JPH0231892A - 好気性活性汚泥型の排水処理工程の制御法 - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 腫東上の利用分野 本発明は、生物学的な排水処理工程を制御しかつＮ景な
代謝％性を有する細菌を分離する方法に関する。

従来の技術 水質調製並びに産業や工場からの排水及び家庭排水の除
去は排水処理装置もしくは排水処理場で行なわれ、最近
の装置は殆んどが機械的、生物学的及び化学的排水処理
工程を備えており、その際に調節回路によるプロセスの
自動制御は極めてｘ喪な役割を担っている。

生物学的分解の際に、つまり生物学的排水処理工程では
微生物（細菌、原生動物、場合により糸状菌及び酵母）
の混合個体群より成り、その組成が栄養素の供給の方法
及び環境条件（温度、−値、浸透圧等）により決定され
る新開活性汚泥が核当する。

排水処理装置の好気的浄化工程の機能のベースとなる活
性汚泥は高度に特異化された微生物の複合物であり、そ
の際に該複合物の各有機体は排水成分を分解する際に固
有の役割を果しかつ活性タンク中でのその出現は排水組
成及び活性タンク中の物理的及び化学的条件、例えば酸
度、温度及び酸素分圧により条件付けられる。

従って、生物学的排水処理工程における排水浄化はバイ
オテクノロジープロセスであり、それ敏活性タンクの生
物学及び微生物学的な作用の可能性についての広い知識
が排水浄化の改良及び制御のためのＮ要な前提となる。

既に例えば生物学的汚泥実験のために実施さ第１２巻、
１２６２〜１２６９頁（１９８６年）；Ｈ，５ｅｉｌｅ
ｒ及びその他共著、’Ｚ、　ｆ、　Ｗａｓｓｅｒ−Ａｂ
ｗａｅｓｅｒ−Ｆｏｒｓｃｈ、　″、第１７巻、１２７
〜１３６頁（１９８４年）参蕉〕は、汚泥フロックの殆
んどの細菌を迅速かつ確笑に定性的及び定量的に検出す
るには十分ではない。培地平版へ移すこと全ベースとす
る定量法（Ｑｕａｎｔｉｆｉｚｉｓｒｕｎｇ−ｍｅｔｈ
ｏｄｅ　）には高い誤差が伴ない、半定量（Ｓｅｍ１−
ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　）と表わされる。それ故、
別法として免疫螢光法をベースとする方法が開発され、
例えばＢ、Ｂ、ウオード（Ｗａｒｄ　）及びＭ。

Ｊ、ベリー（Ｆｅｒｒｙ　）　（’Ａｐｐ１．　Ｅｎｖ
ｉｒｏｎ。

Ｍ１０ｒＯｂ１０’１．’、６９巻、９１３〜９１８頁
（１９８０年）〕は海水中のアンモニアを酸化する菌で
あるニトロソコックス・オセアヌス（Ｎ１ｔｒｏｓｏｃ
ｏｃｃｕｓ　ｏｏｅａｎｕａ　）を免疫螢光法により測
定することを記載している。Ｂ、Ｂ、ポーロール（Ｂｏ
ｈｌｏｏｌ　）及び１．Ｉ、、シュミット（８ｃｈｍ１
ｄｔ　）　（’　５ｃｉｅｎｃｅ　’　　第１６２巻、
１０１２〜１０１４頁（１９６８年）〕は、土壌試料の
免疫螢光法による実験を記載している。

数時間で排水浄化に重要な細菌を測定する（従来は数週
間必要であった）ことに成功したときに初め【、有機体
の動的成長挙動及びその意義についての法外な知識の拡
大がもたらされるばかりでなく、これによって衝しい微
生物学的な調節の尺度が見出されることになり、この尺
度によって排水処理装置従事者は活性タンクの浄化力を
一定に保持しあるいは改良することができるはずである
。また、特にプラスの効藁をもたらす微生物を見出すこ
ともでき、これを活性タンクの外で純培養で増殖しかつ
タンクに再び戻すことができる。

発明が解決しようとする課題 それ故、本発明の課題は、微生物の迅速かつ確実な測定
及びそれと共に排水処理装置の調節を可能にする、生物
学的排水処理装置の制御法を開示することである。

課題を解決するための手段 本発明の目的は、好気性活性汚泥型の生物学的排水処理
工程を制御する方法であり、これは活性汚泥中に最も頻
繁に出現する微生物１種又は数ａ［ヲその蓋について継
続的に監視する際に、活性汚泥及び／又は活性汚泥タン
クの入口からの典型的な試料中で、該微生物を、この選
択した微生物に対する螢光標識抗体に結合させるか又は
該微生物の特異的な代紺能力によりフルオロダン基質を
変換させ、このようにして螢光積繊した微生物のｔｔ−
フローサイトメトリーにより測定しかつそれと同時に、
存在する微生物の全’Ｊｌを散乱光により及び／又はＤ
ＮＡ染色により測定し、かつこのようにして得られた測
定値に相応して特定の微生物１種又は数種の量及び／又
は該微生物の成長条件を調節することにより微生物の量
を監視することを特徴とする。

この方法の実施形は特許請求の範囲の請求項２〜７に記
載されている。

選択した微生物に対する抗体の製造及び結合は、免疫螢
光法で一般的であるように公知方法で実施することがで
きる（　Ｒｏｅｍｐｐ著、’　Ｃｈｅｍｉｅ　Ｌｅｘｉ
ｋｏｎ　’　　第８版、１８４４頁；Ｂ・Ｂ、　Ｗａｒ
ｃＬ及びＭ、Ｊ、　Ｆｅｒｒｙ共著、前記文献参照〕。

特異的な、即ち１つの特定の微生物に固有の代鮒能力を
標識するためのフルオロデン基質、例えばフルオレセイ
ンジアセテート（エステラーゼ指示薬）、フルオレセイ
ン−ベーターゲルコロニド（Ｌコリに特異的なグルコロ
ニダーゼの指示薬ン、フルオレセインーベーターガラク
トシＹ（ガラクトシダーゼの指示薬）は市販されている
が、公知方法で合成することもできる。

例、ｔば、フルオレセインジアセテートの分解は細菌中
でのエステラーゼの発生を特徴付け、フルオレセインー
ベーターグルコロニｒはＥ。

コリ中のグルコロニダーゼの特異的検出である。

一般に、非螢光性基質からは酵素的分解により螢光生成
物が遊離する（例えばフルオレセイン、テキサスレツｒ
等）。このような反応により、ａｉｓＯ群及びａｌを特
定することができかつ１螢光活性化細胞分類（ｆｌｕｏ
ｒｅｓｃｅｎｃｅ　ａｃｔｉｖａｔｅｄｃｅｌｌθｏｒ
ｔｉｎｇ　）　’による分離も可能である。

本発明により、このようなフルオロダン基質により細胞
内代謝能力を展開することができ、かつフローサイトメ
トリー又は顕微説像分析たより定量することができる。

フローサイトメトリー（レーデ励起、Ｈｇ−又はＸθク
ランプ起、Ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、　ＦＣＭ　）
は一般に知られており、かつすべての種類の細胞の分析
にしばしば使われる方法であり、その際にＤＮＡ　、　
ＲＮＡ及び蛋白貴含倉、免疫螢光、細胞の大きさ及び細
胞の形状のようないくつかのパラメータを同時に測定す
ることができる〔例えば’　Ｂｉｏ／Ｔｅａｈｎｏｌｏ
ｇｙ　’　　第６巻、３３７〜６５６頁（１９８５年）
　；　Ｏｒｐｅｇｅｎ　ｍａｃＬｉｚｉｎｉｓｃｈ−Ｉ
ｎ０１ｅｋｕｌａｒｂ１０１．０ｇ１８＋’６）１ｅ　
　Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈ−ａｆｔ　
ｍｂＨ（ハイデルベルク在）の会社説明書’　Ｚｙｔｏ
ｍｅｔｒｉｅ　’　；装置の構成に関しては５ｋａｔｒ
ｏｎＡ／８の会社説Ｆ９４１ｉＦ１Ｎ　−３４０１Ｌｉ
ｅｒ　：Ｉ。それ故、本発明による方法に適用するため
の方法上及び装置上の実施形の選択は、特に試験すべき
特異的試料及び試料の準備、微生物の種類等により決定
する。

フローサイトメトリーの準備に当り、まず初めに試料か
ら測定結果に影響を与える例えば磯類及び他の成分のよ
うな妨害的な随伴物質金除去し、そのために好適な方法
で前処理する。試料の前調製に当り細菌をばらばらにし
、その後有利には遠心処理により洗い、かつアルコール
中で固定する。細菌をリポ核酸の加水分層処理に（デオ
キシリポ核酸の取得下）もたらしく例えばアルカリ性７
０％アルコールで処理）、その後非特異的抗体結合部位
を飽和しく例えばアルカリ性加水分屏した２％ゼラチン
中に移す）、抗血清を添加しかつ作用させる。細菌を例
えば遠心処理により洗い、かつ螢光標識した抗体（殊に
豚−抗−ウサギ抗体抗体）と恒温保持する。

代鮪能のｇｋ光像眞に当り、初めに試料をばらばらにし
、その後で固定しないで、直接フルオロデン基質と恒温
保持する。再度洗った後でデオキシリボ核酸を螢光色素
（例えばプロビジウムヨジド）で鳥色する。その後で、
レー＋ｊ′フローサイトメータ（例えば０ｒｔｈｏ　Ｄ
ｉａｇｎｏａｔｉｃｓｏｄｅｒ　Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃ
ｋｉｎｅｏｎ、　Ｃｏｕｌｔｅｒ　ｏｄｅｒ　Ｂｒｕｋ
ａｒ−Ｏｄａｍ社〕又は例えは水銀蒸気灯フローサイト
メータ（例えば５ｋａｔｒｏｎ社〕中で測定する。

従って、本発明方法により活性汚泥系による生物学的排
水処理装置の新しい制御法が開示され、この方法では制
御を槌々のｖｊ専倣生物（Ｌｓｉｔｏｒｇａｎｉｓ　ｍ
：ｕ８　）の定’に測定により行ない、その際に測定値
に相応して非常に少ない量で存在する微生物では相応し
て添加し、またはこの微生物の成長条件を改良するかも
しくは両方の手段を同時に適用する。

有利に排水処理装置への流入口の細菌かつまた活性汚泥
タンクからの細菌を測定するフローサイトメータ中で、
有用な定量のためには誘導微生物と共に微生物の全１ｔ
ｔ−も−緒に測定する。

これは、光の散乱−これは微生物以外に他の微粒子も検
出するので、場合によっては経賑的に決定した補正係数
を考慮すべきである−又は微生物のＤＮＡ染色により同
時に行ない、そうすることによって両方の色信号が同時
に測定される。

散乱光の測定及びＤＩＪＡ染色を平行して行なうと有利
である。それというのもｎ１度を更に高めることができ
るからである。

特に、成長条件のｐｔｉｉ！ｒＩ又は改良は、例えば栄
養素の供給、−値及び／又は温度を相応して調節するこ
とにより行なうことができ、場合によっては他の調節の
可能性を包含してもよい。栄養素の供給量が非常に少な
い場合には、例えは屠殺場の屑、血液廃物等、又は人造
肥料のような廉価な蛋白質源を添加することにより高め
ることができる。

…値の制御は、…値を変えるための公知方法、例えば好
適な酸又は塩基の添加により行なうことができる。通常
の状況下ではたいていの場合温度上昇が該当する温度調
節は通気に使われる圧扁ガスの温度を介して行なう。

排水処理装置を制御するのに特にｈａかつ好謀 適な細菌としては、Ｉ題別に整理すると次のものが挙げ
られる：型０２１Ｎ、０９６１及び１８５２、スフエロ
チルス・ナタンス （５ｐｈａｅｒｏｔｉｌｕａ　ｎａｔａｎｓ　）　、シ
ーグレアΦスペック（Ｚｏｏｇｌ’ｃｉａ　５ｐｅｃ、
　）、プソイドモナス・オリジハピタンス（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ　ｏｒｙｚｉｈａｂｉｔａｎｓ入アシネト
ｌ々クターｅカルコアセチクス（Ａｃ１ｎｅｔｏｂａｃ
ｔｅｒ　ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｓ　）の分離片（工５
ｏｌａｔθ）；ニトロンモナス−スペック（Ｎｉｔｒｏ
ｓｏｍｏｎａｓ　５ｐｅｃ、　）　、ニトロバクタ−ス
ペック（Ｎ１ｔｒｏｂａｃｔｅｒ　５ｐｅｃ、　）　；
アエロモナスーヒドロフイラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｈ
ｙｄｒｏｐｈｉ’ｌａ　）、アシネートバクター・カル
コアセチフス（Ａａｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｃａｌａ
ｏａａｅｔｉｃｕａ　）　；アシネトバクタ−・スペッ
ク（Ａｃ１ｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　５ｐｅｃ、）、プン
イｒ七ナス拳エルギノーサ（Ｐｓ・ｕｄｏＩＤｏΩａ８
ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　）　、プソイドモナス・フルオ
レセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃ
ｅｎｓ　）及びプソイドそナス・プチダ（Ｐｇｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　）、アルトロバクター−ス
ペック（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒａｐｓｅ、）、ロド
コツクス・スペック（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　５ｐｅ
ｃ、　）　；サルモネラ・スペック（Ｓａｌｍｏｎｓｌ
：Ｌａ　５ｐｅｃ、　）　、パスツレラ会スペック（Ｐ
ａ５ｔｅｕｒｅｌｌａ　５ｐｅｃ、　）　、シデラ・フ
レクスネリ（８ｈｉｇｅｌｌａ　ｆｌｅｘｎｓｒｉ　）
　、プソイドモナス・エルギノーザ（Ｐｓｓｕｄｏｍｏ
ｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、エシエリキア・コリ
（１ｃｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　）、アエロモ
ナス・ヒドロフイ２（Ａθｒｏｍｏｎａｓｂ７ｄｒｏｐ
ｈｉ’ｌａ　）　、クレブシェラφプノイモニエ（Ｋ１
ｅ’ｂｇｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　）　、プ
ソイドモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ａ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）。

特定の細菌を特定の課題区分、例えば影化汚泥の形成、
アンモニアの硝酸への酸化、リン酸の除去、分解困難な
物質（例えば芳香族物質、ハロゲン化炭化水素、脂肪族
物質、洗剤）の代置、人及び動物の病＃菌の除去、排水
の水質及び由来の判定に関連させて分類することができ
、各々の問題全調節するａ菌の好適な選択によりこれら
の問題、例えば脱リン酸及び硝化作用の制御が可能であ
る。例えば、分解を誘発する相応する微生物を配量する
か又はそれらの成長条件を変化させることにより脱リン
酸及び／又は硝化作用音別々に制御しかつ調節すること
ができる。更に、フルオロデンＭ’ＪＩ介して、特定の
代謝能を有する細菌を標識しかつゝ螢光活性化細胞分類
“により分離する。それ故、経費のかかるスクリーニン
グ法及び選択法を適用せずに例えば分解の困難な基ＪＸ
を代置する一定の分解スペシャリストに分離することが
でき、排水処理装置の外で培養して、活性汚泥タンクに
貴び施用することができる。

夾施例 次に、本発明を１つの排水処理装置を例にとって詳説す
るが、これに限定されるものではない。

細菌の動的な成長挙動を明らかにできるように、排水処
理装置の細菌群集を分析するために、初めに該当する微
生物、つまり排水の有機物の汚れを分解する細菌の分離
及び特徴付けを従来の微生物学的方法で行なう。

次の表１に、１９８６年１０月から１９８７年７月まで
の期間に試験排水処理装置の群集から純粋な形状で分離
しかつ同定した菌株を記載する。

表１から、この排水処理装置中に多数の菌株が存在する
ことが認められる。それ故、排水処理装置の動的状態を
記載するためには、数種の重要な誘導菌に限定する必要
がある。誘導有機体を判別するためには、常法で細菌主
要群の半定量測定を行ないかつ６糧の有機体全下水道、
前排水処理装置及び活性タンク中のそれらの成長挙動に
基いて選択した（第１図）。

主に、常法で行なう混合物中の細菌の定電測定は平板法
をベースとしく　Ｍ、・Ｂａｕｍａｎｎ及びＨ０Ｌｅｍ
ｍｅｒ共著、前記文献参照）、この方法では細菌をペト
リ皿の培９＃寒天面上に塗抹し、この寒天上で成長させ
、その後菌数計測しかつ分離する。細菌主要群の改良分
析法（ＰＩｒ鯖スメスタンプ法ｓｔ＠ｍｐｅ１ｍｅｔｈ
ｏｄｅ　）では、排水処理汚泥細菌を初めにホモｒナイ
ず一中で剪断力の適用によりばらばらにし、その後で寒
天上に平板散布する。材料ヲ、寒天上で十分に個別化さ
れたコロニーが成長するように稀釈し、そのコロニーを
スタンプで寒天から選択培地を有する耕しい平板上に移
す。この選択培地は、特定の属によってだけ許容される
程々の阻害物質を含有する（　Ｈ，５ｅｉｆｅｒ及びそ
の他共著、前記文献参照）。

更に、呈色試薬が含まれており、その呈色が細菌の特別
な代謝生理学的能力を示す。スタンプ転移であるので、
個々のコロニーヲ出発平板に逆のほって予測することか
できる。それぞれの細菌に関して阻害物質耐性、代謝生
理学的能力及び特徴的な酵素の含量についての情報が得
られる。この情報に基づいて、出発平板上の各コロニー
を次の群類の１つに分類することができる：１．好気性
排水処理区域中のミクロコックス属、アシトバクタ属及
びロドコックス属、好気性区域及び下水道中のスタフイ
ロコックス属及びストレプトコックス属を包含するダラ
ム陽性菌；２．エンテロバクテリアセエ （Ｋｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａａ　：腸内細菌
）及びアシネトバクタ（Ａｃ１ｎｅｔｏｂａａｔｅｒ　
）　；　３．　　ゾンイドモナセエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｃｅａｅ　）及びモラクセラ（ＭｏｒａＸ８１１ａ
　）　；アｚ　ｏ　モナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　）。

前記の方法は排水分析用であるが、重大な欠点を伴なう
：均質化物中の顕微鏡下に勘定した細菌の１０〜２０％
だけが平板培地上で成長するに過ぎない。生体色素ロー
ダミン１２６を用いる実験では、９０％以上の細菌が顕
微説標本中で生存しかつ代謝活性であることが明らかで
ある。寒天平板上のこの不良な培養効呂は、すべての細
菌が、排水液状媒体から固体寒天面上に移行させる際に
損なわれずに生存するわけではないことに帰因する。一
般に寒天上では硝化側ｌは成長しない。つまり、このス
タンプ法により測定した出現尾は必ず１０１の誤差を伴
なうはずであることを示す。それ故、１＠舎平板の転移
に基づくすべての定曾法は半定量的であると記載される
。

ａ）免役螢光により浪合物中の細菌を特異的に標識し、
それによって個々の細菌を蛍光顕微読下に定性的に、像
分析系によって定量的にも、フローサイトメータで定量
的に検出することができる。

免疫螢光により測定するに当り、検出すべき菌株に対す
る特異的抗体を製造しかつ螢光色素に結合させる。細菌
混合培地をこの抗体と共に恒温保持した後で、相応する
細菌だけが螢光着色しかつ螢光顕微鏡）に検出すること
ができる。

この方法に必要なポリクロナール又はモノクロナール抗
体の製造は公知方法で行なうので、これ以上畦脱する必
要はない。原理的には純培養からの細菌を殺し、実験動
物（′ｇウサギ又はマウス）中に注入しかつこの動物か
ら抗血ｆｆｋ取得するかもしくは１３　＋７ンパｌｋ率
離し、ハイプリドーマ法に適用する。

ハイプリげ一マ法によるモノクロナール抗体の製造は抗
血清の取得よりもはるかに経費がかかるが、２つの決定
的な利点を有する＝１．家ウサギからは限定量の抗血清
しか得られないが、３１７７１球は抗体を無制限に製造
するように励起され得る。２．実験動物が出生直後に既
に皮膚、腸及び飲料水の細菌に対して免疫応答を形成し
かつまさにこれらの細菌が多量に排水中に発生する。こ
れは排水処理汚泥実験でこれらの細菌の不所望な標滅付
けに案内する。モノクロナール抗体ではこの問題はない
。

ｂ）免疫螢光的に漕色された活性汚泥試料を螢光順微蜘
下に分析 Ｂ、Ｂ、ボーロール（Ｂｏｈｌｏｏｌ　）及びＥ、Ｌ、
シュミ　　ッ　　ト　　（Ｓｃｈｍｉｔ　　　）　　　
Ｌ　　’５ｃｉｅｎｃｅ’　　　　　　１　　６　　２
　　％　、１０１２〜１０１４頁（１９６８年）〕の方
法により操作した。リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　
；　ｇ索固定に］ｋ矢な細菌）に対して蛍光発色する抗
体を用いて、前記看者らは土横臥料中の土壌細菌を特異
的に検出した。その除に、Ｐ＃篭的に常電した土壌粒子
への抗体の非特異的粘合は、アルカリ性加水分解したゼ
ラチンを用いて予め恒温保持することにより抑制した。

この方法を活性汚泥試料に転相した。抗体は、１株のア
シネトバクタ及びアエロモナスの殺した＃Ｊ困を夾販用
尿り？イ中に静脈内狂人することによりその血清から得
られた。活性汚泥試料を載せガラス上に載置し、６０℃
で乾燥させ、その後９６％エタノールで固定した。この
標本にアルカリ性加水分解したゼラチンのフィルムを九
し、抗体をその上に載せ、洗浄し、その後でＸウサイ免
役グロブリンに対する豚からの螢光標識した抗体を顔面
した、家つサキ゛抗体に結合したナベての細菌はこのよ
うにして螢光標識された。

このようにして種々の活性汚泥試料及び排水試料中でア
シネトバクタ及びアエロモナスを検出することができか
つその出現ｍｋ評１曲することができた。

Ｃ）免役螢光及びＤＮＡ染色で慄鑓した活性汚泥ａｌｌ
−７０−ブイトメトリーにより分析 螢光検線に比べて７０−ナイトメトリーの決定的な利点
として、例えば宵色の光励起の際に緑色の免役螢光信号
に加えて、赤色のＤＮＡ螢光及び細菌の光散乱も測定し
得ることであることが明らかになった。

第２図は、一方は家ウサギの零血清を用いて及び一方は
死んでｂる菌株細胞の注入後の血清で染色した純粋なア
シネトバクタ菌の混合物に関する測定結果を示す。２つ
の出現元分布が得られ、これらを螢光細菌と非螢光細菌
とに分類することができる。線菌のＤＮＡ含量は、フロ
ーサイトメトリーにより、予測されたように等しいと認
められる。この測定は螢光顕微説下の画像に一致する。

試料のｖ４ｍは、フローサイトメトリー用の細菌試料を
用意するために次の順序で行なった＝１、細菌をダウン
ス（Ｄｏｕｎｃｅ　）ホモｒナイデで個別化し、遠心処
理により洗いかつ７０％アルコール中で固定する。

１１／２時間 ２、その後で細凶ヲアルカリ性７０％アルコール中に移
して、リボ核酸を加水分解する。

１１／２時間 ３、細−を遠心処理により洗浄しかつアルカリ性加水分
解した２％ゼラチン中に移して、非特異的抗体結合部位
全遮断する。

１１／２時間 ４、抗血清を加えかつ４５分間作粗させる。

１時間 ＳＪｕ凶全遠心処理により洗浄しかつ螢光標識した豚−
抗原ウサキ”抗体−抗体と共に１５分間恒温保持する。

６０分間 ン ３、細菌を洗いかつデフキシリボ核酸を螢光色素（例え
ばプロビジウムヨジド）で染色ｆる。

６０分間 Ｚレーで・７０−サイトメータかもしくは水鍜灯−又は
キセノン灯フローサイトメータ中で測定する。

第６図は零血渭及び抗血清で染色したアエロモナス純培
養からの混合物の出現も分布を示す。

アエロモナスｍｒクロラムフェニコールで処理したので
、−倍及び二倍のＤＮＡ＠を並びに免役螢光を有するか
ないしは有していない４他の個体群が認められた。緑色
の免疫螢光及び赤色のＤＮＡ螢光の濃度ｉＹ軸もしくは
Ｘ軸上にプロットした、各々の点が測定された細菌に相
当する。

更に、細胞を抗生物質のクロラムフェニコールで処理す
ることにより、−倍及び二倍のＤＮＡ含量の７エロモナ
スーだけが出現するように設定した。この測定法により
、−倍及び二倍のＤＮＡ含量並びに免疫螢光を有するか
もしくは有していないこれらの細菌並個体！＃全区別で
きることが判明する。

第４Ａ図及び第４Ｂ図は、前排水処理夕／り中のアエロ
モナス園ヲフローサイトメトリーにより測定した因であ
る。細菌出現墓は緑色の免役螢光（Ｙ軸）及び赤色のＤ
ＮＡ螢光（Ｘ軸）に対してプロットした。第４Ａ図では
細菌混合物を苓血清で染色しかつ第４Ｂ図では特異的な
アエロモナス抗体で染色した。

従って、排水試料からの７エロモナス凶の定量は明らか
である。免疫螢光によりアエロモナス菌は第４Ｂにおい
て限定された測定範囲で出現しかつ定量することができ
る。

第５Ａ図、第５Ｂ図、第５Ｃ図、第５Ｄ図はサブトラク
ション法（５ｕｂｔｒａｋｔｉｏｎｓｖｅｒｆａｈｒｅ
ｎ）による＠排水中のアエロモナス菌の定量を示す。

ＤＮＡ含蓋が７エロモナス醒含意に相当する細菌だけを
とらえている赤色螢光区域中の免役螢光の強さに対する
２つの細菌出現率分布を示す。

白地曲線は零血清で標識した前排水試料及び黒地曲線は
アエロモナス抗血清で標識した前排水試料を表わす。サ
ブトラクションにより純アエロモナス園の分布及び全個
体群に対するその割合４３％が得られる。第５Ｄ図には
アエロモナス抗血清の測定による結果が図示されている
。

螢光顕微鏡下では活性汚泥中に１つの細菌がｋｌＧされ
、これはその特徴的な抗体結合により極及び真中で認め
られる。この菌株は活性タンクに限定されかつその抗血
清は活性汚泥の他の１株とは極く僅かに交叉反応するに
過ぎない。

従来、この微生物１ｋＩＷＪ定することに成功しておら
す、Ｋ３と名付けられた。

第６囚は活性汚泥中のｍ園に３の測定及び混合物からの
該細菌の分類を示す。第６Ａ図及び第６Ｂ図に符号３及
び４で区分された区域は、Ｋ３に特徴的である測定区域
の境界を示す。これらの区域からの細菌を分類選別し、
再度第６Ｃ図及び第６Ｄ図で測定した。抗血＆／活性汚
泥試料の測定により第６Ａ図及び第６Ｂ図に図示した分
布パターンが得られる。９０°紋乱光に対する免疫螢光
及びＤＮＡ含量に対して同時に測定を行なう際に、この
細菌は厳密な測定区域だけに出現しかつこの場合にはサ
ブトラクションせずに定量することができる。付加的に
、細胞分類機（′螢光活性化細胞分類：　ｆｌｕｏｒｅ
ａｃθｎｃｅａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔ
ｉｎｇ’　）　ｆ用いてこの測定区域から細菌を分類選
別し、再びティトメータで測定する。第６Ｃ図及び第６
Ｄに図示されているように、単一の軸重個体群が明らか
である。

ｄ）代謝生理能力（エステラーゼ活性）をフローサイト
メトリーにより測定 ストレプトコックス・７エカリス （５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｓｃａｌｉｓ　：
表１参照ン細菌からの純培養物を個別化し、洗浄し、そ
の後でフルオロダン基質のカルボキシフルオレセインジ
アセテートと一緒に１５分間恒温保持した。

細胞全遠心処理により洗いかつ色素のプロピジウムヨジ
−で染色した後で細菌をフロー丈イトメータで測定した
（第７図）。粒子の２４．９％が生きているストレプト
コックス凶であることが明らかであり、この菌は非螢光
性カルボキシフルオレセインジアセテートの分解後に緑
色の螢光生成物フルオレセインが細胞内に蓄積するが、
ＤＮＡ色素のプロビジウムヨジド全排除するので赤色螢
光を示さない。細−の５．１％は赤色螢光を示し、つま
り死んでおり、４．０％は生きている細胞と死んでいる
細胞とからのダブレットであり、かつ粒子の６６．６％
は細菌ではなく、ストレプトコックスにより培地中で沈
殿した炭水化物ポリマーであると思われる。

この方法により、活性汚泥及び活性タンク中への流入口
からの試料において、死んでいる細菌及びエステラーゼ
含有の生きている細菌、散乱光を介してエステラーゼ不
含の生きている細菌並びに細菌ではない粒子を相互に区
別しかつ定量することができる。

ｅ）季節に応じた排水処理装置細菌の検出１９８６年１
０月から１９８７年７月まで毎週活性汚泥試料を採取し
かつ一７０℃でグリセリン中で凍結させた。該試料全融
解しかつアエロそナス菌をスタンプ法及び本発明により
フローサイトメトリーによ、り定量した。殆んどの場合
は両方の試験法の間の結果は一致した。誤差は前記のス
タンプ法の不正確さにより説明することができる。第８
図は季節の変化に応じたアエロモナス菌の出現率及び汚
泥容量を示す。アエロモナス菌は冬期にはほぼ完全に活
性タンクから消失していることが認められる。この時期
の前排水試料を測定しても同じ所見が得られる。

活性タンクに特異的な細菌に６も冬期には活性タンクか
ら消失する（第９Ａ図〜第９Ｇ図参照、これらの図面は
季節の変化における細ｍＫ３のフローサイトメトリーに
よる測定を示す）。排水処理装置中では該当する月々で
作動パラメータが激しく変化する。硝化作用の９０％か
ら１０〜２０％への低下と共に糸状菌の０２１Ｎは１２
月の中旬に大量に発生し、膨化汚泥の問題をひき起す。

史に、１月中旬から６月中旬まで他の糸状菌０９６１型
、１８５２型及びスフエロチルス礫ナタンスが発生する
。０２１Ｎ＆！そのまま残っている。０２１Ｎが６月及
び７月に２週間消失するのは興味深い（第１０図参照、
容量を示す）。排水処理装置の強い水力学的負荷及び相
応するＢＳＢ　９度の低下が先行した。平行してアエロ
モナス薗の増殖及び顕微鏡的評価により原生動物の増殖
が観察された。約２週間後に０２１Ｎが得び強く発生し
、その際にアエロモナス函の低下が先行した。これらの
測定は、排水処理装置の生物学的変化が広く展開しかつ
既に下水道でも起こっていることを示唆する。

アエロモナスのような急速に成長する細菌は、非常に早
い時期Ｋ例えば膨化汚泥問題を予知するのに好適である
。フローサイトメトリーを適用する場合にだけ迅速に定
量することができ、これによって排水処理装置の調節に
おいて活性汚泥の疲労を回避するための鉄塩の添加又は
膨化汚泥の原因となる０２１Ｎ型のような微生物を抑制
するための肥料の添加のような対抗手段を講じることが
できる。

これが、どのようにしてフローサイトメトリー法により
得られた知Ｒｔ−排水処理装置の生態学に適用しかつ指
標細菌の足ｆ″ｆ：排水処理装置の制御に適用し得るか
の最初の例である。

更に、活性タンク中の大部分の細菌はタンク中ではなく
て、下水道中で成長し、活性タンク中に流入するという
ことを知ったことはｉ安である。従って、細菌は排水を
前消化し、それ故基質の供給を介し工活性夕／り中の微
生物学的挙動に作用を及ばずことができる（累１図も参
照）。

知られていて重要なこのための例は生物学的脱リン酸で
ある。流入する廃水がアエロモナスにより十分に前醗酵
される場合にだけ、活性タンク中でアシネトバクタによ
りリン酸塩摂取が行なわれる（　Ｋ、　Ｂｒｏｄｉｓｃ
ｈ著、’　Ｇｗｆ−Ｗａｓｓｅｒ−Ａｂｖｒａｓｓｅｒ
’　　ｊ　２６巻、２３７〜２４００（１９８５年）〕
。フローサイトメトリーによるアエロモナスの定量はこ
の方法のｉＡ′＠に利用し得る。

ｆ）硝化細菌の定値 硝化細菌は、固体培地上に塗抹することができずかつ液
体の特別培地中でだけ１０〜２４時間の倍加時−１で成
長する（例えばアエロモナスの倍加時間は２０分間であ
る）ので、生物学的には検出し難い群である。このよう
な困難のために、排水処理装置法に重要なこれらの有機
体を通常の微生物学的方法で定量することは不可能であ
る。

この場合にも本発明方法により定ｉｔ介してｌＡ節する
ことができる。それぞれ２つの菌株に分離し、そのうち
の一方がアンモニアを亜硝酸に１かつ他方が亜硝酸を硝
酸に酸化する。これらの細菌に対する抗体の製造により
該微生物を排水処理装置中で観察することができる。

ｇ）表１に掲載されているような指標細菌の本発明によ
る測定を介する制御 １、　　ｋ化汚泥の回避 顕微鏡儂分析又はフローサイトメトリーにより免疫螢光
を介して、膨化汚泥の原因となる０２１Ｎ型、０９６１
型及び１８５２型並びに２７エロチルス・ナタンスのよ
うな細菌を定量することができ、それらの成長挙動にお
りて記載することができ、かつ＊素供給量の低下、フロ
ックビルグーの施用等のような細＠全撲滅するだめの手
段を導入することができる。

正常なフロック構造ｔ−酵発するシーグレア・スペック
（Ｚｏｏｇ１６ａ　８ｐｉｉｌＯ，）　、プソイドモナ
ス”オリジハピタンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｏｒ
ｙｚｉｈａｂｉｔａｎｓ）並びにアシネトバクタ及びア
ルトロバクタ・スペックの一定の分離片のような細菌に
ついても同様にその成長ｔ−観観察かつそれらを維持す
るための手段、゛特に施用又は接種材料の添加を導入す
ることができる。

活性タンク中への流入口の分析を介して指標細菌、例え
ばアエロモナス（家庭排水の指標、前記参照）、シンイ
ドモナス・フルオレセンス（化学的に汚染された工業排
水の指標）等を定量しかつ結果から排水の組成及び由来
を推論することができる。これは膨化汚泥問題を早い時
期に示唆しかつ前記の対抗手段全タイミング艮〈適用す
ることができる。

２、最大硝化作用 本発明方法を適用して硝化１１ｔｌＩ菌のニトロソモナ
スΦスペック及びニトロバクタ・スペックの濃度を測定
し、それが減少した際には次の対抗手段を導入すること
ができる： 汚泥エージの上昇、浸漬体の装入、タンク温度の上昇、
高い硝化細菌濃度の好適な接極材料の装入 ３゜生物学的脱リン酸 本発明によりアエロモナス菌及びリン酸蓄積細菌（例え
ばアシネトバクタ−）の濃度を測定する。前記のｅ）で
既に記載したように、活性タンクへの流入口での高いア
エロモナス陶＠度は排水を最適に醗酵させるための、そ
れ敏活性タンク中の例えばアシネトバクタのようなリン
酸蓄積＃ｌ薗を有機酸により培養するだめの前提である
。

次の手段を介して、該細菌の濃度を一定に保持し、それ
故このプロセスを制御することができる： 最適濃度を達成するために低いアエロモナス濃度の排水
と高いこの細菌のａ度の排水との混合；高いアエロモナ
ス−もしくはアシネトバクタ濃度を有する好適な接極材
料の添加混合。

４、分解するのが困難な物質の代謝 本発明により、難分解性物１Ｋを含有する流入排水の汚
れの指標細菌、例えばプソイドモナス・フルオレセンス
を定量しかつ下水道を介して原因を追求する。

該物質を分解するスペシャリストを本発明により活性タ
ンク中で定量しかつその濃度を好適な接極材料の添加に
より一定に保持する。この際に特に、特許請求の範囲の
請求項７によりフルオロゲン基質を用いて特別な代謝能
力を標識するための方法を通用することができる。アシ
ネトバクタＱスペック；ゾンイげモナス・エルギノーザ
、プソイドモナス・フルオレセンス及びシンイドモナス
・プチダ：アルトロバクタ櫓スペック及び口ｒコックス
・スペックは難分解性物質（例えば芳香族物質、ハロビ
ン化炭化水素、脂肪族物質、界面活性剤又は洗剤）の代
謝に特に好適であると思われる。

５、排水処理装置中の病原細菌の除去 人間及び動物の病原細菌（表１に掲載され℃いるサルモ
ネ２・スペック、パスツレラ・スペック、シｒうφ７レ
クスネリ及びプソイドモナス・エルイノ−丈）ｋ本発明
により排水路への排水処理装置の流出口で定量する。一
定の限界値を上廻る場合は、活性タンク中の流入排水の
滞留時間を長くシ、このようにして経験的に病原細菌を
より良好に除去することができる。

ここに記載した排水処理装置の制御可能性のいくつか、
例えば排水の滞留時間、細菌の配量又はタンク温度は調
節可能なポンプ又は発熱体により達成することができる
。電気的な調節尺度としては一定の誘導有機体の濃度を
適用することができ、この濃度は本発明によりフローサ
イトメトリーをベースとする測定検出位置で、活性タン
クへの流入口及び活性タンク中で自動的に測定する。

【図面の簡単な説明】

第１図は禎々の細菌の成長挙動を示す図面、第２因はフ
ローサイトメトリーにより測定したアシネトバクタ菌に
関する呈色結果を示す図面、第６図はフローサイトメト
リーにより測定したアエロモナス・ヒドロフイラ菌の呈
色結果を示す図面、第４Ａ図及び第４Ｂはフローサイト
メトリーにより前排水処理タンク中のアエロモナス菌の
呈色結果を示す図面、第５Ａ図、第５Ｂ図、第５Ｃ図及
び第５Ｄ図はサブトラクション法による前排水中の７エ
ロモナス菌の定量を示す図面、第６Ａ図、第６Ｂ図、第
６Ｃ図及び第６Ｄ図は活性汚泥中の細菌に３の定量及び
分類選別を示す図面、第７図はフローサイトメ）　Ｉ）
−を適用して代謝生理能力により測定したストレゾトコ
ックス・７エカリスの定量結果を示す図面、第８図は排
水細菌のアエロモナス菌の月々のフローサイトメトリー
による定量結果を示す図面、第９Ａ図、第９Ｂ図、第９
Ｃ図、第９Ｄ図、第９Ｅ図、第９１１′図及び第９Ｇ図
は排水細−に６の季節毎のフローサイトメトリーによる
定量結果を示す図面、第１０図は排水処理装置中の微生
物学的挙動を示す図面である。 Ｆｉｇ、１ 図工の浄書（内容に変更金し） Ｆｉｇ、２ ア／不トパクタの呈色 混合物・アノネト・ζフタ＋抗体（Ｏｒｐｅｇｅｎ　　
０２２）ア／不トパクタ＋Ｏ血清 Ａ：排水−に：下水道−■：＠排水り理夕／りＢ：活性
汚泥−Ｎ：後排水′δ理夕／りＹ軸　ＦＩＴＣ螢九 Ｘ軸：ＰＩ□ろ２ユ九（ＤＮＡ倉量ン 図面の浄１！Ｆ（内容に変更なし） Ｆ＋ｇ、３ Ｐ３ＧＲＮ−Ｆい’　ＶＳ　ＲＥＤ−Ｆｌ、／Ｘ　Ｒ２
Ｌ４　ＲＥＤ　ＦＬＩＪ工ＥＳＣＥＩ”ＣＥ図面のｌｊ
、、ｃＩ’ジ容に変更なし）Ｆ　＋ｇ、　４　Ｂ 前排水の呈色 抗体・Ｄ２３ ＯＳＳ丁　　　　　ｋ’　　ＵＮＴ　　デＴ　丁図面の
浄１１Ｆ（内容に変更なし） Ｆｉｇ、４Ａ ｉｉＩｔ′Ｊ１′水の呈色 抗体　０２３１０血渭 ＣＵ：Ｖ：ｆＴτＰＸｐｙＭン−Ｌ！’＋図面の浄瞥（
内容に変更なし） Ｄ　２５／　０ Ｆ　ｉｇ、　５Ｃ Ｆ　ｉｇ、　５Ｄ 手 続 正置′ （方式） １、事件の表示 平成 ２、発明の名称 年 特許願 好気性活性汚泥型の排水処理工程の制御性補正をする者 事件との関係

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、活性汚泥中に最も頻繁に出現する微生物１種又は数
   種をその量について継続的に監視する際に、活性汚泥及
   び／又は活性汚泥タンクの流入口からの典型的な試料中
   で、該微生物を、この選択した微生物に対する螢光標識
   抗体に結合させるか又は該微生物の特異的な代謝能力に
   よりフルオロゲン基質を変換させ、このようにして螢光
   標識した微生物の量をフローサイトメトリーにより測定
   しかつそれと同時に、存在する微生物の全量を散乱光に
   より及び／又はＤＮＡ染色により測定し、かつこのよう
   にして得られた測定値に相応して特定の微生物１種又は
   数種の量及び／又は該微生物の成長条件を調節すること
   により微生物の量を監視することを特徴とする、好気性
   活性汚泥型の排水処理工程の制御法。 ２、次の微生物：０２１Ｎ型、０９６１型及び１８５２
   型、スフエロチルス・ナタンス、ゾーグレア・スペック
   、プソイドモナス・オリジハビタンス、アシネトバクタ
   ・カルコアセチクスの分離片；ニトロソモナス・スペッ
   ク、ニトロバクタ・スペック；アエロモナス・ヒドロフ
   イラ、アシネトバクタ・カルコアセチクス；アシネトバ
   クタ・スペック、プソイドモナス・エルギノーサ、フル
   オレセンス及びプチダ、アルトロバクタ・スペック、ロ
   ドコツクス・スペック；サルモネラ・スペック、パスツ
   レラ・スペック、シゲラ・フレクスネリ、プソイドモナ
   ス・エルギノーサ；エシエリキア・コリ、アエロモナス
   ・ヒドロフイラ、クレプシエラ・プノイモニエ、プソイ
   ドモナス・フルオレセンスの１種又は数種を監視する請
   求項１記載の方法。 ３、膨化汚泥、硝化作用、生物学的脱リン酸、難分解性
   物質の代謝、人間及び動物の感染を誘発しかつ／又は流
   入した排水の品質及び出所を判定するのに好適である微
   生物１種又は数種を監視する請求項１又は２記載の方法
   。 ４、脱リン酸及び／又は硝化作用を調節する微生物を選
   択する請求項３記載の方法。 ５、排水及び活性汚泥中の誘導有機体を測定検出位置で
   フローサイトメトリーの原理又は顕微鏡像分析を介して
   定量しかつ測定信号により排水処理装置を制御する請求
   項１から３までのいずれか１項記載の方法。 ６、制御を完全自動で実施する請求項５記載の方法。 ７、フルオロゲン基質により細胞内の代謝能力を表示し
   かつフローサイトメトリーの原種又は顕微鏡により像分
   析を介して定量する請求項１記載の方法。