JP5003764B2 - エタノールの製造方法及びエタノール製造用酵母 - Google Patents

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Description

本発明は、例えば木質バイオマスを利用したエタノールの製造方法に関し、更にはセロビオースを炭素源としてエタノールを製造することができるエタノール製造用酵母に関する。
バイオマスを原料とした発酵法によりエタノールを製造する、いわゆるバイオマスエタノールがカーボンニュートラルの観点から注目されている。ここでバイオマスとは、再生可能な、生物由来の有機性資源で化石資源を除いたものと定義される。バイオマスのなかでも、稲わら、もみがら、食品廃棄物、家畜排せつ物、木くず、薪、木炭、チップ、ペレット、ブリケット、製材端材、おが屑、樹皮（バーク）及び建築廃材等に代表される木質バイオマスもまたエタノール製造の原料として利用される。
木質バイオマスは、主としてセルロースを炭素源として含有する。木質バイオマスを原料としてエタノール製造を行う場合、先ず、セルロースをセロビオハイドロラーゼにより糖化して２糖類のセロビオースとする。通常、発酵法を適用したエタノール製造に利用されるSaccharomyces cerevisiaeは、セロビオースを直接発酵することができず、セロビオースをβ-グルコシダーゼにより分解してなるグルコースを発酵に利用している。すなわち、従来、木質バイオマスを利用したエタノール製造においては、セルロースをセロビオースとし、その後、セロビオースをグルコースとするといった２段階の糖化工程が必要であった。したがって、木質バイオマス等のセルロースを含有するバイオマスを利用したエタノール製造には、他のバイオマスを利用したエタノール製造と比較してよりコスト高であり、且つ、製造工程が複雑なものとなる。
以上のように、セルロースやセロビオースを原料としたエタノール製造においては、複数の酵素反応を必須とするため酵素試薬や酵素反応系が必要となり、製造コストが高くなるといった問題があった。そこで、本発明は、上述したような実情に鑑み、低コストでセルロースやセロビオースを原料としたエタノール製造を行うことができるエタノールの製造方法及びエタノール製造用酵母を提供することを目的とする。
上述した目的を達成するため本発明者らが鋭意検討した結果、特定の酵母においてはセロビオースを基質としてエタノールを合成できることを見いだし、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下を包含する。
（１）Ogataea dorogensis、Ogataea pini、Ogataea glucozyma、Ogataea neopini及びOgataea corticisからなる群から選ばれる種に分類される微生物を、セロビオースを含有する培地にて培養する工程と、培地からエタノールを回収する工程とを含むエタノールの製造方法。
（２）Ogataea dorogensis NBRC101078株、Ogataea pini ATCC76276株、Ogataea glucozyma ATCC18938株、Ogataea neopini ATCC28781株及びOgataea corticis NBRC1794株からなる群から選ばれる少なくとも１種の菌株における26s rDNA-D1/D2の塩基配列に対して97%以上の相同性を有する塩基配列からなる26s rDNA-D1/D2を有する微生物を、セロビオースを含有する培地にて培養する工程と、培地からエタノールを回収する工程とを含むエタノールの製造方法。
（３）上記微生物は、Ogataea dorogensis NBRC101078株Ogataea pini ATCC76276株、Ogataea glucozyma ATCC18938株、Ogataea neopini ATCC28781株及びOgataea corticis NBRC1794株からなる群から選ばれる少なくとも１種の菌株に分類される微生物であることを特徴とする（１）又は（２）記載のエタノールの製造方法。
（４）上記セロビオースは、木質バイオマスに含まれるセルロース由来であることを特徴とする（１）又は（２）記載のエタノールの製造方法。
（５）上記木質バイオマスに含まれるセルロースをセロビオハイドロラーゼにより分解する工程を更に含むことを特徴とする（４）記載のエタノールの製造方法。
（６）上記微生物は、セロビオース資化性を有するものであることを特徴とする（１）又は（２）記載のエタノールの製造方法。
（７）上記微生物は、キシロース資化性を更に有するものであることを特徴とする（６）記載のエタノールの製造方法。
（８）Ogataea dorogensis、Ogataea pini、Ogataea glucozyma、Ogataea neopini及びOgataea corticisからなる群から選ばれる種に分類される微生物からなるエタノール製造用酵母。
（９）Ogataea dorogensis NBRC101078株、Ogataea pini ATCC76276株、Ogataea glucozyma ATCC18938株、Ogataea neopini ATCC28781株及びOgataea corticis NBRC1794株からなる群から選ばれる少なくとも１種の菌株における26s rDNA-D1/D2の塩基配列に対して97%以上の相同性を有する塩基配列からなる26s rDNA-D1/D2を有する、エタノール製造用酵母。
（１０）上記微生物は、Ogataea dorogensis NBRC101078株Ogataea pini ATCC76276株、Ogataea glucozyma ATCC18938株、Ogataea neopini ATCC28781株及びOgataea corticis NBRC1794株からなる群から選ばれる少なくとも１種の菌株であることを特徴とする（８）又は（９）記載のエタノール製造用酵母。
（１１）セロビオース資化性を有することを特徴とする（８）又は（９）記載のエタノール製造用酵母。
（１２）キシロース資化性を更に有することを特徴とする（１１）記載のエタノール製造用酵母。
なお、Ogataea dorogensis、Ogataea pini及びOgataea glucozymaは、それぞれPichia dorogensis、Pichia pini及びPichia glucozymaという別称が知られている。したがって、本出願において、Ogataea dorogensis、Ogataea pini及びOgataea glucozymaは、それぞれPichia dorogensis、Pichia pini及びPichia glucozymaと同一の微生物を意味する。
また、Ogataea neopini及びOgataea corticisは、ともにPichia piniとして分類されていた一群の微生物がPichia pini（＝Ogataea pini）とは異なる種として分類されたものである。
本発明に係るエタノールの製造方法によれば、セロビオースを含有する培地においてエタノールの製造を行うことができる。このため、本発明に係るエタノールの製造方法によれば、セロビオースをグルコースに分解するのに必要となる酵素や、当該酵素の反応系を必要とせず低コストに製造できる。
また、本発明によれば、セロビオースを基質としてエタノールを合成するといった新規機能に基づいてエタノール製造に利用することができるエタノール製造用酵母を提供することができる。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2007-310870号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
Ogataea pini ATCC76276株、Ogataea neopini ATCC28781株、Ogataea corticis NBRC1794株、Ogataea glucozyma ATCC18938株及びOgataea dorogensis NBRC101078株を含む酵母について、26s rDNA-D1/D2の塩基配列に基づいて作製された進化系統樹を示す。
以下、本発明を詳細に説明する。本発明に係るエタノールの製造方法では、Ogataea dorogensis、Ogataea pini、Ogataea glucozyma、Ogataea neopini及びOgataea corticisからなる群から選ばれる種に分類される微生物を利用する。Ogataea dorogensisに属する微生物としては、Ogataea dorogensis NBRC101078株を使用することが好ましい。Ogataea piniに属する微生物としては、Ogataea pini ATCC76276株を使用することが好ましい。Ogataea glucozymaに属する微生物としては、Ogataea glucozyma ATCC18938株を使用することが好ましい。Ogataea neopiniに属する微生物としては、Ogataea neopini ATCC28781株を使用することが好ましい。Ogataea corticisに属する微生物としては、Ogataea corticis NBRC1794を使用することが好ましい。また、本エタノールの製造方法において使用できる微生物としては、上記菌株における26s rDNA-D1/D2の塩基配列に対して97%以上の相同性、好ましくは98%以上の相同性、より好ましくは99%以上の相同性を有する塩基配列からなる26s rDNA-D1/D2を有する微生物として定義することもできる。ここで挙げた菌株は、後述する実施例で示すように、セロビオースを基質としてエタノールを製造するといった新規機能を見いだされたものである。すなわち、本発明において使用できる微生物は、上記の種に属する微生物であってセロビオース資化性を有する微生物である。また、本発明において使用できる微生物は、好ましくは、上記の株に属する微生物であってセロビオース資化性を有する微生物である。
ここで、上記菌株において、ATCC番号で特定される菌株は、American Type Culture Collectionに寄託されたものであり、規定の手続きによって当業者が入手することができる。また、上記菌株において、NBRC番号で特定される菌株は、独立行政法人 製品評価技術基盤機構における生物遺伝資源部門（NITE Biological Resource Center）に寄託されたものであり、規定の手続きによって当業者が入手することができる。
また、本エタノールの製造方法において、これら微生物から選ばれる１種類の微生物を使用しても良いし、複数種類の微生物を使用しても良い。
本エタノールの製造方法において使用できる微生物は、上述したATCCやNRBCから分譲された寄託菌株に限定されず、当該寄託菌株と同じ株として分類される菌株を使用することができる。換言すれば、本エタノールの製造方法において使用できる微生物は、上記寄託番号で特定される微生物に限定されず、当該菌株から派生する同一株に分類される微生物をも含む意味である。上記菌株から派生する微生物としては、分譲を受けた菌株に対して例えば突然変異を導入する様な処理を施すことで作製しても良いし、自然環境中から定法に従って単離したものであっても良い。
上述した微生物は、更に遺伝子組換え体の宿主として使用してもよい。すなわち、本発明に係るエタノールの製造方法においては、上述した微生物を宿主として所望の遺伝子を導入した遺伝子組換え体として使用することもできる。
本エタノールの製造方法においては、上述した微生物を、セロビオースを含有する培地において培養する。ここでセロビオースは、例えば木質バイオマスに含まれるセルロースからセロビオハイドロラーゼにより生成されたものであっても良い。すなわち、木質バイオマスからエタノールを製造するに際して、木質バイオマスに含まれるセルロースをセロビオハイドロラーゼの作用によりセロビオースとした後、上述した微生物を使用することによってセロビオースからエタノールを製造することができる。
ここで、木質バイオマスとしては、特に限定されず、稲わら、もみがら、食品廃棄物、家畜排せつ物、木くず、薪、木炭、チップ、ペレット、ブリケット、製材端材、おが屑、樹皮（バーク）及び建築廃材等を挙げることができる。木質バイオマスに含まれるセルロースをセロビオースにする際には、セロビオハイドロラーゼ酵素を作用させるか、セロビオハイドロラーゼを産生する微生物を利用することができる。セロビオハイドロラーゼを産生する微生物としては、例えば、トリコデルマ属又はクロストリジウム属に属する微生物を挙げることができる。また、セロビオハイドロラーゼ酵素製剤を使用する場合にも、上述したトリコデルマ属又はクロストリジウム属に属する微生物由来の酵素を使用することができる。
また、本エタノールの製造方法において培地組成は、特に限定されず、エタノール製造の炭素源としてセロビオースを含有する以外は従来公知の培地組成を適用することができる。なお、本発明に係る新規微生物を培養するための培地には、培養条件等に応じて界面活性剤や消泡剤を添加してもよい。
例えば、セロビオース以外の炭素源としては、単糖、二糖、オリゴ糖及び多糖などの糖質や、酢酸塩等の有機酸塩が挙げられる。ここで、炭素源としては、これら各成分を単独で使用しても良いし、必要に応じ複数成分を混合して使用しても良い。特に、セロビオース以外の炭素源としては、キシロースを挙げることができる。本エタノールの製造方法において使用できる微生物は、セロビオース以外にもキシロース資化性を有するといった特徴を有しているからである。また、窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム及び酢酸アンモニウム等の無機並びに有機アンモニウム塩、尿素、ペプトン、肉エキス、酵母エキス及びカゼイン加水分解物等の窒素含有有機物、グリシン、グルタミン酸、アラニン及びメチオニン等のアミノ酸等が挙げられる。ここで、窒素源としては、これら各成分を単独で使用しても良いし、必要に応じ複数成分を混合して使用しても良い。さらに、金属ミネラル類としては、例えば塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛及び炭酸カルシウム等が挙げられる。ここで、金属ミネラル類としては、これら各成分を単独で使用しても良いし、必要に応じ複数成分を混合して使用しても良い。
本エタノールの製造方法において、上述した微生物を培養する際の培養条件としては、特に限定されず、これら微生物における生育至適範囲のpH及び温度に調整して行われる。具体的にpHの至適範囲は３〜９、好ましくは４〜８、より好ましくは５〜７である。また、温度の至適範囲は、２５〜５０℃、好ましくは３０〜４５℃、より好ましくは３０〜４０℃である。培養は、液体培地を用いた振とう培養でも、固体培地を用いた静置培養でもよい。
特に、培地に含まれるセロビオース濃度は、特に限定されないが、１０〜２０％、好ましくは５〜１０％、より好ましくは３〜５％とする。セロビオースは、培養に先立って培地に添加しても良いし、培養途中で添加（流加培養）してもよい。
本エタノールの製造方法では、培地中からエタノールを回収する。エタノールの回収方法及び回収装置は、特に限定されず、バイオマスエタノールの製造において従来使用されている回収方法及び回収装置を使用することができる。一例として、培地に含まれるエタノールは、蒸留や浸透気化膜を用いた方法によって回収することができる。回収されたエタノールは、使用目的に応じて適宜、精製することができる。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
本実施例では、Pichia属、Candida属、Debaryomyces属又はWilliopusis属に属する46種類の酵母菌株を、セロビオースを含む培地で培養した後、培地中のセロビオース及びエタノール量を測定した。なお、供試した菌株はATCC又はNBRCから分譲を受けた菌株である。
本実施例では、セロビオース（和光純薬）を３．０％、ペプトン（Difco）を０．５％、酵母エキス（Difco）を０．３％及びマルトエキス（Difco）を０．３％となるように調製した培地を用いた。先ず、各菌株について培地液量を６mlとして試験管を用いた前培養を行った。前培養において、植菌量は１白金耳とし、培養温度を３０℃とし、撹拌数を１２０rpm（振幅４０mm）とし、培養日数を1日とした。前培養終了後、各菌株について培地液量を１００mlとしてバッフル付５００ml三角フラスコを用いた本培養を行った。本培養において、植菌量は、植菌時OD＝１となるようにした。本培養において培養温度及び撹拌数は前培養と同条件とした。本培養の培養日数は２日とした。
セロビオース量及びエタノール量は以下のように測定した。すなわち、測定対象の微生物を培養中、1日1回の頻度で、各フラスコから培養液を2点無菌的に抜き出し、OD660、エタノール濃度及びセロビオース濃度の測定を行った。OD660は測定範囲に収まるように希釈し波長660nmの吸収を分光光度計（日立製作所社製 U-2000）で測定した。エタノール濃度及びセロビオース濃度はHPLCで測定した。HPLC条件はいずれも下記の通りとした。
なお、OD660分析は1点のサンプルにつき2回分析を行い、HPLCは1点のサンプルにつき1回分析を行った。
カラム：Bio-rad社 HPX-87H
移動層：0.005NH2SO4
流速：0.6ml/min
カラム温度：35℃
検出：RI
４６種類の菌株についてエタノール収率を以下のように算出した。収率は理論収率に対する収率として以下のとおり求めた。
Figure 0005003764
供試した４６種類の菌株について算出したエタノール収率を表１に示す。
Figure 0005003764
表１から判るように、Pichia pini ATCC76276株、Pichia pini ATCC28781株、Pichia pini NBRC1794株、Pichia glucozyma ATCC18938株及びPichia dorogensis NBRC101078株については、エタノール収率が６０％を超えており、セロビオースを基質としてエタノールを製造できるといった新規機能を見いだすことができた。特に、Pichia pini ATCC76276株、Pichia pini ATCC28781株及びPichia glucozyma ATCC18938株については、エタノール収率が７０％を超えており、エタノール合成能が特に優れた菌株であることが判った。
また、Pichia pini ATCC76276株、Pichia pini ATCC28781株、Pichia pini NBRC1794株、Pichia glucozyma ATCC18938株及びPichia dorogensis NBRC101078株について26s rDNA-D1/D2の塩基配列を決定するとともに、その他の菌株についても26s rDNA-D1/D2の塩基配列を決定し、進化系統樹を作製した。26s rDNA-D1/D2の塩基配列は以下のようにして決定した。すなわち、先ず、DNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN社製）を用いて酵母からゲノムDNAを抽出した。次に、抽出したゲノムDNAを鋳型として、puReTaq Ready-To-Go PCR beads（Amersham Biosciences社製）を用いてPCRを行い、26s rDNA-D1/D2領域を増幅した。このPCRには以下の４種類のプライマーを使用した。
NL1：5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG（配列番号６）
NL2：5'-CTCTCTTTTCAAAGTTCTTTTCATCT （配列番号７）
NL3：5'-AGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAG（配列番号８）
NL4：5'-GGTCCGTGTT TCAAGACGG（配列番号９）
次に、増幅した26s rDNA-D1/D2領域について、ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer System (Applied Biosystems社製)を用いて塩基配列を決定した。Pichia pini ATCC76276株の26s rDNA-D1/D2の塩基配列を配列番号１に示し、 Pichia pini ATCC28781株の26s rDNA-D1/D2の塩基配列を配列番号２に示し、Pichia pini NBRC1794株の26s rDNA-D1/D2の塩基配列を配列番号３に示し、Pichia glucozyma ATCC18938株の26s rDNA-D1/D2の塩基配列を配列番号４に示し、Pichia dorogensis NBRC101078株の26s rDNA-D1/D2の塩基配列を配列番号５に示した。得られた塩基配列情報に基づき、国際塩基配列データベース（GenBank/DDBJ/EMBL）を用いて相同性検索を行った。
以上のような解析結果に基づいて作製した進化系統樹を図１に示した。進化系統樹を作製したところ、従来においてPichia属として分類されていた一群の微生物がPichia属とは異なり、新たにOgataea属として分類されることが明らかとなった。特に、セロビオースを基質としてエタノールを製造できるといった新規機能を有することが判明したPichia pini ATCC76276株、Pichia pini ATCC28781株、Pichia pini NBRC1794株、Pichia glucozyma ATCC18938株及びPichia dorogensis NBRC101078株は、それぞれOgataea pini ATCC76276株、Ogataea neopini ATCC28781株、Ogataea corticis NBRC1794株、Ogataea glucozyma ATCC18938株及びOgataea dorogensis NBRC101078株として分類されることが明らかとなった。特に、エタノール収率に優れていたNo.11 Pichia opini ATCC28781株及びNo.23 Pichia pini NBRC1794株は、共にOgataea piniには分類されず新種であり、それぞれOgataea neopini ATCC28781株、Ogataea corticis NBRC1794株であると結論付けられた。
以上の結果から、Ogataea dorogensisに属する微生物、Ogataea piniに属する微生物、Ogataea glucozymaに属する微生物、Ogataea neopiniに属する微生物及びOgataea corticisに属する微生物には、セロビオースからエタノールを合成する機能に優れた微生物があることが示された。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (5)

  1. Ogataea dorogensis NBRC101078株、Ogataea pini ATCC76276株、Ogataea neopini ATCC28781株及びOgataea corticis NBRC1794株からなる群から選ばれる少なくとも１種の微生物を、セロビオースを含有する培地にて培養する工程と、
    培地からエタノールを回収する工程と
    を含むエタノールの製造方法。
  2. 上記セロビオースは、木質バイオマスに含まれるセルロース由来であることを特徴とする請求項１記載のエタノールの製造方法。
  3. 上記木質バイオマスに含まれるセルロースをセロビオハイドロラーゼにより分解する工程を更に含むことを特徴とする請求項２記載のエタノールの製造方法。
  4. 上記微生物は、セロビオース資化性を有するものであることを特徴とする請求項１記載のエタノールの製造方法。
  5. 上記微生物は、キシロース資化性を更に有するものであることを特徴とする請求項４記載のエタノールの製造方法。
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