療法に有用である）は、類似の方法によりリンカー ペプチドに付加することができる。Ｒｅ陽イオンもまた、過レニウム酸塩およびスズイオンからｉｎ ｓｉｔｕ生成可能であるか、または予め還元されたグルコヘプトン酸レニウムまたはその他のトランスキレート剤が使用できる。過レニウム酸塩の還元は、Ｔｃの還元に必要なものよりも多くのスズイオンを必要とする（典型的には最終濃度約２００μｇ／ｍＬ）ので、より高いレベルのスズイオンがジスルフィド環化ペプチドに存在するものなどの感受性のあるジスルフィド結合を還元しないように十分注意する必要がある。レニウムによる放射性標識の際にも、Ｔｃ−９９ｍとともに使用されるものと同様の手順が用いられる。Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ−リガンドのＲｅＯ金属錯体の調製のための好ましい方法は、このペプチドをＲｅＯＣｌ３（Ｐ（Ｐｈ３）２と反応させることによるものであるが、ＲｅＯ（エチレンジアミン）２などの他の還元種を使用することもできる。
８．治療および診断のためのヒト化、キメラおよびヒト抗体の使用
本発明では、治療および診断／検出薬の送達方法、ならびに治療および診断／検出方法におけるマウス、ヒト化、キメラおよびヒト抗ＡＦＰ抗体およびそのフラグメントの使用を意図する。好ましくは、このマウス、キメラ、ヒト化およびヒト抗ＡＦＰ抗体およびそのフラグメントは、キメラ、ヒト化またはヒトＩｍｍｕ３１抗体である。
例えば、診断／検出薬、治療薬、またはその組み合わせを標的へ送達する方法であって、（ｉ）被験体に抗体または抗体のフラグメント、融合タンパク質、またはそのフラグメントを投与すること；（ｉｉ）ある量の非結合タンパク質が被験体の血流から除去されるのに十分な時間待つこと；および（ｉｉｉ）該被験体に、該抗体の結合部位と結合する診断／検出薬、治療薬、またはその組み合わせを含んでなる担体分子を投与することを含む方法である。好ましくは、この担体分子は抗体の一を超える結合部位と結合する。
本発明はまた、被験体において悪性腫瘍を診断または検出する方法も意図する。診断／検出は、抗ＡＦＰモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントまたは融合タンパク質もしくはそのフラグメントを含んでなる診断上有効量の診断／検出用免疫複合体（ここで、該抗ＡＦＰ ＭＡｂもしくはそのフラグメントまたは融合タンパク質もしくはそのフラグメントは医薬上許容される賦形剤中に調剤された少なくとも一つの診断／検出薬と結合されている）を投与すること、および該標識を検出することにより達成できる。好ましくは、この抗ＡＦＰ抗体、融合タンパク質、またはそのフラグメントはＩｍｍｕ３１抗体である。
この関連において、被験体において悪性腫瘍を診断または検出する方法であって、（ｉ）該被験体由来の検体に対し、本発明による抗体、融合タンパク質、またはそのフラグメントのうちのいずれか一つの抗ＡＦＰ ＭＡｂもしくはそのフラグメントまたは抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントを含んでなる組成物を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ診断アッセイを行うことを含む方法も意図される。好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ診断アッセイは免疫アッセイ、ＲＴ−ＰＣＲおよび免疫組織化学からなる群から選択される。
本明細書に記載の方法では、診断薬として放射性および非放射性薬が使用できる。好適な非放射性診断薬としては、磁気共鳴イメージングに好適な造影剤、Ｘ線またはコンピューター断層撮影法用の放射線不透過性化合物、または超音波に好適な造影剤がある。磁気イメージング薬としては、本発明による抗体とともに用いる場合、２−ベンジル−ＤＴＰＡおよびそのモノメチルおよびシクロヘキシル類似体を含む金属−キレートの組み合わせと複合化した、例えば、マンガン、鉄およびガドリニウムなどの非放射性金属が挙げられる。引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする、２００１年１０月１０日に出願された米国出願番号０９／９２１，２９０参照。ある好ましい実施態様では、この造影剤は超音波増強剤である。さらに好ましくは、この超音波増強剤はリポソームである。放射線不透過性剤および造影剤はＸ線およびコンピューター断層撮影法を増強するために用いられ、ヨウ素化合物、バリウム化合物、ガリウム化合物、タリウム化合物などが挙げられる。具体的な化合物としては、バリウム、ジアトリゾエート、エチオド化オイル、クエン酸ガリウム、イオカルム酸、イオセタム酸、ヨーダミド、ヨージパミド、ヨードキサム酸、イオグラミド、イオヘキソール、イオパミドール、イオパン酸、イオプロセム酸、イオセファム酸、イオセル酸、イオスラミドメグルミン、イオセメ酸、イオタスル、イオテトル酸、イオサラム酸、イオトロキシ酸、イオキサグル酸、イオキソトリゾ酸、イポデート、メグルミン、メトリザミド、メトリゾエート、プロピリオドンおよび塩化タリウムが挙げられる。
本発明ではまた、悪性腫瘍をターゲッティングするための方法におけるマウス、キメラ、ヒト化およびヒト抗ＡＦＰ抗体およびそのフラグメントの使用を記載する。例えば、本発明で特に対象となる悪性腫瘍は肝臓の癌である。時には、卵巣癌、また、まれには胃腸癌および肺癌でもＡＦＰを産生する場合がある。好ましくは、この抗ＡＦＰ抗体ｓおよびそのフラグメントはＩｍｍｕ３１抗体およびそのフラグメントである。この方法は、被験体に、医薬上好適な賦形剤中に調剤された少なくとも二つのＭＡｂまたはそのフラグメントを含んでなる治療上有効量の抗体もしくはそのフラグメントまたは抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメント（少なくとも一つの抗ＡＦＰ ＭＡｂもしくはそのフラグメントまたは融合タンパク質もしくはそのフラグメントが本発明による抗体のいずれかである）を投与することを含む。別の実施態様では、第二のＭＡｂ、融合タンパク質またはそのフラグメントは抗ＡＦＰ抗体、融合タンパク質またはそのフラグメントではない。
この関連において、被験体において癌細胞を治療する方法であって、（ｉ）該被験体に、本発明による裸の、または複合化された抗ＡＦＰ ＭＡｂもしくはそのフラグメントまたは抗体融合タンパク質、またはその抗体、融合タンパク質またはそのフラグメントのいずれか一つのフラグメントを含んでなる、治療上有効量の組成物を投与すること、（ｉｉ）該抗ＡＦＰ ＭＡｂもしくはそのフラグメントまたは抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントを医薬上好適な賦形剤中に調剤することを含む方法が意図される。好ましくは、このような組成物は第二の抗体、融合タンパク質、またはそのフラグメントをさらに含む。この第二の抗体、融合タンパク質、またはそのフラグメントは抗ＡＦＰ抗体、融合タンパク質またはそのフラグメントであってなくてもよい。また、好ましくは、この抗ＡＦＰ抗体、融合タンパク質またはそのフラグメントはＩｍｍｕ３１抗体、融合タンパク質、またはそのフラグメントである。好ましい投与様式は非経口である。また、好ましくは、この用量は反復投与される。さらに好ましくは、この抗ＡＦＰ抗体は用量当たり２０〜２０００ミリグラムタンパク質で投与される。
治療用組成物は少なくとも一つの裸のマウス、ヒト化、キメラまたはヒト抗ＡＦＰ抗体またはそのフラグメントを単独で含むか、またはその他の抗ＡＦＰヒト化、キメラまたはヒト抗体などのその他の抗ＡＦＰ抗体または抗体そのフラグメントと組み合わせて含む。好ましくは、この治療用組成物中の抗ＡＦＰ抗体、融合タンパク質、またはそのフラグメントは用量当たり２０〜２０００ミリグラムの用量で投与される。また、好ましくは、この治療用組成物中の抗ＡＦＰ抗体またはそのフラグメントはＩｍｍｕ３１抗体またはそのフラグメントである。本発明はまた、抗ＡＦＰ抗体ではない他の抗体またはその抗体フラグメントと組み合わせた少なくとも一つの裸のヒト化、キメラまたはヒト抗ＡＦＰ抗体またはそのフラグメントでの処置を意図し、これにより、これら他の抗体は少なくとも一つの診断／検出薬または治療薬と複合化させずに（裸の）、または複合化させて投与することができる。例えば、組み合わせ療法に好適な他の抗体としては、限定されるものではないが、ＣＥＡ、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２（例えば、１７−１Ａ）、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、ＭＵＣ−３、ＭＵＣ−４、ＰＡＭ−４、ＫＣ４、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＢｒＥ３、Ｌｅ−Ｙ、Ａ３、Ｅｐ−ＣＡＭ、Ｔｎ、およびＴｈｏｍｓｏｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、テネイシン、癌遺伝子、癌遺伝子産物、ＩＬ−６、ＩＧＦ−１、ＩＧＦＲ−１、腫瘍脈管形成抗原［血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、およびその他の血管増殖因子に対するもの］、Ｇａ７３３、原発性肝癌のフェリチンおよび酸性イソフェリチン（ＡＩＦ）に対する抗体、またはそれらの組み合わせなどの癌腫関連抗体およびそのフラグメントが挙げられる。好適な抗体は癌遺伝子マーカーまたは産物、に向けられるもの、または脈管形成因子ＶＥＧＦなどの腫瘍血管マーカーに対する抗体、およびＣＤ４０に対する抗体など、特定の免疫応答モジュレーターに対する抗体が挙げられる。さらに、治療は、少なくとも一つのヒト化、キメラまたはヒト抗ＡＦＰ免疫複合体またはそのフラグメント単独、あるいは他の抗ＡＦＰヒト化、キメラまたはヒト抗体などの別の抗ＡＦＰ抗体またはその抗体フラグメントと組み合わせて行うことができる。好ましくは、この抗ＡＦＰ抗体またはそのフラグメントは、Ｉｍｍｕ３１抗体またはそのフラグメントである。さらに好ましくは、治療用組成物は少なくとも一つのヒト化、キメラまたはヒト抗ＡＦＰ免疫複合体またはそのフラグメントを、抗ＡＦＰ抗体ではない他の抗体またはその抗体フラグメント（これらは裸であるか、または治療薬と複合化されている）と組み合わせて含むことができる。このような非抗ＡＦＰ抗体。
同様に、複合化された、また、裸の抗ＡＦＰヒト化、キメラまたはヒト抗体またはそのフラグメントは単独で用いてもよいし、本明細書に記載の種々の診断／検出薬または治療薬とともに、しかし、複合化させずに投与してもよい。また、裸の、または複合化された、同じ、または異なるエピトープまたは抗原に対する抗ＡＦＰ抗体を、本発明による一以上の抗体と組み合わせてもよい。好ましくは、この抗ＡＦＰ抗体またはそのフラグメントはＩｍｍｕ３１抗体またはそのフラグメントである。
よって、本発明は、裸の抗体としてのマウス、ヒト化、キメラおよびヒトＩｍｍｕ３１抗体およびそのフラグメント単独の投与、または多様式療法としての投与を意図する。本発明による多様式療法はさらに、他の複合化または非複合化抗体、融合タンパク質、またはそのフラグメントの投与で補助される、裸の、または複合化された抗ＡＦＰ抗体による免疫療法をさらに含む。例えば、ヒト化、キメラまたはヒトＩｍｍｕ３１抗体は別の裸のヒト化、裸のキメラもしくは裸のヒトＩｍｍｕ３１抗体、またはヒト化、キメラもしくはヒトＩｍｍｕ３１抗体免疫複合体、例えば、同位元素、一以上の化学療法薬、サイトカイン、酵素、酵素阻害剤、ホルモンまたはホルモンアンタゴニスト、金属、毒素、またはそれらの組み合わせと複合化されたヒト化、キメラまたはヒトＩｍｍｕ３１抗体と組み合わせることができる。本発明では、マウス、ヒト化、キメラまたはヒトＩｍｍｕ３１抗体と毒素の融合タンパク質もまた用いてよい。多くの異なる抗体の組み合わせが、裸の抗体として、または一部が裸で、一部が治療薬または免疫調節剤と複合化されたものとして、あるいは、単に細胞傷害剤などの別の治療薬と、または放射線と組み合わせて構築され得る。
治療用組成物は少なくとも一つのマウス、ヒト化、キメラまたはヒトモノクローナル抗ＡＦＰ抗体またはそのフラグメントを単独で、または他の抗体およびそのフラグメント、例えば、他の裸の、または複合化された、マウス、ヒト化、キメラ、もしくはヒト抗体、もしくはそのフラグメント、または融合タンパク質もしくはそのフラグメントなどと組み合わせて、または治療薬と組み合わせて含む。特に、完全ヒト抗体との組み合わせ療法も意図され、上記で示したような方法で作製される。
裸の、または複合化された抗体、融合タンパク質、またはそのフラグメントはまた、同じまたは異なるエピトープまたは抗原に対する一以上の抗体、融合タンパク質、またはそのフラグメントと組み合わせてもよい。例えば、裸の、マウス、ヒト化、キメラまたはヒトＩｍｍｕ３１抗体を裸のマウス、ヒト化、裸のキメラまたは裸のヒトＩｍｍｕ３１抗体と組み合わせてもよく；マウス、ヒト化、キメラまたはヒト裸のＩｍｍｕ３１抗体をＩｍｍｕ３１免疫複合体と組み合わせてもよく；裸のマウス、ヒト化、キメラ、ヒトＩｍｍｕ３１抗体を異なる抗体放射性複合体または異なる裸の抗体と組み合わせてもよく；マウス、ヒト化、キメラまたは完全ヒトＩｍｍｕ３１抗体を、同位元素、または一以上の化学療法薬、サイトカイン、毒素、酵素、酵素 阻害剤、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、またはそれらの組み合わせと複合化させたマウス、ヒト化、キメラまたはヒトＩｍｍｕ３１抗体と組み合わせてもよい。マウス、ヒト化、キメラまたはヒトＩｍｍｕ３１抗体と毒素または免疫調節剤との融合タンパク質もまた本発明で使用できる。少なくとも二つの異なる抗原をターゲッティングする多くの異なる抗体の組み合わせを裸の抗体として、または一部が裸で、一部が治療薬または免疫調節剤と複合化されたものとして、あるいは、単に細胞傷害剤などの別の治療薬と、または放射線と組み合わせて構築され得る。
本発明による多様式療法はさらに、複合化または非複合化抗体、融合タンパク質またはそのフラグメントの形態で、癌関連抗体の投与を補った裸のＩｍｍｕ３１抗体またはそのフラクグメントによる免疫療法も含む。ある好ましい実施態様では、多様式療法用の抗体またはそのフラグメントとしては、限定されるものではないが、ＣＥＡ、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２（例えば、１７−１Ａ）、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、ＭＵＣ−３、ＭＵＣ−４、ＰＡＭ−４、ＫＣ４、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＢｒＥ３、Ｌｅ−Ｙ、Ａ３、Ｅｐ−ＣＡＭ、Ｔｎ、およびＴｈｏｍｓｏｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、テネイシン、癌遺伝子、癌遺伝子産物、ＩＬ−６、ＩＧＦ−１、ＩＧＦＲ−１、腫瘍脈管形成抗原［血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、およびその他の血管増殖因子など］、Ｇａ７３３、原発性肝癌のフェリチンおよび酸性イソフェリチン（ＡＩＦ）に対する抗体、またはその組み合わせが挙げられる。これらの抗体としては、これらの抗原決定基上の少なくとも一つのエピトープを認識するポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒトまたはヒト化抗体およびそのフラグメントが挙げられる。
別の形態の多様式療法では、被験体に裸の抗ＡＦＰ抗体またはそのフラグメント、および／または抗ＡＦＰ免疫複合体またはそのフラグメントを、標準的な癌の化学療法と組み合わせて施す。好ましくは、この抗ＡＦＰ抗体またはそのフラグメントはＩｍｍｕ３１抗体またはそのフラグメントである。葉酸と組み合わせた５−フルオロウラシル単独、またはイリノテカン（ＣＰＴ−１１）との組み合わせは、結腸直腸癌を治療する治療計画である。当業者には、オキサリプラチン単独、またはこれらの他の薬物との組み合わせなど、他の好適な組み合わせの化学療法計画もよく知られている。卵巣癌では、タキサンとプラチナ薬、チオ−ＴＥＰＡと他のアルキル化剤（例えば、クロラムブシル）、ならびにゲムシタビンと他のより最近のクラスの細胞傷害剤のいずれかなど、さらに他の化学療法薬も好ましい。ある好ましい多様式療法では、化学療法薬とサイトカインの双方を本発明による複合化または非複合化抗ＡＦＰ抗体、融合タンパク質、またはそのフラグメントと同時投与する。好ましくは、この抗ＡＦＰ抗体またはそのフラグメントはＩｍｍｕ３１抗体またはそのフラグメントである。サイトカイン、化学療法薬および抗体、融合タンパク質、またはそのフラグメントはいずれの順序で投与してもよいし、あるいは一緒に投与してもよい。
本発明はまた、米国特許第６，０９６，２８９号明細書に記載されているような 手術中、血管内、および内視鏡的腫瘍および病変検出、生検および療法において、ｂｓＡｂと、上述のリンカー部分と結合した少なくとも一つの治療薬または診断／検出薬の使用も意図する。好ましくは、この二重特異性抗体は、ＡＦＰ抗原、より好ましくは、Ｉｍｍｕ３１エピトープと結合する少なくとも一つのアームを有する。
本発明による抗ＡＦＰ抗体、融合タンパク質、およびそのフラグメントは治療またはイメージング目的だけでなく、ｉｎ ｖｉｖｏ研究を行う補助としても使用できる。例えば、本発明によるｂｓＡｂは、ターゲッティング可能な構築物が一以上のｂｓＡｂと安定な複合体を形成するかどうかを確認するためにｉｎ ｖｉｔｒｏで使用できる。このようなアッセイは、ｂｓＡｂと安定な複合体を形成するターゲッティング可能な構築物を同定する上で当業者の助けとなる。これにより、次に、当業者は治療薬および／またはイメージング薬として優れている可能性のあるターゲッティング可能な構築物を同定することが可能となる。好ましくは、この抗ＡＦＰ抗体、融合タンパク質、またはそのフラグメントはＩｍｍｕ３１抗体、融合タンパク質、またはそのフラグメントである。
このアッセイは、有利には、対象とするターゲッティング可能な構築物と少なくとも２モル当量のｂｓＡｂを合わせることにより行われる。インキュベーション後、この混合物をサイズ排除ＨＰＬＣにより分析し、構築物がｂｓＡｂと結合していたかどうかを決定する。あるいは、このアッセイは、種々のｂｓＡｂの溶液が標準的な９６ウェルプレートに付着されている、標準的なコンビナトリアル法を用いて行われる。各ウェルにターゲッティング可能な構築物の溶液を加える。インキュベーションおよび分析後、ｂｓＡｂがどの構築物に最もよく結合するかが容易に決定できる。
ターゲッティング可能な構築物に対するｂｓＡｂの添加順序は重要ではないと考えるべきであり、すなわち、ｂｓＡｂを構築物に加えてもよいし、その逆でもよい。同様に、ｂｓＡｂも構築物も溶液である必要はなく、すなわち、それらは溶液として加えてもニートで加えてもよく、いずれでも最も便宜である。最後に、結合に関する分析方法は、結合が確立されている限り、重要ではない。従って、結合に関する分析は、限定されるものではないが、サイズ排除クロマトグラフィーと組み合わせた、またはそれに代わってのＦＡＢＭＳ、ハイフィールドＮＭＲまたは他の適当な方法をはじめとする標準的な分析法を用いて行える。
二重特異性抗体による治療および診断
本発明は、罹患細胞マーカーに特異的に結合する少なくとも一つの結合領域と、ターゲッティング可能な複合体に特異的に結合する少なくとも一つの他の結合領域を有する二重特異性抗体または抗体フラグメントを提供する。ターゲッティング可能な複合体は、二重特異性抗体または抗体フラグメントの少なくとも一つの結合領域により認識される少なくとも一つのエピトープを含む、または担持する担体部分を含んでなる。
例えば、被験体において罹患組織を治療または同定する方法であって、（Ａ）該被験体に、標的組織と特異的に結合する少なくとも一つのアームと、ターゲッティング可能な複合体と特異的に結合する少なくとも一つの他のアームを有し、該標的組織と特異的に結合する一つのアームがＩｍｍｕ３１抗体である、二重特異性抗体または抗体フラグメントを投与すること；（Ｂ）所望により、該被験体にクリアリング組成物を投与して、該組成物により、非局在抗体または抗体フラグメントを循環から除去すること；（Ｃ）該被験体に、該二重特異性抗体または抗体フラグメントの少なくとも一つの他のアームにより認識可能な少なくとも一つのエピトープを含む、またはこれを担持する担体部分と、一以上の複合化された治療薬または診断薬を含んでなる第一のターゲッティング可能な複合体を投与すること；および（Ｄ）該治療薬が酵素である場合には、被験体にさらに以下のもの：１）プロドラッグ（該酵素が標的部位でプロドラッグを薬物へ変換し得る場合）；または２）該被験体で解毒されて低毒性の中間体を形成し得る薬物（該酵素が標的部位で、該解毒中間体を毒性型へ変換し、それにより該薬物の毒性を高め得る場合）；または３）該被験体内で天然のプロセスによって活性化され、低毒性の中間体へ変換されることにより解毒を受けるプロドラッグ（該酵素が標的部位で、該解毒中間体を毒性型へ変換し、それにより該薬物の毒性を高め得る場合）；または４）該二重特異性抗体または抗体フラグメントの少なくとも一つの他のアームにより認識可能な少なくとも一つのエピトープを含む、または担持する担体部分と、プロドラッグ（該酵素が標的部位でプロドラッグを薬物へ変換し得る場合）を含んでなる第二のターゲッティング可能な複合体を投与することを含む方法が記載される。所望により、該第一のターゲッティング可能な複合体はプロドラッグを含んでなる場合、該二重特異性抗体または抗体または抗体フラグメントの少なくとも一つの他のアームによって認識され得る少なくとも一つのエピトープを含む、または担持する担体部分と、該プロドラッグを薬物へと変換し得るか、または該薬物の解毒中間体を毒性型へ変換し得る酵素を含んでなる第二のターゲッティング可能な複合体を投与する。好ましくは、このターゲッティング可能な複合体は少なくとも二つのＨＳＧハプテンを含んでなる。
この関連において、哺乳動物においてＡＦＰを発現する腫瘍を検出または治療する方法が記載される。この方法は（Ａ）標的組織と特異的に結合する少なくとも一つのアームと、ターゲッティング可能な複合体と特異的に結合する少なくとも一つの他のアームを含んでなる、有効量の二重特異性抗体または抗体フラグメントを投与すること（標的組織と特異的に結合する該一つのアームはＩｍｍｕ３１抗体またはそのフラグメントである）；および（Ｂ）以下のもの：（ｉ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；（ｉｉ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；（ｉｉｉ）Ａｃ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２；
Figure 0005161254
および
Figure 0005161254
からなる群から選択されるターゲッティング可能な複合体を投与することを含む。
所望により、この方法は、被験体にクリアリング組成物を投与して、該組成物により、非局在抗体または抗体フラグメントを循環から除去することをさらに含む。
本発明による二重特異性抗体およびそのフラグメントはプレターゲッティング法において有用であり、被験体に二つの治療薬または二つの診断／検出薬を送達する好ましい方法を提供する。米国出願番号０９／３８２，１８６明細書は、二重特異性抗体を用いてプレターゲッティングする方法を開示し、ここで、二重特異性抗体は１２５Ｉで標識され、被験体に送達された後、二価ペプチドを９９ｍＴｃで標識する。この送達の結果、１３１Ｉおよび９９ｍＴｃに対する優れた腫瘍／正常組織比が得られることから、二つの診断用放射性同位元素の有用性が示される。本発明によるＩｍｍｕ３１抗体、Ｉｍｍｕ３１融合タンパク質、およびそのフラグメントを標識するには、既知の治療薬または診断薬のいずれを用いてもよい。Ｉｍｍｕ３１免疫複合体の結合特異性、治療薬または診断薬の効力、ならびに抗体のＦｃ部分のエフェクター活性は複合体の標準的な試験により決定することができる。
ｂｓＡｂおよび上述のリンカー部分と結合した治療薬の投与は、リンカー部分と結合している治療薬の投与のしばらく前にｂｓＡｂを投与することにより行える。これらの試薬の用量およびタイミングは当業者ならば容易に考案でき、用いる試薬の特定の性質によって異なる。ｂｓＡｂ−Ｆ（ａｂ’）２誘導体をまず与える場合には、リンカー部分を投与する２４〜７２時間の待ち時間が適当であろう。ＩｇＧ−Ｆａｂ’ ｂｓＡｂ複合体が一次ターゲッティングベクターである場合には、リンカー部分の投与までのより長い待ち時間は３〜１０日の間で示される。
ｂｓＡｂは罹患組織をターゲッティングするに十分な時間が経過した後、診断／検出薬が投与される。診断／検出薬の投与に続き、イメージングを行うことができる。腫瘍は体腔内で、適当な波長のエネルギーが送達され、集束した種々の構造を直接的または間接的に可視化する手段により検出することができる。身体のいずれの部位の病変も、非イオン化放射線またはエネルギーが送達され、これらの構造から再捕捉され得る限り、可視化することができる。例えば、高分解、非侵襲性のイメージング技術であるＰＥＴをヒト疾病の可視化のための本発明による抗体とともに使用できる。ＰＥＴでは、陽電子消滅崩壊の際に生じた５１１ｋｅＶのγ光子が検出される。
このリンカー部分はまた、標的部位でプロドラッグを活性化し得る、または身体の解毒経路を制御することにより通常の治療薬の効力を向上させ得る酵素と複合化させてもよい。ｂｓＡｂを投与した後、リンカー部分と複合化した酵素、ｂｓＡｂの第二のアームにより認識される低分子量ハプテンを投与する。この酵素が標的部位へプレターゲッティングされた後、その標的部位で働くことが知られている細胞傷害剤を注射する。この薬物は哺乳動物の通常の解毒プロセスにより解毒され得るものである。例えば、この薬物は肝臓において潜在的に毒性の低いグルクロニドに変換され得る。次に、解毒された中間体を標的部位においてプレターゲッティングされた酵素により、その毒性の高い形態へ変換され得る。あるいは、投与したプロドラッグを、プレターゲッティングされた酵素により活性薬物へと変換することもできる。プレターゲッティングされた酵素は解毒された酵素を再利用することにより治療効力を向上させる。このアプローチはいずれの酵素−薬物対との併用に対しても適合させることができる。
標的部位でプロドラッグを活性化させ得る、または身体の解毒経路を制御することにより通常の治療薬の効力を向上させ得る酵素は、あるいはハプテンと複合化させてもよい。この酵素−ハプテン複合体は、プレターゲッティングｂｓＡｂを投与した後に被験体に投与され、標的部位に向けられる。この酵素が標的部位に局在した後、標的部位で作用することが知られている細胞傷害剤、またはプレターゲッティングされた酵素によりｉｎ ｓｉｔｕで薬物へと変換されるそのプロドラッグ形態を注射する。上述のように、この薬物は哺乳動物の通常の解毒プロセスを用いて解毒された低毒性の中間体、最も多くはグルクロニドを形成するものである。解毒された中間体、例えばグルクロニドは標的部位においてプレターゲッティングされた酵素によりその毒性の高い形態へ再変換され、従って高い細胞傷害性を有する。この結果、薬物が再利用される。同様に、投与されたプロドラッグは通常の生体プロセスによって活性薬物へと変換させることもできる。このプレターゲッティングされた酵素は解毒薬物を再利用することにより治療の効力を向上させる。このアプローチはいずれの酵素−薬物対との併用に対しても適合させることができる。
本発明はさらに、ホウ素中性子捕捉療法（Ｂｏｒｏｎ Ｎｅｕｔｒｏｎ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， ＢＮＣＴ）プロトコールに関する本発明によるｂｓＡｂおよび診断薬の使用を意図する。ＢＮＣＴは、腫瘍に局在する１０Ｂ原子の中性子照射によって電離放射線を腫瘍細胞へ送達するよう設計された二元システムである。ＢＮＣＴは、安定した同位元素である同位体的に豊富な１０Ｂ（自然界には１９．８％存在度で存在）が熱中性子とともに照射されてα粒子および７Ｌｉ原子核を生じる際に起こる核反応に基づく。これらの粒子の飛程は約１細胞径であり、結果として線形の高エネルギー転移を生じる。この核反応で生じる飛程の短い１．７ＭｅＶのα粒子がほんのわずかあれば、細胞核を標的とし、それを破壊するのに十分である。ＢＮＣＴで癌治療を成功させるには高濃度の１０Ｂを腫瘍部位に局在さつつ、非標的器官は基本的にホウ素を含まないままにしておく方法が必要である。ＢＮＣＴのためのプレターゲッティングｂｓＡｂを用いて被験体内で腫瘍を治療する組成物および方法は、引用することによりその全開示内が本明細書の一部とされる同時係属の特許出願第０９／２０５，２４３号明細書に記載され、本発明の目的のために容易に修正できる。
ｂｓＡｂとリンカー部分の投与の間に投与するクリアリング剤を用いてもよい。本発明者らは新規な機構作用のクリアリング剤、つまりｂｓＡｂの疾病ターゲッティングアームに向けられたグリコシル化抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）Ｆａｂ’フラグメントを本発明とともに用い得ることを見出した。例えば、抗−ＣＳＡｐ（Ｍｕ−９Ａｂ）×抗−ペプチドｂｓＡｂを得、疾病標的に最大限まで付着させる。残留しているｂｓＡｂを除去するため、Ｍｕ−９に対する抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）Ａｂを、好ましくはグリコシル化Ｆａｂ’フラグメントとして得る。クリアリング剤は一価の様式でｂｓＡｂと結合するが、それに付属するグリコシル残基は複合体全体を急速な代謝が起こる肝臓へ向ける。その後、リンカー部分と結合している治療薬を被験体に与える。ｂｓＡｂのＭｕ−９アームに対する抗Ｉｄ Ａｂは高親和性で、クリアランス機構は開示されている他の機構とは異なる（Ｇｏｏｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．同上参照）が、それは抗Ｉｄ−Ｆａｂ’が一価の部分であるので架橋を伴わないためである。
また、本明細書では、被験体において罹患組織を治療または同定するのに有用なキットであって、（Ａ）標的組織と特異的に結合する少なくとも一つのアームと、ターゲッティング可能な複合体と特異的に結合する少なくとも一つの他のアームを有する二重特異性抗体または抗体フラグメント、（なお、標的組織と特異的に結合する該一つのアームはＩｍｍｕ３１抗体またはそのフラグメントである）；（Ｂ）該二重特異性抗体または抗体フラグメントの少なくとも一つの他のアームにより認識可能な少なくとも一つのエピトープを含む、またはこれを担持する担体部分と、一以上の複合化された治療薬または診断薬を含んでなる第一のターゲッティング可能な複合体；および（Ｃ）所望により、非局在抗体および抗体フラグメントを除去するのに有用なクリアリング組成物；および（Ｄ）所望により、該第一のターゲッティング可能な複合体と複合化された該治療薬が酵素である場合、１）プロドラッグ（該酵素が標的部位でプロドラッグを薬物へ変換し得る場合）；または２）該被験体で解毒されて低毒性の中間体を形成し得る薬物（該酵素が標的部位で、該解毒中間体を毒性型へ変換し、それにより該薬物の毒性を高め得る場合）；または３）該被験体内で天然のプロセスによって活性化され、低毒性の中間体へ変換されることにより解毒を受けるプロドラッグ（該酵素が標的部位で、該解毒中間体を毒性型へ変換し、それにより該薬物の毒性を高め得る場合）；または４）該二重特異性抗体または抗体フラグメントの少なくとも一つの他のアームにより認識可能な少なくとも一つのエピトープを含む、またはこれを担持する担体部分と、プロドラッグ（該酵素が標的部位でプロドラッグを薬物へ変換し得る場合）を含んでなる第二のターゲッティング可能な複合体、を含んでなるキットを意図する。好ましくは、このターゲッティング可能な複合体は（ｉ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；（ｉｉ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；（ｉｉｉ）Ａｃ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２；
Figure 0005161254
および
Figure 0005161254
からなる群から選択される。
また、ターゲッティング可能な複合体をスクリーニングする方法であって、（Ａ）該ターゲッティング可能な構築物を、標的組織と特異的に結合する少なくとも一つのアームと、該ターゲッティング可能な複合体と特異的に結合する少なくとも一つの他のアームとを有する二重特異性抗体または抗体フラグメントと接触させて混合物とすること（標的組織と特異的に結合する前記一つのアームはＩｍｍｕ３１抗体またはそのフラグメントである）；および（Ｂ）所望により、該混合物をインキュベートすること；および（Ｃ）該混合物を分析することを含む方法も記載される。
本発明はさらに、哺乳動物においてＡＦＰを発現する悪性組織または細胞をイメージングする方法；被験体においてＡＦＰを発現する罹患組織を手術中に同定／診断する方；被験体においてＡＦＰを発現する罹患組織を内視鏡同定する方法；および被験体においてＡＦＰを発現する罹患組織を血管内同定する方法を提供する。このような方法は、（Ａ）ＡＦＰを発現する標的組織と特異的に結合する少なくとも一つのアームと、ターゲッティング可能な複合体と特異的に結合する少なくとも一つの他のアームとを含んでなる、有効量の二重特異性抗体または抗体フラグメントを投与すること（標的組織と特異的に結合する前記一つのアームはＩｍｍｕ３１抗体またはそのフラグメントである）；および（Ｂ）以下のもの：（ｉ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；（ｉｉ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；（ｉｉｉ）Ａｃ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２；
Figure 0005161254
および
Figure 0005161254
からなる群から選択されるターゲッティング可能な複合体を投与することを含む。
また、本明細書では、内視鏡処置、腹腔鏡処置、血管内カテーテル処置、または外科的処置の際に病変部を検出する方法であって、（Ａ）ＡＦＰ抗原と特異的に結合する第一の抗体結合部位を有し、かつ、ハプテンと特異的に結合する第二の抗体結合部位を有する二重特異性抗体Ｆ（ａｂ）２またはＦ（ａｂ’）２フラグメントを、このような処置を受ける被験体に注射し、該抗体フラグメントを標的部位に付着させること；（Ｂ）所望により、この二重特異性フラグメントが注射から約２４時間以内に循環からあまり除去されない場合には、ガラクトシル化抗イディオタイプクリアリング剤を用いて非標的化抗体フラグメントを除去し、そして、標的部位に迅速に局在し、かつ腎臓から除去される二価の標識ハプテンを注射すること；（Ｃ）最初の注射から４８時間以内に、検出手段を用いて、標的部位における付着標識の上昇レベルの近距離検出によりハプテンの存在を検出し、そして前記処置を行うこと（該検出は造影剤またはサブトラクション剤を使用せずに行われる）を含む方法を意図する。好ましくは、このハプテンは診断／検出用放射性同位元素、ＭＲＩ画像増強剤または 蛍光標識で標識される。
この関連において、手術的処置、血管内処置、腹腔鏡処置または内視鏡処置中の近距離病変部検出のための方法であって、（Ａ）このような処置を受ける被験体に有効量のＩｍｍｕ３１免疫複合体またはそのフラグメントを非経口注射すること；（Ｂ）注射から４８時間以内に前記処置を行うこと；（Ｃ）該標識抗体またはそのフラグメントの存在を検出するための検出手段を用いて、接近を受けた被験体内部を近距離でスキャンすること；および（Ｄ）その検出手段で、このような部位における該標識抗体またはそのフラグメントの上昇レベルを検出することにより、該標識抗体またはそのフラグメントの付着部位を位置づけることを含む方法も記載される。
９．医薬上好適な賦形剤
被検体に送達されるマウス、ヒト化、キメラおよびヒトＩｍｍｕ３１ ＭＡｂは、ＭＡｂ単独、免疫複合体、融合タンパク質から構成されるか、または一以上の医薬上好適な賦形剤、一以上の付加的成分またはこれらのある組み合わせを含み得る。
本発明による複合化もしくは非複合化抗ＡＦＰ抗体およびそのフラグメント、または融合タンパク質およびそのフラグメントは医薬上有用な組成物を調製するための公知の方法に従って調剤することができる。好ましくは、この抗ＡＦＰ抗体またはそのフラグメントはＩｍｍｕ３１抗体またはそのフラグメントである。滅菌リン酸緩衝生理食塩水は医薬上好適な賦形剤の一例である。他の好適な賦形剤は当業者に周知である。例えば、Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．， ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ， ５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｌｅａ ＆ Ｆｅｂｉｇｅｒ １９９０）、およびＧｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．）， ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ， １８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ １９９０）およびそれらの改訂版を参照。
本発明による複合化もしくは非複合化抗ＡＦＰ抗体、融合タンパク質、またはそのフラグメントは、例えばボーラス注射または点滴による静脈内投与のために調剤できる。好ましくは、この抗ＡＦＰ抗体またはそのフラグメントはＩｍｍｕ３１抗体またはそのフラグメントである。注射製剤は、例えばアンプルのような単位投与形、または保存剤を加えた複数用量容器で提供することができる。この組成物は油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルションの形態をとってもよく、沈殿防止剤、安定剤および／または分散剤のような処方剤を含むことができる。あるいは、その活性成分は使用前に例えば滅菌パイロジェンフリー水のような好適なビヒクルで構成するための粉末形態であってもよい。
付加的な製薬法を用いて治療または診断／検出用免疫複合体または裸の抗体、融合タンパク質、またはそのフラグメントの作用の持続時間を制御してもよい。徐放性製剤は免疫複合体または裸の抗体と複合体を形成する、または吸着するポリマーの使用により調製できる。例えば、生分解性ポリマーとしては、ポリ（エチレン−ｃｏ−酢酸ビニル）のマトリックスおよびステアリン酸二量体とセバシン酸の重合無水コポリマーのマトリックスが挙げられる。Ｓｈｅｒｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０： １４４６（１９９２）．このようなマトリックスからの免疫複合体または抗体の放出速度は免疫複合体または抗体の分子量、マトリックス内の免疫複合体、抗体の量、および分散粒子の大きさによって異なる。Ｓａｌｔｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ． ５５： １６３（１９８９）； Ｓｈｅｒｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．， 前掲。他の固体投与形は、Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．， ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ， ５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｌｅａ ＆ Ｆｅｂｉｇｅｒ １９９０）、およびＧｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．）、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ， １８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ １９９０）、およびそれらの改訂版に記載されている。
また、複合化もしくは非複合化抗ＡＦＰ抗体、融合タンパク質、またはそのフラグメントは哺乳動物に皮下投与または他の非経口経路でも投与できる。さらに、投与は点滴でも単回または複数回のボーラス注射によってもよい。一般に、ヒトにおいては投与される免疫複合体、または裸の抗体、融合タンパク質またはそのフラグメントの用量は、患者の年齢、体重、身長、性別、全身の健康状態、および過去の病歴といった因子によって異なる。通常、単回の静脈点滴として約１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量の免疫複合体、裸の抗体融合タンパク質、裸の抗体またはそのフラグメントをレシピエントに与えるのが望ましいが、状況によってはより低い、またはより高い用量を投与してもよい。この用量は必要に応じで繰り返してもよく、例えば、１週間に１回の投与を４〜１０週間、好ましくは１週間に１回の投与を８週間、そしてより好ましくは、１週間に１回の投与を４週間繰り返してもよい。また、１週間おきの投与を数ヶ月といったように低い頻度で投与してもよい。用量および日程を適宜調節して、種々の非経口経路により投与してよい。
治療目的では、治療上有効な量の複合化または非複合化抗体、融合タンパク質、またはそのフラグメントを哺乳動物に投与する。好ましくは、この抗ＡＦＰ抗体またはそのフラグメントはＩｍｍｕ３１抗体またはそのフラグメントである。ヒト以外の動物被検体も意図されるが、本発明の好適な被検体は通常ヒトである。抗体製剤は、投与される量が生理学上有意であれば、「治療上有効量」で投与されると言われる。薬剤は、その存在が受容哺乳動物の生理に検出可能な変化をもたらす場合に、生理学上有意である。特に、本発明による抗体製剤は、その存在が抗腫瘍応答を誘発する、または自己免疫疾患病態の徴候および症状を軽減する場合に生理学上有意である。生理学上有意な作用はまた、受容哺乳動物における体液性および／または細胞性免疫応答の誘発であってもよい。
１０．発現ベクター
マウス、ヒト化、キメラまたはヒトＩｍｍｕ３１ ＭＡｂをコードするＤＮＡ配列は、核酸の複製をもたらす種々の既知の宿主ベクター中へ組換え操作することができる。これらのベクターは公知の方法を用い、核酸が送達される細胞内で核酸の転写、翻訳またはその双方を命令するために必要なエレメントを含むよう設計することができる。既知の方法論を用い、適当な転写／翻訳制御シグナルと作動可能なように連結されたタンパク質コード配列を有する発現構築物を作製することができる。これらの方法としてはｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術および合成技術を含む。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９， ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）； Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９７， ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照。また、本発明では、ベクターと会合していないポリヌクレオチドの送達も提供する。
本発明における使用に好適なベクターはウイルス系であっても非ウイルス系であってもよい。ウイルスベクターの特定の例としては、アデノウイルス、ＡＡＶ、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、およびレトロウイルスベクターが挙げられる。非ウイルス系ベクターの例としては、プラスミドがある。好ましい実施態様では、ベクターはプラスミドである。
本明細書に記載の発現ベクターは、宿主細胞で発現される遺伝子を含むポリヌクレオチドである。典型的には、遺伝子発現は構成的または誘導型プロモーター、組織特異的調節エレメント、およびエンハンサーをはじめとする、ある特定の調節エレメントの制御下に置かれる。このような遺伝子はそれら調節エレメントに「作動可能なような連結される」と言われる。
好ましくは、本発明による発現ベクターは、重鎖および軽鎖可変および定常領域の双方を含むヒト化、キメラまたはヒト抗Ｉｍｍｕ３１ ＭＡｂをコードするＤＮＡ配列を含んでなる。しかし、一方が重鎖可変および定常領域を含み、他方が軽鎖可変および定常領域を含むといったように二つの発現ベクターを用いてもよい。この発現ベクターはさらにプロモーター、分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列、ヒトＩｇＧ１軽鎖または重鎖定常領域をコードするゲノム配列、Ｉｇエンハンサーエレメント、および選択マーカーをコードする少なくとも一つのＤＮＡ配列を含むことがいっそう好ましい。
以下、単に例として示される実施例により本発明をさらに説明する。本発明はこれらの実施例に限定されるものではなく、本明細書に示される教示から明白なあらゆる変形を含む。
実施例１．Ｉｍｍｕ３１重鎖および軽鎖可変領域の分子クローニングおよび配列解明
Ｏｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．（ＰＮＡＳ ８６： ３８３３−３８３７ （１９８９）およびＬｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １３： ４６９−４７６（１９９４）に記述されているように、ＲＴ−ＰＣＲによりＩｍｍｕ３１のＶＨおよびＶκ遺伝子を得た。
Ｉｍｍｕ３１ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを調製し、記載されているように、ＲＴ−ＰＣＲを実施してＶ遺伝子を単離した（Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １３： ４６９−４７６（１９９４））。要するに、１５０ｎｇのランダムヘキサマープライマーとアニーリングした２０μｇのＲＮＡ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．４、１５ｍＭ ＫＣｌ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ｄＮＴＰミックス、１０ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、および６００単位のスーパースクリプト逆転写酵素を含有する反応量６０μｌでスーパースクリプトプレアンプリフィケーションシステム（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を用いて、全ＲＮＡから第一鎖ｃＤＮＡを逆転写した。まず、伸張工程を室温にて１０分間進行させ、続いて、４２℃にて５０分間インキュベーションを行った。この反応は反応混合物を９０℃で５分間加熱することにより終わらせた。次いで、鋳型として第一鎖ｃＤＮＡを用いたＰＣＲ反応を行ってマウスＩｇ ＶＨおよびＶ□遺伝子を増幅させた。Ｉｍｍｕ３１のＶ□配列をプライマー対ＶＫ１ＢＡＣＫ（Ｏｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ ８６：３８３３−３８３７（１９８９）ＣＫ３’−ＢＨ（Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９３））を用いることにより増幅させた。得られたＰＣＲ産物は〜３５０ｂｐであった。一方、ＶＨ配列をＶＨ１ＢＡＣＫ（Ｏｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ ８６： ３８３３−３８３７（１９８９））およびＣＨ１−Ｃ（５’−ＡＧＣＴＧＧＧＡＡＧＧＴＧＴＧＣＡＣ−３’）を用いて増幅させ、それをネズミγ鎖のＣＨ１領域とアニーリングした場合には、〜５００ｂｐのＰＣＲ産物をもたらした。ＶｋおよびＶＨ ＰＣＲフラグメントの両方をｐＣＲ２．１ ＡＴ−クローニングベクターにクローニングし、それらのＤＮＡ配列をＤＮＡ塩基配列決定法により決定した（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ ７４： ５４６３−５４６７（１９７４））。
配列決定では、ＰＣＲ反応によって生じた可能性のあるエラーを排除するために複数のクローン（各８クローン）を選択した。クローンの大部分は、各々、Ｉｍｍｕ３１ＶＨおよびＩｍｍｕ３１Ｖκ（図１）と呼ばれる、同一のネズミＩｇ ＶＨ（６）またはＶκ（７）配列を含んでいた。それらの遺伝子によりコードされるこれらのアミノ酸配列を推定し、図１でも示している。これらの配列内には欠損突然変異は確認されず、ドメイン内ジスルフィド結合に関して重要なシステインなどの残基が好適な位置に配置されていた。他のマウスＶκ配列との比較では、Ｉｍｍｕ３１Ｖκがκ軽鎖サブクラスＶの一メンバーであり、一方、Ｉｍｍｕ３１ＶＨがマウスＩｇ重鎖サブクラスＩＩＡ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， １９９１）に属していることが分かった。
実施例２．キメラＩｍｍｕ３１の発現ベクターの構築
クローニングされたＶ遺伝子セグメントの「忠実性」を評価するため、推定ネズミＶ□およびＶＨをヒトＩｇＧおよびκ定常領域を含むキメラＩｍｍｕ３１（ｃＩｍｍｕ３１）に構築し、Ｓｐ２／０細胞で発現させた。発現ベクターを作製するためのＩｍｍｕ３１Ｖκ（図１Ａ）のサブクローニングを容易にするため、ＤＮＡ配列を、プライマーＶＫ１ＢＡＣＫおよびＶＫ１ＦＯＲ（Ｏｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ ８６： ３８３３−３８３７（１９８９））を用いたＰＣＲ増幅により、３’末端にＢｇｌＩＩ制限部位、ＡＧＡＴＣＴを含むように改変した。得られたＰＣＲ産物をＰｖｕＩＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、ｐＢＲ３２７に基づく足場ベクター（ＰｖｕＩＩおよびＢｃｌＩで消化したもの）、Ｉｇプロモーター、分泌シグナルペプチド配列およびＶκ ＰＣＲ産物のインフレーム連結を容易にする便宜な制限部位を含んだＶＫｐＢＲに強制クローニングした（Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９４））。同様に、ｈＩｍｍｕ３１ＶＨ（図１Ｂ）の３３６〜３４２位のヌクレオチド配列を、プライマーＶＨ１ＢＡＣＫおよびＶＨ１ＦＯＲ（Ｏｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．， １９８９）を用いたＰＣＲにより、ＢｓｔＥＩＩ部位、ＧＧＴＣＡＣＣに変換した。このＶＨ ＰＣＲ産物を、次いで、ＰｓｔＩおよびＢｓｔＥＩＩで消化し、ＰｓｔＩおよびＢｓｔＥＩＩで消化したＶＨｐＢＳ、Ｉｇプロモーター、シグナルペプチド配列およびＶＨ配列のインフレーム連結に便宜な制限部位を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに基づく足場ベクターに連結した。ｃＩｍｍｕ３１の最終的なＶ配列をｃＩｍｍｕ３１ＶＨおよびＶκと表し、ＤＮＡ塩基配列決定法により確認し、各々、図２Ａおよび２Ｂに示した。
ｃＩｍｍｕ３１のＶＨおよびＶκ配列、ならびにプロモーターおよびシグナルペプチド配列を含むフラグメントを、各足場ベクター、ｃＩｍｍｕ３１ＶＨｐＢＳおよびｃＩｍｍｕ３１ＶＫｐＢＲから、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩでの二重制限消化により切断した。次いで、約８５０ｂｐ ＶＨフラグメントを、哺乳動物発現ベクター、ｃＩｍｍｕ３１ＶＨがヒトγ１定常領域遺伝子のゲノム配列と連結されているｐＧ１ｇのＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ部位にサブクローニングした（Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９４））。同様に、約６５０ｂｐ Ｖκフラグメントを、ヒトκ定常領域のゲノム遺伝子配列、Ｉｇエンハンサー、κエンハンサー、および形質転換体の選択マーカーとしてハイグロマイシン耐性遺伝子を有するｐＫｈのＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ部位に挿入した（Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９４））。これらの最終的な発現ベクターを、各々、ｃＩｍｍｕ３１ｐＧ１ｇおよびｃＩｍｍｕ３１ｐＫｈと表した。
実施例３．キメラＩｍｍｕ３１およびヒト化Ｉｍｍｕ３１のトランスフェクションおよび発現
Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １３： ４６９−４７６（１９９４））に記載されているような同じ手順を、トランスフェクションによりｃＩｍｍｕ３１またはｈＩｍｍｕ３１をＳｐ２／０細胞で発現させるために使用した。一例として、ｃＩｍｍｕ３１の発現をここで説明する。要するに、線状化したｃＩｍｍｕ３１ｐＫｈおよびｃＩｍｍｕ３１ｐＧ１ｇをエレクトロポレーションによりＳｐ２／０細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を９６ウェルプレートで２日間増殖させた後、ハイグロマイシンを５００単位／ｍｌの最終濃度にて添加することにより選抜した。エレクトロポレーションの１０〜１４日後にコロニーが出現し始めた。コロニーの生存選抜の上清をＥＬＩＳＡによりマウス−ヒトキメラＩｇＧの存在についてスクリーニングした。要するに、生存しているクローンの上清サンプルを、三組、ヤギ抗ヒト（ＧＡＨ）ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント特異的な抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ， Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ， ＰＡ）で予めコーティングしたＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートに添加した。これらのプレートを室温にて１時間インキュベートした。結合していないタンパク質は洗浄バッファー（０．０５％ポリソルベート−２０を含有するＰＢＳ）で３回洗浄することにより除去した。次いで、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合化ＧＡＨ ＩｇＧ、Ｆｃフラグメント特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）をウェルに添加した。１時間のインキュベーションの後、それらのプレートを洗浄バッファーで６回洗浄した。これらのウェルに、４ｍＭのｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）および０．０４％Ｈ２Ｏ２を含有する基質溶液を添加した。反応を暗所で３０分間進行させ、この反応を、各ウェルにＨ２ＳＯ４溶液を添加することにより停止させた後、４９０ｎｍでの吸光度を自動ＥＬＩＳＡリーダーで測定した。陽性細胞クローンを増殖させ、細胞培養物上清からｃＩｍｍｕ３１を、Ａタンパク質カラムでのアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。キメラＩｍｍｕ３１およびネズミＩｍｍｕ３１の免疫反応性を比較するために、競合Ａｇ結合アッセイを実施した（実施例４）。図３に示すように、ｃＩｍｍｕ３１およびネズミＩｍｍｕ３１はビオチニル化ネズミＩｍｍｕ３１のＡＦＰ抗原との結合に関して同等に競合した。これらのデータはｃＩｍｍｕ３１の免疫反応性がネズミＩｍｍｕ３１のものと同程度であることを示しており、この結果により、得られたＶ□およびＶＨ配列（図１）の忠実性が確認される。
実施例５に記載のように、同様の手順を、別の発現ベクター、ｐｄＨＬ２を用いて使用した。約３０μｇのｈＩｍｍｕ３１ｐｄＨＬ２を、ＳａｌＩでの消化により線状化し、エレクトロポレーションによりＳｐ２／０細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を９６ウェルプレートにプレーティングし、２日間回復させた。形質転換体を選抜するために、２日後、ＭＴＸを０．０２５□Ｍの最終濃度にて培地に添加した。２週間で出現したＭＴＸ耐性クローンおよびコロニー生存選抜の上清を、ヒトＩｇＧ分泌について、上記のようにＥＬＩＳＡによりモニタリングした。陽性細胞クローンを増殖させ、細胞培養物上清からｈＩｍｍｕ３１を、Ａタンパク質カラムでのアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
実施例４．Ａｇ結合活性アッセイ
ＡＦＰでコーティングしたＥＬＩＳＡマイクロプレートウェル（Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）でのＥＬＩＳＡにより、ｃＩｍｍｕ３１およびｈＩｍｍｕ３１のＡｇ結合活性を測定した。要するに、一定量のビオチニル化ネズミＩｍｍｕ３１を異なる濃度（０．０１〜１００□ｇ／ｍｌ）の試験Ａｂｓ（Ｉｍｍｕ３１、ｃＩｍｍｕ３１またはｈＩｍｍｕ３１）と混合し、それをＡＦＰコーティングしたマイクロウェルに添加し、室温にて１時間インキュベートした。洗浄後、ＨＲＰ複合化ストレプトアビジンを添加し、室温にて１時間インキュベートした。ＡＦＰ結合ビオチニル化Ｉｍｍｕ３１と結合したＨＲＰ複合化ストレプトアビジンの量は、４ｍＭ ＯＰＤおよび０．０４％Ｈ２Ｏ２を含有する基質溶液を添加した後のＥＬＩＳＡリーダーにおける４９０ｎｍでのＯＤ測定値により示された。
実施例５．ヒト枠組み構造の選択およびｈＩｍｍｕ３１の配列設計
ネズミＩｍｍｕ３１Ｖ領域ＦＲ配列を、Ｋａｂａｔデータベース（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ： Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， １９９１）にあるヒトＡｂｓのものと比較することにより、ヒトＲＥＩおよびＥＵ ＶＨのＦＲが、Ｉｍｍｕ３１Ｖ□およびＩｍｍｕ３１ＶＨ各々のものに対して最高水準の配列相同性を示すことが分かった（図４）。１つの例外がＮＥＷＭ ＶＨのものと最も高い配列相同性を示したＩｍｍｕ３１ＶＨのＦＲ４である（図４Ａ）。よって、ＲＥ１ Ｖ□のＦＲ配列（図４Ｂ）、ＥＵ ＶＨのＦＲ１〜３およびＮＥＷＭ ＶＨのＦＲ４（図４Ａ）を、Ｉｍｍｕ３１の各ＣＤＲを移植するための足場として選択した。推定ＣＤＲにフランキングするネズミＦＲの数個のアミノ酸残基が他のＦＲ残基よりもＡｇ結合に大きな影響を与えるという考慮すべき事柄に基づいて、これらの残基をｈＩｍｍｕ３１内に保持した。これらの残基はＶＨの５Ｑ、２７Ｙ、２８Ａ、３０Ｔ、４６Ｙ、４８Ｉ、６６Ｋ、６７Ａおよび９４Ｒ、ならびにＶ□の４Ｌ、３９Ｋ、４８Ｍ、４９Ｈ、５８Ｉ、６９Ｒ、１００Ｇおよび１０７Ｋである。さらに、これまでのＬＬ２のヒト化（Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３２： １４１３−１４２７（１９９５））の結果に基づき、ヒト化ＦＲ配列の設計（図４Ｂ）において、ＣＤＲ接触の可能性があり、得られたＡｂの免疫反応性に影響を及ぼし得る２つの荷電残基、Ｉｍｍｕ３１Ｖ□のＦＲ２の３９ＫおよびＦＲ３の６９Ｒを残した。Ａｂの結合活性に対する荷電ネズミ残基３９Ｋおよび６９Ｒの影響を評価するため、２つの別種類のヒト化Ｖ□、ｈＩｍｍｕ３１ＶＫＴ３９およびｈＩｍｍｕ３１ＶＫＴ６９を、対応するヒト残基、トレオニンの代わりに、各々、残基３９Ｋまたは６９Ｒを用いることにより設計した（図４Ｃ）。
図３Ａは、ヒトＥＵのＶＨ配列をネズミＩｍｍｕ３１ＶＨおよびヒト化Ｉｍｍｕ３１ＶＨと比較したものであり、３ＢはヒトＲＥＩをネズミＩｍｍｕ３１Ｖ□およびヒト化Ｉｍｍｕ３１Ｖ□と比較したものである。ドットは、ヒトＶＨおよびＶ□配列中の対応する残基と同一であるＩｍｍｕ３１およびｈＩｍｍｕ３１配列中の残基を示している。図３Ｃでは、ｈＩｍｍｕ３１Ｖ□と２種の変異体、ｈＩｍｍｕ３１Ｖ□Ｔ６９およびｈＩｍｍｕ３１Ｖ□Ｔ３９との違いを示している。ｈＩｍｍｕ３１ＶＨおよびＶ□のＤＮＡおよびアミノ酸配列を、各々、図５Ａおよび５Ｂ示す。
実施例６．ｈＩｍｍｕ３１の発現および特徴づけ
設計されたｈＩｍｍｕ３１のＶ□およびＶＨ遺伝子を構築するため、Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９４）に記述されているような戦略を、長いオリゴヌクレオチド合成とＰＣＲの組み合わせを利用して使用した。各可変鎖を２部分、５’−ハーフおよび３’−ハーフに構築し、各々、「Ａ」および「Ｂ」と表した。各ハーフは、Ｔａｑポリメラーゼを用いた２つの短いフランキングプライマーでの一本鎖合成オリゴヌクレオチド鋳型のＰＣＲ増幅により作製した。増幅されたフラグメントを、まず、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）のｐＣＲ２．１ ＴＡクローニングベクターにクローニングし、それらをＤＮＡ塩基配列決定の対象とした。鋳型およびプライマー対を以下のとおり記載する：
Figure 0005161254
ｈＩｍｍｕ３１ＶＨドメインの構築のため、２つの長いオリゴヌクレオチド、ｈＩｍｍｕ３１ＶＨＡ（１３５量体）およびｈＩｍｍｕ３１ＶＨＢ（１５１量体）を自動ＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）で合成した。以下に記載するように、長いオリゴｈＩｍｍｕ３１ＶＨＡの配列はｎｔ２８〜１６２に相補的なｈＩｍｍｕ３１ＶＨドメインのマイナス鎖に相当し、ｈＩｍｍｕ３１ＶＨＢの配列はｎｔ１８１〜３３１の相補物であった。
ｈＩｍｍｕ３１ＶＨＡ（１３５ｂｐ）
５’−ＧＴＡＡＧＧＡＴＧＡ ＡＴＡＴＡＴＣＣＡＡ ＴＣＣＡＡＴＡＣＡＧ ＡＣＣＣＴＧＴＣＣＡ ＧＧＴＧＣＣＴＧＣＣ ＴＧＡＣＣＣＡＧＴＧ ＴＡＴＡＡＣＡＴＡＧ ＣＴＡＧＴＡＡＡＡＧ ＣＧＴＡＧＣＣＡＧＡ ＡＧＣＣＴＴＧＣＡＧ ＧＡＧＡＣＣＴＴＣＡ ＣＴＧＡＴＧＡＣＣＣ ＡＧＧＴＴＴＣＴＴＧ ＡＣＴＴＣ−３’
ｈＩｍｍｕ３１ＶＨＢ（１５１ｂｐ）
５’−ＣＴＴＧＧＣＣＣＣＡ ＧＴＡＡＧＣＡＡＡＡ ＧＧＧＴＣＴＣＣＣＣ ＣＣＣＣＡＧＡＴＣＴ ＴＧＣＡＣＡＡＡＡＡ ＴＡＡＡＡＴＧＣＣＧ ＴＧＴＣＣＴＣＡＧＡ ＣＣＴＣＡＧＧＣＴＧ ＣＴＣＡＧＣＴＣＣＡ ＴＧＴＡＧＧＣＴＧＴ ＡＴＴＧＧＴＧＧＡＴ ＴＣＧＴＣＡＧＣＴＧ ＴＴＡＴＴＧＴＧＧＣ ＣＴＴＧＣＣＴＴＴＧ ＡＡＣＴＴＣＴＣＡＴ Ｔ−３’
ｈＩｍｍｕ３１ＶＨＡをプライマー対ＶＨＢＡＣＫおよびＶＨａを用いたＰＣＲにより増幅させ、一方、ｈＩｍｍｕ３１ＶＨＢをＶＨｂおよびＶＨＦＯＲを用いて増幅させた。これらのプライマーの配列を以下に記載する：
ＶＨＢＡＣＫ：５’−ＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣ ＡＡＴＣＡＧＧＧＧＣ ＴＧＡＡＧＴＣＡＡＧ ＡＡＡＣＣＴＧ−３’；
ＶＨａ ：５’−ＧＴＡＣＴＴＧＧＴＡ ＣＣＡＣＣＡＴＴＧＴ ＡＡＧＧＡＴＧＡＡＴ ＡＴＡＴＣＣ−３’；
ＶＨｂ ：５’−ＡＡＴＧＧＴＧＧＴＡ ＣＣＡＡＧＴＡＣＡＡ ＴＧＡＧＡＡＧＴＴＣ ＡＡＡＧＧＣ−３’；
ＶＨＦＯＲ ：５−’ＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧ ＡＣＣＡＧＧＧＡＧＣ ＣＴＴＧＧＣＣＣＣＡ ＧＴＡＡＧＣ−３’。
ここで、下線を付けた配列は、各々、制限部位、ＰｓｔＩ、ＫｐｎＩ、ＫｐｎＩおよびＢｓｔＥＩＩである。得られた二本鎖ＰＣＲ産物、ＶＨＡおよびＶＨＢを、各々、ＰｓｔＩ／ＫｐｎＩおよびＫｐｎＩ／ＢｓｔＥＩＩで消化し、ゲル精製し、これらは重鎖足場ベクター、ＶＨｐＢＳのＰｓｔＩ／ＢｓｔＥＩＩ部位に構成され、全長ｈＩｍｍｕ３１ＶＨ遺伝子（図５Ａ）を形成した。ヒト化ＶＨ配列をｐＧ１ｇベクターにサブクローニングし、得られたヒトＩｇＧ１重鎖発現ベクターをｈＩｍｍｕ３１ｐＧ１ｇと表した。
ｈＩｍｍｕ３１Ｖ□ドメイン：
同様に、ｈＩｍｍｕ３１Ｖ□ドメインの構築のため、長いオリゴヌクレオチドｈＩｍｍｕ３１ＶＫＡおよびｈＩｍｍｕ３１ＶＫＢを鋳型として使用してＶ□遺伝子を構築した。ｈＩｍｍｕ３１ＶＫＡはｎｔ２３〜１３５に相補的なｈＩｍｍｕ３１Ｖ□ドメインのマイナス鎖に相当し、ｈＩｍｍｕ３１ＶＫＢの配列は設計されたｈＩｍｍｕ３１Ｖ□（図５Ｂ）のｎｔ１５５〜３０６に相補的であった。
ｈＩｍｍｕ３１ＶＫＡ（１１３ｂｐ）
５’−ＴＴＴＡＧＧＴＧＣＴ ＴＴＣＣＣＴＧＧＴＴ ＴＣＴＧＣＴＧＧＴＡ ＣＣＡＡＣＣＴＡＴＡ ＴＡＣＴＴＧＴＴＡＡ ＴＧＴＣＴＴＧＧＣＴ ＴＧＣＣＴＴＡＣＡＡ ＧＴＧＡＴＡＧＴＧＡ ＣＣＣＴＡＴＣＴＣＣ ＡＡＣＡＧＡＴＧＣＧ ＣＴＣＡＧＡＧＡＴＧ ＡＴＧ−３’
ｈＩｍｍｕ３１ＶＫＢ（１５２ｂｐ）
５’−ＣＴＴＧＧＴＣＣＣＴ ＣＣＡＣＣＧＡＡＣＧ ＴＣＣＡＣＡＧＡＴＣ ＡＴＣＡＴＡＣＴＧＴ ＡＧＡＣＡＡＴＡＡＴ ＡＴＧＴＴＧＣＡＡＴ ＧＴＣＴＴＣＴＧＧＴ ＴＧＡＡＧＡＧＡＧＣ ＴＧＡＴＧＧＴＧＡＡ ＡＧＴＡＴＡＡＴＣＴ ＧＴＣＣＣＡＧＡＴＣ ＣＧＣＴＧＣＣＡＧＡ ＧＡＡＴＣＧＣＧＡＡ ＧＧＧＡＴＡＣＣＴＧ ＧＣＡＧＴＡＡＴＧＣ ＡＧ−３’
ｈＩｍｍｕ３１ＶＫＡをＶＫＢＡＣＫおよびＶＫａのプライマー対を用いてＰＣＲ増幅させ、一方、ｈＩｍｍｕ３１ＶＫＢをＶＫｂおよびＶＫＦＯＲを用いて増幅させた。これらのプライマーの配列を以下に記載する：
ＶＫＢＡＣＫ：５’−ＧＡＣ ＡＴＴ ＣＡＧ ＣＴＧ ＡＣＣ ＣＡＧ ＴＣＴ ＣＣＡ ＴＣＡ ＴＣＴ ＣＴＧ ＡＧＣ ＧＣ−３’；
ＶＫａ ：５’−Ａ ＴＧＴ ＧＴＡ ＡＴＧ ＣＡＴ ＣＡＧ ＣＡＧ ＴＴＴ ＡＧＧ ＴＧＣ ＴＴＴ ＣＣ−３’；
ＶＫｂ ：５’−ＣＴＧ ＣＴＧ ＡＴＧ ＣＡＴ ＴＡＣ ＡＣＡ ＴＣＴ ＧＣＡ ＴＴＡ ＣＴＧ ＣＣＡ ＧＧ−３’；
ＶＫＦＯＲ ：５’−ＧＡ ＣＣＧ ＧＣＡ ＧＡＴ ＣＴＧ ＣＡＧ ＣＴＴ ＧＧＴ ＣＣＣ ＴＣＣ ＡＣ−３’。
ＶＫＢＡＣＫ、ＶＫａ、ＶＫｂ、およびＶＫＦＯＲにおいて下線を付けた配列は、各々、ＰｖｕＩＩ、ＮｓｉＩ、ＮｓｉＩおよびＢｇｌＩＩ制限部位である。得られた二本鎖ＰＣＲ産物、ＶＫＡおよびＶＫＢを、各々、ＰｖｕＩＩ／ＮｓｉＩおよびＮｓｉＩ／ＢｇｌＩＩで消化し、ゲル精製し、これらは軽鎖足場ベクター、ＶＫｐＢＲのＰｖｕＩＩ／ＢｃｌＩ部位へと構築された。最後に、ヒト化Ｖ□配列を軽鎖発現ベクター、ｐＫｈにサブクローニングし、ｈＩｍｍｕ３１ｐＫｈを形成した。
ｈＩｍｍｕ３１Ｖ□Ｔ３９およびｈＩｍｍｕ３１Ｖ□Ｔ６９を同様に構築し、これら２種の変異体の最終的な発現ベクターは、各々、ｈＩｍｍｕ３１Ｔ３９ｐＫｈおよびｈＩｍｍｕ３１Ｔ６９ｐＫｈであった。
ｈＩｍｍｕ３１の最終的な発現ベクター
ヒト化の初期段階では、ＶκおよびＶＨ構築物の種々の組み合わせの試験に柔軟性を提供することから、上記の２発現ベクター系、すなわち、ｐＧ１ｇおよびｐＫｈを用いることが好ましい。各重鎖または軽鎖に存在している不具合のある設計がもしあれば、系統的に確認し、各ヒト化鎖をそれらのキメラパートナーと混合し、適合させることにより修正することができる。しかし、ｐＧ１ｇ／ｐＫｈ系から生じたトランスフェクト細胞は、一般に、抗体を最終的な培養物の１ｍｇ／リットル未満のレベルで産生する。高度に抗体産生する細胞系を生むためには、ｈＩｍｍｕ３１の作製には単一種の発現ベクター、ｐｄＨＬ２が好ましい。ｐｄＨＬ２は、ＩｇＨエンハンサーおよびＭＴ１プロモーターの制御下にてヒトＩｇＧ重鎖および軽鎖両方の発現カセットを、ならびに形質転換体の選択およびトランスジーンの同時増幅を目的としたマーカーとして、弱いＳＶ４０プロモーターにより制御されるマウスｄｈｆｒ遺伝子（Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５： １９１（１９８９）； Ｌｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ ８０： ２６６０（１９９７））を含む。ｐｄＨＬ２のＶκおよびＶＨセグメントを置き換えることにより、異なるキメラＡｂｓまたはヒト化Ａｂｓを発現させることができる。
ｈＩｍｍｕ３１のｐｄＨＬ２発現ベクターを構築するため、ｈＩｍｍｕ３１ＶＨおよびＶ□遺伝子セグメントを、各々、別の足場ベクター、ＶＨｐＢＳ２およびＶＫｐＢＲ２にサブクローニングした。ＶＨｐＢＳ２は、ＸｈｏＩ制限部位が翻訳開始コドンの上流の１６塩基に導入されたＶＨｐＢＳの改変足場ベクターである（Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１３： ４６９（１９９４））。同様に、ＶＫｐＢＲ２は、ＸｂａＩ制限部位が翻訳開始コドンの上流の１４塩基に導入されたＶＫｐＢＲの改変足場ベクターである（Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ， １３： ４６９（１９９４））。ｈＩｍｍｕ３１ＶｋおよびＶＨのＸｂａＩ−ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩフラグメント各々をｐｄＨＬ２に連続的にサブクローニングすることにより、最終的な発現ベクターｈＩｍｍｕ３１ｐｄＨＬ２を構築した。最終的な発現ベクターをｈＩｍｕ３１ｐｄＨＬ２と表した。
ｈＩｍｍｕ３１の発現および結合活性アッセイ
トランスフェクション、陽性トランスフェクトクローンのスクリーニングおよびｈＩｍｍｕ３１の結合活性アッセイに関する方法は、ｃＩｍｍｕ３１での記述と同じであった（実施例３を参照）。
３種類のヒト化Ａｂ、ｈＩｍｍｕ３１、ｈＩｍｍｕ３１Ｔ３９およびｈＩｍｍｕ３１Ｔ６９を、重鎖発現ベクター、ｈＩｍｍｕ３１ｐＧ１ｇのκ鎖発現ベクター：ｈＩｍｍｕ３１ｐＫｈ、ｈＩｍｍｕ３１Ｔ３９ｐＫｈまたはｈＩｍｍｕ３１Ｔ６９ｐＫｈのいずれかとの同時トランスフェクションにより、Ｓｐ２／０細胞で発現させた。これらのヒト化ＡｂｓのＡｇ結合活性を同じ競合的結合アッセイにより評価した。ｈＩｍｍｕ３１およびｈＩｍｍｕ３１Ｔ６９のＡＦＰ結合親和性は、ビオチン−Ｉｍｍｕ３１とのそれらの競合比較（図６Ａ）から判断して、ネズミＩｍｍｕ３１またはｃＩｍｍｕ３１の親和性と似ているが、ｈＩｍｍｕ３１Ｔ３９は少し低かった（図６Ｂ）。これらの結果はＩｍｍｕ３１のヒト化の成功を示しており、Ｉｍｍｕ３１の免疫反応性の維持にはネズミκ鎖ＦＲ残基Ｒ６９ではなくＫ３９が重要であることが示された。
ｐＫｈおよびｐＧ１ｇ発現ベクター系を用いてトランスフェクトされたＳｐ２／０細胞によるＡｂｓの一般的な生産性は、１桁範囲のｍｇ／ｌ値であるが、実際、臨床応用を目的とした大量のＡｂｓ生産ではこの値は不十分である。ｈＩｍｍｕ３１の場合、ｈＩｍｍｕ３１ｐＫｈおよびｈＩｍｍｕ３１ｐＧ１ｇで同時トランスフェクトされた選抜クローンの最も高い生産性は２〜３ｍｇ／Ｌであった。トランスフェクト細胞のｈＩｍｍｕ３１産生能力を増強するために、重鎖およびκ鎖発現カセットを、ネズミｄｈｆｒ遺伝子を含み、トランスフェクトされた遺伝子産物のＭＴＸ濃度の段階的上昇によるその後の増幅を可能にさせる単一種の発現ベクター、ｐｄＨＬ２に再構築した。２５ｎＭ ＭＴＸで最初に選抜され、各々、４ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌおよび８ｍｇ／ＬのｈＩｍｍｕ３１を産生すると推定された３種のｈＩｍｍｕ３１ｐｄＨＬ２トランスフェクトクローン、３１４．２Ｃ１１、３２２．１Ｇ４および３２３．２Ｈ２、を、Ｌｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ ８０ ：２６６０（１９９７））に記載されている手順を用いて増幅の対象とした。細胞培養培地のＭＴＸ濃度を０．１〜３□Ｍに徐々に上昇させるにつれて、これらの細胞のｈＩｍｍｕ３１生産性が同時に上がり、最終的にはローラーボトルによる最終培養物の１００ｍｇ／Ｌを超えた（データは示されていない）。ｈＩｍｍｕ３１ｐｄＨＬ２でトランスフェクトされた細胞から精製されたｈＩｍｍｕ３１は、そのネズミおよびキメラ対応物の免疫反応性に匹敵する免疫反応性を示した（図６Ｃ）。
実施例７．放射性標識ヒト化抗ＡＦＰモノクローナル抗体を用いた肝細胞腫癌患者の治療法
黄疸、倦怠感、体重減少、および全身の脱力感を示している５７歳齢の男性を、コンピューター断層撮影法により肝臓の右葉では直径約６ｃｍに及び、左葉でも単一の３ｃｍの病巣として現れることが表示されている、手術不可能な肝細胞癌腫について診断する。提示時のその男性の血清ＡＦＰレベルは１５０ｎｇ／ｍＬ、その男性の血清トランスアミナーゼおよびビリルビンレベルは４０％増、ならびにその男性の血清ＬＤＨレベルは５０％増である。右葉病巣は、生検でＡＦＰを発現している肝細胞癌腫であることが確認されている。一回分２５ｍＣｉ（１００ｍｇ 抗体タンパク質）の各治療で注入液を投与するため、患者には、その後、９０−Ｙを含有するＤＯＴＡ複合化ヒト化Ｉｍｍｕ３１モノクローナル抗体を２サイクル施与する。外来診療の場で第１回目の治療を行い、６週後に繰り返す。各治療の前に、１週後に施与する９０−Ｙを含有する治療量を、誘導される平均的な組織／器官毒性が許容とされるもの（例えば、腎臓に対して２０００ｃＧｙ）を超えないように調整し得るよう、腫瘍ターゲッティングを明示し、腫瘍ならびに肝臓、腎臓および骨髄などの他の正常な組織に送達される放射線量を推定するために抗体に対する診断量のＤＯＴＡ複合化１１１−Ｉｎも注入する。その後、その患者を、治療後４〜８週間おきの繰り返しコンピューター断層撮影により、ならびに血清ＡＦＰ、ビリルビン、トランスアミナーゼ、およびＬＤＨレベルにより応答についてモニタリングした。９０−Ｙ標識抗体の第２回目の治療投与の８週間後、その男性のビリルビン、トランスアミナーゼ、およびＬＤＨの血清レベルは正常値を約２０％上回った値まで減少し、その男性の血清ＡＦＰ力価は６０ｎｇ／ｍＬで測定され、これも改善の一因である。その男性の肝臓疾患のＣＴ測定では、左葉病巣がほぼ完全に消失し、右葉の大きな塊が４０％縮小していることを示している。その患者は、左葉に残存する小さな病巣が癌ではなく、瘢痕組織であると考えられることから、その男性は右葉の外科的切除を必要とする。このことは、１１１−Ｉｎ標識Ｉｍｍｕ３１抗体を用いて行われる診断検査によりさらに確認される。この検査では、左葉ではなく右葉の塊において取り込みが認められ、その結果、左葉ではＡＦＰを発現している疾患が存在しないことが示される。
本明細書に引用した全ての出版物ならびに特許出願および特許は、引用することによりその全開示内容が本明細書の一部とされる。
上記の内容は特に好ましい実施態様を言及するものであるが、本発明はそのように限定されないと考えられる。当業者ならば、開示した実施態様に種々の変形を行ってもよく、かつ、そのような変形が添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内にあるものとすることが分かるであろう。
ＲＴ−ＰＣＲによる、クローニングされたマウスＩｍｍｕ３１ＶＨおよびＶκ遺伝子配列および推定アミノ酸配列を示す。５’末端の下線はクローニングに用いられたＰＣＲプライマー配列である。可変領域の配列が示されているので、３’末端のＰＣＲプライマー配列は示されていない。図１ＡはＩｍｍｕ３１ＶＨのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。図１ＢはＩｍｍｕ３１ＶκのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。対応するＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列はヌクレオチド配列の下に一文字コードで示されている。ヌクレオチド配列のナンバリングは右側にある。ＣＤＲ領域のアミノ酸残基は太字と下線で示されている。アミノ酸残基の上にナンバリングすることで示しているように、アミノ酸残基にはＫａｂａｔのＩｇ分子ナンバリング法を用いている。数字の後に文字でナンバリングされている残基は、Ｋａｂａｔのナンバリング法で定義された挿入残基を示す。文字付きでナンバリングされている挿入残基のみ、手前の残基と同じ数値を有する。例えば、図１Ａの残基８２、８２Ａ、８２Ｂおよび８２Ｃは、それぞれ８２、Ａ、ＢおよびＣとして示される。 ＲＴ−ＰＣＲによる、クローニングされたマウスＩｍｍｕ３１ＶＨおよびＶκ遺伝子配列および推定アミノ酸配列を示す。５’末端の下線はクローニングに用いられたＰＣＲプライマー配列である。可変領域の配列が示されているので、３’末端のＰＣＲプライマー配列は示されていない。図１ＡはＩｍｍｕ３１ＶＨのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。図１ＢはＩｍｍｕ３１ＶκのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。対応するＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列はヌクレオチド配列の下に一文字コードで示されている。ヌクレオチド配列のナンバリングは右側にある。ＣＤＲ領域のアミノ酸残基は太字と下線で示されている。アミノ酸残基の上にナンバリングすることで示しているように、アミノ酸残基にはＫａｂａｔのＩｇ分子ナンバリング法を用いている。数字の後に文字でナンバリングされている残基は、Ｋａｂａｔのナンバリング法で定義された挿入残基を示す。文字付きでナンバリングされている挿入残基のみ、手前の残基と同じ数値を有する。例えば、図１Ａの残基８２、８２Ａ、８２Ｂおよび８２Ｃは、それぞれ８２、Ａ、ＢおよびＣとして示される。 Ｓｐ２／０細胞で発現されたキメラＩｍｍｕ３１（ｃＩｍｍｕ３１）重鎖および軽鎖可変領域のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。図２ＡはｃＩｍｍｕ３１ＶＨのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。図２ＢはｃＩｍｍｕ３１ＶκのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。対応するＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列は一文字コードで示されている。ＣＤＲ領域のアミノ酸残基は太字と下線で示されている。ヌクレオチド配列のナンバリングは右側にある。ヌクレオチド配列のナンバリングは図１の場合と同様である。ｃＩｍｍｕ３１の構築に用いた制限部位は線囲みで示してある。 Ｓｐ２／０細胞で発現されたキメラＩｍｍｕ３１（ｃＩｍｍｕ３１）重鎖および軽鎖可変領域のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。図２ＡはｃＩｍｍｕ３１ＶＨのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。図２ＢはｃＩｍｍｕ３１ＶκのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。対応するＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列は一文字コードで示されている。ＣＤＲ領域のアミノ酸残基は太字と下線で示されている。ヌクレオチド配列のナンバリングは右側にある。ヌクレオチド配列のナンバリングは図１の場合と同様である。ｃＩｍｍｕ３１の構築に用いた制限部位は線囲みで示してある。 ｃＩｍｍｕ３１の結合親和性をマウスＩｍｍｕ３１の結合親和性と比べるための競合的細胞表面結合アッセイの結果を示す。種々の濃度のｃＩｍｍｕ３１（三角のライン）またはｍＩｍｍｕ３１（菱形のライン）を一定量のビオチニル化マウスＩｍｍｕ３１と混合し、ＡＦＰでプレコートした９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェル内で１時間インキュベートした。洗浄した後、ＨＲＰ複合化ストレプトアビジンを加え、室温で１時間インキュベートした。ＡＦＰ結合ビオチニル化Ｉｍｍｕ３１と結合したＨＲＰ複合化ストレプトアビジンの量は、４ｍＭのオルト−フェニレンジアミン二塩酸塩および０．０４％のＨ２Ｏ２を含有する基質溶液を添加した後にＯＤ４９０を読みとることで明らかにした。これらの結果は、ｃＩｍｍｕ３１とマウスＩｍｍｕ３１が、放射性標識Ｉｍｍｕ３１のＡＦＰへの結合に関して同等によく競合したことを示し、このことからクローニングされたＶ遺伝子が忠実であることが確認される。 ヒト抗体、マウスＩｍｍｕ３１およびｈＩｍｍｕ３１の軽鎖および重鎖可変領域のアミノ酸配列のアライメントを示す。図４ＡはＥＵ、ＮＥＷＭ、Ｉｍｍｕ３１、およびｈＩｍｍｕ３１のＶＨ配列のアライメントを示し、図４ＢはＲＥＩ、Ｉｍｍｕ３１およびｈＩｍｍｕ３１のＶκ配列アライメントを示す。点は対応するヒト抗体の残基と同一であるＩｍｍｕ３１およびｈＩｍｍｕ３１の残基を示す。ダッシュはアライメントを補助するために配列に挿入されたギャップを示す。線囲みの領域はＣＤＲ領域を示す。ｈＩｍｍｕ３１のＮ末端およびＣ末端の残基（下線）は双方とも、用いた足場ベクターによって固定されている。図１Ａおよび図１Ｂの場合と同様にＫａｂａｔ’のＩｇ分子ナンバリング法を用いている。図４ＣはｈＩｍｍｕ３１Ｖκと、変異体であるｈＩｍｍｕ３１ＶκＴ６９およびｈＩｍｍｕ３１ＶκＴ３９の配列アライメントを示す。ドットは対応するｈＩｍｍｕ３１Ｖκの残基と同一であるｈＩｍｍｕ３１ＶκＴ６９およびｈＩｍｍｕ３１ＶκＴ３９の残基を示す。 ヒト抗体、マウスＩｍｍｕ３１およびｈＩｍｍｕ３１の軽鎖および重鎖可変領域のアミノ酸配列のアライメントを示す。図４ＡはＥＵ、ＮＥＷＭ、Ｉｍｍｕ３１、およびｈＩｍｍｕ３１のＶＨ配列のアライメントを示し、図４ＢはＲＥＩ、Ｉｍｍｕ３１およびｈＩｍｍｕ３１のＶκ配列アライメントを示す。点は対応するヒト抗体の残基と同一であるＩｍｍｕ３１およびｈＩｍｍｕ３１の残基を示す。ダッシュはアライメントを補助するために配列に挿入されたギャップを示す。線囲みの領域はＣＤＲ領域を示す。ｈＩｍｍｕ３１のＮ末端およびＣ末端の残基（下線）は双方とも、用いた足場ベクターによって固定されている。図１Ａおよび図１Ｂの場合と同様にＫａｂａｔ’のＩｇ分子ナンバリング法を用いている。図４ＣはｈＩｍｍｕ３１Ｖκと、変異体であるｈＩｍｍｕ３１ＶκＴ６９およびｈＩｍｍｕ３１ＶκＴ３９の配列アライメントを示す。ドットは対応するｈＩｍｍｕ３１Ｖκの残基と同一であるｈＩｍｍｕ３１ＶκＴ６９およびｈＩｍｍｕ３１ＶκＴ３９の残基を示す。 ヒト抗体、マウスＩｍｍｕ３１およびｈＩｍｍｕ３１の軽鎖および重鎖可変領域のアミノ酸配列のアライメントを示す。図４ＡはＥＵ、ＮＥＷＭ、Ｉｍｍｕ３１、およびｈＩｍｍｕ３１のＶＨ配列のアライメントを示し、図４ＢはＲＥＩ、Ｉｍｍｕ３１およびｈＩｍｍｕ３１のＶκ配列アライメントを示す。点は対応するヒト抗体の残基と同一であるＩｍｍｕ３１およびｈＩｍｍｕ３１の残基を示す。ダッシュはアライメントを補助するために配列に挿入されたギャップを示す。線囲みの領域はＣＤＲ領域を示す。ｈＩｍｍｕ３１のＮ末端およびＣ末端の残基（下線）は双方とも、用いた足場ベクターによって固定されている。図１Ａおよび図１Ｂの場合と同様にＫａｂａｔ’のＩｇ分子ナンバリング法を用いている。図４ＣはｈＩｍｍｕ３１Ｖκと、変異体であるｈＩｍｍｕ３１ＶκＴ６９およびｈＩｍｍｕ３１ＶκＴ３９の配列アライメントを示す。ドットは対応するｈＩｍｍｕ３１Ｖκの残基と同一であるｈＩｍｍｕ３１ＶκＴ６９およびｈＩｍｍｕ３１ＶκＴ３９の残基を示す。 Ｓｐ２／０細胞で発現されたヒト化Ｉｍｍｕ３１（ｈＩｍｍｕ３１）重鎖および軽鎖可変領域のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。図５ＡはｈＩｍｍｕ３１ＶＨのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示し、図５ＢはｈＩｍｍｕ３１ＶκのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。対応するＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列は一文字コードで示されている。ＣＤＲ領域のアミノ酸残基は太字と下線で示されている。図１Ａおよび図１Ｂの場合と同様に、アミノ酸残基にはＫａｂａｔのＩｇ分子ナンバリング法を用いている。 Ｓｐ２／０細胞で発現されたヒト化Ｉｍｍｕ３１（ｈＩｍｍｕ３１）重鎖および軽鎖可変領域のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。図５ＡはｈＩｍｍｕ３１ＶＨのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示し、図５ＢはｈＩｍｍｕ３１ＶκのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。対応するＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列は一文字コードで示されている。ＣＤＲ領域のアミノ酸残基は太字と下線で示されている。図１Ａおよび図１Ｂの場合と同様に、アミノ酸残基にはＫａｂａｔのＩｇ分子ナンバリング法を用いている。 ｈＩｍｍｕ３１ならびに二つの変異体ｈＩｍｍ３１Ｔ３９およびｈＩｍｍｕ３１Ｔ６９の結合親和性をマウスおよびキメラＩｍｍｕ３１の結合親和性と比べるための競合的細胞表面結合アッセイの結果を示す。種々の濃度の競合Ａｂ（ｈＩｍｍｕ３１、ｈＩｍｍ３１Ｔ３９、ｈＩｍｍｕ３１Ｔ６９、ｃＩｍｍｕ３１、または（マウス）Ｉｍｍｕ３１）を一定量のビオチニル化マウスＩｍｍｕ３１と混合し、ＡＦＰでプレコートした９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェル内で１時間インキュベートした。洗浄した後、ＨＲＰ複合化ストレプトアビジンを加え、室温で１時間インキュベートした。ＡＦＰ結合ビオチニル化Ｉｍｍｕ３１と結合したＨＲＰ複合化ストレプトアビジンの量は、４ｍＭのオルト−フェニレンジアミン二塩酸塩および０．０４％のＨ２Ｏ２を含有する基質溶液を添加した後にＯＤ４９０を読みとることで明らかにした。チャートＡは、ｈＩｍｍｕ３１（三角）およびｈＩｍｍｕ３１Ｔ６９（×）と、ｃＩｍｍｕ３１（四角）およびＩｍｍｕ３１（菱形）の結合親和性を比較したものである。これらの結果は、ｈＩｍｍｕ３１、ｃＩｍｍｕ３１およびＩｍｍｕ３１が、ＡＦＰに対する結合に関してビオチン−Ｉｍｍｕ３１と同等によく競合したことを示し、このことからヒト化Ｉｍｍｕ３１においてＭａｂ Ｉｍｍｕ３１の結合特異性と親和性が保存されていることを示す。さらに、ｈＩｍｍｕ３１Ｔ６９のＡＦＰに対する結合親和性は他の Ｉｍｍｕ３１ Ａｂに匹敵することが示された。チャートＢは、ｈＩｍｍｕ３１Ｔ３９（三角）とｈＩｍｍｕ３１（四角）およびＩｍｍｕ３１（菱形）を比較したものである。ｈＩｍｍｕ３１Ｔ３９の結合親和性は有意に低下しており、このことはＡｇ結合における荷電残基３９Ｋの重要性を示唆するものである。図７は、ｐｄＨＬ２ベクターを用いて発現させたｈＩｍｍｕ３１の結合親和性をキメラＩｍｍｕ３１の場合と比べるための競合的細胞表面結合アッセイの結果を示す。

Claims (25)

  1. α−フェトタンパク質（ＡＦＰ）抗原と結合する単離された抗体またはそのフラグメントであって、Ｉｍｍｕ３１抗体の重鎖ＣＤＲ１配列（ＳＹＶＩＨ）、重鎖ＣＤＲ２配列（ＹＩＨＰＹＮＧＧＴＫＹＮＥＫＦＫＧ）、および重鎖ＣＤＲ３配列（ＳＧＧＧＤＰＦＡＹ）、ならびに軽鎖ＣＤＲ１配列（ＫＡＳＱＤＩＮＫＹＩＧ）、軽鎖ＣＤＲ２配列（ＹＴＳＡＬＬＰ）、および軽鎖ＣＤＲ３配列（ＬＱＹＤＤＬＷＴ）を含んでなる、抗体またはそのフラグメント。
  2. ヒト化されている、請求項１に記載の抗体またはそのフラグメント。
  3. キメラ抗体またはそのフラグメントである、請求項１に記載の抗体またはそのフラグメント。
  4. ヒト抗体の軽鎖および重鎖可変領域の枠組み構造領域（ＦＲ）、ならびにヒト抗体の軽鎖および重鎖定常領域を含んでなる、請求項２に記載のヒト化抗体またはそのフラグメント。
  5. 前記抗体またはそのフラグメントの軽鎖および重鎖可変領域のＦＲが、対応するマウスＩｍｍｕ３１抗ＡＦＰ抗体のＦＲからの少なくとも一つの置換アミノ酸を含むものである、請求項４に記載のヒト化抗体またはそのフラグメント。
  6. 前記マウスＩｍｍｕ３１抗体からの前記アミノ酸が、配列番号１０のマウスＩｍｍｕ３１重鎖可変領域のアミノ酸残基４、２６、２７、２９、４５、４７、６６、６７および９７からなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸である、請求項５に記載のヒト化抗体またはそのフラグメント。
  7. 前記マウスＩｍｍｕ３１抗体からの前記アミノ酸が、配列番号１３のマウスＩｍｍｕ３１軽鎖可変領域のアミノ酸残基４、３９、４８、４９、５８、６９、１００および１０６からなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸である、請求項５に記載のヒト化抗体またはそのフラグメント。
  8. 配列番号８のｃＩｍｍｕ３１ ＶＫアミノ酸配列を含んでなる、請求項３に記載のキメラ抗体またはそのフラグメント。
  9. 配列番号６のｃＩｍｍｕ３１ ＶＨアミノ酸配列を含んでなる、請求項３に記載のキメラ抗体またはそのフラグメント。
  10. 配列番号２１のｈＩｍｍｕ３１ ＶＫアミノ酸配列を含んでなる、請求項２に記載のヒト化抗体またはそのフラグメント。
  11. 配列番号１９のｈＩｍｍｕ３１ ＶＨアミノ酸配列を含んでなる、請求項２に記載のヒト化抗体またはそのフラグメント。
  12. 前記フラグメントが、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’およびＦａｂからなる群から選択されるものである、請求項１に記載の抗体またはそのフラグメント。
  13. 請求項１に記載の抗体またはそのフラグメントに、少なくとも一種の診断／検出薬または少なくとも一種の治療薬を結合させた複合体。
  14. 前記診断／検出薬が、光活性診断／検出薬、色素原、色素、放射性核種、造影剤、常磁性イオン、超音波増強剤、リポソームおよび放射線不透過性化合物からなる群から選択されるものである、請求項１３に記載の複合体。
  15. 前記治療薬が、放射性核種、ホウ素、ガドリニウムもしくはウラン原子、免疫調節剤、サイトカイン、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、酵素、酵素阻害剤、光活性治療薬、薬物、細胞傷害剤、毒素、脈管形成阻害剤および異なる抗体からなる群から選択されるものである、請求項１３に記載の複合体。
  16. 前記薬物が、抗有糸分裂剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、脈管形成阻害剤、アポトーシス剤、アルカロイド、抗生物質、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、ニトロソウレア、トリアゼン、葉酸類似体、アントラサイクリン、タキサン、ＣＯＸ−２阻害剤、ピリミジン類似体、プリン類似体、抗生物質、酵素、エピポドフィロトキシン、プラチナ錯体、ビンカアルカロイド、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、ホルモンアンタゴニスト、酵素阻害剤、エンドスタチン、タキソールおよびその他のタキサン、カンプトテシン、ならびにドキソルビシンからなる群から選択されるものである、請求項１５に記載の複合体。
  17. 前記毒素が、リシン、アブリン、アルファトキシン、サポリン、ブドウ球菌内毒素−Ａ、ブタクサ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒、シュードモナス外毒素、およびシュードモナス内毒素からなる群から選択されるものである、請求項１５に記載の複合体。
  18. 前記免疫調節剤が、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、幹細胞増殖因子、エリスロポエチンおよびトロンボポエチンからなる群から選択されるものである、請求項１５に記載の複合体。
  19. 前記リンホトキシンが腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）であり、前記造血因子がインターロイキン（ＩＬ）であり、前記コロニー刺激因子が顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）であり、かつ、前記インターフェロンがインターフェロン−α、−β、または−γである、請求項１８に記載の複合体。
  20. 前記サイトカインが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、インターフェロン−γおよびＴＮＦ−αからなる群から選択されるものである、請求項１８に記載の複合体。
  21. 前記放射性核種が、Ｐ−３２、Ｐ−３３、Ｓｃ−４７、Ｆｅ−５９、Ｃｕ−６４、Ｃｕ−６７、Ｓｅ−７５、Ａｓ−７７、Ｓｒ−８９、Ｙ−９０、Ｍｏ−９９、Ｒｈ−１０５、Ｐｄ−１０９、Ａｇ−１１１、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｐｒ−１４２、Ｐｒ−１４３、Ｐｍ−１４９、Ｓｍ−１５３、Ｔｂ−１６１、Ｈｏ−１６６、Ｅｒ−１６９、Ｌｕ−１７７、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ｒｅ−１８９、Ｉｒ−１９４、Ａｕ−１９８、Ａｕ−１９９、Ｐｂ−２１１、Ｐｂ−２１２、Ｂｉ−２１３、Ｃｏ−５８、Ｇａ−６７、Ｂｒ−８０ｍ、Ｔｃ−９９ｍ、Ｉｎ−１１１、Ｓｂ−１１９、Ｈｏ−１６１、Ｏｓ−１８９ｍ、Ｉｒ−１９２、Ｄｙ−１５２、Ａｔ−２１１、Ｂｉ−２１２、Ｒａ−２２３、Ｂｉ−２１１、Ａｃ−２２５、およびＦｍ−２５５からなる群から選択されるものである、請求項１５に記載の複合体。
  22. 前記診断／検出薬または治療薬が、炭水化物部分により前記抗体またはそのフラグメントに結合している、請求項１３に記載の複合体。
  23. 請求項１に記載の少なくとも一つの抗ＡＦＰ抗体またはそのフラグメントを含んでなる、抗体融合タンパク質。
  24. マウス抗体またはそのフラグメントである、請求項１に記載の抗体またはそのフラグメント。
  25. 請求項１に記載の抗体またはそのフラグメントを含んでなる、癌を治療するための医薬組成物。
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