JP5081012B2 - 微生物検査装置 - Google Patents

Description

本発明は、微生物検査装置に係り、特に、微生物の生体数の計測に用いる微生物検査装置に好適なものである。

従来、微生物の生体数計測の迅速化および簡便化を目的とした様々な簡便迅速測定法を実施する計測装置が知られている。特に、生体数を迅速に直接計測する手法として、蛍光フローサイトメトリ法を用いた測定装置が注目されている。

蛍光フローサイトメトリ法は、蛍光色素で染色した微生物を含む検体の流れる流路径を細くし、微生物を一個ずつ流して計測する粒子計測方法である。この方法を用いた測定装置は、短時間に微生物を一個ずつ計測することができる。

また、蛍光フローサイトメトリ法において、検体中の微生物が流路壁面に付着することを防止するため、検体とシース液の層流を形成し、これらの二液の圧力差を利用し、検体の流径を絞り込むことが行われている。

さらに、低価格化を実現したり、洗浄の手間を省略したりするため、蛍光フローサイトメトリ法による測定を行う流路部分をディスポーザブルのチップにし、このディスポーザブルのチップ内で測定を行い、測定する流路部分であるチップを使い捨てにすることが知られ、例えば非特許文献１に記載されている。

Journal of Biomolecular Techniques、Vol14、Issue2、pp.119-127

上記従来技術においては、大容量の検体に対して迅速な微生物計測を行うことを考慮していないため、検体に含まれる生体数を測定するためには、検査者が検体をチップのウェルに注入する前に、検体の濃縮を行う必要がある。これらの作業は微生物の生体数の損失を防ぐ必要があるため専門的技量を必要としていた。

本発明の目的は、種々の微生物を簡単に濃縮できる微生物検査装置を提供することにある。

前述の目的を達成するために、本発明は、微生物を含む検体を保持する検体容器、磁性粒子を含む捕捉粒子液を保持する捕捉粒子液容器、剥離液を保持する剥離液容器、前記検体に含まれる微生物を捕捉する微生物捕捉部、微生物を検出する検出部、および液流路を内部に有する検出チップと、前記検体容器に保持された検体、前記捕捉粒子液容器に保持された捕捉粒子液および前記剥離液容器に保持された剥離液に搬送力を付与する搬送装置と、前記搬送装置を制御する制御装置と、前記微生物捕捉部に磁性粒子を磁力により保持する磁石と、前記検出チップの前記検出部内を流れる微生物を検出する検出装置と、を備え、前記微生物捕捉部は前記液流路の一部に前記磁性粒子の直径よりも小さい孔径を有する磁性粒子保持フィルタを設けて当該磁性粒子保持フィルタの一側に前記磁性粒子を堆積して濾過フィルタを形成するものであり、前記制御装置は、前記磁石による磁力が前記微生物捕捉部に作用している状態で前記捕捉粒子液を前記微生物捕捉部に流して当該微生物捕捉部の前記磁性粒子保持フィルタの一側に複数個の前記磁性粒子を堆積させて保持することにより前記濾過フィルタを形成し、この状態で前記検体を前記微生物捕捉部に流して前記濾過フィルタの一側に当該検体中の微生物を堆積させ、この状態で前記剥離液を前記微生物捕捉部に流して前記堆積された微生物を濃縮された状態で前記濾過フィルタから当該剥離液とともに剥離して前記検出部に流すように前記搬送装置を制御するものである。

係る本発明におけるより好ましい具体的構成例は次の通りである。
（１）前記磁石は、前記濾過フィルタに堆積された微生物を剥離する工程で、前記磁性粒子を前記微生物捕捉部から剥がす磁性粒子剥離力よりも前記磁性粒子を保持する磁性粒子保持力が大きくなる第１の状態から、前記磁性粒子を前記微生物捕捉部から剥がす磁性粒子剥離力よりも前記磁性粒子を保持する磁性粒子保持力が小さくなる第２の状態をとるように構成されていること。
（２）前記（１）において、前記磁石による前記磁性粒子を保持する磁性粒子保持力を徐々に弱めて前記捕捉粒子保持部から磁性粒子を徐々に流すようにしたこと。
（３）前記（２）において、前記磁石は前記磁性粒子保持フィルタの反濾過フィルタ側に移動可能に配置されていること。
（４）前記微生物を剥離する工程の初期には前記磁性粒子保持フィルタに全ての磁性粒子を保持する磁力を加えながら剥離液を流し、前記微生物を剥離する工程の中期には前記磁性粒子保持フィルタに一部の磁性粒子を保持する磁力に弱めて剥離液を流し、前記微生物を剥離する工程の後期には前記磁性粒子保持フィルタから全ての磁性粒子流れ出す磁力に弱めて剥離液を流すこと。
（５）前記検出チップは前部材、中間部材および後部材からなる多層構造体で構成され、前記微生物捕捉部は、前記中間部材の両面に形成された溝と、これらの溝を連通する貫通孔と、この貫通孔に設置された磁性粒子保持フィルタとを備えて構成されていること。
（６）前記剥離液容器に保持される剥離液の液量を前記検体容器に保持される検体の液量より少なくしたこと。
（７）前記検出チップの検出部を流れる微生物を検出する検出装置を備え、前記検出チップは染色試薬を保持する染色試薬容器および前記検出部を内部に有し、前記搬送装置は前記染色試薬容器に保持された染色試薬に搬送力を付与するものであり、前記制御装置は、前記染色試薬を前記微生物捕捉部に流して前記濾過フィルタに堆積された微生物を染色し、染色されて前記濾過フィルタから剥離された微生物および剥離液からなる検出液を前記検出部に流すように前記搬送装置を制御し、前記検出装置は、前記検出部を流れる検出液に光を照射し、染色された微生物からの蛍光や散乱光を検出して電気信号に変換して当該微生物の数を計測すること。

本発明によれば、種々の微生物を簡単に濃縮できる微生物検査装置を提供することができる。

以下、本発明の一実施形態の微生物検査装置について図面を参照して説明する。

まず、図１および図２を参照しながら、本実施形態の微生物検査装置１の全体概要について説明する。図１は本実施形態の微生物検査装置１の概観図、図２は図１の微生物検査装置１のシステム構成図である。

微生物検査装置１は、検出チップ１０と、ホルダ１１と、蓋１２と、検査装置本体１３と、この検査装置本体１３の各機器を制御する制御装置４０と、この制御装置４０に接続された出力装置４１と、を備えて構成されている。

検出チップ１０は、検体や染色試薬を内部に保持し、微生物計測に必要な工程を行うための機構を内部に備えた一つのディスポーザブルのチップで構成されている。この検出チップ１０はホルダ１１にセットして使用される。検出チップ１０は、ホルダ１１および蓋１２により、検査装置本体１３の正面に保持される。セットする検出チップ１０の種類を変えることで、様々な検体に適した微生物数計測工程を実施することが可能である。

ホルダ１１は、検出チップ１０を保持すると共に、検出チップ１０の温度を制御する機能を備えている。蓋１２は透明な部材で製作され、検出チップ１０をカバーしている。

検査装置本体１３は、検出チップ１０の内部の液体を搬送するための搬送装置２０と、検出チップ１０の内部を流れる微生物を検出するための検出装置３０と、検出チップ１０の内部の磁性粒子に磁力を加えるための磁石３３１と、を備えて構成されている。

搬送装置２０は、チップ連結管２１を介して検出チップ１０と連結され、微生物の計測に必要な工程を行うために、検出チップ１０内の検体や染色試薬や剥離液などの搬送を行う。

検出装置３０は、検出チップ１０の内部を流れる微生物に励起光を照射し、照射された微生物からの蛍光を検出し、その検出結果を電気信号に変換して制御装置４０に送る。本実施形態では、蛍光フローサイトメトリ法を用いて微生物を検出する検出装置３０である。

制御装置４０は、検査装置本体１３の各機器の制御や、その各機器より出力された電気信号の処理などを行い、得られた検査結果を出力装置４１に出力する。この出力装置４１は、その検査結果を画面に表示する。なお、出力装置４１にプリンタを備えて紙に印刷して出力できるようにしてもよい。

次に、図３〜図４を参照しながら、検出チップ１０について具体的に説明する。図３は図１の検出チップ１０の正面図、図４は図１の検出チップ１０の一部を示す縦断面図である。

図３に示すように、検出チップ１０は、検体を保持するための検体容器１２３と、検体内の残渣を除去する残渣除去部１３３と、検体内の微生物を捕捉する微生物捕捉部１３１と、この微生物捕捉部１３１に濾過フィルタを形成するための捕捉粒子を保持する捕捉粒子液容器１２４と、染色試薬を保持する染色試薬容器１２５、１２６と、微生物捕捉部１３１を通過した検体や捕捉粒子液や染色試薬が入る濾過液廃液容器１２１と、剥離液を保持する剥離液容器１２２と、微生物捕捉部から微生物を剥離した液、すなわち検出液を保持する検出液容器１２７と、微生物を検出する検出部１３７と、この検出部１３７を通過した検出液が入る検出液廃液容器１２８と、各容器を連結し、検体や捕捉粒子液や染色試薬や剥離液が流動する溶液用流路１２９と、各容器内の検体や捕捉粒子液や染色試薬や剥離液を気圧により流動させるための通気口１４１〜１４８と、通気口１４１〜１４８と各容器１２１〜１２８とを接続する空気用流路１４９と、を備えて構成されている。

複数の容器１２１〜１２８は検出チップ１０の上部に並置されている。これらの容器１２１〜１２８の各々は縦に長く延びて形成されている。これらの容器１２１〜１２８を共通的に表現する場合には、容器１２０と表現する。

複数の通気口１４１〜１４８は、検出チップ１０の上部に並置されると共に、容器１２１〜１２８よりも上方に配置されている。これらの通気口１４１〜１４８を共通的に表現する場合には、通気口１４０と表現する。

溶液用流路１２９の深さおよび流路幅は１０μｍ〜１ｍｍ、空気用流路１４９の深さおよび流路幅は１０μｍ〜１ｍｍの範囲で設計されている。溶液用流路１２９の断面積は、溶液の搬送を考慮して、空気用流路１４９の断面積より大きくなるように設計されている。

染色試薬は染色試薬容器１２５、１２８内に前もって封入されている。これによって、外部環境による劣化の影響や検査者が各試薬に触れる可能性を最低限に抑えている。検体は、検査前に通気口１４３より、検体容器１２３に注入される。

検体容器１２３の容積は検体の体積より大きい。また、微生物捕捉部１３１と検出液容器１２７を連結する溶液用流路１２９の最高点は、検出液容器１２７中の検出液の水位より高くなるよう設計されている。

染色試薬は、微生物を染色する色素、たとえばＤＡＰＩ（１μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ）、アクリジンオレンジ（１μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ）、エチジウムブロマイド（１μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ）などが使用される。

図４に示すように、検出チップ１０は、ガラス、石英、ポリメタクリル酸エステル、ＰＤＭＳなどの光透過性の物質からなる計測部材１０１と、前部材１０２と、中間部材１０３と、後部材１０４からなる四層構造で構成されている。染色試薬の外部の光による劣化を防ぐために、前部材１０２、中間部材１０３および後部材１０４は、ポリメタクリル酸エステル、ＡＢＳ、ポリカーボネイト、ＰＤＭＳなどの物質に遮光のための処理を行った部材が用いられている。

中間部材１０３は、前部材１０２および後部材１０４に張り合わされる面に溝を有している。前部材１０２、後部材１０４および中間部材１０３を張り合わせることで、深い溝は検体や各試薬を保持する容器１２０を構成し、浅い溝は検体や各試薬が流動するための溶液用流路１２９および空気が流動する空気用流路１４９を構成する。中間部材１０３の両面に形成された溝は貫通孔により連結され、溝および貫通孔により流路が形成される。

前部材１０２は、計測部材１０１と接する面に溝を有し、この溝と中間部材１０３の溝とを連通する貫通孔も備える。計測部材１０１と前部材１０２とが張り合わされることで、外部からの光計測が可能な検出用流路１３７１が構成される。蛍光染色された微生物からの蛍光は、計測部材１０１を通して計測することが可能である。貫通孔は、通気口１４０や、検出用流路１３７１と溶液用流路１２９とを連結する流路を構成する。

次に、図５および図６を参照しながら、検出チップ１０の検出部１３７について具体的に説明する。図５は図１の検出チップ１０の検出部１３７を拡大した正面図、図６はその検出部１３７の縦断面図である。本実施形態の検出装置３０による検出部１３７における微生物１７５の計測は、蛍光フローサイトメトリ法を用いて行われる。

検出部１３７における検出用流路１３７１は、流路幅および流路深さが１μｍ〜０．１ｍｍ、流路長さは１０μｍ〜１０ｍｍの範囲にそれぞれ設計されると共に、流路長さが流路幅および流路深さより長くなるように設計されている。検出用流路１３７１の断面積は、前後の溶液用流路１２９の断面積より小さくなるように設計されている。したがって、非常に幅の細い流路であるため、２つ以上の微生物１７５が並んで流動することは稀である。つまり、検出用流路１３７１を微生物１７５が１つづつ流動するように設計されている。

検出用流路１３７１には、微生物１７５の検出のために、検出装置３０からの励起光１８３が計測部材１０１を通過して入射される。励起光１８３は検出装置３０内で楕円形状に集光されて出射され、励起光１８３の検出部１３７への入射範囲は照射範囲１８２に絞られる。染色された微生物１７５は、矢印１８５の方向に流れ、照射範囲１８２を通過するときに蛍光１８４を出す。この蛍光１８４は、計測部材１０１を通過して検出装置３０にて検出される。

次に、図７を参照しながら、検出装置３０について具体的に説明する。図７は図１の検出装置３０の光学系の構成図である。光学装置やその配置は使用する染色色素の励起スペクトルと蛍光スペクトルによって異なる場合もある。ここでは、エチジウムブロマイド（励起波長５２０ｎｍ、蛍光波長６１５ｎｍ）とＤＡＰＩ（励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍ）の二種類の染色色素を使用に対応した光学系について説明する。

検出装置３０は、短波長（ＤＡＰＩ用）の励起光源のための短波長レーザー４３４（波長３６０ｎｍ）と、長波長（エチジウムブロマイド用）の励起光源のための長波長レーザー４３５（波長５２０ｎｍ）と、それぞれのレーザー４３４、４３５からのレーザー光を楕円状に集光するためのシリンドリカルレンズ４３０〜４３３と、波長４００ｎｍ以下の光を反射する短波長用ダイクロイックミラー４２３と、波長５００以上の光を反射する中波長用ダイクロイックミラー４２４と、波長６００ｎｍ以上の光を反射する長波長用ダイクロイックミラー４２５と、波長５００ｎｍ以上の光を通過しない短波長用光学フィルタ４２６と、波長７００以上の光を通過しない長波長用光学フィルタ４２７と、短波長用光学フィルタ４２６を通過した光を検出する短波長用ホトマル４２８と、長波長用光学フィルタ４２７を通過した光を検出する長波長用ホトマル４２９と、微生物１７５からの蛍光を集光するための対物レンズ４２０と、焦点深度の幅を広げるため、対物レンズ４２０を高速に動かすためのピエゾ４２１と、ピエゾの動作を制御するピエゾコントローラ４２２と、を備えて構成されている。

短波長レーザー４３４から出力された励起光４３６（波長３６０ｎｍ）は、シリンドリカルレンズ４３０、４３１により楕円状に集光され、短波長用ダイクロイックミラー４２３で反射され、中波長用ダイクロイックミラー４２４、長波長用ダイクロイックミラー４２５、対物レンズ４２０を経由し、照射範囲４８２に照射される。これにより、照射範囲４８２を流れる微生物１７５を染色したＤＡＰＩが励起される。このＤＡＰＩからの蛍光４３９（波長４６０ｎｍ）は、長波長用ダイクロイックミラー４２５、中波長用ダイクロイックミラー４２４、短波長用ダイクロイックミラー４２３、短波長用光学フィルタ４２６を経由し、短波長用ホトマル４２８に入射される。短波長用ホトマル４２８により検出された蛍光４３９は電気信号に変換され、この電気信号は制御装置４０に送られる。

一方、長波長レーザー４３５から出力された励起光４３７（波長５３０ｎｍ）は、シリンドリカルレンズ４３２、４３３により楕円状に集光され、中波長用ダイクロイックミラー４２４で反射され、長波長用ダイクロイックミラー４２５、対物レンズ４２０を経由し、照射範囲４８２に照射される。これにより、照射範囲４８２を流れる微生物１７５を染色したエチジウムブロマイドが励起される。エチジウムブロマイドからの蛍光４３８（波長６２０ｎｍ）は、長波長用ダイクロイックミラー４２５で反射され、長波長用光学フィルタ４２７を経由し、長波長用ホトマル４２９に入射される。長波長用ホトマル４２９により検出された蛍光４３８は電気信号に変換され、この電気信号は制御装置４０に送られる。

そして、制御装置４０は、短波長用ホトマル４２８、長波長用ホトマル４２９から送られた電気信号を処理し、微生物数の情報を検査結果として、出力装置４１に出力する。出力装置４１はその検査結果を画面に表示する。

次に、図８を参照しながら、微生物計測の概要を説明する。図８は図１の検出チップ１０内で行われる微生物計測の工程図である。図中の（ａ）〜（ｅ）の記号は、捕捉粒子液１２４１、検体１２３１、染色試薬１２５１１、剥離液１２２１、検出液１２７１の各部の処理経路を示す。

検出チップ１０は、上述したように、微生物１７５より大きい残渣を検体１２３１より取り除くための残渣除去部１３３と、検体１２３１中の微生物１７５を捕捉して濃縮するための微生物捕捉部１３１と、微生物１７５を検出するための検出部１３７を備えている。

微生物１７５を計測する工程の概要を各部の処理経路（ａ）〜（ｅ）に基づいて説明する。制御装置４０が搬送装置２０を制御することによって、これらの工程が切替えられて実行される。

まず、（ａ）が示す処理経路に従い、濾過フィルタの形成工程が行われる。捕捉粒子液１２４１は、搬送装置２０の動作により捕捉粒子液容器１２４から押し出され、微生物捕捉部１３１を通過し、濾液廃棄容器１２１に入り除去される。その微生物捕捉部１３１を通過する際に、微生物捕捉部１３１に捕捉粒子液１２４１中の捕捉粒子（図１０に示す磁性粒子２１４）が堆積される。この磁性粒子２１４によって濾過フィルタが形成される。

次いで、（ｂ）が示す処理経路に従い、検体１２３１中の残渣の除去工程及び微生物捕捉工程が行われる。検体１２３１は、搬送装置２０の動作により検体容器１２３から押し出され、残渣除去部１３３および微生物捕捉部１３１を通過し、その際に、残渣除去部１３３によって検体１２３１中の微生物１７５より大きい残渣が取り除かれ、微生物捕捉部１３１によって検体１２３１中の微生物１７５が捕捉される。なお、微生物１７５より小さい色素のような残渣は、検体１２３１とともに微生物捕捉部１３１を通過して廃液容器１２１に入り除去される。

次いで、（ｃ）が示す処理経路に従い、微生物１７５の染色工程が行われる。微生物１７５を染色する染色試薬１２５１は、搬送装置２０の動作により染色試薬容器１２５または１２６から押し出され、微生物捕捉部１３１を通過し、その際に微生物捕捉部１３１に捕捉された微生物１７５を染色する。微生物捕捉部１３１を通過した余分な染色試薬１２５１は、濾液廃棄容器１２１に入り除去される。

次いで、（ｄ）が示す処理経路に従い、蛍光色素に染色された微生物１７５の剥離工程が行われる。微生物捕捉部１３１に捕捉された微生物１７５を剥離させるための剥離液１２２１は、搬送装置２０の動作により剥離液容器１２２から押し出され、微生物捕捉部１３１を通過し、その際に微生物１７５を剥離し、微生物１７５と共に剥離液１２２１が検出液容器１２７に入り、検出液１２７１となる。

次いで、（ｅ）が示す処理経路に従い、蛍光色素に染色された微生物１７５の検出工程が行われる。検出液１２７１は検出液容器１２７から微生物検出部１３７に入る。微生物検出部１３７にて、検出液１２７１中の微生物１７５の計測が行われる。微生物検出部１３７での計測が終わった後、検出液１２７１は検出液廃液容器１２８に入り除去される。

以上の工程は、検出チップ１０内ですべて行われるため、検査者が検体１２３１中の微生物１７５や染色試薬１５２１に触れる危険を低減し、また検査者の人為的ミスや外的影響による検査結果への影響を少なくする。

次に、図９および図１０を参照しながら、微生物計測における濾過フィルタの形成工程を具体的に説明する。図９は図１の検出チップ１０内での捕捉粒子液１１４の流動を示す図、図１０は図９における捕捉粒子液流動時の微生物捕捉部１３１の縦断面図である。

図９に示すように、通気口１４４を介して搬送装置２０からの圧力を捕捉粒子液容器１２４に加え、捕捉粒子液容器１２４内の気圧を上げる。同時に、通気口１４１を介して、廃液容器１２１を大気に開放する。その他の通気口１４２、１４３、１４５〜１４８は閉じる。捕捉粒子液１１４は、気圧差により、捕捉粒子容器１２４から微生物捕捉部１３１を経由し、廃液容器１２１まで流動する。微生物捕捉部１３１を経由するときに、捕捉粒子液１１４中の磁性粒子２１４が微生物捕捉部１３１に図１０に示すように堆積されて行き、これによって濾過フィルタを形成する。

図１０示すように、微生物捕捉部１３１は、中間部材１０３の貫通孔に、磁性粒子保持フィルタ２３１を有している。磁性粒子保持フィルタ２３１の孔径は磁性粒子２１４の直径よりも小さい寸法としている。このため、捕捉粒子液１２４を磁性粒子保持フィルタ２３１に通すと、捕捉粒子液１１４中の磁性粒子２１４が磁性粒子保持フィルタ２３１の一側に図１０に示すように順次集積され、最終的には図１２に示すように集積されて濾過フィルタを構成する。このように、貫通孔の一側に磁性粒子保持フィルタ２３１を設けることによって、磁性粒子２１４を簡単に集積することができる。

ここで磁性粒子２１４の寸法を、捕捉する微生物１７５の寸法の２倍程度とすることにより、磁性粒子２１４で形成した濾過フィルタとしての孔径（各磁性粒子２１４の間に形成される隙間の寸法）が微生物１７５の外径寸法以下（半分以下）となり、十分に微生物１７５を捕獲することができる。

また、磁性粒子保持フィルタ２３１に捕捉粒子液１１４を通す際に、磁性粒子保持フィルタ２３１の近傍に磁石３３１が配置される。この磁石３３１は、磁性粒子２１４が堆積される位置に対して、磁性粒子保持フィルタ２３１を挟んだ反対側に配置される。この磁石３３１の磁力で磁性粒子２１４を磁性粒子保持フィルタ２３１に引き寄せ続けることができるため、検体の流れで磁性粒子２１４からなるフィルタ構造が崩れるのを防ぐことができると共に、重力の影響を受けずに磁性粒子２１４を堆積することができる。これによって、検出チップ１０内での微生物捕捉部１３１の設置が容易となる。

次に、図１１および図１２を参照しながら、検体１２３１中の微生物捕捉工程を具体的に説明する。図１１は図１の検出チップ１０内での検体１２３１の流動を示す図、図１２Ａは図１１における検体１２３１の流動初期の微生物捕捉部１３１の縦断面図、図１２Ｂは図１１における検体１２３１の流動後期の微生物捕捉部１３１の縦断面図である。

図１１に示すように、通気口１４３を介して搬送装置２０からの圧力を検体液容器１２３に加え、検体液容器１２３内の気圧を上げる。同時に、通気口１４１を介して廃液容器１２１を大気開放する。その他の通気口１４２、１４４〜１４８は閉じる。検体１２３１は、気圧差により、検体容器１２３から微生物捕捉部１３１を経由し、廃液容器１２１まで流動する。微生物捕捉部１３１を経由するときに、微生物捕捉部１３１に形成された濾過フィルタに微生物１７５が図１２に示すように捕捉されて行き、堆積されて濃縮される。

即ち、微生物１７５は、磁性粒子２１４で形成される濾過フィルタとしての孔径より大きいため、まず図１２Ａに示すように濾過フィルタの孔に対応して載積され始め、次いで図１２Ｂに示すように堆積された微生物１７５の上に堆積される。これによって、微生物１７５が磁性粒子２１４に吸着される物質でない場合でも、微生物１７５を堆積させることができると共に、多量に堆積させることができる。換言すれば、微生物の性質に特定されないで、種々の微生物１７５を堆積させることができる。

次に、図１３を参照しながら、微生物１７５の染色工程を具体的に説明する。図１３は図１の検出チップ１０内での染色試薬の流動を示す図である。

通気口１４５を介して搬送装置からの圧力を染色試薬容器１２５に加え、染色試薬容器１２５内の気圧を上げる。同時に、通気口１４１を介して廃液容器１２１を大気開放する。その他の通気口１４２〜１４４、１４６〜１４８は閉じる。染色試薬は、気圧差により、染色試薬容器１２５から微生物捕捉部１３１を経由し、廃液容器１２１まで流動する。微生物捕捉部１３１を経由するときに、微生物捕捉部１３１に形成された捕捉粒子２１４による濾過フィルタに捕獲された微生物１７５が染色される。

同様に、通気口１４６を介して搬送装置からの圧力を染色試薬容器１２６に加え、染色試薬容器１２６内の気圧を上げる。同時に、通気口１４１を介して廃液容器１２１を大気開放する。その他の通気口１４２〜１４５、１４７、１４８は閉じる。染色試薬は、気圧差により、染色試薬容器１２６から微生物捕捉部１３１を経由し、廃液容器１２１まで流動する。微生物捕捉部１３１を経由するときに、微生物捕捉部１３１に形成された捕捉粒子２１４による濾過フィルタに捕獲された微生物１７５が染色する。

次に、図１４から図１８を参照しながら、微生物１７５の剥離工程を具体的に説明する。図１４は図１の検出チップ１０内での剥離液１１２の流動を示す図、図１５は図１４における検剥離液１１２の流動初期の微生物捕捉部１３１の縦断面図、図１６は図１４における検剥離液１１２の流動中期の微生物捕捉部１３１の縦断面図、図１７は図１４における検剥離液１１２の流動後期の微生物捕捉部１３１の縦断面図、図１８は磁性粒子保持力および磁性粒子剥離力の変化を示す図である。

図１４に示すように、通気口１４２を介して搬送装置２０からの圧力を剥離液容器１２２に加え、剥離液容器１２２内の気圧を上げる。同時に、通気口１４７を介して検出液容器１２７を大気開放する。その他の通気口１４１、１４３〜１４６、１４８は閉じる。剥離液１１２は、気圧差により、剥離液容器１２２から微生物捕捉部１３１を経由し、検出液容器１２７まで流動する。微生物捕捉部１３１を経由するときに、微生物捕捉部１３１に形成された磁性粒子２１４による濾過フィルタに捕獲された微生物１７５が剥離される。この剥離液１１２の液量を検体１２３１の液量より少なくすることで、微生物１７５が濃縮された状態で剥離することができる。ここで、溶液用流路１２９の寸法は幅５００μｍ、深さ５００μｍ、磁性粒子２１４の堆積は２５μＬ、剥離液の容量は１ｍＬである。

また、剥離液１１２を検出液容器１２７に一度保持することで、微生物捕捉部１３１を通過して剥離中に混入した気泡を通気口１４７から取り除くことができる。気泡は次の微生物１７５の検出工程にて検出を阻害する可能性があるため、できる限り取り除くことが好ましい。

剥離液１１２の流動初期は、磁石３３１が磁性粒子２１４に最も接近した状態および磁性粒子２１４から離れ始めた状態であり、剥離液１１２による磁性粒子剥離力よりも磁石３３１による磁性粒子保持力が大きい状態である。このため、磁性粒子２１４の全てが磁性粒子保持フィルタ２３１に保持され、剥離液１１２の流れに乗って磁性粒子２１４が流れ出すことがなく、磁性粒子２１４の堆積で形成される濾過フィルタに捕捉された微生物１７５のみが図１５に示すように徐々に剥離される。

剥離液１１２の流動中期は、磁石３３１が磁性粒子２１４から離れることがさらに進行した状態であり、剥離液１１２による磁性粒子剥離力よりも磁石３３１による磁性粒子保持力が小さくなり、その差がさらに大きくなる状態である。このため、流動中期では図１６に示すように剥離液１１２の流れに乗って一部の磁性粒子２１４が流れ出す。

剥離液１１２の流動後期は、磁石３３１が磁性粒子２１４から最も離れた状態であり、剥離液１１２による磁性粒子剥離力よりも磁石３３１による磁性粒子保持力が小さく、その差が最も大きくなった状態である。このため、流動後期では図１７に示すように剥離液１１２の流れに乗って磁性粒子２１４の全てが流れ出す。そして、磁性粒子２１４の全てが流れ出した後に、剥離液１１２の搬送が停止される。

このように、磁石３３１の磁力による保持力と剥離液１１２の流れによる剥離力との力関係を調整することにより、剥離液１１２で微生物捕捉部１３１から微生物１７５を剥離する際に、微生物１７５を濃縮する濾過フィルタを形成する磁性粒子２１４を徐々に流すことができる。これによりディスポーザブルチップである検出チップ１０内での微生物１７５の濃縮における微細流路の目詰まりなどを確実に防止することができる。

次に、図１９を参照しながら、微生物１７５の検出工程を具体的に説明する。図１９は図１の検出チップ１０内での検出液１２７１の流動を示す図である。

通気口１４７を介して搬送装置２０からの圧力を検出液容器１２７に加え、検出液容器１２７内の気圧を上げる。同時に、通気口１４８を介して検出液廃液容器１２８を大気開放する。その他の通気口１４１〜１４６は閉じる。検出液１２７１は、気圧差により、検出液容器１２７から検出部１３７を経由し、検出液容器１２８まで流動する。検出液１２７１中の微生物１７５は検出部１３７を通過するときに計測される。検出部１３７における微生物の計測は、前述の蛍光フローサイトメトリ法を用いて行われる。

上述したように、検出チップ１０の通気口１４１〜１４８を介して検体容器１２３、染色試薬容器１２５、１２６、検出液廃液容器１２８を密閉状態と大気開放状態とに切り替え、検体の移動、濃縮、染色試薬の染色を行うので、ひとつの検出チップ１０内にて、残渣の除去、微生物の濃縮、微生物の染色、生体数計測を一貫して行うことができる。したがって、検査者への作業負担や、染色試薬に被爆する可能性を低減し、検査者の技量に依存しない安定した測定結果を得ることができる。また、使用する染色試薬の残余量を低減することができるため、必要な試薬コストを低減することができる。

本実施形態によれば、微生物濃縮の前処理を組み込んだ、蛍光フローサイトメトリ法による迅速な微生物数計測を一つのディスポーザブルのチップ内で実現することが可能で、簡単な作業で安定した微生物の生体数計測を行うことができると共に、ディスポーザブルチップ内での微生物濃縮における微細流路の目詰まりなどを防止することできる。

本発明の一実施形態の微生物検査装置の概観図である。 図１の微生物検査装置のシステム構成図である。 図１の検出チップの正面図である。 図１の検出チップの一部を示す縦断面図である。 図１の検出チップの検出部を拡大した正面図である。 図５の検出部の縦断面図である。 図１の検出装置の光学系の構成図である。 図１の検出チップ内で行われる微生物計測の工程図である。 図１の検出チップ内での捕捉粒子液の流動を示す図である。 図９における捕捉粒子液流動時の微生物捕捉部の縦断面図である。 図１の検出チップ内での検体液の流動を示す図である。 図１１における検体液の流動初期の微生物捕捉部の縦断面図である。 図１１における検体液の流動後期の微生物捕捉部の縦断面図である。 図１の検出チップ内での染色試薬の流動を示す図である。 図１の検出チップ内での剥離液の流動を示す図である。 図１４における検剥離液の流動初期の微生物捕捉部の縦断面図である。 図１４における検剥離液の流動中期の微生物捕捉部の縦断面図である。 図１４における検剥離液の流動後期の微生物捕捉部の縦断面図である。 本実施形態における磁性粒子保持力および磁性粒子剥離力の変化を示す図である。 図１の検出チップ内での検出液の流動を示す図である。

符号の説明

１…微生物検査装置、１０…検出チップ、１１…ホルダ、１２…蓋、１３…検査装置本体、２０…搬送装置、２１…チップ連結管、３０…検出装置、４０…制御装置、４１…出力装置、１０１…計測部材、１０２…前部材、１０３…中間部材、１０４…後部材、１２０…容器、１２１…廃液容器、１２２…剥離液容器、１２３…検体容器、１２４…捕捉粒子液容器、１２５、１２６…染色試薬容器、１２７…検出液容器、１２８…検出液廃液容器、１２９…溶液用流路、１３１…微生物捕捉部、１３３…残渣除去部、１３７…検出部、１４０，１４１〜１４８…通気口、１４９…空気用流路、１７５…微生物、１８２、４８２…照射範囲、１８３、４３６、４３７…励起光、１８４、４３８，４３９…蛍光、１８５…流れる方向、２１４…磁性粒子、２３１…磁性粒子保持フィルタ、３３１…磁石、４２０…対物レンズ、４２１…ピエゾ、４２２…ピエゾコントローラ、４２３…短波長用ダイクロックミラー、４２４…中波長用ダイクロックミラー、４２５…長波長用ダイクロックミラー、４２６…短波長用光学フィルタ、４２７…長波長用光学フィルタ、４２８…短波長用ホトマル、４２９…長波長用ホトマル、４３４…短波長レーザー、４３５…長波長レーザー、４３０〜４３３…シリンドリカルレンズ、１２２１…剥離液、１２３１…検体、１２４１…捕捉粒子液、１２５１…染色試薬、１２７１…検出液、１３７１…検出用流路。

Claims (8)

1. 微生物を含む検体を保持する検体容器、磁性粒子を含む捕捉粒子液を保持する捕捉粒子液容器、剥離液を保持する剥離液容器、前記検体に含まれる微生物を捕捉する微生物捕捉部、微生物を検出する検出部、および液流路を内部に有する検出チップと、
   前記検体容器に保持された検体、前記捕捉粒子液容器に保持された捕捉粒子液および前記剥離液容器に保持された剥離液に搬送力を付与する搬送装置と、
   前記搬送装置を制御する制御装置と、
   前記微生物捕捉部に磁性粒子を磁力により保持する磁石と、
   前記検出チップの前記検出部内を流れる微生物を検出する検出装置と、を備え、
   前記微生物捕捉部は前記液流路の一部に前記磁性粒子の直径よりも小さい孔径を有する磁性粒子保持フィルタを設けて当該磁性粒子保持フィルタの一側に前記磁性粒子を堆積して濾過フィルタを形成するものであり、
   前記制御装置は、前記磁石による磁力が前記微生物捕捉部に作用している状態で前記捕捉粒子液を前記微生物捕捉部に流して当該微生物捕捉部の前記磁性粒子保持フィルタの一側に複数個の前記磁性粒子を堆積させて保持することにより前記濾過フィルタを形成し、この状態で前記検体を前記微生物捕捉部に流して前記濾過フィルタの一側に当該検体中の微生物を堆積させ、この状態で前記剥離液を前記微生物捕捉部に流して前記堆積された微生物を濃縮された状態で前記濾過フィルタから当該剥離液とともに剥離して前記検出部に流すように前記搬送装置を制御する
   ことを特徴とする微生物検査装置。
2. 請求項１において、
   前記磁石は、前記濾過フィルタに堆積された微生物を剥離する工程で、前記磁性粒子を前記微生物捕捉部から剥がす磁性粒子剥離力よりも前記磁性粒子を保持する磁性粒子保持力が大きくなる第１の状態から、前記磁性粒子を前記微生物捕捉部から剥がす磁性粒子剥離力よりも前記磁性粒子を保持する磁性粒子保持力が小さくなる第２の状態をとるように構成されている
   ことを特徴とする微生物検査装置。
3. 請求項２において、
   前記磁石による前記磁性粒子を保持する磁性粒子保持力を徐々に弱めて前記捕捉粒子保持部から磁性粒子を徐々に流すようにした
   ことを特徴とする微生物検査装置。
4. 請求項３において、
   前記磁石は前記磁性粒子保持フィルタの反濾過フィルタ側に移動可能に配置されている
   ことを特徴とする微生物検査装置。
5. 請求項１において、
   前記微生物を剥離する工程の初期には前記磁性粒子保持フィルタに全ての磁性粒子を保持する磁力を加えながら剥離液を流し、
   前記微生物を剥離する工程の中期には前記磁性粒子保持フィルタに一部の磁性粒子を保持する磁力に弱めて剥離液を流し、
   前記微生物を剥離する工程の後期には前記磁性粒子保持フィルタから全ての磁性粒子流れ出す磁力に弱めて剥離液を流す
   ことを特徴とする微生物検査装置。
6. 請求項１において、
   前記検出チップは前部材、中間部材および後部材からなる多層構造体で構成され、
   前記微生物捕捉部は、前記中間部材の両面に形成された溝と、これらの溝を連通する貫通孔と、この貫通孔に設置された磁性粒子保持フィルタとを備えて構成されている
   ことを特徴とする微生物検査装置。
7. 請求項１において、
   前記剥離液容器に保持される剥離液の液量を前記検体容器に保持される検体の液量より少なくした
   ことを特徴とする微生物検査装置。
8. 請求項１において、
   前記検出チップの検出部を流れる微生物を検出する検出装置を備え、
   前記検出チップは染色試薬を保持する染色試薬容器および前記検出部を内部に有し、
   前記搬送装置は前記染色試薬容器に保持された染色試薬に搬送力を付与するものであり、
   前記制御装置は、前記染色試薬を前記微生物捕捉部に流して前記濾過フィルタに堆積された微生物を染色し、染色されて前記濾過フィルタから剥離された微生物および剥離液からなる検出液を前記検出部に流すように前記搬送装置を制御し、
   前記検出装置は、前記検出部を流れる検出液に光を照射し、染色された微生物からの蛍光や散乱光を検出して電気信号に変換して当該微生物の数を計測する
   ことを特徴とする微生物検査装置。

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