JP2007232382A - 微生物検出方法及び微生物検出装置 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 検出対象微生物を特異的に認識し、蛍光物質が結合した標識抗体による抗原抗体反応を用いて、試料に含まれる粒子の蛍光強度から該検出対象微生物を検出する微生物検出方法であって、上記粒子の前方散乱光強度並びに上記標識抗体による蛍光強度及び夾雑物に特有の蛍光強度とを測定し、測定した光学的情報に基づき、上記標識抗体が上記夾雑物に非特異結合した擬陽性を示す粒子を排除して検出対象微生物のみを検出し、該検出対象微生物を計数することとした。
【選択図】 図1
Description
上記水系感染症のうち、特に新興の水系感染症の原因となっているクリプトスポリジウムやジアルジア等の原虫の検査方法(例えば、厚生労働省から示された「クリプトスポリジウム暫定対策指針」1998年に指針の改正)によれば、クリプトスポリジウムの検査手順は大きく分けて、試料採取、ろ過濃縮、剥離懸濁、分離精製、免疫蛍光染色、顕微鏡観察からなる。
また、このクリプトスポリジウム検査方法では、クリプトスポリジウムの検出、観察を顕微鏡で行うため、作業者の熟練度が測定結果の精度、正確さに大きな影響を与えることとなっており、均一な測定精度が得られ難いという問題もある。
図1に、本発明に係る微生物検出方法を実施するための装置について、一実施の形態を示す。本装置は、河川や湖沼等の環境水中に含まれる検出対象微生物を検出対象としている。
まず、河川や湖沼等の環境水中に含まれる検出対象微生物を分離濃縮する。これには、例えば、以下の方法を挙げることができる。
(1)中空糸膜、メンブレンフィルター等によるろ過による濃縮方法。
(2)抗体を結合させた免疫磁気ビーズによる濃縮方法。
(3)炭酸カルシウム等の無機物質の微粒子に吸着、凝集させ沈殿させる方法。
上記光照射装置2は、上記被測定試料中の上記標識抗体に結合する蛍光物質を励起する波長の光を照射するもので、上記蛍光物質の励起波長に応じて照射光を変えるようになっている。
上記第1の蛍光検出器3からの蛍光の検出信号、第2の蛍光検出器4からの蛍光の検出信号、及び上記前方散乱光検出器からの前方散乱光の検出信号は演算装置6に入力される。
環境水中に含まれる主な夾雑物は藻類であり、この粒子のFL3強度は大きく、FL1強度は小さいため、藻類は主に図中のB内に分布することになる。一方、蛍光標識された検出対象微生物ではFL1強度が大きくなり、FL3強度は小さいため、図中のA(斜線枠)内に分布すると考えられ、かかる領域Aをこの2次元ドットプロットにおける検出対象微生物存在領域として設定できる。
実施例1
本実施例においては、実際の河川水にクリプトスポリジウム(Waterborne社製、クリプトスポリジウムパルバムオーシスト)を添加し、FITC標識された抗クリプトスポリジウム抗体(EasyStainC+G、和光純薬)を加え、フローサイトメータ(FACS Calibur、ベクトンディッキンソン社製)で被測定試料中の粒子を測定することを目的として、以下のような一連の操作を実施した。
フローサイトメータとして上記FACS Caliburを用いる場合、上記光照射装置2の光源はアルゴンレーザー(488nm)を用いることにより、FSC(前方散乱光)、SSC(側方散乱光)、FL1(530±15nm)、FL2(585±21nm)、FL3(650nm以上)に分光されて、対応する光検出器で光信号が検出される。
本実施例では、図1について説明した装置と同様の装置を用いた。第1の蛍光検出器3でFL1を測定し、第2の蛍光検出器4でFL3を測定し、前方散乱光検出器5でFSCを測定した測定結果を用い、これらの測定値(検出値)を上記演算装置6に入力した。
また、上記FSC(前方散乱光)は粒子の粒径に相当するため、あらかじめクリプトスポリジウムを測定することで、クリプトスポリジウムの粒径に相当するFSC強度を把握することができる。
上記各2次元ドットプロットでクリプトスポリジウム存在領域D(図中の枠内)を設定した。図6及び図7は各2次元ドットプロット内で設定したクリプトスポリジウム存在領域Dに分布する粒子の中で、図4及び図5の両方の2次元ドットプロット内に設定したクリプトスポリジウム存在領域Dに分布する粒子のみを抽出した2次元ドットプロットである。
2 光照射装置
3 第1の蛍光検出器
4 第2の蛍光検出器
5 前方散乱光検出器
6 演算装置
7 フォーカスレンズ
8 ダイクロミックミラー
9 バンドパスフィルター
10 ローパスフィルター
11 フォーカスレンズ
Claims (4)
- 検出対象微生物を特異的に認識し、蛍光物質が結合した標識抗体による抗原抗体反応を用いて、試料に含まれる粒子の蛍光強度から該検出対象微生物を検出する微生物検出方法であって、上記粒子の前方散乱光強度並びに上記標識抗体による蛍光強度及び夾雑物に特有の蛍光強度とを測定し、測定した光学的情報に基づき、上記標識抗体が上記夾雑物に非特異結合した擬陽性を示す粒子を排除して検出対象微生物のみを検出し、該検出対象微生物を計数することを特徴とする微生物検出方法。
- 検出対象微生物を、藻類のクロロフィルの蛍光波長と異なる蛍光波長を持つ蛍光物質が結合しかつ上記検出対象微生物を特異的に認識する標識抗体で標識し、標識された上記検出対象微生物を含む試料中の粒子について、上記蛍光物質に対する励起光を照射して発する蛍光の強度と、藻類のクロロフィルを励起する光を照射して発する蛍光の強度と、粒子の散乱光強度とを同時に測定するステップと、
上記粒子の蛍光物質に対する励起光を照射して発する蛍光の強度と藻類のクロロフィルを励起する光を照射して発する蛍光の強度とによるドットプロット、及び上記粒子の蛍光物質に対する励起光を照射して発する蛍光の強度と前方散乱光強度のドットプロットを作成するステップと、
上記2つのドットプロット内に予め設定した検出対象微生物存在領域の範囲に分布する粒子を比較し、検出対象微生物の検出と該微生物の個数を計数するステップとを少なくとも実行することを特徴とする微生物検出方法。 - 上記粒子の上記蛍光物質に対する励起光を照射して発する蛍光の強度と藻類のクロロフィルを励起する光を照射して発する蛍光の強度によるドットプロット内に予め設定した検出対象微生物存在領域に分布する粒子が、上記粒子の蛍光物質に対する励起光を照射して発する蛍光の強度と前方散乱光強度のドットプロット内に設定した検出対象微生物存在領域にも分布するとき、その粒子を検出対象微生物として検出し、該微生物の個数を計数することを特徴とする請求項2に記載の微生物検出方法。
- 検出対象微生物を特異的に認識し、蛍光物質が結合した標識抗体による抗原抗体反応を用いて粒子の蛍光強度から該検出対象微生物を検出するように構成された微生物検出装置において、上記検出対象微生物が含まれる試料に上記標識抗体に蛍光物質を励起する光を照射する光照射装置と、上記被測定試料中の蛍光物質が発する蛍光を測定する第1の蛍光検出器と、上記光照射装置から照射された光から上記試料中の夾雑物のクロロフィルを励起する波長の蛍光を測定する第2の蛍光検出器と、上記光照射装置から照射された光から被測定試料中の粒子の散乱光を測定する散乱光検出器と、上記各検出器で測定した光学的情報に基づき、上記標識抗体が上記環境水中の夾雑物に非特異結合した擬陽性を示す粒子を排除して検出対象微生物のみを検出し、該検出対象微生物を計数する演算手段とを備えることを特徴とする微生物検出装置。
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2006
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