JP4980997B2 - ヒトトロンボポエチン受容体に対するアゴニスト抗体の製造方法 - Google Patents
ヒトトロンボポエチン受容体に対するアゴニスト抗体の製造方法 Download PDFInfo
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Description
トロンボポエチン(Thrombopoietin:TPO)は、生体内で巨核球および血小板の増殖を促進する造血因子である。ヒトTPOは全長332アミノ酸残基からなる糖タンパク質であり、その活性にはN末端側の配列が重要であることが知られている。細胞膜上のTPO受容体と結合することで機能を発揮する。
TPOと同様にc-Mplを介してシグナルを入れる性質を持ちながら、分子としては全く異なる種々のTPOミメティクスが研究されている(非特許文献6,7参照)。ミメティクスには大きく分けて、ペプチド性低分子、非ペプチド性低分子、抗体由来分、アゴニスト抗体などが知られている。
本発明において、抗体とは、これまで全長抗体では困難であった、ヒトc-Mplに対し天然のリガンドであるTPOとほぼ同等のシグナルを入れることができ、プライマリーヒト細胞に対する増殖刺激活性を有する抗体である。
1.ヒトトロンボポエチン受容体に対するアゴニスト抗体
本発明にかかるヒトトロンボポエチン受容体に対するアゴニスト抗体は、以下の(1)〜(6)に示す抗体を含む。
(1)抗体の定常領域が以下の(i)〜(iii):
(i) ヒト抗体の重鎖定常領域及び軽鎖定常領域のアミノ酸配列、
(ii) ヒト抗体サブクラス間で重鎖定常領域のドメインを入れ替えた重鎖定常領域のアミノ酸配列、及び、ヒト抗体軽鎖定常領域のアミノ酸配列、或いは
(iii) 前記(i)又は(ii)のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列、
のいずれかのアミノ酸配列を有し、且つ抗体の可変領域がヒトトロンボポエチン受容体に結合し該受容体を活性化する能力を有する、並びに、以下の(a)及び/又は(b):
(a) ヒト臍帯血CD34+細胞を用いたCFU-MKコロニー形成測定法において、10,000ng/mL以下の濃度でコロニー形成を誘導すること、
(b) UT7/TPO細胞を用いた増殖能測定法において、活性が下記の構造を有するPEG-rHuMGDFの50%以上であり、かつ50%有効濃度(EC50)が100nM以下であること、
の性質を有する、ヒトトロンボポエチン受容体に対するアゴニスト抗体。
PEG-NH-SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVLHSRLSQCPEVHPLPTPVLLPAVDFSLGEWKTQMEETKAQDILGAVTLLLEGVMAARGQLGPTCLSSLLGQLSGQVRLLLGALQSLLGTQLPPQGRTTAHKDPNAIFLSFQHLLRGKVRFLMLVGGSTLCVRRAPPTTAVPS-COOH
を有するものである。
(i) 以下の(a)および(b)の性質を有する、ヒトトロンボポエチン受容体に対するアゴニスト抗体。
(a) ヒト臍帯血CD34+細胞を用いたCFU-MKコロニー形成測定法において、10,000ng/mL以下の濃度でコロニー形成を誘導する。
(b) UT7/TPO細胞を用いた増殖能測定法において、最大活性が下記の構造を有するPEG-rHuMGDFの50%以上であり、かつ50%有効濃度(EC50)が100nM以下である。
(ii) 以下の(a)および(b)の性質を有する、ヒトc-Mplに対するアゴニスト抗体。
(a) ヒト臍帯血CD34+細胞を用いたCFU-MKコロニー形成測定法において、1,000ng/mL以下の濃度でコロニー形成を誘導する。
(b) UT7/TPO細胞を用いた増殖能測定法において、最大活性がPEG-rHuMGDFの70%以上であり、かつEC50が10nM以下である。
(iii) 以下の(a)および(b)の性質を有する、ヒトc-Mplに対するアゴニスト抗体。
(a) ヒト臍帯血CD34+細胞を用いたCFU-MKコロニー形成測定法において、100ng/mL以下の濃度でコロニー形成を誘導する。
(b) UT7/TPO細胞を用いた増殖能測定法において、最大活性がPEG-rHuMGDFの90%以上であり、かつEC50が1nM以下である。
(a) 配列番号2で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号3で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。(抗体の名称:7-10)
(b) 配列番号4で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号5で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。(抗体の名称:4-49)
(c) 配列番号6で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号7で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。(抗体の名称:6-4-50)
(d) 配列番号8で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号9で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。(抗体の名称:6-5-2)
(e) 配列番号2で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号3で示されるアミノ酸配列においてフレームワーク領域に1若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域。
(f) 配列番号4で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号5で示されるアミノ酸配列においてフレームワーク領域に1若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
(g) 配列番号6で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号7で示されるアミノ酸配列においてフレームワーク領域に1若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
(h) 配列番号8で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号9で示されるアミノ酸配列においてフレームワーク領域に1若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
本発明に係る重鎖改変アゴニスト抗体とは、以下のものを含む。
(1)重鎖定常領域のアッパーヒンジ部が、以下の(a)〜(b)のアミノ酸配列から選択されるいずれか1つのアミノ酸配列を有し、並びに、該重鎖定常領域のミドルヒンジ部以降のC末端側がヒトイムノグロブリンG4のアミノ酸配列或いは該G4のアミノ酸配列においてADCC(抗体依存性細胞障害)活性等に係るアゴニスト抗体として好ましくない性質に関する部位を変異させたアミノ酸配列を有するアゴニスト抗体。
(a) 配列番号10で示されるアミノ酸配列。
(b) 配列番号11で示されるアミノ酸配列。
(i) 重鎖定常領域のアッパーヒンジ部が以下の(a)〜(b)のアミノ酸配列から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列を有し、並びに、該重鎖定常領域のミドルヒンジ部以降のC末端側がヒトイムノグロブリンG4のアミノ酸配列或いは該G4のアミノ酸配列においてKabat EU番号付けにおける228位セリンがプロリンに且つ235位ロイシンがグルタミン酸に置換されたアミノ酸配列を有する重鎖を含むヒトc-Mplに対するアゴニスト抗体。
(a) 配列番号10で示されるアミノ酸配列。
(b) 配列番号11で示されるアミノ酸配列。
(ii) 更に好ましい実施形態としては、以下(a)〜(h)からなる群から選択される、上記(i)に記載のヒトc-Mplに対するアゴニスト抗体を挙げることができる。
(a) 配列番号2のアミノ酸配列を含む重鎖と配列番3のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体。
(b) 配列番号4のアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号5のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体。
(c) 配列番号6のアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体。
(d) 配列番号8のアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号9のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体。
(e) 配列番号2のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号3のアミノ酸配列においてフレームワーク領域に1若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体。
(f) 配列番号4のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号5のアミノ酸配列においてフレームワーク領域に1若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体。
(g) 配列番号6のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号7のアミノ酸配列においてフレームワーク領域に1若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体。
(h) 配列番号8のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号9のアミノ酸配列においてフレームワーク領域に1若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体。
本発明に係るヒトc-MPLに対するアゴニスト抗体は、c-Mp1受容体に結合しそれを活性化する能力、および/または(インビボおよびインビトロの両方で)血小板の産生を刺激する能力(「血小板生成活性」)および血小板前駆体の産生を刺激する能力(「巨核球生成活性」)を有する。
(1)上記1.(1)〜(6)及び同2.(3)のいずれかの抗体を有効成分とする医薬組成物。
(2)上記1.(1)〜(6)及び同2.(3)のいずれかに記載の抗体を有効成分とする血小板増多剤。
(3)骨髄移植、臍帯血移植時の血小板回復促進用であることを特徴とする上記(2)に記載の血小板増多剤
(4)上記1.(1)〜(6)及び同2.(3)のいずれかの抗体を有効成分とする血小板減少症治療剤。
(5)血小板減少症が、以下の(a)〜(f)のいずれか1つである、上記(4)に記載の血小板減少症治療剤。
(a) 特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、
(b) 癌化学療法後の血小板減少症、
(c) 再生不良性貧血、
(d) 骨髄異形性症候群(MDS)、
(e) 肝疾患にともなう血小板減少症、又は
(f) 骨髄移植もしくは臍帯血移植後の血小板減少症。
(6)造血幹細胞移植後の血球回復促進用であるヒトc-Mplアゴニスト抗体を有効成分として含む血球増多剤。
(7)上記1.(1)〜(6)及び同2.(3)のいずれかに記載の抗体を有効成分として含む上記(6)に記載の血球増多剤。
本発明の抗体は、本発明に係る抗体を産生するハイブリドーマを用いて抗体を製造してもよいし、又は、ハイブリドーマ等の抗体産生細胞からモノクローナル抗体をコードする遺伝子をクローニングし、適当なベクターに組み込んで、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体を製造することもできる。
ヒトトロンボポエチン受容体(c-Mpl)に対するアゴニスト抗体の製造方法であって、該抗体の定常領域が、以下の(1)〜(3):
(1) ヒト抗体の重鎖定常領域及び軽鎖定常領域のアミノ酸配列、
(2) ヒト抗体サブクラス間で重鎖定常領域のドメインを入れ替えた重鎖定常領域のアミノ酸配列、及び、ヒト抗体軽鎖定常領域のアミノ酸配列、或いは
(3) 前記(1)又は(2)のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列、
のいずれかのアミノ酸配列を有し、且つ抗体の可変領域がヒトトロンボポエチン受容体に結合し該受容体を活性化する能力を有する、並びに、以下の(a)及び(b):
(a) ヒト臍帯血CD34+細胞を用いたCFU-MKコロニー形成測定法において、10,000ng/mL以下の濃度でコロニー形成を誘導すること、及び
(b) UT7/TPO細胞を用いた増殖能測定法において、最大活性が、そのN末端がペグ(PEG)化された配列番号1のアミノ酸配列からなる下記の構造:
PEG-NH-SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVLHSRLSQCPEVHPLPTPVLLPAVDFSLGEWKTQMEETKAQDILGAVTLLLEGVMAARGQLGPTCLSSLLGQLSGQVRLLLGALQSLLGTQLPPQGRTTAHKDPNAIFLSFQHLLRGKVRFLMLVGGSTLCVRRAPPTTAVPS-COOH
を有するPEG-rHuMGDFの50%以上であり、且つ50%有効濃度(EC50)が100nM以下であること、
の性質を有する前記アゴニスト抗体を構成する重鎖及び軽鎖をそれぞれコードする塩基配列を含むDNAと、それらのDNAの発現を制御する塩基配列を含む1又は複数のDNAとを保持する哺乳動物細胞を作製し、該哺乳動物細胞を培養した培養液から、該重鎖及び軽鎖からなる抗体をコードする塩基配列を含むDNAの発現産物を単離精製することを含む、上記方法。
(a) ヒト臍帯血CD34+細胞を用いたCFU-MKコロニー形成測定法において、1,000ng/mL以下の濃度でコロニー形成を誘導すること、及び
(b) UT7/TPO細胞を用いた増殖能測定法において、最大活性がPEG-rHuMGDFの70%以上であり、且つEC50が10nM以下であること、
の性質を有する。
(a) ヒト臍帯血CD34+細胞を用いたCFU-MKコロニー形成測定法において、100ng/mL以下の濃度でコロニー形成を誘導すること、及び
(b) UT7/TPO細胞を用いた増殖能測定法において、最大活性がPEG-rHuMGDFの90%以上であり、かつEC50が1nM以下であること、
の性質を有する。
(1) 配列番号2で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号3で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
(2) 配列番号4で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号5で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
(3) 配列番号6で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号7で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
(4) 配列番号8で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号9で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
(5) 配列番号2で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号3で示されるアミノ酸配列においてフレームワーク領域に1若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
(6) 配列番号4で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号5で示されるアミノ酸配列においてフレームワーク領域に1若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
(7) 配列番号6で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号7で示されるアミノ酸配列においてフレームワーク領域に1若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び
(8) 配列番号8で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号9で示されるアミノ酸配列においてフレームワーク領域に1若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
からなる群から選択される重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有する。
(1) 配列番号10で示されるアミノ酸配列、及び
(2) 配列番号11で示されるアミノ酸配列、
のアミノ酸配列から選択されるいずれか1つのアミノ酸配列を有し、並びに、該重鎖定常領域のミドルヒンジ部以降のC末端側が、ヒトイムノグロブリンG4のアミノ酸配列或いは該G4のアミノ酸配列においてKabat EU番号付けにおける228位セリンがプロリンに且つ235位ロイシンがグルタミン酸に置換されたアミノ酸配列を有する。
下記の(a)〜(h):
(a) 配列番号2のアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号3のアミノ酸配列を含む軽鎖をコードする塩基配列、
(b) 配列番号4のアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号5のアミノ酸配列を含む軽鎖をコードする塩基配列、
(c) 配列番号6のアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖をコードする塩基配列、
(d) 配列番号8のアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号9のアミノ酸配列を含む軽鎖をコードする塩基配列、
(e) 配列番号2のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号3のアミノ酸配列においてフレームワーク領域に1若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖をコードする塩基配列、
(f) 配列番号4のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号5のアミノ酸配列においてフレームワーク領域に1若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖をコードする塩基配列、
(g) 配列番号6のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号7のアミノ酸配列においてフレームワーク領域に1若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖をコードする塩基配列、及び
(h) 配列番号8のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号9のアミノ酸配列においてフレームワーク領域に1若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖をコードする塩基配列、
からなる群から選択される、重鎖をコードする塩基配列を含むDNA及び軽鎖をコードする塩基配列を含むDNAと、それらのDNAの発現を制御する塩基配列を含む1又は複数のDNAとを保持する哺乳動物細胞を作製し、該哺乳動物細胞を培養した培養液から、該重鎖及び軽鎖からなる抗体をコードするDNAの発現産物を単離精製することを含む、ヒトc-Mplに対するアゴニスト抗体の製造方法。
本発明に係るDNAとして、以下のものを挙げることができる。
(1)ヒトMplに対するアゴニスト抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む新規なDNAであって、以下の(a)〜(d)からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むDNA:
(a) 配列番号2で示されるアミノ酸配列;
(b) 配列番号4で示されるアミノ酸配列;
(c) 配列番号6で示されるアミノ酸配列;
(d) 配列番号8で示されるアミノ酸配列。
(2)ヒトMplに対するアゴニスト抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む新規なDNAであって、以下の(a)〜(h)からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むDNA:
(a) 配列番号3で示されるアミノ酸配列;
(b) 配列番号5で示されるアミノ酸配列;
(c) 配列番号7で示されるアミノ酸配列;
(d) 配列番号9で示されるアミノ酸配列;
(e) 配列番号3のアミノ酸配列においてフレームワーク領域に1若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列;
(f) 配列番号5のアミノ酸配列においてフレームワーク領域に1若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列;
(g) 配列番号7のアミノ酸配列においてフレームワーク領域に1若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列;
(h) 配列番号9のアミノ酸配列においてフレームワーク領域に1若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列。
(3)上記(1)又は(2)のDNAが、それぞれ可変領域及び定常領域を含む抗体重鎖或いは軽鎖をコードするDNA。
(4)抗体の重鎖定常領域のアッパーヒンジ部が、以下の(a)及び(b)のアミノ酸配列から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列を有し、並びに、該重鎖定常領域のミドルヒンジ部以降のC末端側がヒトイムノグロブリンG4のアミノ酸配列或いは該G4のアミノ酸配列においてKabat EU番号付けにおける228位セリンがプロリンに且つ235位ロイシンがグルタミン酸に置換されたアミノ酸配列を有する、上記(3)に記載の抗体重鎖をコードするDNA。
(a) 配列番号10で示されるアミノ酸配列。
(b) 配列番号11で示されるアミノ酸配列。
本発明は、プライマリーヒト細胞に作用する抗ヒトc-Mplアゴニストヒト抗体を提供する。
本明細書において抗体とは、Fab領域、ヒンジ領域、Fc領域を有する抗体を意味し、天然に存在する抗体、及び、同様の構成を有する範囲において、それ自体公知の方法で得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマにより産生される、或いは、一旦抗体遺伝子を取得しそれを用いて遺伝子工学的に産生される抗体、更に部位特異的突然変異誘発法により一部改変され遺伝子工学的に産生される抗体を含む。そして本発明に係るヒトcMplに対するアゴニスト抗体及び重鎖改変アゴニスト抗体は前述した通りのものである。
本発明の抗体は、種々の方法により生産できるが、まずは本発明抗体産生ハイブリドーマを得る必要がある。後述の実施例1に記載するような本発明の抗原を用い、マウス等を免疫し、特にヒト抗体を得る場合にはヒト抗体産生トランスジェニックマウスなどの非ヒト哺乳動物に免疫する。モノクローナル抗体は、定法に従い、免疫感作動物から得た抗体産生細胞と、自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞(ミエローマ細胞)を融合することにより得られるハイブリドーマを培養し、免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって取得することができる。取得した抗体群から更にアゴニスト抗体を選択する必要があるが、アゴニスト抗体の作用対象受容体に対するリガンドの活性測定方法として確立した方法を用いればよく、ヒトc-Mplに対するアゴニスト抗体を選択する場合は、後述の実施例5に示したUT7/TPO細胞増殖アッセイ等のTPO活性測定方法として既に確立された方法を用いて適宜行うことができる。
一般にヒトc-mpl抗体を得る場合には、ヒトc-Mplタンパク質の一次構造が公知(Genbank: NP_005364参照)であるので、当業者に周知の方法により、c-Mplのアミノ酸配列からペプチドを化学合成し、これを抗原として使用することができ、またc-Mplの細胞膜貫通領域および細胞内領域を欠損した可溶化c-Mpl組換えタンパク質を抗原として用いることもできる。
上記(1)で得られた抗原と、フロインドの完全若しくは不完全アジュバント、又はカリミョウバンのような助剤とを混合し、免疫原として実験動物に免疫する。実験動物としては、遺伝子改変によってヒト抗体を産生する能力を有するマウス(ヒト抗体産生マウス)が最適である。
ミエローマとしては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ又はヒト等の哺乳動物に由来する自己抗体産生能のない細胞を用いることが出来るが、一般的にはマウスから得られた株化細胞、例えば8-アザグアニン耐性マウス(BALB/c由来)ミエローマ株P3X63Ag8U.1(P3-U1)[Yelton, D.E. et al. Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1-7(1978)]、P3/NSI/1-Ag4-1(NS-1) [Kohler, G. et al. European J. Immunology, 6, 511-519 (1976)]、Sp2/O-Ag14(SP-2)[Shulman, M. et al. Nature, 276, 269-270 (1978)]、P3X63Ag8.653(653)[Kearney, J. F. et al. J. Immunology, 123, 1548-1550(1979)]、P3X63Ag8(X63)[Horibata, K. and Harris, A. W. Nature, 256, 495-497 (1975)]などを用いることが好ましい。これらの細胞株は、適当な培地、例えば8-アザグアニン培地[グルタミン、2-メルカプトエタノール、ゲンタマイシン及びウシ胎児血清(以下、「FCS」という)を加えたRPMI-1640培地に8-アザグアニンを加えた培地]、イスコフ改変ダルベッコ培地(Iscove's Modified Dulbecco's Medium;以下、「IMDM」という)、又はダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco's Modified Eagle Medium;以下、「DMEM」という)で継代培養するが、細胞融合の3〜4日前に正常培地(例えば、10% FCSを含むDMEM培地)で継代培養し、融合当日に2×107以上の細胞数を確保しておく。
抗体産生細胞は、形質細胞、及びその前駆細胞であるリンパ球であり、これは個体のいずれの部位から得てもよく、一般には脾臓、リンパ節、骨髄、扁桃、末梢血、又はこれらを適宜組み合わせたもの等から得ることができるが、脾細胞が最も一般的に用いられる。
上記ミエローマ細胞が、8-アザグアニン耐性株である場合、すなわち、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT)欠損株である場合、融合しなかった該ミエローマ細胞、及びミエローマ細胞どうしの融合細胞は、HAT含有培地中では生存できない。一方、抗体産生細胞どうしの融合細胞、あるいは、抗体産生細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマは生存することができるが、抗体産生細胞どうしの融合細胞には寿命がある。従って、HAT含有培地中での培養を続けることによって、抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合細胞であるハイブリドーマのみが生き残り、結果的にハイブリドーマを選択することができる。コロニー状に生育してきたハイブリドーマについて、HAT培地からアミノプテリンを除いた培地(以下、「HT培地」という)への培地交換を行う。以後、培養上清の一部を採取し、例えば、フローサイトメトリー法により抗ヒトc-Mpl抗体価を測定する。以上、8-アザグアニン耐性の細胞株を用いる方法を例示したが、その他の細胞株もハイブリドーマの選択方法に応じて使用することができ、その場合使用する培地組成も変化する。
前述(2)の記載と同様の方法で抗体価を測定することにより、特異的抗体を産生することが判明したハイブリドーマを、別のプレートに移しクローニングを行う。このクローニング法としては、プレートの1ウェルに1個のハイブリドーマが含まれるように希釈して培養する限界希釈法、軟寒天培地中で培養しコロニーを回収する軟寒天法、マイクロマニュピレーターによって1個ずつの細胞を取り出し培養する方法、セルソーターによって1個の細胞を分離する「ソータクローン」などが挙げられるが、限界希釈法が簡便であり、よく用いられる。
得られた抗ヒトc-Mplモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株の培養上清或いは後記(8)に従って該上清より精製した抗体を、種々のTPO活性測定系にて測定することにより、アゴニスト抗体を選択することができる。スクリーニングとして好適な方法として、哺乳動物細胞にヒトMplを発現させ、細胞増殖アッセイを行う方法が挙げられる。例えばマウス細胞株BaF3にヒトMplを発現させた細胞による増殖アッセイ(Orita et al. Blood. 2005 Jan 15;105(2):562-6.)等も使用し得るが、マウス細胞を用いた場合に、ヒト細胞の反応を反映しているとは限らないことを考慮すると、よりヒト細胞に強い活性を持つ抗体を選抜するにはヒトMplが発現しているヒト細胞を用いる増殖アッセイ方法がより好ましい。ヒト細胞による系として具体的には、後述の実施例5に記載のUT7/TPO細胞を用いた細胞増殖アッセイを挙げることができる。
クローニングを完了したハイブリドーマは、培地をHT培地から正常培地に換えて培養される。大量培養は、大型培養瓶を用いた回転培養、スピナー培養、あるいはホローファイバーシステム等を用いた培養で行われる。この大量培養における上清を、ゲルろ過等、当業者に周知の方法を用いて精製することにより、抗ヒトc-Mplモノクローナル抗体を得ることができる。また、同系統のマウス(例えばBALB/c)若しくはnu/nuマウス、ラット、モルモット、ハムスター又はウサギ等の腹腔内で該ハイブリドーマを増殖させることにより、抗ヒトc-Mplモノクローナル抗体を大量に含む腹水を得ることができる。精製の簡便な方法としては、市販のモノクローナル抗体精製キット(例えば、MAbTrap GIIキット;アマシャムファルマシアバイオテク社製)等を利用することもできる。かくして得られるモノクローナル抗体は、ヒトc-Mplに対して高い抗原特異性を有する。
かくして得られたモノクローナル抗体のアイソタイプ及びサブクラスの決定は以下のように行うことができる。まず、同定法としてはオクテルロニー(Ouchterlony)法、ELISA法、又はRIA法が挙げられる。オクテルロニー法は簡便ではあるが、モノクローナル抗体の濃度が低い場合には濃縮操作が必要である。一方、ELISA法又はRIA法を用いた場合は、培養上清をそのまま抗原吸着固相と反応させ、さらに二次抗体として各種イムノグロブリンアイソタイプ、サブクラスに対応する抗体を用いることにより、モノクローナル抗体のアイソタイプ、サブクラスを同定することが可能である。さらに、タンパク質の定量は、フォーリンロウリー法、及び280nmにおける吸光度[1.4(OD280)=イムノグロブリン1mg/mL]より算出する方法等により行うことができる。また、ハイブリドーマからモノクローナル抗体をコードする遺伝子をクローニングし、配列を決定することでサブクラスを特定することもできる。
また、ハイブリドーマ等の抗体産生細胞からモノクローナル抗体をコードする遺伝子をクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主(例えば哺乳類細胞細胞株、酵母細胞、昆虫細胞など)に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体を調製することもできる(P.J.Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY、P.Shepherd and C.Dean., Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS, J.W.Goding., Monoclonal Antibodies:principles and practice., 1993 ACADEMIC PRESS)。
本発明は、上で述べたように、
(1) ヒトMplに対するアゴニスト抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列であって以下の(a)〜(d)から選択されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むDNA:
(a) 配列番号2で示されるアミノ酸配列;
(b) 配列番号4で示されるアミノ酸配列;
(c) 配列番号6で示されるアミノ酸配列;
(d) 配列番号8で示されるアミノ酸配列;
及び、
(2) ヒトMplに対するアゴニスト抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列であって以下の(a)〜(h)から選択されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むDNA:
(a) 配列番号3で示されるアミノ酸配列;
(b) 配列番号5で示されるアミノ酸配列;
(c) 配列番号7で示されるアミノ酸配列;
(d) 配列番号9で示されるアミノ酸配列;
(e) 配列番号3のアミノ酸配列においてフレームワーク領域に1若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列;
(f) 配列番号5のアミノ酸配列においてフレームワーク領域に1若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列;
(g) 配列番号7のアミノ酸配列においてフレームワーク領域に1若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列;
(h) 配列番号9のアミノ酸配列においてフレームワーク領域に1若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列;
を提供するものであり、上記2.の本発明に係るヒトMplに対するアゴニスト抗体の製法、より具体的には、遺伝子組換え技術を用いた抗体の製造において、用いることができる。
本発明に係るヒトc-Mplに対するアゴニスト抗体は、c-MPL受容体に結合しそれを活性化する能力、および/または(インビボおよびインビトロの両方で)血小板の産生を刺激する能力(「血小板生成活性」)および血小板前駆体の産生を刺激する能力(「巨核球生成活性」)を有する。
1-1 ヒトc-Mpl発現細胞の作製
抗原タンパク質を発現する細胞株を免疫に用いる場合、一般的に発現量が高いほど抗体作製には有利である。ヒトc-Mpl発現細胞株としては、各種ヒト巨核球系細胞株や強制発現株が知られているが、これらの細胞株のc-Mpl発現量は細胞あたり数千分子と低く、抗原には不向きである。実際、マウス造血系細胞株であるFDCP2にヒトc-Mplを導入した発現株FDCP-hMpl(FEBS Lett. 1996 Oct 21;395(2-3):228-34.参照)をヒト抗体産生マウス(KMマウスTM)に免疫した場合、抗体価上昇が不十分であり、hMpl特異的なヒト抗体を得ることができなかった。また、ヒト巨核球系細胞株を抗原として用いる場合、他の膜分子に対する抗体も誘導されるため、c-Mpl特異的な抗体を効率良く誘導するためには、マウス細胞株、しかも可能な限りMHC適合した細胞株を宿主に、ヒトc-Mplを導入した高発現株を用いるのが望ましい。そこで、ヒトc-Mpl(hMpl)高発現株を作製するために、hMpl発現ベクターを以下の通り作製し、かつ2種類のマウス細胞株(L929およびFM3A)へ導入を行った。
hMplの全長cDNAを保持するプラスミドDNAであるhumpl-Pas12(Bartley TDら、 Cell 1994 Jul 1;77(7):1117-1124.或はMorita Hら、FEBS Lett. 1996 Oct 21;395(2-3):228-234.)のDNAを鋳型としてhMplのコーディング領域全域を増幅するPCR反応を実施した。プライマーとして、末端に連結のための制限酵素部位(5’末側EcoRI、3’末側XbaI)を付加するようにデザインした、Mpl_F1及びMpl_R2を用いて、KOD-Plus- DNAポリメラーゼ(東洋紡績(株)製、日本)によるPCRで増幅した。以下、実施例中のPCRの反応温度調節は、ジーンアンプPCRシステム9700((株)パーキンエルマー・ジャパン社製)を使用した。反応温度条件としては、94℃の初期温度で5分間の加熱後、98℃/10秒間と68℃/3分間のサイクルを30回反復し、最後に72℃/7分間加熱した。増幅したPCR断片は、エタノール沈殿で回収した後、アガロースゲル電気泳動で分離し、メンブランを用いるDNA精製キットであるQIAquick Gel Extraction Kit(キアゲン社製)にて精製した。精製したDNA断片をpCR4Blunt- TOPO ベクター(東洋紡績(株)製)にサブクローニングを行い、得られたクローンのプラスミドDNAについてインサートDNAの塩基配列を解析した。DNA塩基配列決定のためのプライマーとして、M13-20FW及びM13RVを用いた。挿入部分のDNA塩基配列解析を行い、hMplの配列(GenBank ACCESSION :M90102)と相違がなく、また、プライマー部分もデザインどおりの配列を有するプラスミドDNAを選択した。次に、hMplの配列を含むプラスミドDNAを精製した後、制限酵素EcoRIとXbaIで消化して、アガロースゲル電気泳動で約2kb弱のDNAを回収し精製した。他方、ヒトEFプロモーターとブラストサイジン(Bsd)選択マーカーを有する発現ベクターであるpEF6/Myc-His(インビトロジェン(株)社製)、及び、CMVプロモーターとネオマイシン(Neo)選択マーカーを有するpEGEP-N1ベクター(ベクトン・ディキンソン・バイオサイエンス・クローンテック社製)についても、同様に制限酵素EcoRI、とXbaIでの消化処理を行った後、脱リン酸化のためにAlkaline Phosphatase (E. coli C75)(タカラバイオ(株)、日本)で処理した後に、アガロースゲル電気泳動とDNA精製キットでDNAを回収した。精製したhMplの全領域DNA断片を、それぞれの発現ベクターDNAにT4 DNA ligase を用いてライゲーションして、大腸菌DH10Bへ導入し、それぞれ形質転換体を得た。インサートDNAを含む形質転換体のプラスミドDNAについてDNA塩基配列を解析して、hMplの全長cDNAが挿入されたpEF-MPL635及びpCMV-MPL635を取得した。
Mpl_F1:5’-AGAGAGAGAG GAATTCGCCA CCATGCCCTC CTGGGCCCTC TT-3’(配列番号12)
Mpl_R2:5’- AGAGAGAGAG CGGCCGCTCA AGGCTGCTGC CAATAGCTTA GTG -3’(配列番号13)
M13-20FW: 5’-GTAAAACGACGGCCAGTG-3’(配列番号14)
M13RV:5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’(配列番号15)
TPO非依存性に細胞内のシグナル活性化が報告されているhMpl変異体(508番目TrpがSerに変換している変異体、Abe Mら、Leukemia. 2002 Aug;16(8):1500-1506)の発現ベクターを作製した。508番目のアミノ酸残基をコードするコドンを変更(TGG→TCG)するために、pEF-MPL635のDNAを鋳型として、GeneEditorTM in vitro Site-Directed Mutagenesis System(プロメガ社)を用いた部位特異的変異導入法を実施した。変異導入用オリゴヌクレオチド(5’末端リン酸化済み)としては、Mut_MplSer508を用いた。目的の変異導入用オリゴヌクレオチドと上記キット付属のSelection Oligonucleotideを鋳型DNAとアニーリングさせて変異導入鎖を合成した後、GeneEditorTM Antibiotic Selection Mix存在下では変異体のみが増殖することを利用して変異体を選択した。より具体的には、dsDNAテンプレートをアルカリ条件下(0.2M NaOH、0.2 mMEDTA(最終濃度))室温で5分間インキュベートした後、2M酢酸アンモニウム(pH4.6)を10分の1容量加えて中和してからエタノール沈殿により回収した。アルカリ変性処理した鋳型DNAに、変異導入用オリゴヌクレオチドと新しい抗生物質耐性獲得用Selection Oligonucleotide(5’末端リン酸化)、及び、キット添付のアニーリングバッファーを加えた後、75℃で5分間保温し、37℃にゆっくり下げることによりアニーリングを行なった。次に、変異鎖の合成と連結のために、キット付属のSynthesis 10×buffer、T4 DNA Polymerase、及びT4 DNA ligaseを加えて、37℃で90分反応を行なった。GeneEditorTM Antibiotic Selection Mix存在下でコンピテントセルBMH 71-18 mutSに形質転換して培養した形質転換体大腸菌よりプラスミドDNAを調製し、更にそのDNAによりコンピテントセルJM109を形質転換後、GeneEditorTM Antibiotic Selection Mixを含むLBプレートに播種した。プレートに生じた形質転換体を培養して、プラスミドDNAのDNA塩基配列を解析して、508番目のアミノ酸が変換(TrpからSer)したhMplを発現するpEF-MPL635-Serベクターを取得した。
Mut_MplSer508:5’-CTGCTGCTGC TGAGGTCGCA GTTTCCTGCA CACTAC-3’(配列番号16)
作製したpEF-MPL635ベクター(1μg)を、Lipofectamine試薬(Invitrogenより購入)および Lipofectamine PLUS(Invitrogenより購入)試薬と混合し、さらに無血清Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)培地と混合した。混合液を1.5×105cells/well で6-well plateに培養したL929細胞に添加し、3時間培養することで細胞にDNAを導入した。10%ウシ胎児血清(FBS)添加DMEM培地にて一晩培養し、翌日より、培地に10μg/mL Blasticidin(Invitrogenより購入)を加えて薬剤耐性細胞を選抜した。その後、抗c-Mpl抗体を用いたFluorescence Activated Cell Sorting(FACS)法にてc-Mpl発現細胞を単離し、全長ヒトc-Mpl発現L929細胞株(以下、L929-hMpl)を樹立した。FACSはFACS-Vantage(Becton Dickinson社製)によって行った。選抜後は5μg/mL Blasticidin, 10%FBS添加DMEM培地にて培養、維持した。
上記 3)と同様の方法でpEF-MPL635ベクターをFM3A細胞に導入し、全長ヒトc-Mpl発現FM3A細胞株(以下、FM3A-hMpl)を樹立した。5μg/mL Blasticidin, 10%FBS添加 Roswell Park Memorial Institute(RPMI)培地にて培養、維持した。
上記、pEF-MPL635-Serベクターを、3)と同様の方法で、FM3A細胞に導入し、hMpl-Ser発現FM3A細胞株(以下、FM3A-hMpl-Ser)を樹立した。5μg/mL Blasticidin, 10%FBS添加RPMI培地にて培養、維持した。
ヒトc-Mplの細胞膜貫通領域および細胞内領域を欠失させた、下記配列の可溶化型ヒトc-MplをコードするDNAを発現ベクターpEAK8(EdgeBioSystems社製)に結合し、トランスフェクタム試薬(Promega社より入手可能)にてHek293細胞に導入した。安定発現株を選択後、その培養上清を抗Mpl抗体カラムにて精製し、可溶化型ヒトc-Mpl組換えタンパク質(以下soluble Mpl-x、sMpl-xと略記)を調製した。
NH2-MPSWALFMVTSCLLLAPQNLAQVSSQDVSLLASDSEPLKCFSRTFEDLTCFWDEEEAAPSGTYQLLYAYPREKPRACPLSSQSMPHFGTRYVCQFPDQEEVRLFFPLHLWVKNVFLNQTRTQRVLFVDSVGLPAPPSIIKAMGGSQPGELQISWEEPAPEISDFLRYELRYGPRDPKNSTGPTVIQLIATETCCPALQRPHSASALDQSPCAQPTMPWQDGPKQTSPSREASALTAEGGSCLISGLQPGNSYWLQLRSEPDGISLGGSWGSWSLPVTVDLPGDAVALGLQCFTLDLKNVTCQWQQQDHASSQGFFYHSRARCCPRDRYPIWENCEEEEKTNPGLQTPQFSRCHFKSRNDSIIHILVEVTTAPGTVHSYLGSPFWIHQAVRLPTPNLHWREISSGHLELEWQHPSSWAAQETCYQLRYTGEGHQDWKVLEPPLGARGGTLELRPRSRYRLQLRARLNGPTYQGPWSSWSDPTRVETATETAW-COOH(配列番号17)
本発明の抗体は、遺伝子改変によってヒト抗体を産生する能力を持つヒト抗体産生マウス(KMマウスTM)を免疫し、モノクローナル抗体を作製することで得られた。KMマウスは、内在性マウスイムノグロブリン(Ig)重鎖及びマウスκ軽鎖を欠損しており、かつ、ヒトIg重鎖遺伝子を含む14番染色体断片(SC20)及びヒトIgκ鎖トランスジーン(KCo5)を同時に保持する。即ち、KMマウスはヒト抗体を産生する能力を持ち、マウスIg重鎖およびκ鎖を欠損したマウスである。このマウスはヒトIg重鎖遺伝子座を持つ系統Aのマウスと、ヒトIgκ鎖トランスジーンを持つ系統Bのマウスとの交配により作製される。系統Aは、内因性Ig重鎖及びκ軽鎖破壊の両者についてホモ接合体であり、子孫伝達可能な14番染色体断片(SC20)を保持するマウス系統(Tomizuka. et al., Proc Natl Acad Sci USA., 2000 Vol97:722参照)である。また、系統Bは内在性マウスIg重鎖及びκ軽鎖欠損の両者についてホモ接合体であり、ヒトIgκ鎖トランスジーン(KCo5)を保持するマウス系統(Nat Biotechnol., 1996 Vol14:845参照)である。
免疫原としてのヒトc-Mplは、実施例1で作製したL929-hMpl細胞、FM3A-hMpl細胞、恒常活性型c-Mpl発現FM3A-hMpl-Ser細胞、sMpl-x組換えタンパク質を用いた。被免疫動物は、実施例2で作製したヒト免疫グロブリンを産生するヒト抗体産生マウス使用し、下記の免疫方法で行った。
最終免疫の3日後にマウスから脾臓及び/又はリンパ節を外科的に取得し、350mg/ml 炭酸水素ナトリウム、50単位/ml ペニシリン、50μg/ml ストレプトマイシンを含む無血清DMEM培地 10ml中に入れ、メッシュ(セルストレイナー:ファルコン社製)上でスパーテルを用いてつぶした。メッシュを通過した細胞懸濁液を遠心して細胞を沈澱させた後、この細胞を無血清DMEM培地で2回洗浄してから、無血清DMEM培地に懸濁して細胞数を測定した。一方、10% FCSを含むDMEM培地にて、37℃、5%炭酸ガス存在下で細胞濃度が1×108細胞/mlを越えないように培養したミエローマ細胞 SP2/0(ATCC No.CRL-1581)を同様に無血清DMEM培地で洗浄し、無血清DMEM培地に懸濁して細胞数を測定した。回収した細胞の懸濁液とマウスミエローマ懸濁液とを細胞数5:1で混合し、遠心後、上清を完全に除去した。このペレットに、融合剤として50%(w/v)ポリエチレングリコール1500(ベーリンガーマンハイム社製)1mlを、ピペットの先で撹拌しながらゆっくり添加した後、予め37℃に加温しておいた無血清DMEM培地1mlを2回に分けてゆっくり添加し、さらに7mlの無血清DMEM培地を添加した。遠心後、上清を除去して得られた融合細胞を、以下に記載する限界希釈法によるスクリーニングに供した。ハイブリドーマの選択は、10%のウシ胎児血清(Fetal Calf Serum、FCS)とヒポキサンチン(H)、アミノプテリン(A)、チミジン(T)(以下「HAT」という。:シグマ社製)を含有するDMEM培地中で培養することによって行った。さらに、10% FCSとHT(シグマ社製)とを含有するDMEM培地を用いて限界希釈法によりシングルクローンにした。培養は、96穴マイクロタイタープレート(ベクトンディッキンソン社製)中で行った。抗ヒトc-Mplヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンの選択(スクリーニング)及び各々のハイブリドーマが産生するヒトモノクローナル抗体の特徴付けは、実施例4に記載のフローサイトメトリー、あるいは実施例5に記載のUT7/TPO細胞を用いた細胞増殖アッセイによって行った。アゴニスト抗体の活性評価系として、BaF3等のマウス細胞株にヒトMplを発現させ、細胞増殖アッセイを行うことができる(Orita et al. Blood. 2005 Jan 15;105(2):562-6.)が、そのような細胞の反応が、ヒト細胞の反応を反映しているとは限らない。UT7/TPOはヒト由来細胞株であるため、これをスクリーニングに用いることで、よりヒト細胞に強い活性を持つ抗体を選抜し易いと考えられる。
ハイブリドーマの培養上清からの抗ヒトc-Mplモノクローナル抗体の精製は以下の方法で行った。抗体を含む培養上清をrmp Protein A(アマシャムファルマシアバイオテク社製)及び0.8×40cm カラム(バイオラッド社製)を用い、吸着緩衝液としてPBS、溶出緩衝液として0.02M グリシン緩衝液(pH 3)を用いてアフィニティー精製した。溶出画分は1M Tris (pH 9.0)を添加してpH7.2付近に調整した。調製された抗体溶液は、透析膜(10000カット、Spectrum Laboratories社製)を用いてPBSに置換し、孔径0.22μm のメンブランフィルターMILLEX-GV(ミリポア社製)でろ過滅菌し、精製抗ヒトc-Mplモノクローナル抗体を得た。精製抗体の濃度は280nmの吸光度を測定し、1mg/ml を1.4 OD として算出した。
まず、抗体産生ハイブリドーマを10ng/ml Recombinant Human IL-6(R&D Systems社製)、10% Low IgG Fetal Bovine Serum(HyClone社製)含有eRDF培地(極東製薬社製)に馴化した。この馴化したハイブリドーマを凍結保存した。次に、その一部を、ウシインシュリン(5μg/ml、ギブコビーアールエル社製)、ヒトトランスフェリン(5μg/ml、ギブコビーアールエル社製)、エタノールアミン(0.01mM、シグマ社製)、亜セレン酸ナトリウム(2.5×10-5mM、シグマ社製)、10ng/ml Recombinant Human IL-6(R&D Systems社製)、1% Low IgG Fetal Bovine Serum(HyClone社製)含有eRDF培地(極東製薬社製)に馴化した。フラスコにて培養し、ハイブリドーマの生細胞率が90%になった時点で培養上清を回収した。回収した上清は、10μm と0.2μmのフィルター(ゲルマンサイエンス社製)に供し、きょう雑物を除去した。
ハイブリドーマ培養上清もしくは精製抗体を用いたフローサイトメトリーによって、抗ヒトc-Mpl抗体の結合活性を測定した。手順は以下の通りである。細胞はFM3A-hMpl細胞もしくはヒトMpl発現FDCP2細胞(FDCP-hMpl)(FEBS Lett. 1996 Oct 21;395(2-3):228-34.参照)を用いた。
ハイブリドーマ上清もしくは精製抗体を用いて、UT7/TPO細胞増殖アッセイを行い、アゴニスト活性を評価した。UT7/TPO細胞はTPO依存性のヒト巨核球系細胞株である(Ozaki K et al. Blood. 1998 Dec 15;92(12):4652-62.参照)。通常は10%FBS, 5ng/mL PEG-rHuMGDF添加 Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium(IMDM)で培養、維持した。細胞増殖アッセイの手順は以下の通りである。
(2) 上記1.で増殖アッセイ用培地に懸濁した細胞を37℃, 5%CO2条件下で6時間培養した。
(3) 培養後、細胞を遠心してペレットにし、増殖アッセイ用培地にて懸濁した。このとき、細胞濃度を6×105cells/mLにあわせ、細胞懸濁液を、各ウェル50μLで96-well plateに播いた。
(4) 次に、ハイブリドーマ培養上清10μLに、増殖アッセイ用培地40μLを加え、各ウェルに添加する。精製抗体の場合は、増殖アッセイ用培地50μLに検体を終濃度の2倍の濃度で加え、各ウェルに添加した。
(5) 37℃,5%CO2にて、48時間培養する。
(6) WST-8試薬(同仁化学研究所社製)を10μL/wellで添加し、2時間培養する。
(7) 吸光マイクロプレートリーダー(TECAN社製SUNRISE RAINBOW)にて各ウェルの吸光度を測定する。(測定波長450nm, 参照波長600nm以上)
図2に7-10(図2A), 4-49(図2B), 6-4-50(図2C), 6-5-2(図2D)各精製抗体を用いたUT7/TPO細胞増殖アッセイにおける増殖曲線を示す。また、スクリーニングの結果得られた抗ヒトc-Mpl抗体のサブクラス、活性の強さ(UT7/TPO細胞増殖アッセイにおける50%有効濃度(EC50)、最大活性(Max))、各抗体が得られた実施例2に記載の免疫方法を表2に示す。
ヒト臍帯血由来CD34+ 細胞を用いたCFU-Mkコロニー形成アッセイを行い、精製抗体のヒトプライマリー細胞に対する作用を検討した。アッセイにはMegaCultTM-C(Stem Cell Technologies社製Cat#04972)を使用した。手順は以下の通りである。
(2) ヒト臍帯血より調製したCD34+細胞を1.1×105cells/mLの濃度で、IMDMに懸濁し、上記1.の培地が入ったチューブに0.05mLずつ添加した。
(3) 細胞を加えた各チューブをボルテックスで攪拌し、0.6mLの氷冷したコラーゲン液を加え、再びボルテックスで攪拌した。
(4) 上記3.までの細胞、検体混合液をチャンバースライドの各ウェルに0.75mLずつ添加した。
(5) チャンバースライドを、100mmペトリディッシュ中に入れた。乾燥を防ぐために、3mLの精製水を入れた35mmペトリディッシュを同じ100mmペトリディッシュ中に入れた。
(6) チャンバースライドが入ったペトリディッシュをインキュベーター中に静置し、37℃,5%CO2条件下で10〜12日間培養した。
(7) 培養後、固定液(メタノール:アセトン=1:3)にて固定した。
(8) 抗ヒトCD41抗体による免疫染色を行い、CFU-Mkコロニーを検出した。顕微鏡下でコロニー数をカウントし、各検体のCFU-Mkコロニー形成能を比較した。
組み換え抗体を作製するために、選抜された抗ヒトc-Mplアゴニスト抗体産生ハイブリドーマから抗体遺伝子、具体的には重鎖(H鎖)をコードするヒトIgγ cDNAおよび軽鎖(L鎖)をコードするヒトIgκ cDNAを単離し、配列を決定した。
1)各モノクローナル抗体のcDNA合成
各ハイブリドーマで発現するヒト抗体重鎖、及び軽鎖の抗体の可変領域を含むDNA断片を取得するために、ヒトIgγ、及びヒトIgκの各々の定常領域に特異的なプライマーを用いた5’RACE(5' rapid amplification of cDNA ends)法によるクローニングを行なった。具体的には、BD SMART RACE cDNA Amplification Kit(ベクトン・ディキンソン・バイオサイエンス・クローンテック社製)を用い、添付の説明書にしたがって実施した。
1st strand cDNA の合成は、
Total RNA 1μg/3μl
5’CDS 1μl
SMART Oligo 1μl
上記組成の反応液を70℃で2分間インキュベートした後、
5×Buffer 2μl
DTT 1μl
DNTP mix 1μl
PowerScript Reverse Transcriptase 1μl
を加え42℃で1.5時間インキュベートした。
さらに、50μlのTricine -EDTA Bufferを加えた後、72℃で7分間インキュベートし、1st strand cDNAを取得した。
2-1)PCRによる重鎖遺伝子、軽鎖遺伝子の増幅
ヒト抗体遺伝子のcDNAを増幅するために、ヒト抗体特異的配列を有する3’プライマー(具体的な配列は後記)とBD SMART RACE cDNA Amplification Kit で合成されたcDNAの5’末端に付加された配列に特異的にハイブリダイズする5’プライマー(Universal primer A mix)をPCR用のプライマーセットとして、またPCR用酵素としてKOD-Plus- DNAポリメラーゼ(東洋紡績(株)社製)を用いて、下記の反応液を調製してPCRに供した。
cDNA 2.5μl
KOD-Plus- buffer (10X) 5μl
dNTP Mix (2mM) 5μl
MgSO4 (25mM) 2μl
KOD-Plus- (1 unit/μl) 1μl
Universal primer A mix (UPM) (10X) 5μl
Gene specific primers (GSP)(10μM) 1.5μl
Total volume 50μl
重鎖遺伝子の増幅反応には、SMART RACE cDNA Amplification Kit付属のUPMプライマーとIgG1pプライマーを用い、他方、軽鎖遺伝子の増幅にはUPMプライマーとhk-2プライマーの各セットを使用した。
IgG1pプライマー:5’-TCTTGTCCACCTTGGTGTTGCTGGGCTTGTG-3’(配列番号18)
hk-2:5’-GTT GAA GCT CTT TGT GAC GGG CGA GC -3’(配列番号19)
また反応温度条件は次のとおりである。
94℃ /30 秒間、72℃/3分間のサイクルを5回反復、
94℃ /30 秒間、70℃/30秒間、72℃/3分間のサイクルを5回反復、
94℃ /30 秒間、68℃/30秒間、72℃/3分間のサイクルを25回反復した。
第一PCR反応液(50倍希釈) 5μl
KOD-Plus- buffer (10X) 5μl
dNTP Mix (2mM) 5μl
MgSO4 (25mM) 2μl
KOD-Plus- (1 unit/μl) 1μl
Nested Universal primer A (NUP;10μM) 1μl
Gene specific primers (GSP)(10μM) 1μl
Total volume 50μl
上記反応のプライマーセットとして、重鎖遺伝子増幅用の場合は、NUPMプライマー(SMART RACE cDNA amplification Kit付属;ベクトン・ディキンソン・バイオサイエンス・クローンテック社製)とhh2プライマー(4-49、6-4-50、6-5-2の場合)、或はIgG2p_134(7-10の場合)を使用して、また、軽鎖遺伝子の増幅の場合は、UPMプライマーとhk-5プライマーを用いた。反応温度条件としては、94℃の初期温度で1分間の後、94℃/5秒間、68℃/10秒及び72℃/3分間のサイクルを20回反復、最後に72℃/7分間加熱した。
上記の方法で増幅した重鎖PCR断片(以下HV[C]と記載)は、重鎖の5’非翻訳領域、リーダー配列(分泌シグナル配列)、可変領域(HV)及び定常領域の一部([C])より構成される。同様に、軽鎖のPCR増幅断片(以下LV[C]と記載)は、軽鎖の5’非翻訳領域、リーダー配列(分泌シグナル配列)、可変領域(LV)及び定常領域の一部([C])より構成される。ここでリーダー配列(分泌シグナル)とは抗体の分泌に必要で、成熟抗体タンパク質からは切り離されるアミノ酸配列である。HV[C]断片およびLV[C]断片は、PCR反応液からエタノール沈殿で回収した後、アガロースゲル電気泳動で分離し、メンブランを用いるDNA精製キットであるQIAquick Gel Extraction Kit (キアゲン社製)にて精製した。精製したHV[C]増幅断片あるいはLV[C]増幅断片は、それぞれZero Blunt TOPO PCR Cloning Kit(インビトロジェン社製)のpCR 4 Blunt- TOPO ベクター(東洋紡績(株)製)にサブクローニングを行い、得られたクローンのプラスミドDNAについてインサートDNAの塩基配列を解析した。DNA塩基配列決定のためにプライマーとして、M13-20FW及びM13RVを用いた。
hk-5:5’- AGG CAC ACA ACA GAG GCA GTT CCA GAT TTC-3’(配列番号20)
hh2プライマー:5’- GCT GGA GGG CAC GG TCA CCA CGC TG -3’(配列番号21)
IgG2p_134:5’- TGCACGCCGC TGGTCAGGGC GCCTGAGTTC C -3’(配列番号22)
<7-10重鎖核酸配列>(ATG開始コドンより可変領域C末端アミノ酸残基をコードするDNA配列まで)
ATGGAGTTGGGACTGAGCTGGATTTTCCTTTTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGCATAGGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAAAAATCTATGGTTCGGGGAGTTCCGTTACTGGTACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACTGTCTCCTCA(配列番号23)
<7-10重鎖アミノ酸配列>(リーダー配列及び可変領域まで)
(下線で示すアミノ酸残基は分泌シグナルとなるリーダー配列を示す)
MELGLSWIFLLAILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKNLWFGEFRYWYFD LWGRGTLVTV SS(配列番号24)
<7-10軽鎖核酸配列>(ATG開始コドンより可変領域C末端アミノ酸残基をコードするDNA配列まで)
ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGCCATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGCAGTGCTTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCCTCCAGTTTGGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTTTAATAGTTACCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA(配列番号25)
<7-10軽鎖アミノ酸配列>(リーダー配列及び可変領域まで)
(下線で示すアミノ酸残基は分泌シグナルとなるリーダー配列を示す)
MELGLSWIFLLAILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKNLWFGEFRYWYFDLWGRGTLVTVSS(配列番号26)
<4-49重鎖核酸配列>(ATG開始コドンより可変領域C末端アミノ酸残基をコードするDNA配列まで)
ATGGAGTTGGGACTGAGCTGGATTTTCCTTGTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGAGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTACAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGTACTGGGTCCGGCAAGTTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAACAGTGGTAGCATAGGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCGTTTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTATATTACTGTGCAAAAGCCCTATGGTTCGGGGAGTTCCCCCACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA(配列番号27)
<4-49重鎖アミノ酸配列>(リーダー配列及び可変領域まで)
(下線で示すアミノ酸残基は分泌シグナルとなるリーダー配列を示す)
MELGLSWIFLVAILKGVQCEEQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFDDYAMYWVRQVPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTVSRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKALWFGEFPHYYGMDVWGQGTTVTVSS(配列番号28)
<4-49軽鎖核酸配列>(ATG開始コドンより可変領域C末端アミノ酸残基をコードするDNA配列まで)
ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGCCATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGCAGTACTTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCCTCCAGTTTGGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTTTAATAGTTACCCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGT(配列番号29)
<4-49軽鎖アミノ酸配列>(リーダー配列及び可変領域まで)
(下線で示すアミノ酸残基は分泌シグナルとなるリーダー配列を示す)
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARCAIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSTLAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPYTFGQGTKLEIKR(配列番号30)
<6-4-50重鎖核酸配列>(ATG開始コドンより可変領域C末端アミノ酸残基をコードするDNA配列まで)
ATGGAATTGGGACTGAGCTGGATTTTCCTTTTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAACCTCTGGATTCACCTTTGATAATTATGCCATGTACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTGACATAGGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAGGGATGCGGGGTTCGGGGAGTTCCACTACGGTCTGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA(配列番号31)
<6-4-50重鎖アミノ酸配列>(リーダー配列及び可変領域まで)
(下線で示すアミノ酸残基は分泌シグナルとなるリーダー配列を示す)
MELGLSWIFLLAILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCATSGFTFDNYAMYWVRQAP
GKGLEWVSGISWNSGDIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDAG
FGEFHYGLDVWGQGTTVTVSS(配列番号32)
<6-4-50軽鎖核酸配列>(ATG開始コドンより可変領域C末端アミノ酸残基をコードするDNA配列まで)
ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGCCATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGCAGTGCTTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCCTCCAGTTTGGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTTTAATAGTTACCCGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGT(配列番号33)
<6-4-50軽鎖アミノ酸配列>(リーダー配列及び可変領域まで)
(下線で示すアミノ酸残基は分泌シグナルとなるリーダー配列を示す)
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARCAIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKVPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPWTFGQGTKVEIKR(配列番号34)
<6-5-2重鎖核酸配列>(ATG開始コドンより可変領域C末端アミノ酸残基をコードするDNA配列まで)
ATGGAGTTGGGACTGAGCTGGATTTTCCTTTTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGCAACTGGTGGAGTGTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGTATAGGTTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAAACCTATATGGTTCGGGGAGTGGGGAAACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA(配列番号35)
<6-5-2重鎖アミノ酸配列>(リーダー配列及び可変領域まで)
(下線で示すアミノ酸残基は分泌シグナルとなるリーダー配列を示す)
MELGLSWIFLLAILKGVQCEVQLVECGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKPIWFGEWGNYYGMDVWGQGTTVTVSS(配列番号36)
<6-5-2軽鎖核酸配列>(ATG開始コドンより可変領域C末端アミノ酸残基をコードするDNA配列まで)
ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAACGT(配列番号37)
<6-5-2軽鎖アミノ酸配列>(リーダー配列及び可変領域まで)
(下線で示すアミノ酸残基は分泌シグナルとなるリーダー配列を示す)
METPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPITFGQGTRLEIKR(配列番号38)
上記の方法でハイブリドーマからクローニングした抗体の可変領域を、ヒト抗体発現用ベクターに組み込み、様々な定常領域を持った組換え抗体発現ベクターを作製した。
さらに本実施例では、N5KG1, N5KG3, N5KG4PEをもとに、重鎖定常領域(特にヒンジ領域)に種々の改変を加えた発現ベクターを作製した。
さらにG3uhヒンジにL217SとR228Pの変異を加えた重鎖定常領域を作製した。この変異にはG3uhヒンジをよりIgG4PEの配列に近づける意図がある。これをG3uhm(upper hinge mutationの略)と名付け、これを持つ抗体をIgGx3xxuhmと表記した。
1)IgG1サブクラスの抗c-Mpl抗体発現ベクターの作製
1-1)抗ヒトc-Mpl抗体4-49_IgG1及び7-10_IgG1発現ベクターの作製
7-10と4-49については、N5KG1ベクターに最初に重鎖可変領域、次に、軽鎖可変領域の順に挿入して発現ベクターを作製した。
7-10;
HV断片5’用プライマー:40-3H5Sal
5’- AGAGAGAGAG GTCGACCACC ATGGAGTTGG GACTGAGCTG GATTT -3’(配列番号39)
HV断片3’用プライマー:40-3H3Nhe
5’- AGAGAGAGAG GCTAGCTGAG GAGACAGTGA CCAGGGTGCC A -3’(配列番号40)
4-49;
HV断片5’用プライマー:F24HSal
5’-AGAGAGAGAGGTCGACCACCATGGAGTTGGGACTGAGCTGGATTT -3’(配列番号41)
HV断片3’用プライマー:C15H3Nhe
5’- AGAGAGAGAGGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCGTGGT-3’(配列番号42)
7-10;
LV断片5’用プライマー:165-1B_L18Bgl
5’- AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTC-3’(配列番号43)
LV断片3’用プライマー:165_1B_L18_Bsi
5’- AGAGAGAGAG CGTACGTTTG ATCTCCACCT TGGTCCCTCC -3’(配列番号44)
4-49;
LV断片5’用プライマー:DNP_L1Bglp
5’- AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGAGGGTCCCCGCTCAGCTC -3’(配列番号45)
LV断片3’用プライマー:A27_R_N202
5’- AGAGAGAGAGCGTACGTTTGATTTCCACCTTGGTCCCTTGGC-3’(配列番号46)
図4CにN5KG1_7-10、及びN5KG1_4-49の作製工程を図示した。
6-4-50、及び、6-5-2については、ヒト抗体発現用ベクターに最初に軽鎖可変領域、次に、重鎖可変領域の順に挿入して発現ベクターを作製した。
6-4-50;
LV断片5’用プライマー:208LF
5’-AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGC -3’(配列番号47)
LV断片3’用プライマー:62LP3Bsi
5’- AGAGAGAGAGCGTACGTTTGATTTCCACCTTGGTCCCTTG -3’(配列番号48)
6-5-2;
LV断片5’用プライマー:A27_F
5’-AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTC -3’(配列番号49)
LV断片3’用プライマー:202LR
5’- AGAGAGAGAGCGTACGTTTAATCTCCAGTCGTGTCCCTTGGC -3’(配列番号50)
6-4-50;
HV断片5’用プライマー:50-5-7Hsal
5’- AGAGAGAGAG GTCGACCACC ATGGAATTGG GACTGAGCTG GATTTT -3’(配列番号51)
HV断片3’用プライマー:C15H3Nhe
5’ -AGAGAGAGAGGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCGTGGT-3’(配列番号52)
6-5-2;
HV断片5’用プライマー:F24HSal
5’- AGAGAGAGAGGTCGACCACCATGGAGTTGGGACTGAGCTGGATTT-3’(配列番号53)
HV断片3’用プライマー:L66H3Nhe
5’- AGAGAGAGAGGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTC-3’(配列番号54)
図4DにN5KG1_6-4-50、及びN5KG1_6-5-2の作製工程を図示した。
IgG4PEサブクラス抗体の発現ベクター作製には前述のN5KG4PEベクターを用いた。N5KG4PEのプラスミドDNAを制限酵素NheIとBamHIで切断して、重鎖定常領域を含む断片を精製して、抗c-Mpl抗体であるN5KG1_7-10、及びN5KG1_4-49の同じ制限酵素部位内につなぎ換えることにより、N5KG4PE_7-10、及びN5KG4PE_4-49を作製した。
ヒトIgG3用発現ベクターN5KG3はN5KG1のIgG1重鎖定常領域を下記配列のIgG3定常領域に置換することで作製した。
IgG3定常領域アミノ酸配列
STKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKLREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPGK*(配列番号55)
IgG3定常領域塩基配列
CTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGTTTGGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCTCAAAACCCCACTTGGTGACACAACTCACACATGCCCACGGTGCCCAGAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCGTGCCCACGGTGCCCAGAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCATGCCCACGGTGCCCAGAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCGTGCCCAAGGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGATACCCTTATGATTTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAAGTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCTGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGACAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAACACCACGCCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACATCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGCTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA(配列番号56)
IgG3311発現ベクターは、N5KG3を鋳型として、プライマーlinkH, 13ch1-Rで98℃1秒、60℃30秒、72℃30秒の反応を15回行った。同時に、N5KG1を鋳型として、プライマー13ch1、linkH2を用いて、98℃1秒、60℃30秒、72℃30秒の反応を15回行った。増幅したDNA断片をPCR purification kit で精製し、2つの精製DNA断片を等量混合したのち、98℃1秒、60℃30秒、72℃30秒の反応を5回行い、プライマーlinkH、linkH2を加えて、15回反応した。増幅したDNA断片をNheI, BamHIで切断し、N5KG1ベクターのIgG1定常領域と置き換えた。この発現ベクターをN5KG3311と名づけた。
linkH: GGG TAC GTC CTC ACA TTC AGT GAT CAG(配列番号57)
13ch1-R: GTC TTC GTG GCT CAC GTC CAC CAC CAC GCA(配列番号58)
13ch1: TGC GTG GTG GTG GAC GTG AGC CAC GAA GAC(配列番号59)
linkH2: TGA TCA TAC GTA GAT ATC ACG GC(配列番号60)
IgG3331発現ベクターは、N5KG3を鋳型として、プライマーlinkH, CH3consRで98℃1秒、60℃30秒、72℃30秒の反応を15回行った。同時に、N5KG1を鋳型として、プライマーCH3cons、linkH2を用いて、98℃1秒、60℃30秒、72℃30秒の反応を15回行った。増幅したDNA断片をPCR purification kit で精製し、2つの精製DNA断片を等量混合したのち、98℃1秒、60℃30秒、72℃30秒の反応を5回行い、プライマーlinkH、linkH2を加えて、15回反応した。増幅したDNA断片をNheI, BamHIで切断し、N5KG1ベクターのIgG1定常領域と置き換えた。この発現ベクターをN5KG3331と名づけた。
CH3consR: GGTGTACACCTGTGGCTCTCGGGGCTGCCC(配列番号61)
CH3cons: GGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACC(配列番号62)
以下に、IgG3344, IgG3344h1, IgG4344, IgG4344h1, IgG4344uh, IgG4344uhmの作製法を記す。これらについては、各定常領域をPCR法によって増幅し、それをクローニングしたプラスミドを作製した。ついで、それら改変定常領域をN5KG1_7-10等のIgG1定常領域と置換した。
IgG3344発現ベクターは、N5KG3331およびN5KG4PEを鋳型として、PCRを用いた変異導入(Overlap Extention法による部位特異的変異導入法)によって以下の手順で行った。
G3G4_P1_F:5’-AGAGAGGCTA GCACCAAGGG CCCATCG-3’(配列番号63)
G3G4_P2_R:5’-GAACTCAGGT GCTGGGCACC TTGGGCACG-3’(配列番号64)
G3G4_P3_F:5’- CCAAGGTGCC CAGCACCTGA GTTCGAGGGG GGA -3’(配列番号65)
G3G4_P4_R:5’- AGAGAGGGAT CCTCATTTAC CCAGAGACAG GGA -3’(配列番号66)
IgG4344発現ベクターの作製においては、N5KG3331を鋳型として、プライマーとしてG434_P5_FとG434_P6_Rを用いて94℃の初期温度で1分間の加熱後、94℃/15秒間、55℃/10秒間、そして68℃/1分間のサイクルを35回反復し、最後に72℃/7分間加熱した。同時に、N5KG4PEを鋳型として、プライマーとしてG434_P7_FとG3G4_P2_Rを用いて同条件にてPCRを実施した。増幅したDNA断片をアガロースゲル電気泳動で回収し、QIAquick Gel Extraction Kit (キアゲン社製)にて精製した。これらの精製2DNA断片と、前述したN5KG4PEを鋳型として、G3G4_P3_FとG3G4_P4_Rをプライマーとして増幅・精製しておいたDNA断片の計3種類のOverlap Extention反応を実施した。すなわち、3種類のDNA断片のオーバーラップ部分をアニーリングさせて94℃の初期温度で1分間の加熱後、94℃/10秒間、55℃/10秒間68℃/1.5分間のサイクルを5回反復して伸長した後、全長を増幅させる為に反応液にプライマーとしてG434_P5_FとG3G4_P4_Rを加えて、94℃/5秒間と68℃/2分間のサイクルを20回反復し、最後に72℃/7分間の加熱を行なった。増幅したPCR断片はQIAquick Gel Extraction Kitにて精製した後、pCR 4 Blunt- TOPO ベクターにサブクローニングを行い、得られたクローンのプラスミドDNAについてインサートDNAの塩基配列を解析した。塩基配列の解析よりIgG4344定常領域を持つクローンを選択した。
G434_P5_F:5’- AGAGAGGCTA GCACCAAGGG GCCATCC -3’(配列番号67)
G434_P6_R:5’- GGTTTTGAGC TCAACTCTCT TGTCCACCTT GGTGTTGC -3’(配列番号68)
G434_P7_F:5’- GTGGACAAGA GAGTTGAGCT CAAAACCCCA CTTGGTGACA C -3’(配列番号69)
IgG4344h1発現ベクターの作製は、N5KG4344を鋳型として、プライマーとしてG434_P5_F, G434_P6_Rを用いて98℃の初期温度で10秒間の加熱後、98℃/10秒間、55℃/30秒間、そして72℃/1分間のサイクルを7回反復し、次いで98℃/10秒間、68℃/1分間のサイクルを30回反復して、最後に72℃/7分間加熱した。PCR用酵素としては、Pyrobest DNA Polymerase(タカラバイオ株式会社)を使用した。同時に、N5KG3344h1を鋳型として、プライマーとしてG434_P7_FとG3G4_P4_Rを用いて同条件にてPCRを実施した。増幅したDNA断片をアガロースゲル電気泳動で回収し、QIAquick Gel Extraction Kit (キアゲン社製)にて精製した。これらの精製DNA断片を等量混合した後、2DNA断片のオーバーラップ部分をアニーリングさせて、98℃の初期温度で10秒間の加熱後、98℃/10秒間、55℃/30秒間、そして72℃/1分間のサイクルを7回反復して伸長した後、全長を増幅させる為に反応液にプライマーとしてG434_P5_FとG3G4_P4_Rを加えて、更に98℃/10秒間と68℃/1分間のサイクルを30回反復し、最後に72℃/7分間の加熱を行なった。増幅したPCR断片は、アガロースゲル電気泳動で回収し、QIAquick Gel Extraction Kitにて精製した。精製した増幅断片は、pCR 4 Blunt- TOPO ベクターにサブクローニングを行い、得られたクローンのプラスミドDNAについてインサートDNAの塩基配列を解析した。塩基配列の解析よりG4344h1定常領域持つクローンを選択した。
G4344uhの作製は、N5KG4344を鋳型として、プライマーとしてG434_P5_Fと17-1Rを用いて98℃の初期温度で10秒間の加熱後、98℃/10秒間、50℃/30秒間、そして72℃/1分間のサイクルを5回反復し、次いで98℃/10秒間、55℃/30秒間、そして72℃/1分間のサイクルを5回反復し、98℃/10秒間、68℃/1分間のサイクルを25回反復して、最後に72℃/7分間加熱した。PCR用酵素としては、Pyrobest DNA Polymerase(タカラバイオ株式会社)を使用した。並行して、N5KG3344h1を鋳型として、プライマーとして17-2FとG3G4_P4_Rを用いて同条件にてPCRを実施した。増幅したDNA断片をアガロースゲル電気泳動で回収し、QIAquick Gel Extraction Kitにて精製した。これらの精製DNA断片を等量混合した後、2DNA断片のオーバーラップ部分をアニーリングさせて、98℃の初期温度で10秒間の加熱後、98℃/10秒間、68℃/1分間のサイクルを5回、さらに98℃/10秒間、55℃/30秒間、そして72℃/1分間のサイクルを5回反復して伸長した後、全長を増幅させる為に反応液にプライマーとしてG434_P5_FとG3G4_P4_Rを加えて、更に94℃/30秒間と68℃/1分間のサイクルを30回反復し、最後に72℃/7分間の加熱を行なった。増幅したPCR断片は、アガロースゲル電気泳動で回収し、QIAquick Gel Extraction Kitにて精製した。精製した増幅断片は、pCR 4 Blunt- TOPO ベクターにサブクローニングを行い、得られたクローンのプラスミドDNAについてインサートDNAの塩基配列を解析した。塩基配列の解析よりIgG4344uh定常領域を持つクローンを選択した。
17-1R:5’- AGGTGCTGGG CACCGTGGGC ATGTGTGAGT TGT -3’(配列番号70)
17-2F:5’- CACACATGCC CACGGTGCCC AGCACCTGAG TTC -3’(配列番号71)
IgG4344uhm発現ベクターの作製は、N5KG4PEを鋳型として、プライマーとしてG434_P5_Fと17m-1Rを用いて98℃の初期温度で10秒間の加熱後、98℃/10秒間、50℃/30秒間、そして72℃/1分間のサイクルを5回反復し、次いで98℃/10秒間、55℃/30秒間、そして72℃/1分間のサイクルを5回反復し、98℃/10秒間、68℃/1分間のサイクルを25回反復して、最後に72℃/7分間加熱した。PCR用酵素としては、Pyrobest DNA Polymeraseを使用した。並行して、N5KG4PEを鋳型として、プライマーとして17m-2FとG3G4_P4_Rを用いて同条件にてPCRを実施した。増幅したDNA断片をアガロースゲル電気泳動で回収し、QIAquick Gel Extraction Kitにて精製した。これらの精製DNA断片を等量混合した後、2DNA断片のオーバーラップ部分をアニーリングさせて、94℃/30秒間、55℃/30秒間、そして72℃/1分間のサイクルを7回反復して伸長した後、全長を増幅させる為に反応液にプライマーとしてG434_P5_FとG3G4_P4_Rを加えて、更に94℃/30秒間と68℃/1分間のサイクルを30回反復し、最後に72℃/7分間の加熱を行なった。増幅したPCR断片は、アガロースゲル電気泳動で回収し、QIAquick Gel Extraction Kitにて精製した。精製した増幅断片は、pCR 4 Blunt- TOPO ベクターにサブクローニングを行い、得られたクローンのプラスミドDNAについてインサートDNAの塩基配列を解析した。塩基配列の解析よりIgG4344uhm定常領域を持つクローンを選択した。
17m-1R:5’- TGTGTGAGTT GTGTCACCAA GTGGGGTTTT GGACTCAACT CTCTTGTCCA CCTTGGT -3’(配列番号72)
17m-2F:5’- ACCCCACTTG GTGACACAAC TCACACATGC CCACCATGCC CAGCACCTGA GTTCGAG -3’(配列番号73)
図4Eに各種改変重鎖のアミノ酸配列を示した。
作製した各種改変重鎖定常領域を持つプラスミドDNAを、制限酵素NheI, BamHIで切断後、定常領域配列を精製分離した。続いて、抗ヒトc-Mpl抗体発現ベクターN5KG1_7-10, N5KG1_4-49, N5KG1_6-4-50, N5KG1_6-5-2を同酵素で処理し、定常領域を置換した。
図4Fに7-10_IgG4344uhmの重鎖配列を示した。
図4Gに7-10_IgG4344uhmの軽鎖配列を示した。
実施例8で作製した発現ベクターDNAをEndoFree Plasmid Kit(キアゲン社)にて調製し、FreeStyleTM 293 Expression System(インビトロジェンライフテクノロジー社)を用いて浮遊性293細胞(インビトロジェンライフテクノロジー社)に導入して、一過性発現により各抗体を含む培養上清を得た。孔径0.22μm のメンブランフィルター(MILLIPORE 製)で濾過した培養上清(IgGとして約500μg)を抗体精製用アフニティーカラムであるHiTrap rProtein A FF(カラム体積1ml)(アマシャムバイオサイエンス社)にチャージし、PBS (-)で洗浄後20 mMクエン酸バッファー(pH3.4)により溶出し、200 mMリン酸バッファー(pH7.0)を含むチューブに回収した。
構築した抗体発現ベクターを宿主細胞に導入して、抗体発現細胞を作製した。発現のための宿主細胞には、dhfr欠損のCHO DG44 細胞(IDEC Pharmaceuticals Corporation)を無血清培地であるEX-CELL325PF(JRH)に馴化した細胞株を用いた。宿主細胞へのベクターの導入はエレクトロポレーションにより実施した。エレクトロポレーションは抗体発現ベクター約2μgを制限酵素AscIで線状化し、Bio-Rad electrophoreterをもちいて350V、500μFの条件で、4×106個のCHO細胞に遺伝子を導入し、96well culture plateに播種した。ベクターの導入処理後、G418を添加して培養を継続した。コロニーを確認した後、抗体発現株を選別した。選択したCHO細胞株をEX-CELL325-PF培地(JRH)(2 mM glutamine、100 units/ml penicillin、100 μg/ml streptomycin、 hypoxanthine and thymidine (HT) サプリメント(1:100) (Invitrogen)を含む)で5% CO2条件下で培養した。培養上清をMabselect Protein A カラム(Amersham Pharmacia Biotech, Co., Ltd.)に吸着後、PBSで洗浄して、20mMクエン酸-Na、50mM NaCl (pH3.4)バッファーで溶出した。溶出液は50mM Phosphate-Na, pH7.0 にて中和した。Milli-Q水にて、約1.5倍に希釈してConductivityを4.0ms/cm以下に調製した。次に、Q-Sepharose(Hitrap Q HP)(Amersham Pharmacia Biotech, Co., Ltd.)と、SP-Sepharose(HiTrap SP FF)(Amersham Pharmacia Biotech, Co., Ltd.)を連結したカラムに、サンプルをチャージして吸着後、20mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)にて洗浄後、1×PBSバッファーにて溶出した。調製された抗体溶液は、孔径0.22μmのメンブランフィルターMILLEX-GV (ミリポア社製)でろ過滅菌した。精製した抗体の濃度は280nmの吸光度を測定し、1mg/mL を1.4 ODとして算出した。
TPOが受容体であるc-Mplに結合すると、細胞内タンパク質のリン酸化が起こる。TPOによって活性化する主要な経路は、Jak-STAT, Ras-MAPK, PI3K-Aktの3つが知られている。アゴニスト抗体によるc-Mpl下流のリン酸化シグナル伝達の解析を行った。解析は、リン酸化タンパク質特異的な抗体を用いたウェスタンブロット法で行った。以下に使用した抗体を列記する。抗STAT5(Cell Signaling社製, Cat#9352), 抗phospho-STAT5(Cell Signaling社製, Cat#9351L), 抗JAK2(Upstate社製, Cat#06-255), 抗phospho-JAK2(Upstate社製, Cat#07-606), 抗Erk1/2(Cell Signaling社製, Cat#9272), 抗phospho-Erk1/2(Cell Signaling社製, Cat#9271L), 抗Akt(Cell Signaling社製, Cat#9102), 抗phospho-Akt(Cell Signaling社製, Cat#9101S)。
1) UT7/TPO細胞をサイトカイン非添加IMDM培地で洗浄し、6時間培養した。
2) 培養後、細胞を1×106cells/mLに調製し、6-wellプレートに2mL/wellで播いた。
3) ウェルに、アゴニスト抗体または陽性コントロールとしてPEG-rHuMGDFを添加し、細胞を刺激した。
4) 最短5分〜最長2時間の刺激時間の後に細胞を回収し、氷冷PBSにて細胞を洗浄した。
5) 遠心分離で細胞をペレットにし、上清を除去後、PhosphoSafeTM Extraction Reagent(Novagen社製, Cat#71296)でペレットを溶解したのち、再度遠心して、上清(細胞抽出液)を回収した。
6) 上記5.の細胞抽出液を用いて、ウェスタンブロット法でリン酸化タンパク質を検出した。
TPOはそれ自体では血小板凝集を起こさないが、ADP等の凝集惹起物質による血小板凝集を促進する作用(プライミング作用)がある。アゴニスト抗体によるヒト血小板プライミング作用を以下の手順で調べた。
2) さらに遠心分離(2500g, 15min)して血球成分を沈殿させ、血漿を採取した。
3) PRPに含まれる血小板数を測定し、血漿を用いて血小板数を3×105/μLにあわせた。
4) 上記3.で調製した血小板浮遊液100μLに検体を加え、攪拌しながら3分間インキュベーションした。
5) 30μM ADP(SIGMA社製)を5μL添加し、血小板凝集による濁度の低下を測定した。測定にはMCメディカル社製, Hematracer801を用いた。
アゴニスト抗体をカニクイザルに投与し、血小板数の変動を解析した。使用個体のTPOに対する反応性を確かめるため、初日(Day0)にPEG-rHuMGDF(10μg/kg)を静脈内投与し3週間経過を観察した後、初回投与後21日目に精製アゴニスト抗体7-10G4PE(個体A)7-10G3344h1(個体B)を用量1mg/kgで静脈内投与した。
実施例10で作製したアゴニスト抗体が、ヒト臍帯血移植モデルにおけるヒト造血系の構築を促進することを確認するため、以下の手順で実験を行った。
・ 移植後一日目に最初の被検物質投与を行い、その後、週に一回投与を実施した。群構成と各々の被検物質および投与量は下記のとおりである。匹数は各群6匹、投与は腹腔内投与で行った。また、毎週の投与時に体重測定を行った。
I: 移植数10,000, PBS(コントロール)投与
II: 移植数1,000, PBS投与
III: 移植数10,000, 抗体7-10G4344uhm投与, 100μg/head/week
IV: 移植数1,000, 抗体7-10G4344uhm投与, 100μg/head/week
V: 移植数10,000, TPO (PEG-rHuMGDF)投与, 5μg/head/week
VI: 移植数1,000, TPO (PEG-rHuMGDF)投与, 5μg/head/week
・ 移植前1日と移植後2、4、6週に末梢血の解析を行った。末梢血解析の手順は下記のとおりである。
・ キャピラリ−を用いて、マウス眼窩静脈より末梢血(約70μL)を採取した。
・ KX-21自動血球解析システム(Sysmex社製)を用いて血球数を測定した。
・ ヒト血小板および白血球のキメラ率を調べるため、以下のAおよびBに挙げた各抗体の組み合わせで染色し、FACS Caliburで解析した。A(血小板解析用):PE標識−抗ヒトCD41抗体(Dako社製 R7058)+FITC標識−抗マウスCD41抗体(BD Pharmingen社製#553848)、B(白血球解析用): APC標識−抗ヒトCD45抗体(ベックマン・コールター社製IM2473)+FITC標識−抗マウスCD45抗体(BD Pharmingen社製#553080)。また、解析の際に定量用の蛍光ビーズ(フローカウントビーズ)を加え、一定量の血液を解析できるようにした。
・ 血小板・白血球ともに、ヒト細胞数/(ヒト細胞数+マウス細胞数)×100(%)、という式でキメラ率を算出した。末梢血中の全血小板数とキメラ率を乗じることにより、ヒト血小板数を算出した。
・ 6週目にマウスを屠殺し、大腿骨から骨髄細胞を採取した。それを用いてコロニーアッセイを行い、ヒトの巨核球系(MK)および赤血球系(E)、顆粒球・マクロファージ系(GM)の前駆細胞の数を測定した。巨核球系前駆細胞(CFU-Mk)を検出するコロニーアッセイは、培養中にTPO(50ng/mL)とSCF(100ng/mL)を加えて行った。37℃、5%CO2条件下で12日間の培養を行った。コロニーの検出は実施例6と同様に抗ヒトCD41抗体を用いて行った。赤血球系、顆粒球・マクロファージ系の前駆細胞を検出するコロニーアッセイは、Methocult system(Stem Cell Technologies社製)を用いて、培養中にEPO(4IU/mL), SCF(100ng/mL), IL-3(20ng/mL), GM-CSF(10ng/mL)を加えて行った。37℃, 5%CO2, 5%O2条件下で14日間の培養を行った。培養後、顕微鏡下でコロニーのカウントを行った。
移植後6週の時点において、抗体投与群では、他群に比べ、末梢血ヒト血小板数が有意に高かった(図9A)。これにより、アゴニスト抗体7-10G4344uhmは臍帯血移植時の血小板回復を促進することが示唆された。さらに抗体投与群では、骨髄中のヒト赤血球系および顆粒球・マクロファージ系前駆細胞の数が有意に高かった(図9B)。またマウス白血球に対するヒト白血球の割を示すCD45キメラ率においても有意に高かったことから、抗体投与群においてヒト白血球が増加していることがわかる(図9C)。このことは7-10G4344uhmが巨核球系のみならず、他系列の細胞の生着も促進できる可能性を示唆している。
本発明のアゴニスト抗体はヒンジ部分の改変によって活性を増強していることを特徴としているが、改変による抗原性の上昇が懸念された。そこで、ヒンジ改変体である7-10G4344uhmのアミノ酸配列をもとに、コンピュータ上での抗原性予測を実施した。
本発明の抗体はマウスMplには交叉しないため、薬効を測定するため、外来遺伝子としてヒトMplを導入したトランスジェニック(Tg)マウスを作製し、抗体を投与する実験を行った。まず、マウスMplのプロモータ領域5.5kbをPCRで増幅し、pBluescriptプラスミドベクターにクローニングした。次に、ヒトMplの翻訳領域および3’側非翻訳領域をPCRで増幅し、マウスMplプロモーター下流に連結した。このコンストラクトをC57BL/6マウス受精卵に注入し、受精卵を仮親に戻し出産させた。生後3週経過した時点で尻尾からゲノムDNAを抽出し、PCRでTgマウスを選別した。得られたTgマウス個体をC57BL/6と交配し、系統化した。骨髄でのヒトMplの発現解析を行った。
II: 7-10G4344uhm 3μg投与群
III: TPO 3μg投与群
IV: PBS投与群
VI: 野生型マウス 7-10G4344uhm 10μg投与群
結果を図10に示す。抗体投与群、TPO投与群で血小板が増加した。TPO投与群は投与後2週間でほぼベースラインに戻った。これに対して抗体投与群は投与後一ヶ月を経過しても血小板数は上昇したままであった。この結果から、アゴニスト抗体は血中で非常に安定であり、単回投与で長期にわたって血小板造血を促進できることが示唆された。このことから、特にアゴニスト抗体は慢性血小板減少症の治療に適していることが示唆された。
アゴニスト抗体7-10の軽鎖可変領域(7-10VL)のフレームワーク領域に変異を導入し、結合活性及びアゴニスト活性に与える影響を調べた。軽鎖の変異体はアゴニスト抗体4-49の軽鎖(V104L)、アゴニスト6-4-50の軽鎖のアミノ酸を1つ置換したもの(A43V,G100Q)の3種である。これら変異軽鎖と7−10G4344uhm重鎖を組み合わせた抗体を作製したところ、全て、結合活性、アゴニスト活性ともにオリジナルの7-10G4344uhmと同等であった。一方で、アゴニスト抗体7-10の軽鎖可変領域の相補性決定領域(CDR領域)に変異(Y94F)を導入した場合、結合活性、アゴニスト活性ともに10分の1程度に低下した。この結果から軽鎖アミノ酸配列には、ある程度の自由度があることが示された。
各変異体の軽鎖アミノ酸配列及び7-10VLのアミノ酸配列は、以下のとおりである。なお、変異部は太字と下線で示した。
アゴニスト活性解析: 実施例5に記載の方法で、UT-7/TPO細胞を用いた細胞増殖アッセイを行った。軽鎖変異抗体は7-10G4344uhmと同等のアゴニスト活性を示した(図12)。
配列番号12〜16:プライマー
配列番号18〜22:プライマー
配列番号39〜54:プライマー
配列番号57〜73:プライマー
配列番号74:G3344h1
配列番号75:G3344
配列番号76:G4344
配列番号77:G4344h1
配列番号78:G4344uh
配列番号79:G4344uhm
配列番号80:G4PE
配列番号81:7-10G4344uhm H鎖
配列番号82:7-10G4344uhm H鎖
配列番号83:7-10G4344uhm L鎖
配列番号84:7-10G4344uhm L鎖
配列番号85:7-10VL_V104L(変異体)
配列番号86:7-10VL_G100Q(変異体)
配列番号87:7-10VL_A43V(変異体)
Claims (6)
- 配列番号2で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号3で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ヒトトロンボポエチン受容体(c−Mpl)に対するアゴニスト抗体。
- ヒトc−Mplに対するアゴニスト抗体がヒト抗体である、請求項1に記載の抗体。
- 請求項1または2に記載の抗体を有効成分として含む医薬組成物。
- 請求項1または2に記載の抗体を有効成分として含む血小板増多剤。
- 骨髄移植又は臍帯血移植時の血小板回復促進用である、請求項4に記載の血小板増多剤。
- 請求項1または2に記載の抗体を有効成分として含む血小板減少症治療剤。
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