JP5052133B2 - タキサン化学受容性予測試験法 - Google Patents
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Description
本発明は、一般に癌治療および癌予防の分野に関する。より詳細には、癌患者におけるタキサン化学受容性を予測することに関する。なお、本願は、2003年8月25日に出願された米国仮特許出願第60/497,665号の優先権を主張し、その全ての開示が、具体的に参照として本明細書に組み入れられる。
癌化学療法に付随する主な問題のうちの1つは、同じ組織像をもつ個々の患者が、所与の薬剤または所与の治療プロトコルに対して同様に応答しないということである。応答範囲は、乳癌などの化学受容性の腫瘍においてさえも、大部分において異なる可能性がある。薬物用量、薬物の併用、並びに投与計画、患者の年齢および状態、腫瘍局在、その他などの、薬物感受性の多くの決定因子が周知であるが、所与の腫瘍の内因性の感受性は、評価することが依然困難である主な因子である。多数の耐性のメカニズムが同定されており、これらいくつかを腫瘍生検で評価することができるが、これらは、抗癌剤に対する腫瘍感受性の問題を解決するものではない。これは、腫瘍細胞の感受性の関数として薬物療法を個別化しようとするための多くの研究をリードしてきた。
癌療法における主要な問題は、化学療法薬に対する癌細胞の耐性である。従って、本発明は、癌細胞または腫瘍組織のタキサン化学受容性を決定するための方法を提供する。本方法は、パクリタキセルおよびドセタキセルなどのタキサンの骨格を有する全ての抗癌剤に対して有効である。
I. 本発明
本発明は、癌細胞および組織のタキサン化学受容性を決定するための方法を提供する。本発明は、紡錘体形成チェックポイントにおいてタキサン感受性のために必要である分子、したがって、Cdk1またはその他の分子マーカーなどのこのチェックポイントに関与する分子が、タキサン感受性を予測する際に有用であることを決定するということを決定する。従って、本発明は、癌細胞および組織の細胞周期プロファイリングによってタキサン化学受容性を決定するか、または評価する方法を提供する。細胞周期プロファイリングは、キナーゼ活性測定値についてCDK1、CDK2、CDK4、およびCDK6などのいくつかの細胞周期分子(また、本明細書においてパラメーターともいわれる)を;並びにタンパク質発現測定値についてCDK1、CDK2、CDK4、CDK6、サイクリンB1、サイクリンD1、サイクリンE、p21/Waf1、p27/Kip1、p16、p53、およびMAD2を測定することによって行った。細胞周期プロファイリング系のパラメーターは、MAD2発現およびCDK1活性を含むM期調節機構に関与するので、本系は、タキサン感受性の有効な予測法である。
タキサンおよび関連活性成分は、イチイ属(Taxus)種の植物によって産生され、このような植物の異なる部分の成分である。タキソール(パクリタキセル)などのタキサンは、イチイ樹木から得られる環状毒性ジテルペンである。タキサンは、これらが細胞周期のG2/M期において増殖細胞を阻害するという点で、分子に基づいて細胞複製を阻害することが当技術分野において公知である。従って、タキサンは、抗腫瘍効果を有し、一連の癌腫(卵巣癌、乳癌、気管支癌、肺癌)の治療のために次第に使用されている。
パクリタキセルは、タキソールとしても知られ、ジテルペンアルカロイドであって、従ってこれは、その構造にタキサン骨格を有する。パクリタキセルは、抗癌活性を有する天然の化合物としてイチイ(タキサス・ブレビフォリア(Taxus brevifolia))の樹皮から抽出される(FuchsおよびJohnson, 1978)。パクリタキセルは、有糸分裂を妨害することによって癌に対して作用する。パクリタキセルは、タキソイド(taxoid)薬であり、原発性および転移性癌の有効な治療として広く使用されている。
ドセタキセルは、タキソイドファミリーに属する抗悪性腫瘍薬である。ドセタキセルは、主に乳癌、肺癌、非小細胞肺癌を治療するために使用されてきた。加えて、これは、頭頚部癌、小細胞肺癌、中皮腫、卵巣癌、前立腺癌、および尿路上皮移行細胞癌を治療するために使用してもよい。ドセタキセルは、癌細胞の増殖を妨害し、最終的にこれが破壊される。しかし、パクリタキセル療法に関して上で議論したように、一部の患者は、ドセタキセル療法に耐性である。従って、癌患者におけるこのタキサンの化学受容性を評価するか、または決定することにより、この薬剤は、癌を治療するためにより効率的に使用することができる。
また、本発明は、抗癌活性を有するタキサン類似体もしくは誘導体を含む、任意のタキサンまたは当技術分野において当業者に周知であるタキサン骨格を有する化合物の化学受容性を試験することを想定する。「タキサン化合物」は、タキソール、タキソールと構造的に類似する化合物、および/またはタキソールの類似体を含んでもよい。また、「タキサン化合物」は、「擬態」を含んでもよい。「擬態」には、タキソールと構造的に類似しないが、インビボでタキソールまたは構造的に類似のタキサン化合物の治療活性を模倣する化合物を含むことが企図される。本発明のタキサン化合物は、癌を有する被検者(患者)における腫瘍成長を阻害するために有用である化合物である。また、タキサン化合物という用語は、化合物の薬学的に許容される塩を含むことが企図される。タキサン化合物は、米国特許5,641,803号、米国特許第5,665,671号、米国特許第5,380,751号、米国特許第5,728,687号、米国特許第5,415,869号、米国特許第5,407,683号、米国特許第5,399,363号、米国特許第5,424,073号、米国特許第5,157,049号、米国特許第5,773,464号、米国特許第5,821,263号、米国特許第5,840,929号、米国特許第4,814,470号、米国特許第5,438,072号、米国特許第5,403,858号、米国特許第4,960,790号、米国特許第5,433,364号、米国特許第4,942,184号、米国特許第5,362,831号、米国特許第5,705,503号、米国特許第5,278,324号、米国特許第5,840,929号、米国特許第5,773,464号、米国特許第5,248,796号、米国特許第5,821,263号、米国特許第4,814,470号、米国特許第5,438,072号、米国特許第4,960,790号、米国特許第4,942,184号、米国特許第5,433,364号、米国特許第5,278,324号、米国特許第6,362,217号、米国特許第6,017,935号、米国特許第5,977,376号、米国特許第5,912,264号、米国特許第5,773,464号、米国特許第5,739,539号、米国特許第5,698,712号、米国特許第6,284,746号;米国特許出願第20030144344号、米国特許出願第20030130341号、米国特許出願第20030134793号、米国特許出願第20030130170号、米国特許出願第20030130178号、米国特許出願第20030124055号、および米国特許出願第20020016356号;並びにPCT出願のWO95/33740、WO96/03394、WO95/33736、WO93/02067、WO94/15929、およびWO94/15599に以前に記載されており、これらの全てが参照として本明細書に組み入れられる。
本発明は、細胞、組織、または器官試料などの試料を得ることを想定する。本発明の試料は、いくつかの手段によって患者から得てもよい。たとえば、本発明の細胞、器官、または組織試料は、生検によって得てもよい。生検は、体から試料を除去することである。本発明に使用してもよい生検は、パンチ生検または針生検を含むが、このようなものに限定されるわけではない。細胞周期分子を含む試料は、当技術分野において公知の任意の方法によって得てもよい。血液または血清試料は、静脈穿刺を使用して収集してもよい。この方法を使用して、血液が単一の静脈に配置された針を介して個体の腕の血管から直接引き出される。次いで、血液をガラスまたはプラスチックチューブに収集してもよい。
本発明は、癌試料などの試料を得るための、パンチまたは錐体生検の使用を想定する。パンチ生検は、典型的には皮膚発疹、ほくろ、頚部の小さな組織試料、およびその他の小さな質量の試料を得るために使用される。局所麻酔薬を注射した後、生検パンチ(3mm〜4mmまたは直径0.15インチ)を使用して円柱形部分を皮膚から切断する。開口部は、典型的には縫合で閉じられて、最小限の瘢痕で回復する。
1. コア針生検
コア針生検(またはコア生検)は、皮膚を通して器官内に小さな中空針を挿入することによって行われる。次いで、針を細胞層に進めて、試料またはコアを除去する。針は、組織試料を除去するのを補助するために、切断先端に設計してもよい。コア生検は、組織試料を除去するのを補助するために、バネを充填した銃を使用して行われることが多い。
吸引生検法は、細針穿刺吸引(FNA)とも称され、注射器に取り付けた細針で行われる。吸引生検またはFNAは、本発明において癌試料を得るために使用してもよい。FNA生検は、経皮的(皮膚を介した)生検である。FNA生検は、典型的には細いゲージ針(22ゲージまたは25ゲージ)で達成される。領域を最初に洗って、次いで通常局所麻酔薬で麻痺させる。針は、関心対象の器官または組織の領域に入れられる。一旦針が配置されたら、注射器で真空を生じさせ、繰り返し針を出し入れする動作を行う。サンプル採取される細胞は、細針を介して注射器に吸い込まれる。通常、3つまたは4つの試料が作製される。
内視鏡生検は、本発明において癌試料を得るために使用してもよい生検のうちの非常に一般的なタイプである。内視鏡生検は、サンプリング機器と共に体に挿入される内視鏡(体内を見るための光ファイバーケーブル)を介してなされる。内視鏡は、関心対象の器官の裏打ち上の領域を直接可視化すること;試料の内視鏡内部を走る長いケーブルに取り付けられた鉗子で組織の極めて小さな小片を収集し、またはつまみとることができる。内視鏡生検は、消化管(消化管内視鏡検査)、膀胱(膀胱鏡検査)、腹腔(腹腔鏡検査)、関節腔(関節鏡検査)、胸部の中間部分(縦隔鏡)、または気管および気管支系(喉頭鏡検査および気管支鏡検査法)で、天然の体の開口部か、もしくはある小さな手術切開を介して、いずれかで行ってもよい。
本発明において癌試料を得るために、表面生検を使用してもよい。この技術は、細胞を除去するために、組織もしくは器官の表面のサンプリングすること、または削ることを含む。表面生検は、皮膚のわずかな部分を除去するために行われることが多い。
タキサン化学受容性を評価または決定する際に、本発明は、患者の癌細胞における細胞周期分子もしくは因子の発現レベルおよび活性を評価または決定する。
異なるサイクリンが結合するCDKの7つのタイプ、すなわちCDK1、CDK2、CDK3、CDK4、CDK5、CDK6、およびCDK7が公知である。より詳細には、CDK1は、サイクリンAまたはBと結合し、CDK2は、サイクリンAまたはEと結合し、CDK4およびCDK6は、サイクリンD1、D2、またはD3と結合して活性化される。活性化されたCDKは、細胞周期の特定の期を制御する。従って、細胞周期が制御されて、細胞増殖は、異なるタイプのCDKの活性化によって調節される。活性化されたCDKは、基質としてタンパク質のセリン残基およびスレオニン残基をリン酸化する。インビトロ反応系では、活性化されたCDK1およびCDK2が、基質としてヒストンH1に対して十分に反応し、および活性化されたCDK4およびCDK6が、基質としてRb(網膜芽細胞腫タンパク質)に対して十分に反応する。インビボでの細胞周期制御では、活性化されたCDKは、生理的基質としてRbを必要とすることが考えられるが、その他のどのタンパク質が基質として作用するかは公知でない。
p16INK4は、p16B、p19、p21WAF1、およびp27KIP1をも含むCDK阻害性タンパク質の新たに記載されたクラスに属する。p16INK4遺伝子は、9p21にマップし、多くの腫瘍型において染色体領域が頻繁に欠失されている。p16INK4遺伝子のホモ接合性欠失および突然変異は、ヒト腫瘍株に頻繁に存在する。これは、p16INK4遺伝子が、癌抑制遺伝子であることを示唆した。しかし、この解釈は、p16INK4遺伝子変化の頻度が、培養された株化細胞におけるよりも、初代無培養腫瘍において非常に低いという知見によって疑いがもたれていた(Caldas et al., 1994;Cheng et al., 1994;Hussussian et al., 1994;Kamb et al., 1994a;Kamb et al., 1994b;Mori et al., 1994;Okamoto et al., 1994;Nobori et al., 1995;Orlow et al., 1994;Arap et al., 1995)。プラスミド発現ベクターでトランスフェクションを行うことによる野生型p16INK4機能の回復により、いくつかのヒト癌株化細胞によるコロニー形成が減少した(Okamoto, 1994;Arap, 1995)。
有糸分裂紡錘体形成チェックポイントでは、未熟な染色体の分裂を防止するために、紡錘体に対する染色体の付着および微小管によって作製される姉妹染色分体全体の緊張の両方をモニターする。パクリタキセルなどの薬物が、微小管を安定化して紡錘体の形成の間に生じる動的変化を妨害する場合に、紡錘体形成チェックポイントが活性化されて、有糸分裂で細胞停止される。
A. 細胞周期プロファイリング系
タキサン化学受容性に関与する細胞周期分子を同定するために、本発明は、細胞周期プロファイリングのために多パラメーター解析を使用する。この系は、ドットブロット技術に基づいた、日本特許出願第200348653号(その全体が本明細書に組み入れられる)に記載されている装置を使用して、同位元素を用いずに正常および癌組織の小さな臨床試料におけるタンパク質発現、並びに活性を迅速に、定量的に、かつ自動的にアッセイし得る。CDKの活性およびその他の種類のタンパク質の発現を測定するためには、2mm3だけの組織試料で十分である。この細胞周期プロファイリング系/装置は、多くの疾患の診断の際の、または分子ターゲティング療法を含む種々の療法に対する予後もしくは患者の感受性を評価する際の、その他のキナーゼのまたはタンパク質の活性の測定など種々の適用可能性を有する。また、この装置/系は、個々の疾患に対する危険因子の診断のために使用してもよい。
本発明に使用されるアッセイ法プロトコルの原理を下記に簡単に説明してある。細胞周期分子(パラメーター)のタンパク質発現は、CPDIBという名で(粗タンパク質直接ブロッティング、米国出願第10/423,892号;その全体が参照として本明細書に組み入れられる)かつドットブロット技術に基づいた新たな技術によって測定してもよい。解析は、3工程だけを含む:疎水性膜に対する粗製細胞可溶化物の直接固定化、一次抗体の反応、および結合した一次抗体の検出。たとえば、ビオチン化二次抗体およびフルオレッセイン標識されたストレプトアビジンの逐次反応による。合計アッセイ時間は、3時間以内である。相対的蛍光単位と標準的な組換えタンパク質の量とは、直線的関連があることが確かめられる。MAD2のためのアッセイ条件は、現在最適化されている。本系は、1つの標的分子に対する1つの特異的なポリクローナル抗体が必要なだけであるので、本系の主な利点は、プロファイリングのための新たなパラメーターを追加することが、新たなサンドイッチELISA系を開発するよりも非常に容易であることである。
CDKの酵素アッセイのために、非放射同位元素CDKアッセイ法を使用した(米国特許出願第20020164673号)。本アッセイ法は、以下の工程を含む:対応する抗体(たとえば、抗CDK1、抗CDK2、抗CDK4、または抗CDK6抗体)とプロテインAビーズとによるCDK分子の沈澱。基質のセリンまたはスレオニン残基にモノチオリン酸エステル基を導入するために、タンパク質基質およびアデノシン5'-O-(3-チオ三リン酸エステル)(ATP-γS)のキナーゼ緩衝液の溶液を含む基質混合物を反応させる工程(タンパク質基質として、CDK1およびCDK2のためにはヒストンH1を、並びにCDK4およびCDK6のためには組換えRBタンパク質(アミノ酸769〜921)を使用してもよい)。標識化フルオロフォアまたは標識化酵素を、導入されたモノチオリン酸エステル基の硫黄原子と結合することによって基質を標識する工程。基質を標識する標識化フルオロフォアから蛍光の量を測定する工程か、または基質を標識する標識化酵素を、標識化酵素との反応によって光学的に検出可能な生成物を生じる物質と反応させて、生じる生成物の量を光学的に測定する工程。測定された蛍光の量または測定された生じた生成物の量からサイクリン依存性キナーゼの活性を、予め作製した参照曲線を基準として算出する工程。
本発明の態様において、癌を有する患者のタキサン化学受容性の評価に基づいて、効率的に癌を治療および予防する方法が想定される。治療のために想定される癌の例は、肺癌、頭頚部癌、乳癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、骨癌、精巣癌、子宮頚癌、胃腸癌、リンパ腫、肺における新生物発生前の病変、大腸癌、黒色腫、膀胱癌、および他の任意の腫瘍疾患も含む。
本発明の方法および組成物を使用して細胞を死滅させ、細胞増殖を阻害し、転移を阻害し、腫瘍または組織サイズを減少し、およびそうでなければ、腫瘍細胞の悪性の表現型を逆転し、または減少させるためには、一般にタキサン化合物と癌細胞を接触させることが考えられる。投与の経路は、必然的に、病変の位置および性質と共に変化し、たとえば、皮内、経皮、非経口的、静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮下、経皮的、気管内、腹腔内、腫瘍内、灌流、洗浄液、直接注射、並びに経口投与および製剤を含む。また、癌の治療または診断に関して議論した任意の製剤および投与経路を、腫瘍性疾患および症状に関して使用してもよい。
本発明の癌細胞に対するタキサン組成物の送達のための好ましい方法は、全身的であるか、または腫瘍内注射を介する。しかし、本明細書に開示された薬学的組成物は、代わりに、米国特許第5,543,158号;米国特許第5,641,515号、および米国特許第5,399,363号(それぞれ、その全体が参照として本明細書に具体的に組み入れられる)に記載されているように、非経口的、静脈内、皮内、筋肉内、経皮的、またはさらに腹腔内に投与してもよい。
本発明の化合物および方法は、癌を含む腫瘍性疾患/症状に関して使用してもよい。癌のタイプは、肺癌、頭頚部癌、乳癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、骨癌、精巣癌、子宮頚癌、胃腸癌、リンパ腫、肺における新生物発生前の病変、大腸癌、黒色腫、膀胱癌、および他のいかなる腫瘍疾患も含んでもよい。本発明のタキサン組成物での治療の有効性を増大するために、パクリタキセル、ドセタキセル、またはこれらの類似体などの、これらの疾患および症状の治療に有効なその他の薬剤とこれらの組成物を併用することが望ましい場合がある。たとえば、本発明のタキサン化合物および抗癌剤または手術などのその他の抗癌療法と共に、癌の治療を実行してもよい。
本発明で使用することが想定される抗癌治療は、たとえば、癌細胞を死滅させるか、癌細胞のアポトーシスを誘導するか、癌細胞の増殖速度を減少させるか、転移の発病率もしくは数を減少させるか、腫瘍サイズを減少させるか、腫瘍成長を阻害するか、腫瘍もしくは癌細胞に対する血液供給を減少させるか、癌細胞もしくは腫瘍に対する免疫応答を促進するか、癌の進行を防げるか、もしくは阻害するか、または癌である被検者の寿命を増大することにより、被検者において癌に負の影響を与えることができると思われる。抗癌治療は、生物学的薬剤(生物療法)、化学療法薬、および放射線療法薬を含む。生物学的療法と化学療法との併用は、生物化学療法として公知である。
また、本発明において、タキサンを化学療法薬と併用して使用してもよいことが想定される。このような化学療法薬は、たとえば、シスプラチン(CDDP)、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトセシン、イホスファミド、メルファラン、クロランブシル、ブスルファン、ニトロソ尿素(nitrosurea)、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン(plicomycin)、マイトマイシン、エトポシド(VP 16)、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲン受容体結合剤、タキソール、ゲムシタビン、ナベルビン、ファルネシル-タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランスプラチナ(transplatinum)、5-フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびメトトレキセート、テマゾロミド(Temazolomide)(DTICの水性型)、またはこれらの任意の類似体もしくは誘導体を含んでもよい。膵癌を治療するために現在使用される化学療法薬の一例は、ゲムシタビンである。その他の研究では、進行した膵癌の治療のために、高用量の5-フルオロウラシル(5-FU)を使用する。
癌を有する患者を治療する際に、タキサンと併用して本発明に使用してもよいもう一つの療法は、放射線療法である。本発明に使用してもよい放射線療法因子は、DNA損傷を生じさせ、かつγ線、X線、および/または腫瘍細胞に対して放射性同位元素を直接送達するものなどの広範囲に使用されてきた因子であることが想定される。また、マイクロ波およびUV照射などのDNAに損害を与える因子のその他の形態も想定される。これらの因子は全て、DNAに対する、DNAの前駆体に対する、DNAの複製および修復に対する、並びに染色体の構築および維持に対する広範な損傷を及ぼす可能性が最も高い。X線の用量範囲は、長期間(3〜4週)にわたって50〜200レントゲンの1日量から2000〜6000レントゲンの一回用量の範囲である。放射性同位元素のための用量範囲は、広く変動し、同位元素の半減期、放射される放射線の強度および型、並びに癌または腫瘍細胞による摂取に依存する。
癌である人の約60%は、予防的、診断的または段階的(staging)、治療的、並びに一時的な手術を含む、いくつかのタイプの手術を受けると考えられる。治療的手術は、本発明の治療、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法、および/または代替療法などのその他の療法と共に使用してもよい癌治療法である。
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を証明するために含まれる。続く実施例に開示した技術は、本発明の実施において十分に機能することが本発明者らによって発見された技術を示すことが当業者により認識されるはずであり、したがって、その実施のための好ましい様式を構成するとみなすことができる。しかし、当業者であれば、本開示を考慮して、開示された特定の態様に多くの変更を行うことができ、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、なおも同様の、または類似の結果を得ることができることを認識するはずである。
実験手順
株化細胞および細胞培養
本研究に使用される全てのヒト株化細胞組換えプラスミドの開発のためのHEK 293細胞;機能的な紡錘体形成チェックポイントを有することが公知であるMCF-7乳癌およびMCF-10A正常細胞;並びに低Mad2発現のために欠陥チェックポイントを有するT47D乳癌およびOvca432卵嚢癌細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)(Rockville, MD)から得た。HEK 293細胞、MCF-7細胞、およびT47D細胞は、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)/F12培地中で培養した。Ovca432細胞は、RPMI 1640中で維持した。DMEM/F12培地およびRPMI 1640は、2mMのL-グルタミン、10%のウシ胎児血清(FBS;100IU/ml)、およびペニシリン・ストレプトマイシン(100mg/ml)を補った。MCF-10A細胞は、5%のウマ血清、0.02μg/mlの上皮細胞成長因子、0.5μg/mlのヒドロコルチゾン、10μg/mlのインスリン、0.1μg/mlのコレラ毒素、100IU/mlのペニシリン、および100mg/mlのストレプトマイシンを補ったDMEM/F12培地中で維持した。
Mad2配列 5'-
およびBubR1配列 5'-
を標的化するために、21ヌクレオチドのsiRNA二重鎖をDharmacon Research, Inc. (Lafayette, CO)によって合成した。MCF-7細胞のトランスフェクションは、オリゴフェクトアミントランスフェクション試薬(Invitrogen, Carlsbad, CA)を使用して、Dharmacon Researchによって提供されるプロトコルに従って行った。対照研究については、細胞はsiRNAスクランブル二重鎖(Dharmacon Research)でトランスフェクションを行った。siRNAの終濃度は、200nMであった。
アデノウイルスは、以前に(He et al., 1998)およびStratagene(La Jolla, CA)記載されているプロトコルに従って作製した。簡潔には、最初に、cDNA Mad2の遺伝子をシャトルベクター、pAdTrack-サイトメガロウイルス(CMV)にクローニングした。生じるプラスミドを制限エンドヌクレアーゼPme Iで消化することによって直線化し、その後にアデノウイルス・バックボーン・プラスミドpAdEasy-1(Stratagene, La Jolla, CA)を使用して大腸菌(Escherichia coli.)BJ5183細胞に同時形質転換した。組換え体をカナマイシン耐性について選択し、組換えを制限エンドヌクレアーゼ解析によって確認した。最後に、HEK293細胞を直線化した組換えプラスミドでトランスフェクションを行った。研究については、それぞれの細胞において、細胞変性効果を伴わずに80〜90%の感染効率が得られた。
トランスフェクションの24時間、48時間、および72時間後に、細胞を収集してタンパク質免疫ブロット解析に供した。細胞を氷冷リン酸緩衝食塩水中で一度洗浄し、プロテアーゼ阻害剤(1mMのフェニルメタンスルホニルフルオライドおよび10μg/mlアプロチニン)およびホスファターゼ阻害剤(20mMのβ-グリセロリン酸、5 mMのNaF、および100μMのNa3VO4)を含む溶解緩衝液(1%のNP-40、150mMのNaCl、および50mMのトリス-HCl[pH 7.5])で溶解した。氷上で30分後、細胞を4℃において15分間、13,000rpmでの遠心分離に供した。ウェスタンブロット法のために、同量のタンパク質をドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して分解し、ニトロセルロース膜に転送した。膜をポリクローナル抗Mad2抗体(Covance, Princeton, NJ; 1:500)、 モノクローナル抗BubR1抗体(Chemicon, Temecula, CA; 1:500)、およびモノクローナル抗αチューブリン(Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO; 1:5000)と共に室温で1時間(または4℃で一晩)インキュベートし、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗体とインキュベーションした。結果は、化学発光検出系で増強して視覚化した。
細胞をトリプシン処理によって剥離し、96ウェル・マイクロタイタープレートに2.0×103細胞/ウェルで播き、パクリタキセル(1、5、10、50、100、および1000 nM)の種々の濃度で処置した。72時間後に、細胞増殖に対する効果を3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)アッセイ法によって検査し:20μlのMTT溶液(5mg/mlのリン酸塩緩衝食塩水溶液;Sigma Aldrich)をそれぞれのウェルに添加して、細胞を37℃において4時間インキュベートした。代謝的に生存可能な細胞によって形成されたMTT-ホルマザンを100μlの細胞溶解緩衝液に溶解し、570nmの波長でマイクロプレートを使用して蛍光をモニターした。細胞増殖率は、パクリタキセル(対照)で処置されていない細胞の吸収を100%と定義することによって算出した。
有糸分裂の凝縮染色質をもつ細胞は、10μg/mlヨウ化プロピジウムと連動して10μMのヘキストで33342色素(Aventis Pharmaceuticals Inc., Bridgewater, NJ)で染色することによって視覚化し;ヨウ化プロピジウムは、死細胞だけに組みこまれた。従って、死細胞は、ヨウ化プロピジウムおよびヘキスト33342色素の両方で染色されるが、有糸分裂細胞は、ヘキスト33342色素のみで凝縮染色質を示した。細胞をトランスフェクションの12時間、24時間、および36時間後に収集して有糸分裂指数を算出した。
細胞死は、トリパンブルー染料排除アッセイ法を使用して評価した。簡潔には、細胞を、トリプシンを使用して収集し、0.4%のトリパンブルー色素(Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO)で染色した。トリパンブルー陽性および陰性の細胞は、位相差顕微鏡(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)下で、血球計算板(Hausser Scientific, Horsham, PA)を使用して計数した。それぞれのアッセイ結果は、細胞の総数を基準として死細胞の割合に関して表してある。個々の実験は、三回行った。結果は、平均値±標準偏差として報告してある。
Cdk1プロテインキナーゼ・アッセイ法は、SignaTECT cdc2タンパク質アッセイ法系(Promega, Madison, WI)を使用して行った。簡潔には、収集した細胞をプロテアーゼ阻害剤(100μg/mlのアプロチニンおよび0.5mMのフェニルメタンスルホニルフルオライド)およびホスファターゼ阻害剤(50mMのNaF)を含む抽出緩衝液(50mMのトリス[pH 7.4]、150 mMのNaCl、0.1%のトリトンX-100、および1mMのEDTA)で溶解した。これらの可溶化液を、ヒストンH1および[γ-32P] ATPに由来するcdc2特異的ビオチン化ペプチドからなる基質と結合させて、30℃において10分間インキュベートした。これらの放射標識された、リン酸化された基質をストレプトアビジン・マトリックス・ビオチン捕獲膜で回収した(SAM;Promega)。数回の洗浄後、それぞれの捕獲した膜を別々のバイアルに入れて、液体シンチレーションカウンター(Beckman Coulter, Palo Alto, CA)を使用して解析した。
細胞周期プロファイリングに供される株化細胞の可溶化液は、以下のとおりに調製した。細胞を10%のFCS(ウシ胎児血清)を含むDMEM(ダルベッコ改変イーグル培地)で培養し、100nMのパクリタキセルで0時間、24時間、48時間、または72時間処置した。処置後、細胞を収集して、PBSで一度洗浄した。次いで、細胞を21Gの針で20回注射することによって溶解緩衝液(0.1%のNP-40、20 mMのトリス-HCl[pH 7.4]、150 mMのNaCl、2% プロテイナーゼ阻害剤反応混液[Sigma, St Louis, MO, USA])で溶解した。不溶性物質を除去するために5分間の15000rpmの遠心分離後、上清のタンパク質濃度を解析し(DCキット, Pierce, Rockford, IL, USA)、使用するまで-80℃で貯蔵した。
細胞周期プロファイリングの発現解析については、2.5μgの総タンパク質を、疎水性膜(0.22μmの孔をもつPVDF;Millipore, Billerica, MA(USA))をもつ5×7cm2のドットブロット装置の78μlのウェル(3mm [w]×5mm [l]×7mm[d])に加えた。膜に結合した粗試料中の標的タンパク質は、抗CDK抗体(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)、ビオチン化二次抗体(Santa Cruz Biotechnology)、およびフルオレッセイン標識されたストレプトアビジン(Vector, Burlingame, CA, USA)での連続反応によって定量的に検出した。それぞれの反応間に、ウェルをTBS溶液(25mMのトリス-HCl[pH 7.4]、150 mMのNaCl)で自動洗浄した。膜の蛍光イメージは、イメージアナライザー(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)を使用して解析し、ドットの強度は、「Quantity One」ソフトウェア(Bio-Rad)を使用して定量化した。相対的蛍光単位(RFU)および標準的組換えタンパク質(Santa Cruz Biotechnology)の量は、標準化された範囲で直線的に相関させた(CDK1、2.5〜25ng/ドット;CDK2、1.0〜10ng/ドット;CDK4、1.0〜10ng/ドット;CDK6、2.5〜25ng/ドット)。
細胞周期プロファイリングの酵素活性解析は、非放射同位元素法を使用して行った。細胞可溶化物は、発現解析について記載したとおりに調製した。CDK分子は、2μgの対応する抗体(抗CDK1、抗CDK2、抗CDK4、または抗CDK6抗体;Santa Cruz Biotechnology)および20μlのプロテインAビーズ(Amersham Pharmacia, Uppsala, Sweden)で、100μgの可溶化液総タンパク質量から4℃において1時間、選択的に沈殿させた。洗浄緩衝液(0.1%のNP-40、50 mM トリス-Cl[pH 7.4])で3回洗浄後、10μgのタンパク質基質、5mMアデノシン5'-O-(3-チオ三リン酸エステル)(Sigma)、20mM トリス-Cl(pH 7.4)、および0.1%のトリトンX-100を含む50μlの基質混合物をビーズに添加して、37℃において10分間、連続振盪下でインキュベートした。タンパク質基質として、CDK1およびCDK2のためにはヒストンH1(Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, USA)を、並びにCDK4およびCDK6のためには組換えRBタンパク質(アミノ酸769〜921)を使用した。ビーズを除去した後、基質に導入されたモノチオリン酸エステルを、10mMのヨードアセチル-ビオチン(Pierce)と共に、結合緩衝液(100mMのトリス-Cl[pH 8.5]、1 mM EDTA)中で、暗がりで室温において90分間インキュベーションすることによってさらに標識した。反応をβ-メルカプトエタノールでクエンチして、0.4μgの基質をドットブロット装置のウェルに適用した。ウェルを4%のウシ血清アルブミン(BSA)で30分間ブロッキングし、次いで37℃において1時間アビジン-FITC(Vector)と共にインキュベートした。膜を洗浄した後、イメージアナライザー(Bio-Rad)を使用してイメージを評価し、ドットの蛍光強度を「Quantity One」ソフトウェア(Bio-Rad)を使用して定量化した。K562慢性骨髄性白血病株化細胞から抽出された0μg、12.5μg、25μg、50μg、100μg、および150μgのタンパク質に対応するCDK活性で調製した検量線によって活性を算出した。1ユニット(U)は、K562細胞からの1μgの総タンパク質量のキナーゼ活性に匹敵する。
紡錘体形成チェックポイントの不活性化とCdk1活性の抑制との相関
以前の研究は、紡錘体形成チェックポイントの活性化により、Mad2およびBubR1の両方がCdc20と直接相互作用し、そのAPCを活性化する能力を阻害することを示した(Fang et al., 1998;Sudakin et al., 2001;Tang et al., 2001;Fang, 2002)。株化細胞における一過性ノックダウンを介したMad2またはBubR1の抑制が、パクリタキセルで誘導される紡錘体形成チェックポイントの機能に影響を及ぼすかどうかを決定するために、本発明者らは、siRNA二重鎖を使用して遺伝子サイレンシングを行った。
紡錘体形成チェックポイントおよびパクリタキセル耐性の減少
パクリタキセル感受性に対するMad2、BubR1、または両方ともの抑制による紡錘体形成チェックポイントの減少の効果を決定するために、MTTアッセイ法を使用してパクリタキセルの細胞生存度を比較した。図2Aに示したように、Mad2、BubR1、または両方ともが抑制されたMCF-7細胞は、対照細胞よりもパクリタキセルに対して耐性であった。次に、これらの耐性がパクリタキセルで誘導される細胞死の減少によるものであったかどうかを決定するために、本発明者らは、トリパンブルー排除法を使用して細胞死の集団を評価した。パクリタキセルでの処置の48時間後に、細胞死のレベルは、対照細胞では高かったが、Mad2、BubR1、または両方ともが抑制された細胞では減少していた(図2B)。これらのデータは、紡錘体形成チェックポイントの減少が、パクリタキセル耐性を増大することを証明する。
Mad2依存的な、チェックポイント欠陥細胞におけるCdk1活性およびパクリタキセル感受性に対するMad2過剰発現の効果
Mad2突然変異は、チェックポイント欠陥がある癌株化細胞において検出されなかったが(Takahashi et al., 1999)、Mad2タンパク質の発現レベルは、紡錘体形成チェックポイントの応答能と相関しているように見える(Wang et al., 2000;Wang et al., 2002)。ヒト検体におけるMad2タンパク質の発現レベルについての報告は、ほとんど発表されていなかった(Tanaka et al., 2001)。従って、Mad2の過剰発現が、低Mad2発現によって紡錘体形成チェックポイントが機能しなくなった細胞における紡錘体形成チェックポイント活性化を回復するかどうかを決定した。効率的にMad2を発現させるために、Mad2(Ad-EGFP/Mad2)を発現する組換えアデノウイルスを作製した。このアデノウイルスは、2つの独立したCMV駆動転写単位(GFPについて1つ、およびMad2について1つ)を含み、感染効率を直接観察することができる。Ad-EGFP/Mad2は、外来Mad2の高発現を誘導し(図3A)、細胞周期の種々の期の間の細胞の分布に影響を及ぼさなかった(図3B)。
BubR1が抑制された細胞におけるチェックポイント機能およびパクリタキセル感受性に対するMad2過剰発現の効果
次に、Mad2の過剰発現が、Mad2以外の分子のための紡錘体形成チェックポイント欠陥を克服することができるかどうかを決定した。チェックポイントに欠陥のあることが示されたBubR1-ノックダウンMCF-7細胞を使用した(図1Cおよび図1D)。Ad-EGFP/Mad2は、外来Mad2の高発現を誘導し、BubR1-ノックダウン細胞におけるBubR1の発現には影響を及ぼさなかった(図4A)。しかし、Cdk1は、Ad-EGFP/Mad2感染細胞においてアップレギュレートされず、パクリタキセルで誘導される細胞死は、増強されなかった(図4Bおよび図4C)。これらのデータは、Mad2の過剰発現が、Mad2非依存的な欠陥チェックポイントをもつ細胞におけるチェックポイントの機能およびパクリタキセル感受性を克服しなかったことを示す。
機能的チェックポイントをもつ細胞におけるチェックポイント機能およびパクリタキセル感受性に対するMad2の過剰発現の効果
次に、Mad2の過剰発現が、紡錘体形成チェックポイントの機能(Cdk1活性およびパクリタキセル感受性)を増強するかどうか(チェックポイントが無傷の細胞におけるパクリタキセルで誘導される細胞死が増強されるように移行することができるという知見)を決定した。以前の報告では、一方のMad2対立遺伝子の欠失が、欠陥のある紡錘体形成チェックポイントを生じること(Michel et al., 2001)並びにMad2が、そのMad1との相互作用およびAPC/Cdc20の阻害を経て動原体に動員されなければならないこと(Chen et al., 1998;Waters et al., 1998)を示した。これらの結果は、Mad2が紡錘体形成チェックポイント機構の構成成分として作用するためには、Mad2の一定量および特異的局在化が必要とされること、並びにチェックポイントの機能の増強のために、大量のMad2が必要とされないことを示唆する。
パクリタキセルに対する株化細胞の感受性
パクリタキセルに対する4種のヒト乳癌株化細胞の感受性をパクリタキセル細胞障害性試験のグラフ解析に従って判断した(図5)。結果は、MDA-MB231およびMDA-MB435が感受性であり、MCF-7およびT47Dが耐性であったことを示した。パクリタキセル細胞障害性試験は、以下のとおりに行った。細胞を96ウェル培養プレートのウェル内で1nM、5nM、10nM、50nM、または100nMパクリタキセルの存在下において培養した。72時間の培養後、細胞生存をMTTアッセイ法によって測定した。
インビトロでのバリデーション
インビトロでのバリデーション研究において、全ての株化細胞を100nMパクリタキセルで処置して、処置の0時間、24時間、48時間、および72時間後に収集した。次いで、細胞可溶化物を細胞周期プロファイリングに供した。プロファイリング結果により、7つのパラメーター(細胞周期分子)が、パクリタキセルに対して感受性と耐性の株化細胞とを区別するために有用であることが明らかになった。これらは、(1)処置の24時間後のCDK1比活性;(2)処置前のCDK2比活性;(3)処置前のMAD2発現;(4)処置前のサイクリンB1;(5)処置前のサイクリンE発現;(6)処置前のp21発現;および(7)処置前のCDK6発現である(図6)。結果によれば、パクリタキセル感受性予測試験のためには、9つのパラメーターが決定された。これらは、(1)CDK1キナーゼ活性;(2)CDK1発現(CDK1比活性の算出のため);(3)CDK2キナーゼ活性;(4)CDK2発現(CDK2比活性の算出のため);(5)MAD2発現;(6)サイクリンB1;(7)サイクリンE発現;(8)p21発現;および(9)CDK6発現である。
インビボでのバリデーション
上記のインビトロでの結果をさらに確認するために、インビボでのバリデーション研究を行った。感受性および耐性の細胞をヌードマウスに接種した。腫瘍体積が300mm3を超える体積に達した場合に、1日につき20mgのパクリタキセルを5日連続で(接種後34〜38日)腹腔内に投与した。腫瘍サイズを20〜43日に記録した。図7に示したように、感受性の腫瘍は、460mm3〜120mm3に腫瘍体積の有意な減少を示した。対照的に、耐性腫瘍の体積は、43日までに350mm3のままであった。
ヌードマウスにおけるパクリタキセルに対する感受性
感受性および耐性の細胞(1×107細胞/マウス)をヌードマウスに接種した。腫瘍体積が300mm3を超える体積に達した場合に、1日につき20mgのパクリタキセルを5日連続で(接種後34〜38日)腹腔内に投与した。腫瘍サイズを20〜43日に記録した。図7に示したように、感受性の腫瘍は、460mm3〜120mm3に腫瘍体積の有意な減少を示した。対照的に、耐性腫瘍の体積は、43日までに350mm3のままであった(図7)。
Claims (19)
- インビトロでタキサンによって処理された癌細胞のCDK1活性を測定する工程と、
測定されたCDK1活性と、インビトロでタキサンによって処理されたタキサン耐性癌細胞のCDK1活性を比較する工程と、
測定されたCDK1活性がタキサン耐性癌細胞のCDK1活性よりも高いとき、癌細胞がタキサンに対して感受性であると判定する工程と、
を含む、タキサンに対する癌細胞の化学感受性を判定する方法。 - 癌細胞が患者から得られる、請求項1記載の方法。
- 癌細胞が組織試料である、請求項2記載の方法。
- 組織試料が生検組織試料である、請求項3記載の方法。
- 組織試料がエキソビボで培養された生検組織試料である、請求項3記載の方法。
- 組織試料が外科的に切開した組織試料である、請求項3記載の方法。
- 組織試料がエキソビボで培養された外科的に切開した組織試料である、請求項3記載の方法。
- タキサンがパクリタキセルである、請求項1記載の方法。
- タキサンがドセタキセルである、請求項1記載の方法。
- 癌細胞が乳癌細胞、前立腺癌細胞、皮膚癌細胞、肺癌細胞、頭頚部癌細胞、膀胱癌細胞、骨癌細胞、骨髄癌細胞、脳癌細胞、大腸癌細胞、食道癌細胞、胃腸癌細胞、歯肉癌細胞、腎臓癌細胞、肝臓癌細胞、上咽頭癌細胞、卵巣癌細胞、胃癌細胞、精巣癌細胞、舌癌細胞、または子宮癌細胞である、請求項1記載の方法。
- 癌細胞が抗癌治療の適用前に得られる、請求項2記載の方法。
- 抗癌治療が化学療法である、請求項11記載の方法。
- 抗癌治療が放射線療法である、請求項11記載の方法。
- 癌細胞が抗癌治療の適用後に得られる、請求項2記載の方法。
- 抗癌治療が化学療法である、請求項14記載の方法。
- 抗癌治療が放射線療法である、請求項14記載の方法。
- 測定工程が、さらにインビトロでタキサンによって処理されていない癌細胞のCDK2活性を測定し、
比較工程が、さらに測定されたCDK2活性と、インビトロでタキサンによって処理されていないタキサン耐性癌細胞のCDK2活性とを比較し、
判定工程が、測定されたCDK1活性がタキサン耐性癌細胞のCDK1活性より高く、且つ測定されたCDK2活性がタキサン耐性癌細胞のCDK2活性より高いとき、癌細胞がタキサンに対して感受性であると判定する、
請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。 - 測定工程が、さらにインビトロでタキサンによって処理されていない癌細胞のMAD2発現量を測定し、
比較工程が、さらに測定されたMAD2発現量と、インビトロでタキサンによって処理されていないタキサン耐性癌細胞のMAD2発現量とを比較し、
判定工程が、測定されたCDK1活性がタキサン耐性癌細胞のCDK1活性より高く、且つ測定されたMAD2発現量がタキサン耐性癌細胞のMAD2発現量より高いとき、癌細胞がタキサンに対して感受性であると判定する、
請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。 - 測定工程が、さらにインビトロでタキサンによって処理されていない癌細胞のp21発現量を測定し、
比較工程が、さらに測定されたp21発現量と、インビトロでタキサンによって処理されていないタキサン耐性癌細胞のp21発現量とを比較し、
判定工程が、測定されたCDK1活性がタキサン耐性癌細胞のCDK1活性より高く、且つ測定されたp21発現量がタキサン耐性癌細胞のp21発現量より低いとき、癌細胞がタキサンに対して感受性であると判定する、
請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
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