JP4966450B2 - ペット用動物のための抗酸化剤組成物およびその使用方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
遊離基は、生体の好気性代謝に固有であり、生理学的および病理学的過程により産生される。これらは時に意図的に産生されて、貪食細胞中の殺菌薬のような生物学的官能基を供給する、または化学作用により偶然産生されて破壊的行為を示すかもしれない。産生の機構がどうであれ、遊離基の産生および除去がコントロールされなければ、生体における効果は有害なものになり得る。過度のおよび不適切な損傷に対抗するために、抗酸化防御の同化システムが発達してきた。
【０００２】
酸化剤と酸化剤のための抗酸化剤との間に不均衡が存在するので、ある状態の酸化ストレスが存在し、組織を損傷し得る。
【０００３】
本発明は、特に、ペット用のネコおよびイヌにおける酸化ストレスの問題を克服するための方法を提供する。
【０００４】
したがって、本発明の第一の態様により、ペット用のネコまたはイヌにおける血漿ビタミンＥレベルを増加する方法であって、血漿ビタミンＥレベルを増加させるのに十分な量のビタミンＥを前記ネコまたはイヌに投与する工程を含む方法が提供される。この増加は、動物の血漿中で測定可能な最大／飽和点まででもよい。この増加は、血漿ビタミンＥレベルについての動物自身の基準線の2から3倍の範囲でもよい（最大の生理的増加に近い）。この増加は、対照の食餌が与えられた動物の血漿ビタミンＥレベルと比較して、それぞれの動物の25％まで、好ましくは25％以上（好ましくは50％まで、または25％から50％まで、あるいは50％から90％まで）の血漿ビタミンＥレベルの増加として測定してもよい。対照の食餌とは例えば、ネコまたはイヌについてビタミンＥ消費の合計が10IU/400kcalである。
【０００５】
ビタミンＥは、同じ生物学的活性を有する、いわゆるトコフェノールおよびトコトリエノールを含む、いくつかの生物学的に類似する化合物についての集合的な用語である。動物組織において最も生物学的に活性のあるビタミンＥの生物学的形態は（同時に最も活性のある酸化剤）、アルファ−トコフェノールである。ビタミンＥは、インビボで合成できない。ビタミンＥは、細胞および細胞小器官の機能を有害に変化させる、細胞膜の完全性の喪失を保護する。
【０００６】
ビタミンＥの単位は、国際単位(IU)で示すことができ、1IUのアルファ−トコフェノールは、1mgのアルファ−トコフェノールと等しい。McDowell, L.R(1989) Vitamin E: In vitamins in Animal Nutrition, Chapter 4, page 96, Academic Press, UKに記載されるように、他のビタミンＥ化合物は、アルファ−トコフェノールと比較した生物効力により測定されるIUを有する。
【０００７】
現在まで、ペット用のイヌまたはネコにおいて存在するビタミンＥ欠乏症を防止するのに十分な最低レベルの他にビタミンＥのレベルは関心を持たれていない。本発明により、イヌまたはネコにおけるビタミンＥのレベルが食餌中に存在するレベルを示し、これらのレベルにより動物が調整されたペットフードを与えられている場合には超えることのない通常の基準線レベル（実施例参照）が提供されるということが同定される。本発明により、イヌおよびネコにおけるビタミンＥのレベルは、動物の食餌により高レベルのビタミンＥを組み込むことにより増加できること（およびこのことは特別に調整されたペットフードおよび／またはネコまたはイヌのサプリメントを提供することにより達成できること）が示される。
【０００８】
本発明の態様により、ペット用のネコおよびイヌにおける酸化ストレスを減少する方法が提供される。そのような酸化ストレスの減少は、特に免疫応答を強化し、より健康な動物が提供される。イヌまたはネコにおける酸化的損傷の標識には、特に：血漿カルボニル（タンパク質酸化の最終産物）、血漿脂質ヒドロペルオキシド（脂質酸化の標識）、およびLDL酸化への応答として産生される抗LDL抗体が含まれる。これらのいずれかの低下は、酸化的損傷の減少を示す。
【０００９】
本発明の第一の態様によるビタミンＥは、任意の形態でもよい。これは、トコフェノールまたはトコトリエノールでもよい。アルファ−トコフェノール（d-αまたはdl-α）、ベータ−トコフェノール（d-βまたはdl-β）、ガンマ−トコフェノール（d-γまたはdl-γ）、デルタ−トコフェノール、アルファ−トコトリエノール、ベータ−トコトリエノール、ガンマ−トコトリエノールまたはデルタトコトリエノールでもよい。好ましくは、アルファ−トコフェノールである。
【００１０】
ビタミンＥの供給源は制限されない。好ましいビタミンＥ供給源には、ビタミンＥアセテート、（例えばトコフェノールアセテート）、ビタミンＥアセテート吸着物または噴霧乾燥されたビタミンＥアセテートが含まれる。天然の供給源を使用してもよいが、好ましい供給源は合成物である。
【００１１】
ビタミンＥの投与の形態は制限されない。食餌、食品またはサプリメントの形態でもよい。本明細書において以下、「食品」とは、すべての食品、食餌およびサプリメントを含む。任意のこれらの形態は、固体、半固体または液体でもよい。
【００１２】
サプリメントは、十分に高いレベルの本発明による一つ以上の成分を含有しない食餌または食品を補うのに特に有用である。サプリメントにおける成分の濃縮を、動物の食餌または食品におけるレベルを「一杯にする(top up)」ために使用してもよい。このことは、動物の食餌にある量のサプリメントを含むことによりまたはある量のサプリメントを動物にさらに与えることにより実施できる。サプリメントは、動物に与える前に希釈が必要な、非常に高いレベルの本発明の一つ以上の成分を有する食品として形成してもよい。サプリメントは、固体（例えば粉末）、半固体（例えば食物状の軟度／ゲル）、液体を含む任意の形態でもよく、あるいは錠剤またはカプセルの形態でもよい。液体は、例えばスプーンまたはピペット状の装置により、食物と都合よく混合できるまたは動物に直接与えることができる。サプリメントは、本発明の一つ以上の成分において高くてもよい、またはそれぞれの部分が必要なレベルの一つ以上の成分を含有する少なくとも二つの部分の結合したパックの形態でもよい。
【００１３】
好ましくはビタミンＥは、市販のペットフード産物または市販の食餌サプリメントに組み込まれる。ペットフード産物は、乾性、半乾性、湿ったまたは液体（飲料）の産物でもよい。湿った産物には、缶詰またはホイル容器で販売され、70％から90％までの含水率を有する食物が含まれる。乾燥産物には、同様の組成を有するが、5％から15％までの含水率を有し、ビスケットのような粗びきの穀物として存在する。食餌、食品またはサプリメントは、好ましくは包装される。このように、消費者は、包装から食物中の成分を同定でき、当のイヌまたはネコに適切であることを同定できる。包装は、金属（通常は缶詰またはフレキシホイル(flexifoil)の形態で）、プラスチック、紙または厚紙でもよい。任意の産物における含水率の量は、使用できるまたは必要とされる包装の種類に影響を与え得る。
【００１４】
本発明による食品には、イヌまたはネコが食餌において消費し得る任意の産物が含まれる。したがって、本発明は、一般的な食品産物、並びにペットフードスナック（例えばスナックバー、ビスケットおよび菓子産物）を含む。食品は好ましくは調理された産物である。肉または動物に由来する材料（牛肉、鶏肉、七面鳥、子羊、血漿、髄入りの骨など、またはこれらの二つ以上）が含まれてもよい。あるいは食品は、タンパク質供給源を提供するために肉を含まなくてもよい（好ましくは大豆、メイズグルテンまたは大豆産物のような肉の代用物を含む）。産物には、大豆タンパク質濃縮物、乳タンパク質、グルテンなどのような追加のタンパク質供給源が含まれてもよい。産物にはまた、一つ以上の穀物（例えば小麦、トウモロコシ、米、オート麦など）のような澱粉供給源を含んでもよいまたは澱粉を含まなくてもよい。通常の乾燥した市販されているイヌおよびネコの食品には、約30％の天然タンパク質、約10−20％の脂肪を含有し、残りは食餌の繊維および灰分を含む炭水化物である。通常湿った、または湿気のある産物には、（乾燥した物質を基礎として）約40％の脂肪、50％のタンパク質が含まれ、残りは繊維および灰分である。本発明は、ネコまたはイヌのための食餌、食品またはサプリメントとして販売されるここに記載される食品に特に関連する。
【００１５】
本明細書において、「ペット用の」イヌおよび「ペット用の」ネコとは、イヌおよびネコ、特にフェリス・ドメスティックス(Felis domesticus)およびカニス・ドメスティックス(Canis domesticus)を意味する。
【００１６】
ネコまたはイヌにおける血漿ビタミンＥのレベルは容易に測定できる。血漿ビタミンＥレベルを測定する代表例が、実施例の序説部分に記載されている。
【００１７】
産物（固体または液体あるいは任意の他の形態）におけるビタミンＥの濃度は容易に測定できる。このことも、実施例の序説部分に記載されている。
【００１８】
本発明の第一の態様において、対照の食餌は、代わりに、全体で15IU/400kcalのビタミンＥを動物に提供してもよい。
【００１９】
好ましくは、本発明の第一の態様によるビタミンＥの投与は、25IU/400kcalからのレベルの食餌である。本明細書に亘って、kcal毎の濃度についての言及は、代謝可能なエネルギーの総摂取量のkcalについてである。カロリー濃度の測定は、Nutritional Requirements of Dogs (1985) National Research Council (U.S.) National Academy Press Washington DC, ISBN: 0-309-03496-5またはNutritional Requirements of Cats (1986) National Research Council (U.S.) National Academy Press Washington DC, ISBN: 0-309-03682-8を使用して同定できる。ネコについて好ましいレベルは、30IU/400kcalから、35IU/400kcalから、40IU/400kcalから、45IU/400kcalから、50IU/400kcalから、55IU/400kcalから、約100IU/400kcal以上までである。イヌについて好ましいレベルは、30IU/400kcalから、40IU/400kcalから、45IU/400kcalから、50IU/400kcalから、55IU/400kcalから、60IU/400kcalから、65IU/400kcalから、約100IU/400kcal以上までである。
【００２０】
本発明の第一の態様について、本発明の方法には、ある量のビタミンC（アスコルビン酸）の投与が含まれる。
【００２１】
ビタミンCは、水溶性の物質である。ビタミンCは、ペット用のネコおよびペット用のイヌの両方においてde novo合成される。インビボで合成されるので、イヌおよびネコにおけるビタミンCサプリメントの効果は、以前は研究されていない。特に、潜在的な酸化剤としておよびビタミンＥと組み合わせた、ネコおよびイヌにおけるビタミンCの補助の効果は研究されていない。
【００２２】
本発明により、ネコまたはイヌにおけるビタミンCレベルは補助により増加できることが示される。このことは、ビタミンC補助後の血漿値における増加により示される。ビタミンCレベルにおける増加は、遊離基の減少、したがって動物における酸化ストレスの減少の一因となり得る。
【００２３】
本発明の第一の態様によるビタミンCは、任意の形態でもよい。ビタミンCは、液体、半固体または固体でもよい。好ましくはある形態のリン酸カルシウムのような熱安定性の形態である。
【００２４】
ビタミンCの供給源は、制限されない。好ましいビタミンC供給源には、極微量の二リン酸塩および極微量の三リン酸塩、リン酸カルシウム、または例えば新鮮な肝臓を有する、結晶状アスコルビン酸（必要に応じて純粋な）、エチルセルロース被覆されたアスコルビン酸、アスコルビン酸のリン酸カルシウム塩、アスコルビン酸−2−一リン酸塩またはアスコルビル−2−一リン酸塩が含まれる。
【００２５】
産物（固体、液体または任意の他の形態）中のビタミンCのレベルは、容易に測定できる。このことは、実施例の序説部分に記載されている。
【００２６】
ビタミンCと組み合わせたビタミンＥの使用に関するさらなる有用な点は、共同作用的に作用する可能性である。このことは、ビタミンＥは脂溶性でありビタミンCは水溶性であるという事実により補助される。アルファ−トコフェノールは、脂質膜中に位置することが知られている。例えばアスコルビン酸塩およびアルファ−トコフェノールは、細胞膜またはリポタンパク質と水との間の界面において相互に作用する。アスコルビン酸は、膜中のアルファ−トコフェノール遊離基を急速に減少させ、アルファ−トコフェノールを再生する。本発明の第一の態様によるビタミンCの好ましい濃度は、動物が対照の食餌を与えられる場合と比較して約25％まで（好ましくは25％以上）動物の血漿ビタミンCレベルを増加するレベルであり、全ビタミンC消費は、（ネコまたはイヌの両方について）5mg/400kcalの食餌である。この増加を達成しないビタミンCのレベルも、本発明の第一の態様に含まれる。本発明の第一の態様によるビタミンCのレベルには、10、12、15、17、20、22、25、27、30、32、38、40、42、48から約50mg/400kcalの食餌が含まれる。ネコについて好ましいレベルは、10から48mg/400kcalまでの上述の選択であり、イヌについては12から50mg/400kcalまでの上述の選択である。55mg/400kcalより上のレベルは追加の利益を提供せず、通常は避けるのがよい。
【００２７】
本発明の第一の態様には、ある量のタウリンの投与が含まれてもよい。タウリンは、上述される補助されたビタミンCに加えて、またはその代わりでもよい。
【００２８】
タウリンは、様々の種類の動物において見られる変わったアミノ酸である。タウリンは、イヌと異なりネコにとって必須栄養素であり、前駆体アミノ酸からタウリンを合成することはできない。タウリンは、酸化剤を含む毒性組成物から細胞膜を保護すると考えられている。動物の食餌中のビタミンタウリンレベルの増加は、特に本発明の他の成分と組み合わせて、遊離基の減少およびしたがって動物における酸化ストレスの減少の一因となり得る。
【００２９】
本発明の第一の態様によるタウリンは、任意の形態でもよい。粉末、結晶、半固体または液体でもよい。
【００３０】
タウリンの供給源は制限されない。好ましいタウリンの供給源には、アミノエチルスルホン酸(C2H7N03S)が含まれる。供給源は、天然または合成でもよい。
【００３１】
本発明の第一の態様による使用に適切なタウリンの濃度は通常、ある程度は産物の加工（例えば産物が乾燥しているかまたは缶詰にされるか）に関して決定される。ネコにおける血漿タウリンレベルを正常な範囲(>60μmol/l)に維持するために、缶詰にされた（湿った）食餌により1日に少なくとも体重1kgにつき39mgのタウリンを供給し、乾燥した食餌により1日に少なくとも体重1kgにつき19mgのタウリンを供給しなければならない。本発明の第一の態様により、高温方法（例えば缶詰）を受けない産物について、好ましくは約80mg/400kcalから、より好ましくは約100から、さらに好ましくは120 、150、180、200、220、250、280、300、320、350、400およびそれ以上のmg/400kcalからのレベルの食餌が提供される。例えば高温により加工される産物において、本発明によるレベルは、好ましくは約380mg/400kcalから、より好ましくは約400から、さらに好ましくは420 、450、480、500、520、550、580、600、620、650、700およびそれ以上のmg/400kcalからのレベルの食餌である。産物（固体、液体または任意の他の形態）におけるタウリンの濃度は、容易に測定できる。典型的な方法が、実施例の序説部分に記載されている。インビボのネコにおけるタウリンの状態は、食餌補助により増強できる。食餌のタウリン含有量の用量反応効果は、血漿レベルにより測定できる。このことも実施例の序説部分に記載されている。
【００３２】
本発明の第一の態様にはさらに、ある量のカロチノイドの投与が含まれる。カロチノイドは、上述のように補助されたビタミンCおよび／またはタウリンに加えて、またはその代わりでもよい。
【００３３】
カロチノイドは、植物食品、特に果物および野菜、および植物を食べる動物の組織中に主に見られる赤、オレンジおよび黄色の色素の一群である。カロチノイドは、脂肪親和性の化合物である。カロチノイドには、ビタミンAの前駆体として作用するものもあり、作用できないものもある。この特性は、抗酸化作用とは関連しない。カロチノイドは、強力な抗酸化剤として作用できる。カロチノイドは、異なる動物の種類により様々の程度で吸収される。カロチノイドは、二つの主なグループに分類される；カロチンに基づくものおよびキサントフィルに基づくもの（含酸素化合物を含む）。一般的なカロチノイドには、ベータ−カロチン、アルファ−カロチン、リコピン、ルテイン、ゼアキサンチンおよびアスタキサンチンが含まれる。カロチノイドは、ネコまたはイヌの食餌における必須栄養素であることは証明されていない。ヒトおよびイヌと異なり、転換に必要な酵素がネコの腸粘膜に存在しないので（ネコはカロチン分子を分解するのに必要なジオキシゲナーゼ酵素を有しない）、ネコは前駆体ベータ−カロチンを活性ビタミンA形態に転換できない。
【００３４】
本発明により、カロチノイドはペット用のネコおよびイヌにより吸収されることが可能であり（血漿濃度を増加する）、酸化ストレスの減少に寄与し得るということが示される。さらに、本発明により、カロチノイドは市販の産物に組み込んだ後吸収できることが示された。上述のように、本発明の第一の態様の成分は、共同作用的に作用する。ビタミンＥは、ベータ−カロチンを酸化から保護することができ、ベータ−カロチンに節約効果を有する。ビタミンＥは、ベータ−カロチンの化学結合を酸化から保護すると考えられる。
【００３５】
カロチノイドの供給源は制限されず、天然および合成の供給源が含まれてもよい。特に、好ましい供給源は天然の供給源であり、以下のものが含まれる；マリゴールド粉餌およびムラサキウマゴヤシ粉餌（ルテインの供給源）；トマト粉餌、赤パーム油、トマト粉末、トマトのしぼりかす／果肉（ベータ−カロチンおよびリコピンの供給源）。供給源には、カロチノイドレベルの高い油およびルテイン、ビオラキサンチン、クリプトキサンチン、ビキシン、ゼアキサンチン、アポ−EE（アポ−8−カロチン酸エチルエステル）、カンタキサンチン、シトラナキサンチン(citranaxanthin)、アキネノン(achinenone)、リコピンおよびカプサンチンのような純粋に製造されたカロチノイドが含まれる。全カロチノイドの好ましいレベルは、0.01mg/400kcalから、または0.2mg/400kcalからまたは1mg/400kcalからあるいは2mg/400kcalからである。
【００３６】
以下のカロチノイドの濃度が好ましい：
ベータ−カロチン：0.01から1.5mg/400kcalまで、好ましくは0.5から1mg/400kcalまで
リコピン：0.01から1.5mg/400kcalまで、好ましくは0.5から1mg/400kcalまで
ルテイン：0.05から1.5mg/400kcalまで、好ましくは0.5から1mg/400kcalまで。
特に、本発明により、本発明の第一の態様においてカロチノイドの組合せが提供される。
【００３７】
組み合わせたカロチノイドの好ましい供給源には；
赤パーム油およびマリゴールド粉餌
トマト粉末、マリゴールド粉餌およびムラサキウマゴヤシ
トマトのしぼりかすおよびマリゴールド粉餌
が含まれる。
【００３８】
上述のように、本発明には、ビタミンＥおよび必要に応じて他の成分が含まれる。成分の有用な組合せには（好ましくは缶詰にされたまたは乾燥したペットフード中の）、
ビタミンＥ、ビタミンC、タウリン、赤パーム油およびマリゴールド粉餌
ビタミンＥ、ビタミンC、タウリン、トマト粉末、マリゴールド粉餌およびムラサキウマゴヤシ
ビタミンＥ、ビタミンC、タウリン、トマト粉末およびマリゴールド粉餌
ビタミンＥ、ビタミンC、タウリン、トマト粉末およびムラサキウマゴヤシ
ビタミンＥ、タウリン、トマトのしぼりかすおよびマリゴールド粉餌
が含まれる。
【００３９】
本発明の組合せは、以下のようである。
【００４０】
【表１】
本発明のさらなる有用な組合せは、以下のようである。
【００４１】
【表２】
本発明による食品の他の有用な成分には、極微量の無機質（直接抗酸化剤ではないが、抗酸化金属酵素システム内の補因子として作用する）、セレニウム（抗酸化セレノ酵素の実質的部分であるグルタチオンペルオキシダーゼ）、銅、亜鉛およびマンガン（抗酸化金属酵素Cu-Zn-スーパーオキシドジスムターゼおよびMn-スーパーオキシドジスムターゼの必須部分を形成する）が含まれる。
【００４２】
本発明の第一の態様の方法によると、同時に、別々に、または連続して成分を投与、または消費してもよい。
【００４３】
本発明の第２の態様に基づき、動物の抗酸化剤状態を高めるのに十分な濃度の成分をイヌまたはネコに供給する食品を提供する。
【００４４】
本発明の第１の態様の好ましい特徴の全てが第２の態様にも適用される。特に、第１の態様に基づくレベルおよび好ましいレベル（より好ましいおよび最も好ましいレベルを含む）の全てが第２の態様にも適用される。
【００４５】
好ましくは、そのイヌまたはネコ用の食品は、２０mg/lより高いレベルのビタミンＥの抗酸化剤状態を提供する。
【００４６】
本発明の第３の態様は、本発明の第１の態様に基づくレベルの濃度のビタミンＥを提供する。その濃度は、本発明の第１の態様に基づき記載された濃度であり、記載の割合（％）の上昇または特定レベル（好ましいレベルを含む）をもたらす濃度である。
【００４７】
また、第３の態様に基づくイヌまたはネコ用の食品も、本発明の第１の態様のビタミンＣのレベルに基づく濃度のビタミンＣを提供し得る。
【００４８】
第３の態様のイヌまたはネコ用の食品は、ビタミンＣに加えてまたはビタミンＣの代わりに、本発明の第１の態様のタウリンレベルに基づく濃度のタウリンも提供し得る。
【００４９】
第３の態様に基づくイヌまたはネコ用の食品は、ビタミンＣおよび／またはタウリンに加えてまたはそれらの代わりに、本発明の第１の態様のカロチンレベルに基づく濃度のカロチンも提供し得る。
【００５０】
第１および第２の態様の好ましい特徴は、第３の態様にも適用される。
【００５１】
本発明の第４の態様は、イヌまたはネコの低い抗酸化剤状態を防止または治療するのに用いるための、本発明の第３の態様に基づくイヌまたはネコ用の食品を提供する。
【００５２】
第１から第３の態様の好ましい特徴は、第４の態様にも適用される。
【００５３】
本発明の第５の態様は、酸化的ストレスによる要因を有する任意の疾患を予防または治療するのに用いるための、本発明の第２、第３、第４または第９の態様に基づくイヌまたはネコ用の食品を提供する。その使用は、「病気」または「疾患」の要因としての酸化的ストレスを予防または治療するためである（従って、酸化的ストレスによる要因を（少なくともある程度）軽減することによって、病気または疾患が緩和され得る）。そのような疾患として、老化、癌、心疾患、粥状動脈硬化、関節炎、白内障、炎症性腸疾患、腎臓病、腎不全、神経変性疾患、免疫性疾患（例えば免疫低下(compromised immunity)）が挙げられる。また、動物のワクチン接種（毎年であることが多い）ならびに麻酔（一般的な麻酔を必要とし得る歯の治療および紫外線または放射線の照射のような例年の処置にも用い得る）によって生じる酸化的ストレスを予防および治療することを含む。免疫機能に関して、本発明は、年齢のせいで低下した免疫機能を有する動物（例えば成長中の動物または老化した動物）、ならびに免疫的攻撃を経験した動物にも適用可能である。臨床的に健康な動物において健全な免疫反応を維持（ならびに免疫反応を最適化しまたは高める）こともその定義に含まれる。
【００５４】
脊椎動物の免疫系は当業界でかなり検討されている（例えば、Immunology, Roitt, Brostaff and Male, Gower Medical Publishing, London, New York, 1985）。免疫的攻撃として、感染、ワクチン接種、ならびに麻酔（例えば外科手術の前）のような他の外的要因が挙げられる。本発明の１つの目的は、免疫的攻撃に対して改善された免疫反応がもたらされるように、免疫系を維持、最適化または「高める」のに用い得る食餌／食品または栄養補助食品（および関連態様）を提供することである。所定の抗原に対する反応において産生された抗体を測定することによって、免疫反応をモニターすることができる。そのような知識および技術は当業界で一般的である。所定の時間枠の中での循環抗体のレベル（抗体価）が高いこと、検出された抗体反応が速いこと、あるいは循環抗体価が長時間に亘って維持されることによって、改善された免疫反応を説明することができる。
【００５５】
改善された免疫反応は、免疫的攻撃の間に動物を補助し、さらに、動物の子は完全に発達した免疫系を持たないため、特に、動物の子に有用となり得る。動物の子はワクチン接種されることが多いため、本発明は、ワクチン接種された際に動物が改善された免疫反応をもたらすことができるような手段を提供する。本発明は、特に、ジステンパー、パルボウィルスおよび／またはアデノウィルスに対するワクチン抗原でワクチン接種する前にイヌに与えるのに有用である。本発明は、特に、ネコ汎白血球減少ウィルス、ネコカリシウィルスおよび／またはネコヘルペスウィルスに対するワクチンまたは複合ワクチンのためにネコに与えるのに有用である。免疫的攻撃の前に与えるための適切な期間は、その動物および免疫的攻撃に依存する。一貫してその食品を与えて差し支えない。免疫的攻撃前の８、６、４、２および１週間が適切である。それより長い期間であっても適切である。
【００５６】
また、本発明は、酸化的ストレスによる要因または酸化的ストレスによる要因を有する疾患を予防または治療するための方法（イヌまたはネコに適切である）を提供し、その方法はイヌまたはネコに本発明の食品を与えることを含む。その疾患は上記の通りである。また、本発明は、イヌまたはネコにおいて、免疫的攻撃に対する免疫反応を強化する方法に関するものであり、その方法は、本発明の食品を与えることを含む。
【００５７】
第１から第４の態様の好ましい特徴は第５の態様にも適用される。
【００５８】
酸化的ストレスによる要因を有する任意のネコまたはイヌの疾患の予防または治療のための、あるいは酸化的ストレスの予防または治療のための薬剤／臨床的または獣医的な食餌の製造におけるビタミンＥの使用に関する。
【００５９】
第１から第５の態様の好ましい特徴は第６の態様にも適用される。
【００６０】
本発明の第７の態様は、イヌまたはネコにおける、in vivo抗酸化剤として食品に組み込まれた25IU/400kcal以上のレベルのビタミンＥの使用に関する。第１から第６の好ましい特徴の全てが第７の態様にも適用される。特に、ビタミンＥのレベルは本発明の第１の態様のために示されたビタミンＥの好ましいレベルと同様であって差し支えない。
【００６１】
本発明の第８の態様は、本発明の第２から第５の任意の態様の食品を製造する方法を提供し、その方法は、その食品の２つ以上の成分を一緒に混合することを含む。その成分の１つは、要求レベルのビタミンＥである。食品の好ましい形態はペットフード製品であり、従って、任意の形態のペットフード製品を製造する方法は、ペットフード製品の成分を共に混合し、さらに本発明の１つ以上の成分を組み込むことを含む。その食品を製造／加工する間の任意の時に（包装前の最後の工程のような最後の時期を含む）その成分を加えて差し支えない。
【００６２】
Waltham Book of Dog and Cat Nutrition, Ed. ATB Edney, Chapter by A. Rainbird, entitled “A Balanced Diet”, pages 57 to 74, Pergamon Pressに記載のような任意の当業界で公知の方法に基づいてその製品を製造することができる。
【００６３】
本発明の第９の態様は、15mg/400kcal食餌 以上の濃度でビタミンＣを包含するイヌまたはネコ用の食品を提供する。その食餌、食品または栄養補助食品の詳細は、ビタミンＣ成分に関して、15mg/400kcal食餌 以上の濃度のビタミンＣを包含する点で、本発明の前記の態様で記載したものと同様である。本発明の第９の態様のビタミンＣ濃度と別々にあるいは組み合わせて、この中に記載の第１から第８の態様の特徴を選択して差し支えない。本発明の第９の態様は、酸化的ストレスによる要因を有する疾患の予防または治療に有用な食品を提供する。そのような疾患は、本発明の前記態様のために上述されているような疾患である。イヌまたはネコ用の食品にビタミンＣを含めることは、定められたおよび特定のビタミンＣの濃度および所定の用途に関する限り独特である。
【００６４】
ビタミンＣの濃度は15mg/400kcal以上の範囲である。好ましいレベルは本発明の第１の態様のビタミンＣの好ましい濃度である上記の15mg/400kgを越える濃度である。ビタミンＣは、ペット用のネコおよびペット用のイヌの両方においてin vivoで合成されるため、ネコまたはイヌの食物を介してネコまたはイヌに補足レベルのビタミンＣを導入することを考えることは特に興味深いものではない。しかしながら、本発明は、そのような食餌が主に臨床食／獣医食／薬剤の製造のために特に有用と成り得ることを示す。
【００６５】
また、本発明は、イヌまたはネコのための食品におけるビタミンＣの使用に関する。その使用は、酸化的ストレスによる要因を有する疾患の予防または治療のため、あるいは酸化的ストレスによる要因の予防または治療のための食餌の製造における使用であって差し支えない。そのような疾患として、癌、老化、心疾患、粥状動脈硬化、関節炎、白内障、炎症性腸疾患、腎臓病、腎不全、神経変性疾患または例えば感染症に罹った動物のような免疫低下が挙げられる。また、本発明は、健康な動物での免疫的攻撃において処置または補助するために使用され得る。
【００６６】
また、本発明は、イヌまたはネコにおいて、酸化的ストレスによる要因を有する疾患（または酸化的ストレスによる要因）の予防または治療のための方法に関するものであり、本発明の第９の食品をネコまたはイヌに与えることを含む。
【００６７】
実施例において下記の図面を参照する。
【００６８】
ここで、以下の非限定的な実施例を参照して本発明を説明する。当業者は、特にこの中に挙げられている種々の引例の教示（その開示は参照によって組み込まれる）を考慮して、実施例において具体化された本発明に変更を加え得ることを認識するであろう。
【００６９】
実施例
緒言
ここでは、まず、ビタミンＥ、ビタミンＣ、タウリンおよびカロチノイドの特定のために、どのように血液試料を採取し得るかについて記載する。また、血漿中の成分の分析方法および食物中の成分を測定する方法についても記載する。以下に示した詳細に加えて、McDowell L. R. (1989) Vitamin E: In Vitamins in Animal Nutrition Chapter 4, page 96, Academic Press, UKにおいて分析方法に関する詳細を見出すことができる。
【００７０】
血漿および全血中のタウリン
試料の調製：
頭部静脈または頸静脈のいずれかから血液試料をヘパリン処理した容器に採取する。ローラー上において試料を混合後、実験室に移すために試料を氷上に保持する。分析するまで、全血を−２０℃に凍結する。あるいは、血漿測定のために、血液試料を遠心して（３５００ｒｐｍ、０℃で１０分間）血漿を回収する。分析するまで血漿を−２０℃に凍結する。
【００７１】
試料を採って、スルホサリチル酸溶液と反応させてタンパク質を沈殿させることによって、ネコ血漿／血液中のタウリンの分析を実施する。次に試料を遠心し、上澄みを濾過する。
【００７２】
ネコにおいて血漿タウリンを測定している引例として、Earle, K.E. and Smith, P. M. (1991) The effect of dietary taurine content on the plasma taurine concentration of the cat. British Journal of Nutrition 66, 227-235を参照。
【００７３】
血漿ビタミンＣ
試料の調製：
頭部静脈または頸静脈のいずれかから血液試料をヘパリン処理した遮光容器に採取する。ローラー上において試料を混合後、実験室に移すために試料を氷上に保持する。血液試料を遠心して（３５００ｒｐｍ、０℃で１０分間）血漿を回収する。次の日分析するまで血漿を−２０℃に凍結する。全ての時間、抑えた照明下において試料を調製する。
【００７４】
抽出溶媒(5ml)（15g メタリン酸＋0.475g EDTA＋20ml 氷酢酸/500ml水）で血漿(1ml)を抽出する−その方法は生成物のための方法と同じである。
【００７５】
ネコにおいて血漿中の上昇をもたらすのに好ましいビタミンＣの最少用量は20mg/400kcalである。イヌにおいて血漿中の上昇をもたらすために試験された好ましいビタミンＣの最少用量は27mg/400kcalである。
【００７６】
血漿ビタミンＥ
試料の調製：
頭部静脈または頸静脈のいずれかから血液試料をヘパリン処理した容器に採取する。ローラー上において試料を混合後、実験室に移すために試料を氷上に保持する。血液試料を遠心して（３５００ｒｐｍ、０℃で１０分間）血漿を回収する。分析するまで血漿を−２０℃に凍結する。
【００７７】
試料サイズ＝250μl。内部標準として酢酸トコフェロールを添加した後、ヘキサン中に試料を抽出する。ヘキサンを蒸発させ、残渣をメタノール中に溶解させてＨＰＬＣに注入する。逆相カラム（溶出液としてメタノールを用い、285nmでUV検出する）を用いて分離を実施する。
【００７８】
ネコにおいて血漿中の上昇をもたらすのに好ましいビタミンＥの最少用量は34IU/400kcalである。イヌにおいて血漿中の上昇をもたらすために試験された好ましいビタミンＥの最少用量は50IU/400kcalである。
【００７９】
血漿中のカロチノイドの特定
頭部静脈または頸静脈のいずれかから血液試料をヘパリン処理した遮光容器に採取する。ローラー上において試料を混合後、実験室に移すために試料を氷上に保持する。血液試料を遠心して（３５００ｒｐｍ、０℃で１０分間）血漿を回収する。分析するまで血漿を−８０℃に凍結する。全ての時間、抑えた照明下において試料を調製する。
【００８０】
血漿中のカロチノイドを特定するために以下の２つの方法を用いることができる。
【００８１】
方法１
第１の方法は、ルテインおよびゼアキサンチン（本方法では分離されない）を除いて、関心のある主要カロチノイドを測定する。
【００８２】
カロチノイドを検出するために用いられる方法は、Craft, N.E. and Wise, S.A., Journal of Chromatography, 34, 377-381, 1988の方法を改変したものである。
【００８３】
血漿からのカロチノイドの抽出は、Thurnham et al. Clinical Chemistry, 34, 377-381, 1988の方法を改変したものを用いて成される。
【００８４】
方法２
第２の方法は、ルテインおよびゼアキサンチンを分離し、さらにカロチノイドの異なるアイソフォームを分離する。
【００８５】
カロチノイドを検出するために用いられる方法は、Yeum, Kyung-Jin., et. al. Am. J. Clin. Nutr, 64, 594-602, 1996の方法を改変したものである。
【００８６】
血漿からのカロチノイドの抽出は、Thurnham et al. Clinical Chemistry, 34, 377-381, 1988の方法を改変したものを用いて成される。
【００８７】
全ての抽出は抑えた照明下で実施され、さらにカロチノイドのストック溶液をアルゴン下で保存した。
【００８８】
ビタミンＣ−食品
アスコルビン酸は酵素的に酸化されてデヒドロアスコルビン酸になり、デヒドロアスコルビン酸はo-フェニレンジアミンと縮合して蛍光キノキサリン誘導体になる。後者（蛍光キノキサリン誘導体）は、蛍光検出を用いた逆相ＨＰＬＣによって干渉化合物から分離される。
【００８９】
ビタミンＡ ＆ Ｅ食品
水酸化カリウムエタノール溶液(ethanolic potassium hydroxide solution)で試料を加水分解し、石油エーテル中にビタミンを抽出する。エバポレーションで石油エーテルを除去し、残渣をプロパン-2-オール中に溶解させる。逆相液体クロマトグラフィーによって、プロパン-2-オール抽出物中のビタミンＡおよびＥの濃度を特定する。
【００９０】
フリーのタウリン−食品
フリーのタウリンは、食品中において栄養的に利用できるタウリンである。
【００９１】
試料を採り、希釈塩酸を添加することによってフリーのタウリンの分析を実施する。その試料を浸漬し、用量フラスコに移す。少量を採って、スルホサリチル酸を添加してタンパク質を沈殿させる。次にその試料を遠心し、さらに上澄みを濾過する。得られた溶液をダンシル塩化物と反応させ、蛍光検出を用いたＨＰＬＣによって分析する。
【００９２】
カロチノイド−食品
分析のために２０−２５ｇの試料を採る。２８％水酸化カリウムエタノール溶液を用いて、３０分間、試料を鹸化する。窒素下、９０℃で、かつ抗酸化剤としてピロガロールを用いて鹸化する。冷却後、鹸化した抽出物を混合エーテル(エーテル／ジエチルエーテル1：1)(2x250ml)で抽出し、さらに有機相を中性になるまで水で洗浄する。抗酸化剤としてＢＨＴを用い、真空下、３５℃で、エーテル抽出物を蒸発させ、さらに残渣をＨＰＬＣ移動相中に再溶解させる。450nmでのUV検出を用いた逆相ＨＰＬＣによってカロチノイドを特定する。
【００９３】
所定の実験研究に加えて、本発明は、抗酸化剤カクテルをネコに与えた後、ネコの赤血球浸透圧脆弱性が改善されることによって健康の改善の指標となった。
【００９４】
浸透圧ストレスに抵抗する赤血球細胞の能力を試験した。その方法は、異なる濃度のNaClを含有する溶液中に洗浄した赤血球を再懸濁させることを含む；インキュベートし、さらに遠心する。浸透圧脆弱性に基づき、ヘモグロビンが細胞から放出される。結果は、本発明の抗酸化剤を与えられたネコの赤血球が浸透圧ストレスに対してより抵抗性が高く、同じレベルの溶血をもたらすのに有意に低い濃度のNaClが必要であることを示した。浸透圧ストレスの状態を許容する赤血球の能力は、生理的状態が改善されていることの指標である。
【００９５】
実施例１
ビタミンＥ
８匹のイヌから成る群に、２つのレベルのビタミンＥ（以下（表１）に記載のα−酢酸トコフェロール）を与える前の６週間の間、完全栄養食（基準食の欄の例示的食餌を参照）を与え続ける。
【００９６】
【表３】
50IU/400kcalおよび100IU/400kcalの両方のレベルでの単に１週間の補足によって、血漿レベルは有意(p<0.05)に上昇した。１週間の補足後、血漿飽和が認められた。補足を中止してから２週間後、血漿レベルは基線レベルまで低下した。
【００９７】
検討された用量から、ビタミンＥでの食餌の補足は、イヌにおける血漿状態を６０−６６％有意に上昇させる。
【００９８】
実施例２
ネコにおける抗酸化剤の補足
ビタミンＣ
８または９匹のネコから成る４つの群に、完全栄養食（基準食の欄を参照）を与えながら、４つの異なるレベルでビタミンＣの経口用栄養補助食品を与えた。
【００９９】
基線の血漿ビタミンＣレベルは、補足前の群の間で有意な差が無いことを示す。
【０１００】
図２から分かるように、7日以内に、４つの群全ての血漿ビタミンＣレベルが補足前の基線を越えて有意に上昇した。
【０１０１】
より高いレベルでのビタミンＣの補足によってより高い血漿値がもたらされるが、その上昇に関して、４つの群の間で有意差は無かった。
【０１０２】
補足期間の終了後、血漿ビタミンＣレベルは基線に戻った。
【０１０３】
それらデータは、食餌への相対的に低いレベルでのビタミンＣの補足によって、ネコの抗酸化剤状態が上昇し得ることを示す。
【０１０４】
実施例３
ビタミンＥ
ネコのビタミンＥ状態に対する標準的な食餌のビタミンＥレベルの効果、ならびに食餌の補足の効果を評価した。
【０１０５】
異なるビタミンＥレベルを含有する２つの市販されているネコ用の完全栄養食（基準食の欄を参照）を与え続けた１２匹のネコから成る２つの群の血漿ビタミンＥ濃度を特定した。表２に示した血漿レベル（２週間離して二重測定）は、高いレベルのビタミンＥを含有する食餌を４週間与え続けたネコの方が相対的にビタミンＥ状態が上昇することを示した。
【０１０６】
【表４】
補足の効果を特定するため、１２匹のネコから成る群に、完全栄養食を与えながら、経口用ビタミンＥ栄養補助食品（α−酢酸トコフェロール）を与えた。
【０１０７】
その補足の効果を図３に示す。補足後、血漿ビタミンＥレベルは有意に上昇し、約４から６週間の補足後、飽和に達した。
【０１０８】
従って、食餌のビタミンＥ補足はネコの抗酸化剤状態を上昇させ得る。
【０１０９】
実施例４
ネコにおける全血漿抗酸化剤；正常範囲および年齢の影響
ペット用のネコにおける全抗酸化剤状態は今まで報告されていない。本研究の目的は、ネコにおける全抗酸化剤状態を特定する方法が有効であることを確認し、健康な成ネコ(adult cat)での正常な全抗酸化剤の範囲を特定し、さらに全血漿抗酸化剤状態に対する年齢の影響を調べることである。
【０１１０】
Randox Laboratories Limitedが製造している比色測定キット(NX2332)がネコにおける全抗酸化剤状態を特定するのに有効であった。ネコ血漿試料および市販の品質管理(ＱＣ)物質(PAR 721013およびPAR 721014；Bio-stat Diagnostics)の分析を繰り返すことによって、測定の精度を特定した。測定内の(Intra)および測定間の(Inter)の変動計数（ＣＶ）は、血漿試料を用いた分光光度測定法において許容される変動を示した（ＣＶ＜１０％、ＱＣ ＣＶ＜５％）。ネコ血漿の希釈は、その測定法において線形反応をもたらした。
【０１１１】
血漿抗酸化剤レベルに対する老化の影響を評価した。ある範囲のネコ用の完全栄養食（基準食の欄を参照）を与えられた１３４匹のネコが本研究に参加した。６ヶ月から１４歳の間の年齢の６９匹の雄および６５匹の雌のペット用のショートヘアーのネコ(domestic shorthaired cats)から採取した単一の血漿試料において、全抗酸化剤状態を評価した。全て、平均値±標準偏差(SD)で示した。
【０１１２】
結果は、抗酸化剤状態の過渡期は６歳にあることを示唆する。ニューマン−クールズ多重域テスト(Newman-Keuls multiple range test)は、６歳より若い年齢のネコの全血漿抗酸化剤状態が６．５歳を越える年齢のネコよりも、有意に(p<0.01)高いことを示した（表３を参照）。その年齢での抗酸化剤状態の低下が病気に罹りやすさを示唆するか否か、あるいはその年齢での抗酸化剤状態がネコの寿命に影響するか否かは分かっていない。
【０１１３】
【表５】
実施例５
イヌにおける全血漿抗酸化剤およびスーパーオキシドジスムターゼの状態
ペット用のイヌにおける抗酸化剤状態についてほとんど知られていない。本研究の目的は、全血漿抗酸化剤(ＴＰＡＯ)および赤血球ＳＯＤ(スーパーオキシドジスムターゼ)活性を測定する方法の有効性を確かめ、さらにそれらの正常範囲を特定することである。
【０１１４】
Randox Laboratories Limitedが製造している比色測定キットがイヌにおけるＴＰＡＯ状態(キット番号：NX2332)およびＳＯＤ状態（キット番号：SD125）を特定するのに有効であった。イヌ血漿試料および市販の品質管理(ＱＣ)物質(PAR 721013およびPAR 721014；Bio-stat Diagnostics)の分析を繰り返すことによって、ＴＰＡＯの測定の精度を特定した。測定内のおよび測定間の変動計数（ＣＶ）は、血漿試料を用いた分光光度測定法において許容される変動を示した（ＣＶ＜１０％、ＱＣ ＣＶ＜５％）。イヌ赤血球試料の分析を繰り返すことによって、ＳＯＤ状態の測定の精度を特定した。測定内のおよび測定間の変動計数（ＣＶ）は、赤血球試料を用いた分光光度測定法において許容される変動を示した（ＣＶ＜１０％）。
【０１１５】
９ヶ月から１６歳の間の年齢の３０匹の雄および２０匹の雌のイヌにおいて、ＴＰＡＯおよび赤血球ＳＯＤ状態を評価した。１０種類の系統が含まれた。全てのイヌが臨床的に正常であり、さらに種々の完全栄養食を長期間与えられた。年齢とＴＰＡＯまたはＳＯＤ活性との間の明らかな関連性は無かった。イヌは年齢群の間で同等では無く（データは示していない）、その所見がより多くの試料およびより適切な年齢の差によって支持されるか否かを評価するため、さらに研究を進めている。平均ＴＰＡＯ状態（雄：0.719±0.135、雌：0.786±0.101）またはＳＯＤ活性（雄：1275.41±264.46、雌：1267.61±166.34U/g Hb）のいずれにおいても、性別による有意差は認められなかった。しかしながら、バートレットテスト(Bartletts Test)によると、雄（6994.0）と雌（27670.3）のイヌにおけるＳＯＤ活性の変動の間に有意差が認められた(p<0.05)。
【０１１６】
５種類以上の代表的系統を含むそれら系統の分析によると、ＳＯＤ活性およびＴＰＡＯ状態について、性別ではなく、系統間において有意差が認められた。ニューマン−クールズ多重域テストによると、ビーグル犬は、ラブラドール犬およびヨークシャーテリア犬よりも、有意に低い平均ＳＯＤ活性(p<0.05)および平均ＴＰＡＯ状態(p<0.01)を有することが示された（表４）。
【０１１７】
【表６】
それらデータは、イヌにおいて、正常なＳＯＤおよびＴＰＡＯが単一の値であると仮定するのは十分でないことを示唆する。これに関連して、２つの値が必要であり、１つはビーグル犬用の値であり、もう１つは他の２つの系統用の値である。ＴＰＡＯ状態および赤血球ＳＯＤ活性の平均値域の９５％信頼区間は、ビーグル犬においてそれぞれ0.569±0.067mmol/lおよび1084.9±97.27U/g Hbであり、他の２つの系統では、0.822±0.047mmol/lおよび1316.2±88.03U/g Hbである。
【０１１８】
実施例６
完全自動化比色測定法によるネコおよびイヌにおける全抗酸化剤状態の評価
本研究の目的は、Randox Laboratories Ltdが製造している比色測定キットがネコおよびイヌにおける全抗酸化剤状態を特定するのに有効であることを確認することである。第２に、ネコおよびイヌの年齢による全抗酸剤状態における変化を評価し、さらにそれら変化を他の生物学的パラメーターおよび血液パラメーターにおける変化と比較するために上記の確認された測定法を用いる。その測定法は、2,2’-アジノ−ジ−（3−エチルベンズチアゾリンスルホンメート）(ABTS)と過酸化物およびH2O2とを反応させて、600nmで測定され得るラジカルカチオンABTS+を産生する。試料中に存在する抗酸化剤は、その濃度に比例する割合で、その着色を抑制するであろう。その測定法は、Randox Laboratoriesによって提供されるプロトコルを用いて、Cobas Mira アナライザー(Roche Diagnostics)において実施された。ネコおよびイヌの血漿試料および市販の品質管理(ＱＣ)物質の分析を繰り返すことによって、測定の精度を特定した。測定内のおよび測定間のＣＶは、ＱＣ物質において共に５％未満であり、ネコおよびイヌの血漿試料において共に１０％未満であった。ネコおよびイヌの血漿の希釈は、その測定法において線形反応をもたらした。種々の年齢のペット用のショートヘアーのネコおよび数種類の系統の血統書付きイヌにおいて、全抗酸化剤状態を含む通常の血漿および生物学的プロフィールを実施した。ネコにおいて、抗酸化剤状態は２ヶ月の年齢に至るまで上昇したが、その後低下を示した。性別による差は観察されなかった。１歳未満の雌イヌは、抗酸化剤状態においてわずかな低下が認められたが、年齢による有意な変化は無かった。多重回帰分析によると、ネコにおける抗酸化剤状態、アルブミン、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼおよびカルシウムの間、ならびにイヌにおける抗酸化剤状態、リン酸塩およびアラニンアミノトランスフェラーゼの間において、関連性が認められた。有効性確認の結果は許容され得るものであると考えられ、さらにその測定法はネコまたはイヌにおける抗酸化剤状態を特定するのに適切である。
【０１１９】
実施例７
健康な成ネコにおける血漿状態に対するビタミンＣ栄養補助食品の効果
ビタミンＣはin vovoにおける主要な水溶性抗酸化剤であり、酸化を遅延させまたは阻害することができ、特に細胞外液中において重要である。しかしながら、ネコ（フェリス・ドメスティックス(Felis domesticus)）における異なる食餌中のビタミンＣレベルに対する反応は今まで評価されていない。本研究の目的は、健康な成ネコにおける、血漿状態に対するビタミンＣ補足の効果を明らかにすることである。
【０１２０】
逆相高性能液体クロマトグラフィーによって、３３匹のネコの血漿ビタミンＣ濃度を特定した。続いて、階層化されたランダムサンプリングによってそれらネコを４つの群に配分し、その４つの群の基線の血漿ビタミンＣレベルの間に有意差が無いことを確認した（ANOVA p>0.05）。２１日間、毎日、ビタミンＣ栄養補助食品(結晶Ｌ−アスコルビン酸,ICN Phrmaceuticals, UK,ゼラチンカプセル中,Analytical Supplies Limited, UK)をネコに経口的に与えた。ネコの４つの群に、3.5、7.0、10.5または21.0mgビタミンＣ／日の何れかの用量を与えた。補足を開始してから７、１４および２１日目、ならびに補足中止後２１日目に血漿ビタミンＣレベルを特定した。全てのネコに、11.6mg/1.6MJのビタミンＣを含有する缶詰の完全栄養食を与えた。
【０１２１】
ネコの血漿ビタミンＣレベルは、与えられた４つ全てのレベルでの毎日の補足の７日後に、有意に上昇し（paired t-test p<0.05）、さらに補足期間の間、そのレベルは維持された（表５）。高いビタミンＣの補足レベルは、低いレベルでの補足と比較して、より高い血漿値をもたらしたが、血漿中の上昇において、各群間での有意差はなかった（General Linear Modelを用いた反復測定多因子(repeated measures multifactor)ＡＮＯＶＡ p<0.05）。全てのネコの血漿レベルは、補足中止後２１日で基線レベルに戻った。
【０１２２】
【表７】
それらデータは、毎日の投与を基本として、低いレベルでのビタミンＣによる食餌の補足によって、ネコの血漿状態は有意に強化され得ることを示す。その強化された血漿状態を維持するためには、継続的な補足が必要である。
【０１２３】
実施例８
ネコおよびイヌにおける血漿セルロプラスミン濃度の妥当性確認および正常範囲
銅酵素であるセルロプラスミンは、身体において、多くの機能的役割を有する。銅貯蔵タンパク質として、セルロプラスミンは、フリーの銅イオンの触媒能を防ぐのを助ける。フリーの銅はシングル電子（ラジカル）転移による自動酸化を加速し得ると共に、過酸化水素と反応して、細胞破壊を誘導する高反応性の水酸化ラジカルを形成する。また、外傷の際に、セルロプラスミンは、前酸化体である第一鉄の形態から第二鉄への鉄の転換を助長する。急性タンパク質として、セルロプラスミンは、炎症または感染の指標となり得、従って、鉄貯蔵の指標として、血清フェリチンと共に使用され得る。
【０１２４】
ネコおよびイヌにおけるセルロプラスミン酸化酵素活性を特定するための比色法は、基質としてp−フェニレンジアミンを用いるSunderman F. W. and Nomoto, S. (1990) Clin. Chem 16, 903の方法に基づいて有効性が確認された。
【０１２５】
1回の実施において、２つのイヌの血清試料および２つのネコの血清試料を１０回分析した。測定内の変動計数は、イヌの試料において1.94％と2.95％であり、ネコの試料において1.81％と3.94％であった。異なる日に１０回同じ試料を測定したところ、測定間の変動計数は、イヌの試料において8.21％と7.01％であり、ネコの試料において6.88％と9.35％であった。従って、許容レベルの測定内および測定間の変動性が得られた。続いて、血清試料と血漿試料との間のセルロプラスミン濃度の違いを評価した。何れの種においても、血清試料と血漿試料との間で有意差は無かった。従って、必要とする試料の全容量を減らすため、血漿試料を採取した。
【０１２６】
正常値を明らかにするため、１０２匹の健康なイヌ（いろいろな系統、年齢および性を混ぜる）および５４匹の健康なペット用のショートヘアーのネコ（いろいろな年齢および性を混ぜる）から血漿試料を得た。イヌおよびネコの平均血漿セルロプラスミン濃度は、それぞれ、9.28IU/L(SD 3.03IU/L)および10.90IU/L(SD 3.34IU/L)であった。それらの値を用いて、正常範囲（平均値±2SD）が、イヌでは3.22IU/Lから15.35IU/Lであり、ネコでは4.22IU/Lから17.58IU/Lであることを明らかにした。イヌにおけるその正常範囲は、以前報告された値(Solter P. F. et al (1991) Am J Vet Res 52, 1738, 1991)と一致した。ネコにおける正常範囲は今まで明らかにされていないが、イヌの正常範囲に類似していることから、それら２つの種の間で循環セルロプラスミンレベルにおける差はほとんどないことが示唆された。ネコおよびイヌの健康状態を評価するために、本研究において明確にされた正常範囲を用いることができる。
【０１２７】
実施例９
イヌのフェリチン：血清における測定法の有効性確認および正常範囲
フェリチンは、身体において、抗酸化防御システムにおいて重要な役割を果たす。鉄に対する高親和性貯蔵タンパク質として、フェリチンは、鉄を安全な結合形態に維持して、反応性の第一鉄が酸化的損傷を誘導し得るフェントン反応に加わるのを防止する。正常な健康状態において、フェリチンは種特異的タンパク質であり、身体の鉄貯蔵を反映する濃度で血中に認められ、他のパラメーターと共にin vivoでの鉄の状態を評価するのに用いることができる。イヌにおける循環フェリチンレベルを特定するために、モノクロナール抗体を用いるWeeks, B.R. et al (1988) Am J Vet Res 49, 1193 (1988)の方法を応用した酵素結合免疫測定法（ELISA）を開発した。その測定法の有効性確認に続いて、イヌの正常範囲を明らかにした。
【０１２８】
０−４０ng/mlの範囲において、フェリチンの標準曲線は直線であり（最少ニ乗回帰分析、r=0.997）かつイヌ血清に加えられた精製フェリチンの回収率は97.7％であった。２つの血清試料中のフェリチン濃度を１２回測定することによって得られた測定内変動計数は8.2％および6.6％であった。２つの血清試料を異なる日に１０回測定することによって得られた測定間変動計数は16.6％と16.2％であった。
【０１２９】
正常値を定めるためのフェリチン測定用に、雄雌混合のかつ５種類の異なる系統の９６匹の健康なイヌから血清試料を得た。三重または四重のいずれかで、各試料を測定し、それら値の平均値をその試料のフェリチン濃度として用いた。血清フェリチン濃度は、67.20から621.07の範囲で変化し、平均値は371.62ng/ml(SD 102.85ng/ml)であった。そのデータは正常に分布していた。それら結果は、イヌにおいて、血清フェリチンが優れた再現性で特定され得ることを示す。得られた値は、将来の研究における正常範囲として用いられ、さらにイヌにおける鉄貯蔵レベルを特定する有用な方法を提供するであろう。
【０１３０】
実施例１０
食餌のトコフェノールの補足は正常範囲を越えてイヌの血漿値を上昇させる
ビタミンＥは天然の８つの分子、すなわち４つのトコフェロールおよび４つのトコトリエノールの集合名である。種々の形態の生物学的活性は、α＞β＞γ＞δ−トコフェロールの相対的なペロキシル−スキャベンジング反応性(peroxyl scavenging reactivities)の順序による抗酸化活性と大体相関する。通常、必要量を越えた栄養素の供給は、明確な利益を何らもたらさない。成犬におけるビタミンＥの最少必要量は、2.5IUα−トコフェロール／400kcal（食餌）として確立されている(Nutrient Requirements of Dogs (1985) National Research Council(U.S.) National Academy Press Washington DC ISBN: 0-309-03496-5)。調製されたペットフードは、大体、ペットフード中のビタミンＥの正常範囲を越えて、上記最少必要量の10倍までの量を含んでおり、血漿濃度が一定となる傾向がある。血漿反応に対するビタミンＥ補足の効果を評価する研究において、缶詰に入ったイヌの完全栄養食（基準食の欄を参照）を与えられた６匹の成犬（ビタミンＥ含有量は8.2mg/400kcal (8.2IU/400kcal)）に、100IUビタミンＥ／日に等価な栄養補助食品を６週間与えた。６匹のイヌから成る対照群は、同じ条件下で飼育されたが、食餌の補足を受けなかった。補足期間の間および補足期間後の４週間、血漿α−トコフェロールをモニターした。
【０１３１】
血漿α−トコフェロールレベルを表６に示す。処置群と対照群との基線の平均血漿α−トコフェロールレベルは有意差が無かった(p=0.43)。補足開始２週間後、処置群の平均値は対照群(p=0.002)および基線値(p<0.001)と比較して有意に上昇した。５６日目および７０日目（補足中止後１４日目および２８日目）に実施した測定は、基線より有意に高い状態を維持していることを示した。それら結果は、調製されたペットフード中に通常含まれるレベルを超えるレベルのビタミンＥが、イヌにおいて血漿状態を上昇させることができ、さらにその上昇が補足中止後数週間維持され得ることを明らかに示唆する。血漿を飽和させるためには、調製されたペットフードに通常含まれるレベルを越えて与える必要があることが明らかである。ビタミンＥの強い抗酸化能を考慮すると、フリーラジカル損傷および関連する変性疾患を防ぐ機会を最大にするため、イヌにおいてビタミンＥ状態を上昇させることは賢明であろう。
【０１３２】
【表８】
実施例１１
ビタミンＥは同じ生物学的活性を有する８つの異なるトコフェロールおよびトコトリエノールの集合名である。８つの中で、α−トコフェロールが生物学的におよび化学的に最も活性が高い形態のビタミンＥであり、α−トコフェロール1mgは、ビタミンＥの１IUに相当する。ビタミンＥは身体において強力な抗酸化剤であり、主に生体膜に存在し、過酸化物損傷から膜のリン脂質を保護する。また、ビタミンＥはビタミンＡの酸化を阻害し、従って、ビタミンＡ欠乏症を防ぐ。成犬におけるビタミンＥの最少必要量は、2.5IUα−トコフェロール／400kcal食餌 であることが明らかにされている(Nutrient Requirements of Dogs (1985) National Research Council(U.S.) National Academy Press Washington DC ISBN: 0-309-03496-5)。しかしながら、健康な成犬および子犬におけるビタミンＥの正常値に関して情報が不足している。健康な成犬および子犬における一般的な基線の血漿α−トコフェロールレベルを特定するため、ある範囲の缶詰のおよび乾燥した完全栄養調製ペットフード（基準食の欄を参照）を与えられたイヌにおいて、一連の研究を実施した（表７）。体重に応じて食餌を与えた(110kcal/kg0.75)。各血漿α−トコフェロールレベルは、9から39.2mg/lの範囲であり、中間値は21.1mg/lであった。異なる食餌を与えられたイヌのグループの間で、基線のα−トコフェロール値の平均値に有意差は無かった(p=0.24)。それらデータは、子犬および成犬における一般的なα−トコフェロールレベルが類似し、調製されたペットフード中において通常認められるビタミンＥレベル内において、血漿トコフェロールレベルが同様の範囲を示すことを示唆する。
【０１３３】
【表９】
実施例１２
健康な成犬における運動が血漿ＴＢＡＲＳ(酸化的ストレスの指標)を上昇させる
プレカラムを有するＨＰＬＣによって測定された血漿ＴＢＡＲＳ（チオバルビツール酸反応性物質）は、in vivoにおける脂質過剰酸化の十分立証されたマーカーである。本研究の目的は、イヌ(キャニス・ファミリアリス(Canis familiaris)における酸化的ストレスの指標に対する運動の効果を調べることである。
【０１３４】
各種系統および年齢を混ぜた１４匹のイヌから成るパネルに、本実験前3ヶ月および本実験の間、市販されている乾燥完全栄養食を与えた。ＴＢＡＲＳとして形成されたマロンアルデヒド（ＭＤＡ）を特定することによって、急激な２０分間の小放牧場での運動の直前の脂質の過剰酸化の程度を定量化した。その分析は、Bird, P. P.＆Draper, H.H. (1984), Methods in Enzymology 105: 299-305 (1984)によって記載された方法に基づいて測定した。その結果は、運動後、血漿ＴＢＡＲＳにおいて有意な上昇(22%)を示した(運動前0.74μM±0.2、運動後0.92μM±0.2, Paired T Test p<0.05)。運動後における濃縮された血液の容積の直接的結果として生じる上昇を調べるため、ＰＣＶ（赤血球沈層容積）および血漿アルブミンを測定した。結果は運動前と運動後において有意差を示さず(p>0.05)、従って本研究の所見は、in vivoでの増大した脂質の過剰酸化が、運動−誘導の酸化的ストレスの直接的結果として生じることを示唆する。文献は、酸化的損傷の特異的部位が細胞膜であり、強い酸化的ストレスの条件下において過酸化ラジカル(RO2)が増幅することを提案する。その所見は、健康な成犬における、食餌の脂質相抗酸化剤介入(dietary lipid -phase antioxidant intervention)の潜在的役割を推測する。
【０１３５】
動物の抗酸化剤状態および発明的な抗酸化剤カクテルの効果の他の実施例を以下に示す。
【０１３６】
実施例１３
ペット用のネコにおける食餌のカロチノイド吸収
ネコは代謝的に肉食性であるにもかかわらず、市販されているキャットフードに組み込まれているβ−カロチンおよびリコペンのような抗酸化剤は、ネコにおいてカロチノイドの吸収の有意な上昇をもたらすであろう。本研究において、３つの缶詰のネコの食餌は、同じ基本レシピを用いて、同じバッチの生の材料を用いて製造された。対照の食餌（食餌Ａ）はβ−カロチンおよびリコペン（含有量が＞0.1mg/1.67MJ ME）を含み、代謝可能なエネルギー(ME) 3.39MJ/kgを有していた。食餌Ｂは、0.36mg/1.67MJ MEのβ−カロチン含有量および＞0.1MJ MEのリコペン含有量を有するレッドパームオイルを(3.70MJ ME/kg)を補足された。食餌Ｃは、＞0.1MG/1.67MJ MEのβ−カロチン含有量および0.9MG/1.67MJ MEのリコペン含有量を有するトマトの絞りかす(3.54 MJ ME/kg)を補足された。
【０１３７】
５匹の健康なネコから成る２つの群を本研究のため選択した。群１のネコは、平均年齢が8.72歳(SD 2.1歳)であり、かつ３匹の雄と２匹の雌を含んでいた。群２のネコは、平均年齢が7.4歳(SD 1.7歳)であり、かつ２匹の雄と3匹の雌を含んでいた。本研究のネコの全ては、既に種々の市販の完全栄養調製キャットフードを与えられており、その後７日間食餌Ａを与えて、食餌Ａに対するアクラメイション(acclamation)を可能とした。本研究の８日目に、基線の血漿カロチノイドレベルを特定した。続いて、５日間、群１のネコに食餌Ｂを与え、かつ群２のネコに食餌Ｃを与えた。本研究の１３日目に、基線用の試料と同じ方法で、血漿の採取を繰り返した。高性能液体クロマトグラフィーによって分析を実施した。
【０１３８】
食餌Ｂを与えられた群１のβ−カロチン濃度は、基線値(平均値 6.35ng/ml、SD 3.23ng/mL)を越えて、有意に上昇した(平均値 17.62ng.mL、SD 2.50 ng/mL)。その群において、血漿リコペン濃度は、検出限界未満を維持した。食餌Ｃを与えられた群２のネコにおいて、基線レベルの血漿β−カロチン濃度(平均値 5.30ng/mL、SD 5.78ng/mL)と食餌Ｃを与えた後のレベルの血漿β−カロチン濃度(平均値 6.61ng/mL、SD 2.83ng/mL)に有意な変化は無かった。しかしながら、群２のネコは、血漿リコペン濃度において、基線レベル(0ng/mL)から食餌Ｃを与えた後のレベル(平均値14.6ng/mL、SD 7.25ng/mL)へと有意な上昇を示した。
【０１３９】
従って、本研究は、ネコが代謝的に肉食性であるにもかかわらず、市販されているキャットフードに組み込まれたβ−カロチンおよびリコペンのような天然供給源の抗酸化剤が、ネコにおいてカロチノイドの吸収における有意な上昇をもたらすであろうことを示す。循環抗酸化剤における上昇は、ネコの抗酸化剤状態に有益な効果をもたらすであろう。ネコにおけるカロチノイドの吸収の増加は、これまでは、そのような低い食餌濃度では認められなかった。
【０１４０】
実施例１４
母乳は発育中の子猫において最大の抗酸化剤状態をもたらすには不十分であろう
免疫機能に関して、年齢のせいで低い免疫機能を有する動物（例えば成長中の動物）ならびに免疫的攻撃を受けた動物に、抗酸化剤の効果を同様に適用できる。以下の研究の結果は、母乳が発育中の子猫において最大の抗酸化剤状態をもたらすには不十分であろうことを示しており、そのことは、子猫が酸化的ストレスを受け易いことに寄与し得る。従って、子猫のために、栄養補助食品として抗酸化剤カクテルを投与すると、抗酸化剤カクテルを与えられた子犬において認められたように、抗体反応時間における改善を同様に示す。
【０１４１】
酸化的損傷に抵抗する哺乳類の能力は、内因性の抗酸化防御システム、および食餌によって提供される総合的抗酸化剤状態に対する寄与の両方に依存する。動物の抗酸化剤状態を測定する１つの方法は、その全血漿抗酸化能（ＴＰＡＯ）を評価することである。Randox Laboratories Ltdが製造している比色測定キットが、ＴＰＡＯの正常範囲を測定するためにネコにおいて用いるのに有効であることを確認した。血液試料中に存在する抗酸化剤は、その血液濃度に比例して、その測定において着色の抑制を生じさせるであろう。
【０１４２】
健康な子猫におけるＴＰＡＯの正常範囲を特定するため、および年齢とＴＰＡＯとの間に何らかの関連性が有るか否かを特定するため、本研究を実施した。１４、３５および６０日の年齢の１６匹の健康な子猫（８匹の雄、8匹の雌）から血漿試料を得た。上記の方法を用いてその試料を測定し、さらにＡＮＯＶＡを用いてその結果を比較した。結果を以下の表に示す
【表１０】
その結果から、乳離れ前の子猫のＴＰＡＯの状態は正常な成体の範囲の底値であり、３５から６０日の間に成体レベルに達する。生後１４日において、栄養必要量を与えるために子猫は完全に母乳に依存する。３５日の年齢の子猫は、母乳への依存度がかなり少なくなり、その主な栄養摂取を固形食物から得ており、６０日の年齢では完全に乳離れする。それら結果は、発育中の子猫において、母乳は最大の抗酸化剤状態をもたらすのに不十分であることを示唆し、そのことは子猫が酸化的ストレスに罹りやすいことに寄与する。
【０１４３】
実施例１５
抗酸化剤を補強した食餌はネコの抗酸化能を高める
４６匹の健康なペット用ショートヘアーのネコから成る群を年齢および性別に基づいて２つの群に無作為に分配した。群Ａに対照の基本の食餌(基準食の欄に基づく完全湿食)を与え、群Ｂには抗酸化剤カクテルを補足した湿食を３０週間与えた。
【０１４４】
【表１１】
全てのネコから絶食試料を得て、第二鉄還元抗酸化力(ferric reducing antioxidant power)(ＦＲＡＰ)、ならびに第二鉄還元抗酸化力およびアスコルビン酸濃度(ferric reducing antioxidant power and ascorbic acid concentration) (ＦＲＡＳＣ)測定法を用いて抗酸化能を評価した。
【０１４５】
ＦＲＡＰおよびＦＲＡＳＣの両方に関して、群Ａと比較して群Ｂにおいて抗酸化能が有意に(p<0.05)高かった。
【０１４６】
【表１２】
従って、抗酸化剤を補強した食餌を与えられたネコにおいて抗酸化能が上昇し、そのことは酸化的損傷に関連する有害な影響を緩和する能力の上昇をもたらす。
【０１４７】
実施例１６
ネコの免疫状態に対する抗酸化剤を補足した食餌の効果
実験計画
４８匹の正常で健康なネコに対照の食餌（基準食の欄の完全食）を６週間与え、その後、基線値の測定を実施した。次に、対照群または処置群の何れかにネコを分配し（年齢を合わせる）、実施例１５に記載の補足された食餌を与えた。８週間目に、血清イムノグロブリン濃度を特定するため、動物から試料を採取した。１２週間目に免疫パラメーターを測定し、さらにネコにワクチン接種した（ネコ汎白血球減少ウィルス、ネコカリシウィルスおよびネコヘルペスウィルスに対する標準的複合ワクチンを用いる）。１８週間目に、ワクチン接種後の最後の測定を実施した。
【０１４８】
方法
マイトジェン誘導リンパ球転換測定法（ＭＩＬＴ）による末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)増殖反応の評価
Histopaque1077(Sigma)において、密度勾配遠心によって、ヘパリン処理した血液から末梢血単核細胞を単離した。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で２回、および１０％熱不活化牛胎仔血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、および２％ピルビン酸ナトリウムを補足したRPMI-1640(Dutch修飾)で１回、細胞を洗浄した。トリパンブルー排除試験(Sigma)によって細胞の生存率を評価した。
【０１４９】
９６穴平底マイクロタイタープレート中において、フィトヘムアグルチニン(ＰＨＡ)(5μg/ml)(Murex)、コンカナバリンＡ(Ｃｏｎ Ａ)(7.5μg/ml)およびヤマゴボウマイトジェン(ＰＷＭ)(1μg/ml)(Sigma)と共に、1x105/well（三重）で９６時間細胞を培養した。培養の最後の１８時間、[3H]−チミジン取り込み（カウント／分）(cpm)(0.5μCi/well)によって増殖を測定した。
【０１５０】
フローサイトメトリーによるリンパ球サブセットの分析
ＣＤ４およびＣＤ８陽性細胞がネコの免疫において最も特徴付けられているリンパ球であり、それら細胞の十分な蓄積が健康な免疫系の指標となり得る。精製されたリンパ球および全血の両方、ならびに種々のモノクロナール抗体(Mabs)を用いて測定を実施した。
【０１５１】
結果
マイトジェン誘導リンパ球転換測定法（ＭＩＬＴ）によるＰＢＭＣ増殖反応の評価
表８は、免疫的攻撃前および後のマイトジェンＰＨＡ、Ｃｏｎ ＡおよびＰＷＭに対するＰＢＭＣの反応を示す。マイトジェン誘導リンパ球転換測定法(ＭＩＬＴ)のデータは、対照群または処置群の増殖反応において有意な変化を示さなかった。刺激指標の分析を行うと、ワクチン接種前からワクチン接種後において、ＰＨＡ刺激指標(ＳＩ)(p<0.05)およびＣｏｎ Ａ指標(p<0.001)の両方が、処置群で有意に低下した。ヤマゴボウＳＩは、両方の群において、基線からワクチン接種前において有意に上昇し(p<0.05)、かつワクチン接種後処置群において有意に低下した(p<0.01)。
【０１５２】
【表１３】
フローサイトメトリーによるリンパ球サブセットの分析
表９は、ワクチン接種の前後におけるＴ細胞の相対的なサブセット総数およびＣＤ４+：ＣＤ８+比を示す。ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞サブセットを分析した結果、ワクチン接種後、両方の群において、ＣＤ４陽性細胞の割合（％）が有意に増加し(p<0.05)、さらに対照群(p<0.05)と試験群(p<0.001)の両方の群においてＣＤ８陽性細胞が有意に増加した。
【０１５３】
リンパ球のＣＤ４+：ＣＤ８比を評価した結果、免疫的攻撃後、対照群ではその比が有意に低下したが、処置群では変化しなかった。年齢の関連を評価した結果、ワクチン接種前、対照群において、年齢の上昇に伴いＣＤ４+：ＣＤ８+比が低下する傾向があった(r=-0.483, p<0.05)。
【０１５４】
【表１４】
補足された食餌を与えられたネコのＰＷＭ刺激細胞のＳＩにおける観察された相違は（表８）、ＣＤ２の有益なアップレギュレーション（Ｔ細胞の活性化マーカー）があることを示唆する。
【０１５５】
表９は、ネコのワクチン接種後のＣＤ４：ＣＤ８比に対する、補足された食餌の有益な効果を明白に示す。補足されたネコにおけるＣＤ４：ＣＤ８比は、対照群と比較して、ワクチン接種後も維持された。その維持は主としてＣＤ４の増加によるものである。
【０１５６】
それら事実は、ネコの免疫反応に対する補足の有益な効果を示す。
【０１５７】
実施例１７
子犬の特異的抗体反応に対する抗酸化剤カクテルの効果
* 一緒に生まれたラブラドールおよびグレイハウンドの子犬を年齢および性を合わせた２つの群に分けた。
【０１５８】
* 各系統の１つの群には、カクテル（以下に詳細を記載）を補足した標準食（基準食の欄の完全食）を与え、各系統の他の群には、補足していない食餌を与えた。
【０１５９】
【表１５】
* ワクチン接種の前、最大４週間までの間、栄養補助食品を与えた。
【０１６０】
*通常のワクチン接種手順に基づいて、全ての子犬にワクチン接種した
（パルボウィルスおよびジステンパーを含むワクチン）
*全ての子犬について、ワクチン抗原に対する抗体レベルを測定した。
【０１６１】
*それら結果のいくつかを表４、５および６に示す。
【０１６２】
*それら結果は、抗酸化剤カクテルの補足を受けた子犬が、特異的抗原に対するより迅速な反応（ワクチンによって誘導されるようなあるいは病原菌への暴露によって誘導され得る）を起こすことを明白に示唆する。
【０１６３】
*それら結果は、抗酸化剤カクテルが動物の子の免疫反応に非常に有益な効果を有することを示す。
【０１６４】
実施例１８
成犬および老犬におけるワクチン反応の維持に対する抗酸化剤カクテルの有益な効果
*２つの群のイヌの年齢、性および系統を合わせた。
【０１６５】
*以前ワクチン接種を受けた時期（本研究開始前）に基づいて、２つの群をさらに合わせた。
【０１６６】
*１つの群には抗酸化剤カクテルを補足された食餌を与え（以下に詳細を示す）、他方の群には補足されていない対照食を与えた。
【０１６７】
【表１６】
*補足された食餌を開始して６ヶ月後、イヌにおいて、循環中の抗アデノウィルス抗体価を測定した。結果を図７のグラフに示す。
【０１６８】
*それら結果は、抗酸化剤カクテルを含有する食餌を与えられた動物が、補足されなかったイヌと比べて長時間ワクチン誘導抗体を維持し得ることを示す。
【０１６９】
実施例１９
抗酸化剤カクテルを含有する缶詰の乾燥食を８週間与えられたイヌにおける抗酸化剤状態および酸化的損傷
概要
*この報告は、抗酸化剤カクテルを含有する缶詰の乾燥食を８週間与えられたイヌから得られた結果（抗酸化剤状態および酸化的損傷）を含む。
【０１７０】
*抗酸化剤を与えられた群における血漿ＦＲＡＰおよびビタミンＥレベルは、対照食を与えられた群よりも有意に高かった。
【０１７１】
*抗酸化剤食を与えられた若い成犬および老犬の両方における血漿ビタミンＥレベルは、それぞれの対照群よりも有意に高かった。
【０１７２】
材料＆方法
動物
１）動物のタイプ
純血種で（ラブラドール、ビーグル、ウェストハイランドホワイトテリア、ニューファンドランド、およびゴールデンレトリバー）、雌雄混合の(無傷の、去勢した／卵巣摘出した)４０匹の若い成犬(0.8歳から3.3歳)および老犬(6.5歳から12.5歳)が本研究に含まれた。
【０１７３】
２）飼育
イヌは、２匹で一組に分けられ、その囲いから外部環境に出入りできた。全てのイヌは、絶えず室内に出入りできた。汚食症による(糞便を食べることによる)交差汚染(cross contamination)を防ぐため、同じ処置群からのイヌを一緒に収納した。自然光サイクルで、温度は２２℃に制御された。イヌは毎日の規則的な運動の日課に従った。
【０１７４】
３）給餌スケジュール
本研究の開始前１週間、全てのイヌに、缶詰の完全栄養乾燥食を与えた。１週間の順応期間の後、２／３のイヌには対照群として基準食を与え続けたが、残りの１／３のイヌは試験食に切換えた。各イヌに与える食餌の量は、ＭＥ方程式(110xBM^0.75kcal)に基づいた。従って、各イヌに与える食餌の量は、体重を維持するように適合させた。全てのイヌは常に新鮮な水を飲むことができた。
【０１７５】
試験物質
試験食は、対照食には添加されていない以下の材料を含有する。
【０１７６】
【表１７】
試験計画
本研究は長期的な試験計画であった。系統、性、年齢、体重および健康状態に基づいて、全てのイヌを無作為に分配した。
【０１７７】
【表１８】
【表１９】
血液および唾のバイオマーカー：処置の８週間後における以下のパラメーターを測定するため、各イヌから血液を採取した。
【０１７８】
【表２０】
統計
処置間におけるp<0.05での統計的有意差をみるため、n数の異なるTukey’s post hoc testによって全ての動物について、全てのパラメーターの解析を行った。群の平均値±SDとしてデータを表す。
【０１７９】
図８：抗酸化剤カクテルを含有する缶詰の乾燥食を８週間与えられたイヌにおける「抗酸化能」を測定するための血漿の第二鉄還元能(ＦＲＡＰ)の測定（対照群ｎ＝２６、試験群ｎ＝１４）。*対照群に対する有意差を示す(p<0.05)。
【０１８０】
*試験群における血漿「抗酸化能」の測定値は、８週間の処置後、対照群よりも有意に高かった。
【０１８１】
図９：抗酸化剤カクテルを含有する缶詰の乾燥食を８週間与えられたイヌにおける血漿ビタミンＥレベルの測定（対照群ｎ＝２６、試験群ｎ＝１４）。*対照群に対する有意差を示す(p<0.05)。
【０１８２】
*試験群における血漿ビタミンＥレベルは、８週間の処置後、対照群よりも有意に高かった。
【０１８３】
基準食の欄
完全栄養食
食品用の完全食、特に完全栄養ペットフード(または食)は、個々の動物の生活様式および生活段階の全ての栄養必要量を満たす食餌である。
【０１８４】
Waltham Book of Dog and Cat Nutrition, Ed. ATB Edney, Chapter by A. Rainsbird, entitled “A Balanced Diet” in pages 57 to 74, Pergoren Press Oxfordに記載のような、当業界で公知の任意の方法に基づいて、食餌または食品を製造することができる。
【０１８５】
以下に、実施例に基づく完全栄養食の組成を示す。
【０１８６】
【表２１】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、50IU/400kcalおよび100IU/400lcalのビタミンＥを補足することによる、イヌにおけるビタミンＥの血漿状態の上昇を示す
【図２】 図２は、食餌のビタミンＣ補足を反映するネコにおけるビタミンＣの血漿状態を示す
【図３】 図３は、食餌のビタミンＥ補足を受けたネコにおけるビタミンＥの血漿状態を示す
【図４】 図４は、補足された食餌または補足されていない食餌を与えた場合における、ワクチン接種後の抗パルボウィルス抗体のレベルを示す
【図５】 図５は、補足された食餌または補足されていない食餌を与えた場合における、ワクチン接種後の抗ジステンパーワクチン反応を示す
【図６】 図６は、補足された食餌または補足されていない食餌を与えた場合における、ワクチン接種後の抗パルボウィルス抗体のレベルを示す
【図７】 図７は、抗酸化剤カクテルを補足されたイヌにおける抗アデノウィルス抗体価の維持を示す
【図８】 図８は、抗酸化食餌を８週間与えられたイヌにおけるＦＲＡＰの測定を示す
【図９】 図９は抗酸化食餌を８週間与えられたイヌにおける血漿ビタミンＥレベルを示す
遊離基は、生体の好気性代謝に固有であり、生理学的および病理学的過程により産生される。これらは時に意図的に産生されて、貪食細胞中の殺菌薬のような生物学的官能基を供給する、または化学作用により偶然産生されて破壊的行為を示すかもしれない。産生の機構がどうであれ、遊離基の産生および除去がコントロールされなければ、生体における効果は有害なものになり得る。過度のおよび不適切な損傷に対抗するために、抗酸化防御の同化システムが発達してきた。
【０００２】
酸化剤と酸化剤のための抗酸化剤との間に不均衡が存在するので、ある状態の酸化ストレスが存在し、組織を損傷し得る。
【０００３】
本発明は、特に、ペット用のネコおよびイヌにおける酸化ストレスの問題を克服するための方法を提供する。
【０００４】
したがって、本発明の第一の態様により、ペット用のネコまたはイヌにおける血漿ビタミンＥレベルを増加する方法であって、血漿ビタミンＥレベルを増加させるのに十分な量のビタミンＥを前記ネコまたはイヌに投与する工程を含む方法が提供される。この増加は、動物の血漿中で測定可能な最大／飽和点まででもよい。この増加は、血漿ビタミンＥレベルについての動物自身の基準線の2から3倍の範囲でもよい（最大の生理的増加に近い）。この増加は、対照の食餌が与えられた動物の血漿ビタミンＥレベルと比較して、それぞれの動物の25％まで、好ましくは25％以上（好ましくは50％まで、または25％から50％まで、あるいは50％から90％まで）の血漿ビタミンＥレベルの増加として測定してもよい。対照の食餌とは例えば、ネコまたはイヌについてビタミンＥ消費の合計が10IU/400kcalである。
【０００５】
ビタミンＥは、同じ生物学的活性を有する、いわゆるトコフェノールおよびトコトリエノールを含む、いくつかの生物学的に類似する化合物についての集合的な用語である。動物組織において最も生物学的に活性のあるビタミンＥの生物学的形態は（同時に最も活性のある酸化剤）、アルファ−トコフェノールである。ビタミンＥは、インビボで合成できない。ビタミンＥは、細胞および細胞小器官の機能を有害に変化させる、細胞膜の完全性の喪失を保護する。
【０００６】
ビタミンＥの単位は、国際単位(IU)で示すことができ、1IUのアルファ−トコフェノールは、1mgのアルファ−トコフェノールと等しい。McDowell, L.R(1989) Vitamin E: In vitamins in Animal Nutrition, Chapter 4, page 96, Academic Press, UKに記載されるように、他のビタミンＥ化合物は、アルファ−トコフェノールと比較した生物効力により測定されるIUを有する。
【０００７】
現在まで、ペット用のイヌまたはネコにおいて存在するビタミンＥ欠乏症を防止するのに十分な最低レベルの他にビタミンＥのレベルは関心を持たれていない。本発明により、イヌまたはネコにおけるビタミンＥのレベルが食餌中に存在するレベルを示し、これらのレベルにより動物が調整されたペットフードを与えられている場合には超えることのない通常の基準線レベル（実施例参照）が提供されるということが同定される。本発明により、イヌおよびネコにおけるビタミンＥのレベルは、動物の食餌により高レベルのビタミンＥを組み込むことにより増加できること（およびこのことは特別に調整されたペットフードおよび／またはネコまたはイヌのサプリメントを提供することにより達成できること）が示される。
【０００８】
本発明の態様により、ペット用のネコおよびイヌにおける酸化ストレスを減少する方法が提供される。そのような酸化ストレスの減少は、特に免疫応答を強化し、より健康な動物が提供される。イヌまたはネコにおける酸化的損傷の標識には、特に：血漿カルボニル（タンパク質酸化の最終産物）、血漿脂質ヒドロペルオキシド（脂質酸化の標識）、およびLDL酸化への応答として産生される抗LDL抗体が含まれる。これらのいずれかの低下は、酸化的損傷の減少を示す。
【０００９】
本発明の第一の態様によるビタミンＥは、任意の形態でもよい。これは、トコフェノールまたはトコトリエノールでもよい。アルファ−トコフェノール（d-αまたはdl-α）、ベータ−トコフェノール（d-βまたはdl-β）、ガンマ−トコフェノール（d-γまたはdl-γ）、デルタ−トコフェノール、アルファ−トコトリエノール、ベータ−トコトリエノール、ガンマ−トコトリエノールまたはデルタトコトリエノールでもよい。好ましくは、アルファ−トコフェノールである。
【００１０】
ビタミンＥの供給源は制限されない。好ましいビタミンＥ供給源には、ビタミンＥアセテート、（例えばトコフェノールアセテート）、ビタミンＥアセテート吸着物または噴霧乾燥されたビタミンＥアセテートが含まれる。天然の供給源を使用してもよいが、好ましい供給源は合成物である。
【００１１】
ビタミンＥの投与の形態は制限されない。食餌、食品またはサプリメントの形態でもよい。本明細書において以下、「食品」とは、すべての食品、食餌およびサプリメントを含む。任意のこれらの形態は、固体、半固体または液体でもよい。
【００１２】
サプリメントは、十分に高いレベルの本発明による一つ以上の成分を含有しない食餌または食品を補うのに特に有用である。サプリメントにおける成分の濃縮を、動物の食餌または食品におけるレベルを「一杯にする(top up)」ために使用してもよい。このことは、動物の食餌にある量のサプリメントを含むことによりまたはある量のサプリメントを動物にさらに与えることにより実施できる。サプリメントは、動物に与える前に希釈が必要な、非常に高いレベルの本発明の一つ以上の成分を有する食品として形成してもよい。サプリメントは、固体（例えば粉末）、半固体（例えば食物状の軟度／ゲル）、液体を含む任意の形態でもよく、あるいは錠剤またはカプセルの形態でもよい。液体は、例えばスプーンまたはピペット状の装置により、食物と都合よく混合できるまたは動物に直接与えることができる。サプリメントは、本発明の一つ以上の成分において高くてもよい、またはそれぞれの部分が必要なレベルの一つ以上の成分を含有する少なくとも二つの部分の結合したパックの形態でもよい。
【００１３】
好ましくはビタミンＥは、市販のペットフード産物または市販の食餌サプリメントに組み込まれる。ペットフード産物は、乾性、半乾性、湿ったまたは液体（飲料）の産物でもよい。湿った産物には、缶詰またはホイル容器で販売され、70％から90％までの含水率を有する食物が含まれる。乾燥産物には、同様の組成を有するが、5％から15％までの含水率を有し、ビスケットのような粗びきの穀物として存在する。食餌、食品またはサプリメントは、好ましくは包装される。このように、消費者は、包装から食物中の成分を同定でき、当のイヌまたはネコに適切であることを同定できる。包装は、金属（通常は缶詰またはフレキシホイル(flexifoil)の形態で）、プラスチック、紙または厚紙でもよい。任意の産物における含水率の量は、使用できるまたは必要とされる包装の種類に影響を与え得る。
【００１４】
本発明による食品には、イヌまたはネコが食餌において消費し得る任意の産物が含まれる。したがって、本発明は、一般的な食品産物、並びにペットフードスナック（例えばスナックバー、ビスケットおよび菓子産物）を含む。食品は好ましくは調理された産物である。肉または動物に由来する材料（牛肉、鶏肉、七面鳥、子羊、血漿、髄入りの骨など、またはこれらの二つ以上）が含まれてもよい。あるいは食品は、タンパク質供給源を提供するために肉を含まなくてもよい（好ましくは大豆、メイズグルテンまたは大豆産物のような肉の代用物を含む）。産物には、大豆タンパク質濃縮物、乳タンパク質、グルテンなどのような追加のタンパク質供給源が含まれてもよい。産物にはまた、一つ以上の穀物（例えば小麦、トウモロコシ、米、オート麦など）のような澱粉供給源を含んでもよいまたは澱粉を含まなくてもよい。通常の乾燥した市販されているイヌおよびネコの食品には、約30％の天然タンパク質、約10−20％の脂肪を含有し、残りは食餌の繊維および灰分を含む炭水化物である。通常湿った、または湿気のある産物には、（乾燥した物質を基礎として）約40％の脂肪、50％のタンパク質が含まれ、残りは繊維および灰分である。本発明は、ネコまたはイヌのための食餌、食品またはサプリメントとして販売されるここに記載される食品に特に関連する。
【００１５】
本明細書において、「ペット用の」イヌおよび「ペット用の」ネコとは、イヌおよびネコ、特にフェリス・ドメスティックス(Felis domesticus)およびカニス・ドメスティックス(Canis domesticus)を意味する。
【００１６】
ネコまたはイヌにおける血漿ビタミンＥのレベルは容易に測定できる。血漿ビタミンＥレベルを測定する代表例が、実施例の序説部分に記載されている。
【００１７】
産物（固体または液体あるいは任意の他の形態）におけるビタミンＥの濃度は容易に測定できる。このことも、実施例の序説部分に記載されている。
【００１８】
本発明の第一の態様において、対照の食餌は、代わりに、全体で15IU/400kcalのビタミンＥを動物に提供してもよい。
【００１９】
好ましくは、本発明の第一の態様によるビタミンＥの投与は、25IU/400kcalからのレベルの食餌である。本明細書に亘って、kcal毎の濃度についての言及は、代謝可能なエネルギーの総摂取量のkcalについてである。カロリー濃度の測定は、Nutritional Requirements of Dogs (1985) National Research Council (U.S.) National Academy Press Washington DC, ISBN: 0-309-03496-5またはNutritional Requirements of Cats (1986) National Research Council (U.S.) National Academy Press Washington DC, ISBN: 0-309-03682-8を使用して同定できる。ネコについて好ましいレベルは、30IU/400kcalから、35IU/400kcalから、40IU/400kcalから、45IU/400kcalから、50IU/400kcalから、55IU/400kcalから、約100IU/400kcal以上までである。イヌについて好ましいレベルは、30IU/400kcalから、40IU/400kcalから、45IU/400kcalから、50IU/400kcalから、55IU/400kcalから、60IU/400kcalから、65IU/400kcalから、約100IU/400kcal以上までである。
【００２０】
本発明の第一の態様について、本発明の方法には、ある量のビタミンC（アスコルビン酸）の投与が含まれる。
【００２１】
ビタミンCは、水溶性の物質である。ビタミンCは、ペット用のネコおよびペット用のイヌの両方においてde novo合成される。インビボで合成されるので、イヌおよびネコにおけるビタミンCサプリメントの効果は、以前は研究されていない。特に、潜在的な酸化剤としておよびビタミンＥと組み合わせた、ネコおよびイヌにおけるビタミンCの補助の効果は研究されていない。
【００２２】
本発明により、ネコまたはイヌにおけるビタミンCレベルは補助により増加できることが示される。このことは、ビタミンC補助後の血漿値における増加により示される。ビタミンCレベルにおける増加は、遊離基の減少、したがって動物における酸化ストレスの減少の一因となり得る。
【００２３】
本発明の第一の態様によるビタミンCは、任意の形態でもよい。ビタミンCは、液体、半固体または固体でもよい。好ましくはある形態のリン酸カルシウムのような熱安定性の形態である。
【００２４】
ビタミンCの供給源は、制限されない。好ましいビタミンC供給源には、極微量の二リン酸塩および極微量の三リン酸塩、リン酸カルシウム、または例えば新鮮な肝臓を有する、結晶状アスコルビン酸（必要に応じて純粋な）、エチルセルロース被覆されたアスコルビン酸、アスコルビン酸のリン酸カルシウム塩、アスコルビン酸−2−一リン酸塩またはアスコルビル−2−一リン酸塩が含まれる。
【００２５】
産物（固体、液体または任意の他の形態）中のビタミンCのレベルは、容易に測定できる。このことは、実施例の序説部分に記載されている。
【００２６】
ビタミンCと組み合わせたビタミンＥの使用に関するさらなる有用な点は、共同作用的に作用する可能性である。このことは、ビタミンＥは脂溶性でありビタミンCは水溶性であるという事実により補助される。アルファ−トコフェノールは、脂質膜中に位置することが知られている。例えばアスコルビン酸塩およびアルファ−トコフェノールは、細胞膜またはリポタンパク質と水との間の界面において相互に作用する。アスコルビン酸は、膜中のアルファ−トコフェノール遊離基を急速に減少させ、アルファ−トコフェノールを再生する。本発明の第一の態様によるビタミンCの好ましい濃度は、動物が対照の食餌を与えられる場合と比較して約25％まで（好ましくは25％以上）動物の血漿ビタミンCレベルを増加するレベルであり、全ビタミンC消費は、（ネコまたはイヌの両方について）5mg/400kcalの食餌である。この増加を達成しないビタミンCのレベルも、本発明の第一の態様に含まれる。本発明の第一の態様によるビタミンCのレベルには、10、12、15、17、20、22、25、27、30、32、38、40、42、48から約50mg/400kcalの食餌が含まれる。ネコについて好ましいレベルは、10から48mg/400kcalまでの上述の選択であり、イヌについては12から50mg/400kcalまでの上述の選択である。55mg/400kcalより上のレベルは追加の利益を提供せず、通常は避けるのがよい。
【００２７】
本発明の第一の態様には、ある量のタウリンの投与が含まれてもよい。タウリンは、上述される補助されたビタミンCに加えて、またはその代わりでもよい。
【００２８】
タウリンは、様々の種類の動物において見られる変わったアミノ酸である。タウリンは、イヌと異なりネコにとって必須栄養素であり、前駆体アミノ酸からタウリンを合成することはできない。タウリンは、酸化剤を含む毒性組成物から細胞膜を保護すると考えられている。動物の食餌中のビタミンタウリンレベルの増加は、特に本発明の他の成分と組み合わせて、遊離基の減少およびしたがって動物における酸化ストレスの減少の一因となり得る。
【００２９】
本発明の第一の態様によるタウリンは、任意の形態でもよい。粉末、結晶、半固体または液体でもよい。
【００３０】
タウリンの供給源は制限されない。好ましいタウリンの供給源には、アミノエチルスルホン酸(C2H7N03S)が含まれる。供給源は、天然または合成でもよい。
【００３１】
本発明の第一の態様による使用に適切なタウリンの濃度は通常、ある程度は産物の加工（例えば産物が乾燥しているかまたは缶詰にされるか）に関して決定される。ネコにおける血漿タウリンレベルを正常な範囲(>60μmol/l)に維持するために、缶詰にされた（湿った）食餌により1日に少なくとも体重1kgにつき39mgのタウリンを供給し、乾燥した食餌により1日に少なくとも体重1kgにつき19mgのタウリンを供給しなければならない。本発明の第一の態様により、高温方法（例えば缶詰）を受けない産物について、好ましくは約80mg/400kcalから、より好ましくは約100から、さらに好ましくは120 、150、180、200、220、250、280、300、320、350、400およびそれ以上のmg/400kcalからのレベルの食餌が提供される。例えば高温により加工される産物において、本発明によるレベルは、好ましくは約380mg/400kcalから、より好ましくは約400から、さらに好ましくは420 、450、480、500、520、550、580、600、620、650、700およびそれ以上のmg/400kcalからのレベルの食餌である。産物（固体、液体または任意の他の形態）におけるタウリンの濃度は、容易に測定できる。典型的な方法が、実施例の序説部分に記載されている。インビボのネコにおけるタウリンの状態は、食餌補助により増強できる。食餌のタウリン含有量の用量反応効果は、血漿レベルにより測定できる。このことも実施例の序説部分に記載されている。
【００３２】
本発明の第一の態様にはさらに、ある量のカロチノイドの投与が含まれる。カロチノイドは、上述のように補助されたビタミンCおよび／またはタウリンに加えて、またはその代わりでもよい。
【００３３】
カロチノイドは、植物食品、特に果物および野菜、および植物を食べる動物の組織中に主に見られる赤、オレンジおよび黄色の色素の一群である。カロチノイドは、脂肪親和性の化合物である。カロチノイドには、ビタミンAの前駆体として作用するものもあり、作用できないものもある。この特性は、抗酸化作用とは関連しない。カロチノイドは、強力な抗酸化剤として作用できる。カロチノイドは、異なる動物の種類により様々の程度で吸収される。カロチノイドは、二つの主なグループに分類される；カロチンに基づくものおよびキサントフィルに基づくもの（含酸素化合物を含む）。一般的なカロチノイドには、ベータ−カロチン、アルファ−カロチン、リコピン、ルテイン、ゼアキサンチンおよびアスタキサンチンが含まれる。カロチノイドは、ネコまたはイヌの食餌における必須栄養素であることは証明されていない。ヒトおよびイヌと異なり、転換に必要な酵素がネコの腸粘膜に存在しないので（ネコはカロチン分子を分解するのに必要なジオキシゲナーゼ酵素を有しない）、ネコは前駆体ベータ−カロチンを活性ビタミンA形態に転換できない。
【００３４】
本発明により、カロチノイドはペット用のネコおよびイヌにより吸収されることが可能であり（血漿濃度を増加する）、酸化ストレスの減少に寄与し得るということが示される。さらに、本発明により、カロチノイドは市販の産物に組み込んだ後吸収できることが示された。上述のように、本発明の第一の態様の成分は、共同作用的に作用する。ビタミンＥは、ベータ−カロチンを酸化から保護することができ、ベータ−カロチンに節約効果を有する。ビタミンＥは、ベータ−カロチンの化学結合を酸化から保護すると考えられる。
【００３５】
カロチノイドの供給源は制限されず、天然および合成の供給源が含まれてもよい。特に、好ましい供給源は天然の供給源であり、以下のものが含まれる；マリゴールド粉餌およびムラサキウマゴヤシ粉餌（ルテインの供給源）；トマト粉餌、赤パーム油、トマト粉末、トマトのしぼりかす／果肉（ベータ−カロチンおよびリコピンの供給源）。供給源には、カロチノイドレベルの高い油およびルテイン、ビオラキサンチン、クリプトキサンチン、ビキシン、ゼアキサンチン、アポ−EE（アポ−8−カロチン酸エチルエステル）、カンタキサンチン、シトラナキサンチン(citranaxanthin)、アキネノン(achinenone)、リコピンおよびカプサンチンのような純粋に製造されたカロチノイドが含まれる。全カロチノイドの好ましいレベルは、0.01mg/400kcalから、または0.2mg/400kcalからまたは1mg/400kcalからあるいは2mg/400kcalからである。
【００３６】
以下のカロチノイドの濃度が好ましい：
ベータ−カロチン：0.01から1.5mg/400kcalまで、好ましくは0.5から1mg/400kcalまで
リコピン：0.01から1.5mg/400kcalまで、好ましくは0.5から1mg/400kcalまで
ルテイン：0.05から1.5mg/400kcalまで、好ましくは0.5から1mg/400kcalまで。
特に、本発明により、本発明の第一の態様においてカロチノイドの組合せが提供される。
【００３７】
組み合わせたカロチノイドの好ましい供給源には；
赤パーム油およびマリゴールド粉餌
トマト粉末、マリゴールド粉餌およびムラサキウマゴヤシ
トマトのしぼりかすおよびマリゴールド粉餌
が含まれる。
【００３８】
上述のように、本発明には、ビタミンＥおよび必要に応じて他の成分が含まれる。成分の有用な組合せには（好ましくは缶詰にされたまたは乾燥したペットフード中の）、
ビタミンＥ、ビタミンC、タウリン、赤パーム油およびマリゴールド粉餌
ビタミンＥ、ビタミンC、タウリン、トマト粉末、マリゴールド粉餌およびムラサキウマゴヤシ
ビタミンＥ、ビタミンC、タウリン、トマト粉末およびマリゴールド粉餌
ビタミンＥ、ビタミンC、タウリン、トマト粉末およびムラサキウマゴヤシ
ビタミンＥ、タウリン、トマトのしぼりかすおよびマリゴールド粉餌
が含まれる。
【００３９】
本発明の組合せは、以下のようである。
【００４０】
【表１】
【００４１】
【表２】
【００４２】
本発明の第一の態様の方法によると、同時に、別々に、または連続して成分を投与、または消費してもよい。
【００４３】
本発明の第２の態様に基づき、動物の抗酸化剤状態を高めるのに十分な濃度の成分をイヌまたはネコに供給する食品を提供する。
【００４４】
本発明の第１の態様の好ましい特徴の全てが第２の態様にも適用される。特に、第１の態様に基づくレベルおよび好ましいレベル（より好ましいおよび最も好ましいレベルを含む）の全てが第２の態様にも適用される。
【００４５】
好ましくは、そのイヌまたはネコ用の食品は、２０mg/lより高いレベルのビタミンＥの抗酸化剤状態を提供する。
【００４６】
本発明の第３の態様は、本発明の第１の態様に基づくレベルの濃度のビタミンＥを提供する。その濃度は、本発明の第１の態様に基づき記載された濃度であり、記載の割合（％）の上昇または特定レベル（好ましいレベルを含む）をもたらす濃度である。
【００４７】
また、第３の態様に基づくイヌまたはネコ用の食品も、本発明の第１の態様のビタミンＣのレベルに基づく濃度のビタミンＣを提供し得る。
【００４８】
第３の態様のイヌまたはネコ用の食品は、ビタミンＣに加えてまたはビタミンＣの代わりに、本発明の第１の態様のタウリンレベルに基づく濃度のタウリンも提供し得る。
【００４９】
第３の態様に基づくイヌまたはネコ用の食品は、ビタミンＣおよび／またはタウリンに加えてまたはそれらの代わりに、本発明の第１の態様のカロチンレベルに基づく濃度のカロチンも提供し得る。
【００５０】
第１および第２の態様の好ましい特徴は、第３の態様にも適用される。
【００５１】
本発明の第４の態様は、イヌまたはネコの低い抗酸化剤状態を防止または治療するのに用いるための、本発明の第３の態様に基づくイヌまたはネコ用の食品を提供する。
【００５２】
第１から第３の態様の好ましい特徴は、第４の態様にも適用される。
【００５３】
本発明の第５の態様は、酸化的ストレスによる要因を有する任意の疾患を予防または治療するのに用いるための、本発明の第２、第３、第４または第９の態様に基づくイヌまたはネコ用の食品を提供する。その使用は、「病気」または「疾患」の要因としての酸化的ストレスを予防または治療するためである（従って、酸化的ストレスによる要因を（少なくともある程度）軽減することによって、病気または疾患が緩和され得る）。そのような疾患として、老化、癌、心疾患、粥状動脈硬化、関節炎、白内障、炎症性腸疾患、腎臓病、腎不全、神経変性疾患、免疫性疾患（例えば免疫低下(compromised immunity)）が挙げられる。また、動物のワクチン接種（毎年であることが多い）ならびに麻酔（一般的な麻酔を必要とし得る歯の治療および紫外線または放射線の照射のような例年の処置にも用い得る）によって生じる酸化的ストレスを予防および治療することを含む。免疫機能に関して、本発明は、年齢のせいで低下した免疫機能を有する動物（例えば成長中の動物または老化した動物）、ならびに免疫的攻撃を経験した動物にも適用可能である。臨床的に健康な動物において健全な免疫反応を維持（ならびに免疫反応を最適化しまたは高める）こともその定義に含まれる。
【００５４】
脊椎動物の免疫系は当業界でかなり検討されている（例えば、Immunology, Roitt, Brostaff and Male, Gower Medical Publishing, London, New York, 1985）。免疫的攻撃として、感染、ワクチン接種、ならびに麻酔（例えば外科手術の前）のような他の外的要因が挙げられる。本発明の１つの目的は、免疫的攻撃に対して改善された免疫反応がもたらされるように、免疫系を維持、最適化または「高める」のに用い得る食餌／食品または栄養補助食品（および関連態様）を提供することである。所定の抗原に対する反応において産生された抗体を測定することによって、免疫反応をモニターすることができる。そのような知識および技術は当業界で一般的である。所定の時間枠の中での循環抗体のレベル（抗体価）が高いこと、検出された抗体反応が速いこと、あるいは循環抗体価が長時間に亘って維持されることによって、改善された免疫反応を説明することができる。
【００５５】
改善された免疫反応は、免疫的攻撃の間に動物を補助し、さらに、動物の子は完全に発達した免疫系を持たないため、特に、動物の子に有用となり得る。動物の子はワクチン接種されることが多いため、本発明は、ワクチン接種された際に動物が改善された免疫反応をもたらすことができるような手段を提供する。本発明は、特に、ジステンパー、パルボウィルスおよび／またはアデノウィルスに対するワクチン抗原でワクチン接種する前にイヌに与えるのに有用である。本発明は、特に、ネコ汎白血球減少ウィルス、ネコカリシウィルスおよび／またはネコヘルペスウィルスに対するワクチンまたは複合ワクチンのためにネコに与えるのに有用である。免疫的攻撃の前に与えるための適切な期間は、その動物および免疫的攻撃に依存する。一貫してその食品を与えて差し支えない。免疫的攻撃前の８、６、４、２および１週間が適切である。それより長い期間であっても適切である。
【００５６】
また、本発明は、酸化的ストレスによる要因または酸化的ストレスによる要因を有する疾患を予防または治療するための方法（イヌまたはネコに適切である）を提供し、その方法はイヌまたはネコに本発明の食品を与えることを含む。その疾患は上記の通りである。また、本発明は、イヌまたはネコにおいて、免疫的攻撃に対する免疫反応を強化する方法に関するものであり、その方法は、本発明の食品を与えることを含む。
【００５７】
第１から第４の態様の好ましい特徴は第５の態様にも適用される。
【００５８】
酸化的ストレスによる要因を有する任意のネコまたはイヌの疾患の予防または治療のための、あるいは酸化的ストレスの予防または治療のための薬剤／臨床的または獣医的な食餌の製造におけるビタミンＥの使用に関する。
【００５９】
第１から第５の態様の好ましい特徴は第６の態様にも適用される。
【００６０】
本発明の第７の態様は、イヌまたはネコにおける、in vivo抗酸化剤として食品に組み込まれた25IU/400kcal以上のレベルのビタミンＥの使用に関する。第１から第６の好ましい特徴の全てが第７の態様にも適用される。特に、ビタミンＥのレベルは本発明の第１の態様のために示されたビタミンＥの好ましいレベルと同様であって差し支えない。
【００６１】
本発明の第８の態様は、本発明の第２から第５の任意の態様の食品を製造する方法を提供し、その方法は、その食品の２つ以上の成分を一緒に混合することを含む。その成分の１つは、要求レベルのビタミンＥである。食品の好ましい形態はペットフード製品であり、従って、任意の形態のペットフード製品を製造する方法は、ペットフード製品の成分を共に混合し、さらに本発明の１つ以上の成分を組み込むことを含む。その食品を製造／加工する間の任意の時に（包装前の最後の工程のような最後の時期を含む）その成分を加えて差し支えない。
【００６２】
Waltham Book of Dog and Cat Nutrition, Ed. ATB Edney, Chapter by A. Rainbird, entitled “A Balanced Diet”, pages 57 to 74, Pergamon Pressに記載のような任意の当業界で公知の方法に基づいてその製品を製造することができる。
【００６３】
本発明の第９の態様は、15mg/400kcal食餌 以上の濃度でビタミンＣを包含するイヌまたはネコ用の食品を提供する。その食餌、食品または栄養補助食品の詳細は、ビタミンＣ成分に関して、15mg/400kcal食餌 以上の濃度のビタミンＣを包含する点で、本発明の前記の態様で記載したものと同様である。本発明の第９の態様のビタミンＣ濃度と別々にあるいは組み合わせて、この中に記載の第１から第８の態様の特徴を選択して差し支えない。本発明の第９の態様は、酸化的ストレスによる要因を有する疾患の予防または治療に有用な食品を提供する。そのような疾患は、本発明の前記態様のために上述されているような疾患である。イヌまたはネコ用の食品にビタミンＣを含めることは、定められたおよび特定のビタミンＣの濃度および所定の用途に関する限り独特である。
【００６４】
ビタミンＣの濃度は15mg/400kcal以上の範囲である。好ましいレベルは本発明の第１の態様のビタミンＣの好ましい濃度である上記の15mg/400kgを越える濃度である。ビタミンＣは、ペット用のネコおよびペット用のイヌの両方においてin vivoで合成されるため、ネコまたはイヌの食物を介してネコまたはイヌに補足レベルのビタミンＣを導入することを考えることは特に興味深いものではない。しかしながら、本発明は、そのような食餌が主に臨床食／獣医食／薬剤の製造のために特に有用と成り得ることを示す。
【００６５】
また、本発明は、イヌまたはネコのための食品におけるビタミンＣの使用に関する。その使用は、酸化的ストレスによる要因を有する疾患の予防または治療のため、あるいは酸化的ストレスによる要因の予防または治療のための食餌の製造における使用であって差し支えない。そのような疾患として、癌、老化、心疾患、粥状動脈硬化、関節炎、白内障、炎症性腸疾患、腎臓病、腎不全、神経変性疾患または例えば感染症に罹った動物のような免疫低下が挙げられる。また、本発明は、健康な動物での免疫的攻撃において処置または補助するために使用され得る。
【００６６】
また、本発明は、イヌまたはネコにおいて、酸化的ストレスによる要因を有する疾患（または酸化的ストレスによる要因）の予防または治療のための方法に関するものであり、本発明の第９の食品をネコまたはイヌに与えることを含む。
【００６７】
実施例において下記の図面を参照する。
【００６８】
ここで、以下の非限定的な実施例を参照して本発明を説明する。当業者は、特にこの中に挙げられている種々の引例の教示（その開示は参照によって組み込まれる）を考慮して、実施例において具体化された本発明に変更を加え得ることを認識するであろう。
【００６９】
実施例
緒言
ここでは、まず、ビタミンＥ、ビタミンＣ、タウリンおよびカロチノイドの特定のために、どのように血液試料を採取し得るかについて記載する。また、血漿中の成分の分析方法および食物中の成分を測定する方法についても記載する。以下に示した詳細に加えて、McDowell L. R. (1989) Vitamin E: In Vitamins in Animal Nutrition Chapter 4, page 96, Academic Press, UKにおいて分析方法に関する詳細を見出すことができる。
【００７０】
血漿および全血中のタウリン
試料の調製：
頭部静脈または頸静脈のいずれかから血液試料をヘパリン処理した容器に採取する。ローラー上において試料を混合後、実験室に移すために試料を氷上に保持する。分析するまで、全血を−２０℃に凍結する。あるいは、血漿測定のために、血液試料を遠心して（３５００ｒｐｍ、０℃で１０分間）血漿を回収する。分析するまで血漿を−２０℃に凍結する。
【００７１】
試料を採って、スルホサリチル酸溶液と反応させてタンパク質を沈殿させることによって、ネコ血漿／血液中のタウリンの分析を実施する。次に試料を遠心し、上澄みを濾過する。
【００７２】
ネコにおいて血漿タウリンを測定している引例として、Earle, K.E. and Smith, P. M. (1991) The effect of dietary taurine content on the plasma taurine concentration of the cat. British Journal of Nutrition 66, 227-235を参照。
【００７３】
血漿ビタミンＣ
試料の調製：
頭部静脈または頸静脈のいずれかから血液試料をヘパリン処理した遮光容器に採取する。ローラー上において試料を混合後、実験室に移すために試料を氷上に保持する。血液試料を遠心して（３５００ｒｐｍ、０℃で１０分間）血漿を回収する。次の日分析するまで血漿を−２０℃に凍結する。全ての時間、抑えた照明下において試料を調製する。
【００７４】
抽出溶媒(5ml)（15g メタリン酸＋0.475g EDTA＋20ml 氷酢酸/500ml水）で血漿(1ml)を抽出する−その方法は生成物のための方法と同じである。
【００７５】
ネコにおいて血漿中の上昇をもたらすのに好ましいビタミンＣの最少用量は20mg/400kcalである。イヌにおいて血漿中の上昇をもたらすために試験された好ましいビタミンＣの最少用量は27mg/400kcalである。
【００７６】
血漿ビタミンＥ
試料の調製：
頭部静脈または頸静脈のいずれかから血液試料をヘパリン処理した容器に採取する。ローラー上において試料を混合後、実験室に移すために試料を氷上に保持する。血液試料を遠心して（３５００ｒｐｍ、０℃で１０分間）血漿を回収する。分析するまで血漿を−２０℃に凍結する。
【００７７】
試料サイズ＝250μl。内部標準として酢酸トコフェロールを添加した後、ヘキサン中に試料を抽出する。ヘキサンを蒸発させ、残渣をメタノール中に溶解させてＨＰＬＣに注入する。逆相カラム（溶出液としてメタノールを用い、285nmでUV検出する）を用いて分離を実施する。
【００７８】
ネコにおいて血漿中の上昇をもたらすのに好ましいビタミンＥの最少用量は34IU/400kcalである。イヌにおいて血漿中の上昇をもたらすために試験された好ましいビタミンＥの最少用量は50IU/400kcalである。
【００７９】
血漿中のカロチノイドの特定
頭部静脈または頸静脈のいずれかから血液試料をヘパリン処理した遮光容器に採取する。ローラー上において試料を混合後、実験室に移すために試料を氷上に保持する。血液試料を遠心して（３５００ｒｐｍ、０℃で１０分間）血漿を回収する。分析するまで血漿を−８０℃に凍結する。全ての時間、抑えた照明下において試料を調製する。
【００８０】
血漿中のカロチノイドを特定するために以下の２つの方法を用いることができる。
【００８１】
方法１
第１の方法は、ルテインおよびゼアキサンチン（本方法では分離されない）を除いて、関心のある主要カロチノイドを測定する。
【００８２】
カロチノイドを検出するために用いられる方法は、Craft, N.E. and Wise, S.A., Journal of Chromatography, 34, 377-381, 1988の方法を改変したものである。
【００８３】
血漿からのカロチノイドの抽出は、Thurnham et al. Clinical Chemistry, 34, 377-381, 1988の方法を改変したものを用いて成される。
【００８４】
方法２
第２の方法は、ルテインおよびゼアキサンチンを分離し、さらにカロチノイドの異なるアイソフォームを分離する。
【００８５】
カロチノイドを検出するために用いられる方法は、Yeum, Kyung-Jin., et. al. Am. J. Clin. Nutr, 64, 594-602, 1996の方法を改変したものである。
【００８６】
血漿からのカロチノイドの抽出は、Thurnham et al. Clinical Chemistry, 34, 377-381, 1988の方法を改変したものを用いて成される。
【００８７】
全ての抽出は抑えた照明下で実施され、さらにカロチノイドのストック溶液をアルゴン下で保存した。
【００８８】
ビタミンＣ−食品
アスコルビン酸は酵素的に酸化されてデヒドロアスコルビン酸になり、デヒドロアスコルビン酸はo-フェニレンジアミンと縮合して蛍光キノキサリン誘導体になる。後者（蛍光キノキサリン誘導体）は、蛍光検出を用いた逆相ＨＰＬＣによって干渉化合物から分離される。
【００８９】
ビタミンＡ ＆ Ｅ食品
水酸化カリウムエタノール溶液(ethanolic potassium hydroxide solution)で試料を加水分解し、石油エーテル中にビタミンを抽出する。エバポレーションで石油エーテルを除去し、残渣をプロパン-2-オール中に溶解させる。逆相液体クロマトグラフィーによって、プロパン-2-オール抽出物中のビタミンＡおよびＥの濃度を特定する。
【００９０】
フリーのタウリン−食品
フリーのタウリンは、食品中において栄養的に利用できるタウリンである。
【００９１】
試料を採り、希釈塩酸を添加することによってフリーのタウリンの分析を実施する。その試料を浸漬し、用量フラスコに移す。少量を採って、スルホサリチル酸を添加してタンパク質を沈殿させる。次にその試料を遠心し、さらに上澄みを濾過する。得られた溶液をダンシル塩化物と反応させ、蛍光検出を用いたＨＰＬＣによって分析する。
【００９２】
カロチノイド−食品
分析のために２０−２５ｇの試料を採る。２８％水酸化カリウムエタノール溶液を用いて、３０分間、試料を鹸化する。窒素下、９０℃で、かつ抗酸化剤としてピロガロールを用いて鹸化する。冷却後、鹸化した抽出物を混合エーテル(エーテル／ジエチルエーテル1：1)(2x250ml)で抽出し、さらに有機相を中性になるまで水で洗浄する。抗酸化剤としてＢＨＴを用い、真空下、３５℃で、エーテル抽出物を蒸発させ、さらに残渣をＨＰＬＣ移動相中に再溶解させる。450nmでのUV検出を用いた逆相ＨＰＬＣによってカロチノイドを特定する。
【００９３】
所定の実験研究に加えて、本発明は、抗酸化剤カクテルをネコに与えた後、ネコの赤血球浸透圧脆弱性が改善されることによって健康の改善の指標となった。
【００９４】
浸透圧ストレスに抵抗する赤血球細胞の能力を試験した。その方法は、異なる濃度のNaClを含有する溶液中に洗浄した赤血球を再懸濁させることを含む；インキュベートし、さらに遠心する。浸透圧脆弱性に基づき、ヘモグロビンが細胞から放出される。結果は、本発明の抗酸化剤を与えられたネコの赤血球が浸透圧ストレスに対してより抵抗性が高く、同じレベルの溶血をもたらすのに有意に低い濃度のNaClが必要であることを示した。浸透圧ストレスの状態を許容する赤血球の能力は、生理的状態が改善されていることの指標である。
【００９５】
実施例１
ビタミンＥ
８匹のイヌから成る群に、２つのレベルのビタミンＥ（以下（表１）に記載のα−酢酸トコフェロール）を与える前の６週間の間、完全栄養食（基準食の欄の例示的食餌を参照）を与え続ける。
【００９６】
【表３】
【００９７】
検討された用量から、ビタミンＥでの食餌の補足は、イヌにおける血漿状態を６０−６６％有意に上昇させる。
【００９８】
実施例２
ネコにおける抗酸化剤の補足
ビタミンＣ
８または９匹のネコから成る４つの群に、完全栄養食（基準食の欄を参照）を与えながら、４つの異なるレベルでビタミンＣの経口用栄養補助食品を与えた。
【００９９】
基線の血漿ビタミンＣレベルは、補足前の群の間で有意な差が無いことを示す。
【０１００】
図２から分かるように、7日以内に、４つの群全ての血漿ビタミンＣレベルが補足前の基線を越えて有意に上昇した。
【０１０１】
より高いレベルでのビタミンＣの補足によってより高い血漿値がもたらされるが、その上昇に関して、４つの群の間で有意差は無かった。
【０１０２】
補足期間の終了後、血漿ビタミンＣレベルは基線に戻った。
【０１０３】
それらデータは、食餌への相対的に低いレベルでのビタミンＣの補足によって、ネコの抗酸化剤状態が上昇し得ることを示す。
【０１０４】
実施例３
ビタミンＥ
ネコのビタミンＥ状態に対する標準的な食餌のビタミンＥレベルの効果、ならびに食餌の補足の効果を評価した。
【０１０５】
異なるビタミンＥレベルを含有する２つの市販されているネコ用の完全栄養食（基準食の欄を参照）を与え続けた１２匹のネコから成る２つの群の血漿ビタミンＥ濃度を特定した。表２に示した血漿レベル（２週間離して二重測定）は、高いレベルのビタミンＥを含有する食餌を４週間与え続けたネコの方が相対的にビタミンＥ状態が上昇することを示した。
【０１０６】
【表４】
【０１０７】
その補足の効果を図３に示す。補足後、血漿ビタミンＥレベルは有意に上昇し、約４から６週間の補足後、飽和に達した。
【０１０８】
従って、食餌のビタミンＥ補足はネコの抗酸化剤状態を上昇させ得る。
【０１０９】
実施例４
ネコにおける全血漿抗酸化剤；正常範囲および年齢の影響
ペット用のネコにおける全抗酸化剤状態は今まで報告されていない。本研究の目的は、ネコにおける全抗酸化剤状態を特定する方法が有効であることを確認し、健康な成ネコ(adult cat)での正常な全抗酸化剤の範囲を特定し、さらに全血漿抗酸化剤状態に対する年齢の影響を調べることである。
【０１１０】
Randox Laboratories Limitedが製造している比色測定キット(NX2332)がネコにおける全抗酸化剤状態を特定するのに有効であった。ネコ血漿試料および市販の品質管理(ＱＣ)物質(PAR 721013およびPAR 721014；Bio-stat Diagnostics)の分析を繰り返すことによって、測定の精度を特定した。測定内の(Intra)および測定間の(Inter)の変動計数（ＣＶ）は、血漿試料を用いた分光光度測定法において許容される変動を示した（ＣＶ＜１０％、ＱＣ ＣＶ＜５％）。ネコ血漿の希釈は、その測定法において線形反応をもたらした。
【０１１１】
血漿抗酸化剤レベルに対する老化の影響を評価した。ある範囲のネコ用の完全栄養食（基準食の欄を参照）を与えられた１３４匹のネコが本研究に参加した。６ヶ月から１４歳の間の年齢の６９匹の雄および６５匹の雌のペット用のショートヘアーのネコ(domestic shorthaired cats)から採取した単一の血漿試料において、全抗酸化剤状態を評価した。全て、平均値±標準偏差(SD)で示した。
【０１１２】
結果は、抗酸化剤状態の過渡期は６歳にあることを示唆する。ニューマン−クールズ多重域テスト(Newman-Keuls multiple range test)は、６歳より若い年齢のネコの全血漿抗酸化剤状態が６．５歳を越える年齢のネコよりも、有意に(p<0.01)高いことを示した（表３を参照）。その年齢での抗酸化剤状態の低下が病気に罹りやすさを示唆するか否か、あるいはその年齢での抗酸化剤状態がネコの寿命に影響するか否かは分かっていない。
【０１１３】
【表５】
イヌにおける全血漿抗酸化剤およびスーパーオキシドジスムターゼの状態
ペット用のイヌにおける抗酸化剤状態についてほとんど知られていない。本研究の目的は、全血漿抗酸化剤(ＴＰＡＯ)および赤血球ＳＯＤ(スーパーオキシドジスムターゼ)活性を測定する方法の有効性を確かめ、さらにそれらの正常範囲を特定することである。
【０１１４】
Randox Laboratories Limitedが製造している比色測定キットがイヌにおけるＴＰＡＯ状態(キット番号：NX2332)およびＳＯＤ状態（キット番号：SD125）を特定するのに有効であった。イヌ血漿試料および市販の品質管理(ＱＣ)物質(PAR 721013およびPAR 721014；Bio-stat Diagnostics)の分析を繰り返すことによって、ＴＰＡＯの測定の精度を特定した。測定内のおよび測定間の変動計数（ＣＶ）は、血漿試料を用いた分光光度測定法において許容される変動を示した（ＣＶ＜１０％、ＱＣ ＣＶ＜５％）。イヌ赤血球試料の分析を繰り返すことによって、ＳＯＤ状態の測定の精度を特定した。測定内のおよび測定間の変動計数（ＣＶ）は、赤血球試料を用いた分光光度測定法において許容される変動を示した（ＣＶ＜１０％）。
【０１１５】
９ヶ月から１６歳の間の年齢の３０匹の雄および２０匹の雌のイヌにおいて、ＴＰＡＯおよび赤血球ＳＯＤ状態を評価した。１０種類の系統が含まれた。全てのイヌが臨床的に正常であり、さらに種々の完全栄養食を長期間与えられた。年齢とＴＰＡＯまたはＳＯＤ活性との間の明らかな関連性は無かった。イヌは年齢群の間で同等では無く（データは示していない）、その所見がより多くの試料およびより適切な年齢の差によって支持されるか否かを評価するため、さらに研究を進めている。平均ＴＰＡＯ状態（雄：0.719±0.135、雌：0.786±0.101）またはＳＯＤ活性（雄：1275.41±264.46、雌：1267.61±166.34U/g Hb）のいずれにおいても、性別による有意差は認められなかった。しかしながら、バートレットテスト(Bartletts Test)によると、雄（6994.0）と雌（27670.3）のイヌにおけるＳＯＤ活性の変動の間に有意差が認められた(p<0.05)。
【０１１６】
５種類以上の代表的系統を含むそれら系統の分析によると、ＳＯＤ活性およびＴＰＡＯ状態について、性別ではなく、系統間において有意差が認められた。ニューマン−クールズ多重域テストによると、ビーグル犬は、ラブラドール犬およびヨークシャーテリア犬よりも、有意に低い平均ＳＯＤ活性(p<0.05)および平均ＴＰＡＯ状態(p<0.01)を有することが示された（表４）。
【０１１７】
【表６】
【０１１８】
実施例６
完全自動化比色測定法によるネコおよびイヌにおける全抗酸化剤状態の評価
本研究の目的は、Randox Laboratories Ltdが製造している比色測定キットがネコおよびイヌにおける全抗酸化剤状態を特定するのに有効であることを確認することである。第２に、ネコおよびイヌの年齢による全抗酸剤状態における変化を評価し、さらにそれら変化を他の生物学的パラメーターおよび血液パラメーターにおける変化と比較するために上記の確認された測定法を用いる。その測定法は、2,2’-アジノ−ジ−（3−エチルベンズチアゾリンスルホンメート）(ABTS)と過酸化物およびH2O2とを反応させて、600nmで測定され得るラジカルカチオンABTS+を産生する。試料中に存在する抗酸化剤は、その濃度に比例する割合で、その着色を抑制するであろう。その測定法は、Randox Laboratoriesによって提供されるプロトコルを用いて、Cobas Mira アナライザー(Roche Diagnostics)において実施された。ネコおよびイヌの血漿試料および市販の品質管理(ＱＣ)物質の分析を繰り返すことによって、測定の精度を特定した。測定内のおよび測定間のＣＶは、ＱＣ物質において共に５％未満であり、ネコおよびイヌの血漿試料において共に１０％未満であった。ネコおよびイヌの血漿の希釈は、その測定法において線形反応をもたらした。種々の年齢のペット用のショートヘアーのネコおよび数種類の系統の血統書付きイヌにおいて、全抗酸化剤状態を含む通常の血漿および生物学的プロフィールを実施した。ネコにおいて、抗酸化剤状態は２ヶ月の年齢に至るまで上昇したが、その後低下を示した。性別による差は観察されなかった。１歳未満の雌イヌは、抗酸化剤状態においてわずかな低下が認められたが、年齢による有意な変化は無かった。多重回帰分析によると、ネコにおける抗酸化剤状態、アルブミン、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼおよびカルシウムの間、ならびにイヌにおける抗酸化剤状態、リン酸塩およびアラニンアミノトランスフェラーゼの間において、関連性が認められた。有効性確認の結果は許容され得るものであると考えられ、さらにその測定法はネコまたはイヌにおける抗酸化剤状態を特定するのに適切である。
【０１１９】
実施例７
健康な成ネコにおける血漿状態に対するビタミンＣ栄養補助食品の効果
ビタミンＣはin vovoにおける主要な水溶性抗酸化剤であり、酸化を遅延させまたは阻害することができ、特に細胞外液中において重要である。しかしながら、ネコ（フェリス・ドメスティックス(Felis domesticus)）における異なる食餌中のビタミンＣレベルに対する反応は今まで評価されていない。本研究の目的は、健康な成ネコにおける、血漿状態に対するビタミンＣ補足の効果を明らかにすることである。
【０１２０】
逆相高性能液体クロマトグラフィーによって、３３匹のネコの血漿ビタミンＣ濃度を特定した。続いて、階層化されたランダムサンプリングによってそれらネコを４つの群に配分し、その４つの群の基線の血漿ビタミンＣレベルの間に有意差が無いことを確認した（ANOVA p>0.05）。２１日間、毎日、ビタミンＣ栄養補助食品(結晶Ｌ−アスコルビン酸,ICN Phrmaceuticals, UK,ゼラチンカプセル中,Analytical Supplies Limited, UK)をネコに経口的に与えた。ネコの４つの群に、3.5、7.0、10.5または21.0mgビタミンＣ／日の何れかの用量を与えた。補足を開始してから７、１４および２１日目、ならびに補足中止後２１日目に血漿ビタミンＣレベルを特定した。全てのネコに、11.6mg/1.6MJのビタミンＣを含有する缶詰の完全栄養食を与えた。
【０１２１】
ネコの血漿ビタミンＣレベルは、与えられた４つ全てのレベルでの毎日の補足の７日後に、有意に上昇し（paired t-test p<0.05）、さらに補足期間の間、そのレベルは維持された（表５）。高いビタミンＣの補足レベルは、低いレベルでの補足と比較して、より高い血漿値をもたらしたが、血漿中の上昇において、各群間での有意差はなかった（General Linear Modelを用いた反復測定多因子(repeated measures multifactor)ＡＮＯＶＡ p<0.05）。全てのネコの血漿レベルは、補足中止後２１日で基線レベルに戻った。
【０１２２】
【表７】
【０１２３】
実施例８
ネコおよびイヌにおける血漿セルロプラスミン濃度の妥当性確認および正常範囲
銅酵素であるセルロプラスミンは、身体において、多くの機能的役割を有する。銅貯蔵タンパク質として、セルロプラスミンは、フリーの銅イオンの触媒能を防ぐのを助ける。フリーの銅はシングル電子（ラジカル）転移による自動酸化を加速し得ると共に、過酸化水素と反応して、細胞破壊を誘導する高反応性の水酸化ラジカルを形成する。また、外傷の際に、セルロプラスミンは、前酸化体である第一鉄の形態から第二鉄への鉄の転換を助長する。急性タンパク質として、セルロプラスミンは、炎症または感染の指標となり得、従って、鉄貯蔵の指標として、血清フェリチンと共に使用され得る。
【０１２４】
ネコおよびイヌにおけるセルロプラスミン酸化酵素活性を特定するための比色法は、基質としてp−フェニレンジアミンを用いるSunderman F. W. and Nomoto, S. (1990) Clin. Chem 16, 903の方法に基づいて有効性が確認された。
【０１２５】
1回の実施において、２つのイヌの血清試料および２つのネコの血清試料を１０回分析した。測定内の変動計数は、イヌの試料において1.94％と2.95％であり、ネコの試料において1.81％と3.94％であった。異なる日に１０回同じ試料を測定したところ、測定間の変動計数は、イヌの試料において8.21％と7.01％であり、ネコの試料において6.88％と9.35％であった。従って、許容レベルの測定内および測定間の変動性が得られた。続いて、血清試料と血漿試料との間のセルロプラスミン濃度の違いを評価した。何れの種においても、血清試料と血漿試料との間で有意差は無かった。従って、必要とする試料の全容量を減らすため、血漿試料を採取した。
【０１２６】
正常値を明らかにするため、１０２匹の健康なイヌ（いろいろな系統、年齢および性を混ぜる）および５４匹の健康なペット用のショートヘアーのネコ（いろいろな年齢および性を混ぜる）から血漿試料を得た。イヌおよびネコの平均血漿セルロプラスミン濃度は、それぞれ、9.28IU/L(SD 3.03IU/L)および10.90IU/L(SD 3.34IU/L)であった。それらの値を用いて、正常範囲（平均値±2SD）が、イヌでは3.22IU/Lから15.35IU/Lであり、ネコでは4.22IU/Lから17.58IU/Lであることを明らかにした。イヌにおけるその正常範囲は、以前報告された値(Solter P. F. et al (1991) Am J Vet Res 52, 1738, 1991)と一致した。ネコにおける正常範囲は今まで明らかにされていないが、イヌの正常範囲に類似していることから、それら２つの種の間で循環セルロプラスミンレベルにおける差はほとんどないことが示唆された。ネコおよびイヌの健康状態を評価するために、本研究において明確にされた正常範囲を用いることができる。
【０１２７】
実施例９
イヌのフェリチン：血清における測定法の有効性確認および正常範囲
フェリチンは、身体において、抗酸化防御システムにおいて重要な役割を果たす。鉄に対する高親和性貯蔵タンパク質として、フェリチンは、鉄を安全な結合形態に維持して、反応性の第一鉄が酸化的損傷を誘導し得るフェントン反応に加わるのを防止する。正常な健康状態において、フェリチンは種特異的タンパク質であり、身体の鉄貯蔵を反映する濃度で血中に認められ、他のパラメーターと共にin vivoでの鉄の状態を評価するのに用いることができる。イヌにおける循環フェリチンレベルを特定するために、モノクロナール抗体を用いるWeeks, B.R. et al (1988) Am J Vet Res 49, 1193 (1988)の方法を応用した酵素結合免疫測定法（ELISA）を開発した。その測定法の有効性確認に続いて、イヌの正常範囲を明らかにした。
【０１２８】
０−４０ng/mlの範囲において、フェリチンの標準曲線は直線であり（最少ニ乗回帰分析、r=0.997）かつイヌ血清に加えられた精製フェリチンの回収率は97.7％であった。２つの血清試料中のフェリチン濃度を１２回測定することによって得られた測定内変動計数は8.2％および6.6％であった。２つの血清試料を異なる日に１０回測定することによって得られた測定間変動計数は16.6％と16.2％であった。
【０１２９】
正常値を定めるためのフェリチン測定用に、雄雌混合のかつ５種類の異なる系統の９６匹の健康なイヌから血清試料を得た。三重または四重のいずれかで、各試料を測定し、それら値の平均値をその試料のフェリチン濃度として用いた。血清フェリチン濃度は、67.20から621.07の範囲で変化し、平均値は371.62ng/ml(SD 102.85ng/ml)であった。そのデータは正常に分布していた。それら結果は、イヌにおいて、血清フェリチンが優れた再現性で特定され得ることを示す。得られた値は、将来の研究における正常範囲として用いられ、さらにイヌにおける鉄貯蔵レベルを特定する有用な方法を提供するであろう。
【０１３０】
実施例１０
食餌のトコフェノールの補足は正常範囲を越えてイヌの血漿値を上昇させる
ビタミンＥは天然の８つの分子、すなわち４つのトコフェロールおよび４つのトコトリエノールの集合名である。種々の形態の生物学的活性は、α＞β＞γ＞δ−トコフェロールの相対的なペロキシル−スキャベンジング反応性(peroxyl scavenging reactivities)の順序による抗酸化活性と大体相関する。通常、必要量を越えた栄養素の供給は、明確な利益を何らもたらさない。成犬におけるビタミンＥの最少必要量は、2.5IUα−トコフェロール／400kcal（食餌）として確立されている(Nutrient Requirements of Dogs (1985) National Research Council(U.S.) National Academy Press Washington DC ISBN: 0-309-03496-5)。調製されたペットフードは、大体、ペットフード中のビタミンＥの正常範囲を越えて、上記最少必要量の10倍までの量を含んでおり、血漿濃度が一定となる傾向がある。血漿反応に対するビタミンＥ補足の効果を評価する研究において、缶詰に入ったイヌの完全栄養食（基準食の欄を参照）を与えられた６匹の成犬（ビタミンＥ含有量は8.2mg/400kcal (8.2IU/400kcal)）に、100IUビタミンＥ／日に等価な栄養補助食品を６週間与えた。６匹のイヌから成る対照群は、同じ条件下で飼育されたが、食餌の補足を受けなかった。補足期間の間および補足期間後の４週間、血漿α−トコフェロールをモニターした。
【０１３１】
血漿α−トコフェロールレベルを表６に示す。処置群と対照群との基線の平均血漿α−トコフェロールレベルは有意差が無かった(p=0.43)。補足開始２週間後、処置群の平均値は対照群(p=0.002)および基線値(p<0.001)と比較して有意に上昇した。５６日目および７０日目（補足中止後１４日目および２８日目）に実施した測定は、基線より有意に高い状態を維持していることを示した。それら結果は、調製されたペットフード中に通常含まれるレベルを超えるレベルのビタミンＥが、イヌにおいて血漿状態を上昇させることができ、さらにその上昇が補足中止後数週間維持され得ることを明らかに示唆する。血漿を飽和させるためには、調製されたペットフードに通常含まれるレベルを越えて与える必要があることが明らかである。ビタミンＥの強い抗酸化能を考慮すると、フリーラジカル損傷および関連する変性疾患を防ぐ機会を最大にするため、イヌにおいてビタミンＥ状態を上昇させることは賢明であろう。
【０１３２】
【表８】
ビタミンＥは同じ生物学的活性を有する８つの異なるトコフェロールおよびトコトリエノールの集合名である。８つの中で、α−トコフェロールが生物学的におよび化学的に最も活性が高い形態のビタミンＥであり、α−トコフェロール1mgは、ビタミンＥの１IUに相当する。ビタミンＥは身体において強力な抗酸化剤であり、主に生体膜に存在し、過酸化物損傷から膜のリン脂質を保護する。また、ビタミンＥはビタミンＡの酸化を阻害し、従って、ビタミンＡ欠乏症を防ぐ。成犬におけるビタミンＥの最少必要量は、2.5IUα−トコフェロール／400kcal食餌 であることが明らかにされている(Nutrient Requirements of Dogs (1985) National Research Council(U.S.) National Academy Press Washington DC ISBN: 0-309-03496-5)。しかしながら、健康な成犬および子犬におけるビタミンＥの正常値に関して情報が不足している。健康な成犬および子犬における一般的な基線の血漿α−トコフェロールレベルを特定するため、ある範囲の缶詰のおよび乾燥した完全栄養調製ペットフード（基準食の欄を参照）を与えられたイヌにおいて、一連の研究を実施した（表７）。体重に応じて食餌を与えた(110kcal/kg0.75)。各血漿α−トコフェロールレベルは、9から39.2mg/lの範囲であり、中間値は21.1mg/lであった。異なる食餌を与えられたイヌのグループの間で、基線のα−トコフェロール値の平均値に有意差は無かった(p=0.24)。それらデータは、子犬および成犬における一般的なα−トコフェロールレベルが類似し、調製されたペットフード中において通常認められるビタミンＥレベル内において、血漿トコフェロールレベルが同様の範囲を示すことを示唆する。
【０１３３】
【表９】
健康な成犬における運動が血漿ＴＢＡＲＳ(酸化的ストレスの指標)を上昇させる
プレカラムを有するＨＰＬＣによって測定された血漿ＴＢＡＲＳ（チオバルビツール酸反応性物質）は、in vivoにおける脂質過剰酸化の十分立証されたマーカーである。本研究の目的は、イヌ(キャニス・ファミリアリス(Canis familiaris)における酸化的ストレスの指標に対する運動の効果を調べることである。
【０１３４】
各種系統および年齢を混ぜた１４匹のイヌから成るパネルに、本実験前3ヶ月および本実験の間、市販されている乾燥完全栄養食を与えた。ＴＢＡＲＳとして形成されたマロンアルデヒド（ＭＤＡ）を特定することによって、急激な２０分間の小放牧場での運動の直前の脂質の過剰酸化の程度を定量化した。その分析は、Bird, P. P.＆Draper, H.H. (1984), Methods in Enzymology 105: 299-305 (1984)によって記載された方法に基づいて測定した。その結果は、運動後、血漿ＴＢＡＲＳにおいて有意な上昇(22%)を示した(運動前0.74μM±0.2、運動後0.92μM±0.2, Paired T Test p<0.05)。運動後における濃縮された血液の容積の直接的結果として生じる上昇を調べるため、ＰＣＶ（赤血球沈層容積）および血漿アルブミンを測定した。結果は運動前と運動後において有意差を示さず(p>0.05)、従って本研究の所見は、in vivoでの増大した脂質の過剰酸化が、運動−誘導の酸化的ストレスの直接的結果として生じることを示唆する。文献は、酸化的損傷の特異的部位が細胞膜であり、強い酸化的ストレスの条件下において過酸化ラジカル(RO2)が増幅することを提案する。その所見は、健康な成犬における、食餌の脂質相抗酸化剤介入(dietary lipid -phase antioxidant intervention)の潜在的役割を推測する。
【０１３５】
動物の抗酸化剤状態および発明的な抗酸化剤カクテルの効果の他の実施例を以下に示す。
【０１３６】
実施例１３
ペット用のネコにおける食餌のカロチノイド吸収
ネコは代謝的に肉食性であるにもかかわらず、市販されているキャットフードに組み込まれているβ−カロチンおよびリコペンのような抗酸化剤は、ネコにおいてカロチノイドの吸収の有意な上昇をもたらすであろう。本研究において、３つの缶詰のネコの食餌は、同じ基本レシピを用いて、同じバッチの生の材料を用いて製造された。対照の食餌（食餌Ａ）はβ−カロチンおよびリコペン（含有量が＞0.1mg/1.67MJ ME）を含み、代謝可能なエネルギー(ME) 3.39MJ/kgを有していた。食餌Ｂは、0.36mg/1.67MJ MEのβ−カロチン含有量および＞0.1MJ MEのリコペン含有量を有するレッドパームオイルを(3.70MJ ME/kg)を補足された。食餌Ｃは、＞0.1MG/1.67MJ MEのβ−カロチン含有量および0.9MG/1.67MJ MEのリコペン含有量を有するトマトの絞りかす(3.54 MJ ME/kg)を補足された。
【０１３７】
５匹の健康なネコから成る２つの群を本研究のため選択した。群１のネコは、平均年齢が8.72歳(SD 2.1歳)であり、かつ３匹の雄と２匹の雌を含んでいた。群２のネコは、平均年齢が7.4歳(SD 1.7歳)であり、かつ２匹の雄と3匹の雌を含んでいた。本研究のネコの全ては、既に種々の市販の完全栄養調製キャットフードを与えられており、その後７日間食餌Ａを与えて、食餌Ａに対するアクラメイション(acclamation)を可能とした。本研究の８日目に、基線の血漿カロチノイドレベルを特定した。続いて、５日間、群１のネコに食餌Ｂを与え、かつ群２のネコに食餌Ｃを与えた。本研究の１３日目に、基線用の試料と同じ方法で、血漿の採取を繰り返した。高性能液体クロマトグラフィーによって分析を実施した。
【０１３８】
食餌Ｂを与えられた群１のβ−カロチン濃度は、基線値(平均値 6.35ng/ml、SD 3.23ng/mL)を越えて、有意に上昇した(平均値 17.62ng.mL、SD 2.50 ng/mL)。その群において、血漿リコペン濃度は、検出限界未満を維持した。食餌Ｃを与えられた群２のネコにおいて、基線レベルの血漿β−カロチン濃度(平均値 5.30ng/mL、SD 5.78ng/mL)と食餌Ｃを与えた後のレベルの血漿β−カロチン濃度(平均値 6.61ng/mL、SD 2.83ng/mL)に有意な変化は無かった。しかしながら、群２のネコは、血漿リコペン濃度において、基線レベル(0ng/mL)から食餌Ｃを与えた後のレベル(平均値14.6ng/mL、SD 7.25ng/mL)へと有意な上昇を示した。
【０１３９】
従って、本研究は、ネコが代謝的に肉食性であるにもかかわらず、市販されているキャットフードに組み込まれたβ−カロチンおよびリコペンのような天然供給源の抗酸化剤が、ネコにおいてカロチノイドの吸収における有意な上昇をもたらすであろうことを示す。循環抗酸化剤における上昇は、ネコの抗酸化剤状態に有益な効果をもたらすであろう。ネコにおけるカロチノイドの吸収の増加は、これまでは、そのような低い食餌濃度では認められなかった。
【０１４０】
実施例１４
母乳は発育中の子猫において最大の抗酸化剤状態をもたらすには不十分であろう
免疫機能に関して、年齢のせいで低い免疫機能を有する動物（例えば成長中の動物）ならびに免疫的攻撃を受けた動物に、抗酸化剤の効果を同様に適用できる。以下の研究の結果は、母乳が発育中の子猫において最大の抗酸化剤状態をもたらすには不十分であろうことを示しており、そのことは、子猫が酸化的ストレスを受け易いことに寄与し得る。従って、子猫のために、栄養補助食品として抗酸化剤カクテルを投与すると、抗酸化剤カクテルを与えられた子犬において認められたように、抗体反応時間における改善を同様に示す。
【０１４１】
酸化的損傷に抵抗する哺乳類の能力は、内因性の抗酸化防御システム、および食餌によって提供される総合的抗酸化剤状態に対する寄与の両方に依存する。動物の抗酸化剤状態を測定する１つの方法は、その全血漿抗酸化能（ＴＰＡＯ）を評価することである。Randox Laboratories Ltdが製造している比色測定キットが、ＴＰＡＯの正常範囲を測定するためにネコにおいて用いるのに有効であることを確認した。血液試料中に存在する抗酸化剤は、その血液濃度に比例して、その測定において着色の抑制を生じさせるであろう。
【０１４２】
健康な子猫におけるＴＰＡＯの正常範囲を特定するため、および年齢とＴＰＡＯとの間に何らかの関連性が有るか否かを特定するため、本研究を実施した。１４、３５および６０日の年齢の１６匹の健康な子猫（８匹の雄、8匹の雌）から血漿試料を得た。上記の方法を用いてその試料を測定し、さらにＡＮＯＶＡを用いてその結果を比較した。結果を以下の表に示す
【表１０】
【０１４３】
実施例１５
抗酸化剤を補強した食餌はネコの抗酸化能を高める
４６匹の健康なペット用ショートヘアーのネコから成る群を年齢および性別に基づいて２つの群に無作為に分配した。群Ａに対照の基本の食餌(基準食の欄に基づく完全湿食)を与え、群Ｂには抗酸化剤カクテルを補足した湿食を３０週間与えた。
【０１４４】
【表１１】
【０１４５】
ＦＲＡＰおよびＦＲＡＳＣの両方に関して、群Ａと比較して群Ｂにおいて抗酸化能が有意に(p<0.05)高かった。
【０１４６】
【表１２】
【０１４７】
実施例１６
ネコの免疫状態に対する抗酸化剤を補足した食餌の効果
実験計画
４８匹の正常で健康なネコに対照の食餌（基準食の欄の完全食）を６週間与え、その後、基線値の測定を実施した。次に、対照群または処置群の何れかにネコを分配し（年齢を合わせる）、実施例１５に記載の補足された食餌を与えた。８週間目に、血清イムノグロブリン濃度を特定するため、動物から試料を採取した。１２週間目に免疫パラメーターを測定し、さらにネコにワクチン接種した（ネコ汎白血球減少ウィルス、ネコカリシウィルスおよびネコヘルペスウィルスに対する標準的複合ワクチンを用いる）。１８週間目に、ワクチン接種後の最後の測定を実施した。
【０１４８】
方法
マイトジェン誘導リンパ球転換測定法（ＭＩＬＴ）による末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)増殖反応の評価
Histopaque1077(Sigma)において、密度勾配遠心によって、ヘパリン処理した血液から末梢血単核細胞を単離した。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で２回、および１０％熱不活化牛胎仔血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、および２％ピルビン酸ナトリウムを補足したRPMI-1640(Dutch修飾)で１回、細胞を洗浄した。トリパンブルー排除試験(Sigma)によって細胞の生存率を評価した。
【０１４９】
９６穴平底マイクロタイタープレート中において、フィトヘムアグルチニン(ＰＨＡ)(5μg/ml)(Murex)、コンカナバリンＡ(Ｃｏｎ Ａ)(7.5μg/ml)およびヤマゴボウマイトジェン(ＰＷＭ)(1μg/ml)(Sigma)と共に、1x105/well（三重）で９６時間細胞を培養した。培養の最後の１８時間、[3H]−チミジン取り込み（カウント／分）(cpm)(0.5μCi/well)によって増殖を測定した。
【０１５０】
フローサイトメトリーによるリンパ球サブセットの分析
ＣＤ４およびＣＤ８陽性細胞がネコの免疫において最も特徴付けられているリンパ球であり、それら細胞の十分な蓄積が健康な免疫系の指標となり得る。精製されたリンパ球および全血の両方、ならびに種々のモノクロナール抗体(Mabs)を用いて測定を実施した。
【０１５１】
結果
マイトジェン誘導リンパ球転換測定法（ＭＩＬＴ）によるＰＢＭＣ増殖反応の評価
表８は、免疫的攻撃前および後のマイトジェンＰＨＡ、Ｃｏｎ ＡおよびＰＷＭに対するＰＢＭＣの反応を示す。マイトジェン誘導リンパ球転換測定法(ＭＩＬＴ)のデータは、対照群または処置群の増殖反応において有意な変化を示さなかった。刺激指標の分析を行うと、ワクチン接種前からワクチン接種後において、ＰＨＡ刺激指標(ＳＩ)(p<0.05)およびＣｏｎ Ａ指標(p<0.001)の両方が、処置群で有意に低下した。ヤマゴボウＳＩは、両方の群において、基線からワクチン接種前において有意に上昇し(p<0.05)、かつワクチン接種後処置群において有意に低下した(p<0.01)。
【０１５２】
【表１３】
表９は、ワクチン接種の前後におけるＴ細胞の相対的なサブセット総数およびＣＤ４+：ＣＤ８+比を示す。ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞サブセットを分析した結果、ワクチン接種後、両方の群において、ＣＤ４陽性細胞の割合（％）が有意に増加し(p<0.05)、さらに対照群(p<0.05)と試験群(p<0.001)の両方の群においてＣＤ８陽性細胞が有意に増加した。
【０１５３】
リンパ球のＣＤ４+：ＣＤ８比を評価した結果、免疫的攻撃後、対照群ではその比が有意に低下したが、処置群では変化しなかった。年齢の関連を評価した結果、ワクチン接種前、対照群において、年齢の上昇に伴いＣＤ４+：ＣＤ８+比が低下する傾向があった(r=-0.483, p<0.05)。
【０１５４】
【表１４】
【０１５５】
表９は、ネコのワクチン接種後のＣＤ４：ＣＤ８比に対する、補足された食餌の有益な効果を明白に示す。補足されたネコにおけるＣＤ４：ＣＤ８比は、対照群と比較して、ワクチン接種後も維持された。その維持は主としてＣＤ４の増加によるものである。
【０１５６】
それら事実は、ネコの免疫反応に対する補足の有益な効果を示す。
【０１５７】
実施例１７
子犬の特異的抗体反応に対する抗酸化剤カクテルの効果
* 一緒に生まれたラブラドールおよびグレイハウンドの子犬を年齢および性を合わせた２つの群に分けた。
【０１５８】
* 各系統の１つの群には、カクテル（以下に詳細を記載）を補足した標準食（基準食の欄の完全食）を与え、各系統の他の群には、補足していない食餌を与えた。
【０１５９】
【表１５】
【０１６０】
*通常のワクチン接種手順に基づいて、全ての子犬にワクチン接種した
（パルボウィルスおよびジステンパーを含むワクチン）
*全ての子犬について、ワクチン抗原に対する抗体レベルを測定した。
【０１６１】
*それら結果のいくつかを表４、５および６に示す。
【０１６２】
*それら結果は、抗酸化剤カクテルの補足を受けた子犬が、特異的抗原に対するより迅速な反応（ワクチンによって誘導されるようなあるいは病原菌への暴露によって誘導され得る）を起こすことを明白に示唆する。
【０１６３】
*それら結果は、抗酸化剤カクテルが動物の子の免疫反応に非常に有益な効果を有することを示す。
【０１６４】
実施例１８
成犬および老犬におけるワクチン反応の維持に対する抗酸化剤カクテルの有益な効果
*２つの群のイヌの年齢、性および系統を合わせた。
【０１６５】
*以前ワクチン接種を受けた時期（本研究開始前）に基づいて、２つの群をさらに合わせた。
【０１６６】
*１つの群には抗酸化剤カクテルを補足された食餌を与え（以下に詳細を示す）、他方の群には補足されていない対照食を与えた。
【０１６７】
【表１６】
【０１６８】
*それら結果は、抗酸化剤カクテルを含有する食餌を与えられた動物が、補足されなかったイヌと比べて長時間ワクチン誘導抗体を維持し得ることを示す。
【０１６９】
実施例１９
抗酸化剤カクテルを含有する缶詰の乾燥食を８週間与えられたイヌにおける抗酸化剤状態および酸化的損傷
概要
*この報告は、抗酸化剤カクテルを含有する缶詰の乾燥食を８週間与えられたイヌから得られた結果（抗酸化剤状態および酸化的損傷）を含む。
【０１７０】
*抗酸化剤を与えられた群における血漿ＦＲＡＰおよびビタミンＥレベルは、対照食を与えられた群よりも有意に高かった。
【０１７１】
*抗酸化剤食を与えられた若い成犬および老犬の両方における血漿ビタミンＥレベルは、それぞれの対照群よりも有意に高かった。
【０１７２】
材料＆方法
動物
１）動物のタイプ
純血種で（ラブラドール、ビーグル、ウェストハイランドホワイトテリア、ニューファンドランド、およびゴールデンレトリバー）、雌雄混合の(無傷の、去勢した／卵巣摘出した)４０匹の若い成犬(0.8歳から3.3歳)および老犬(6.5歳から12.5歳)が本研究に含まれた。
【０１７３】
２）飼育
イヌは、２匹で一組に分けられ、その囲いから外部環境に出入りできた。全てのイヌは、絶えず室内に出入りできた。汚食症による(糞便を食べることによる)交差汚染(cross contamination)を防ぐため、同じ処置群からのイヌを一緒に収納した。自然光サイクルで、温度は２２℃に制御された。イヌは毎日の規則的な運動の日課に従った。
【０１７４】
３）給餌スケジュール
本研究の開始前１週間、全てのイヌに、缶詰の完全栄養乾燥食を与えた。１週間の順応期間の後、２／３のイヌには対照群として基準食を与え続けたが、残りの１／３のイヌは試験食に切換えた。各イヌに与える食餌の量は、ＭＥ方程式(110xBM^0.75kcal)に基づいた。従って、各イヌに与える食餌の量は、体重を維持するように適合させた。全てのイヌは常に新鮮な水を飲むことができた。
【０１７５】
試験物質
試験食は、対照食には添加されていない以下の材料を含有する。
【０１７６】
【表１７】
本研究は長期的な試験計画であった。系統、性、年齢、体重および健康状態に基づいて、全てのイヌを無作為に分配した。
【０１７７】
【表１８】
【０１７８】
【表２０】
処置間におけるp<0.05での統計的有意差をみるため、n数の異なるTukey’s post hoc testによって全ての動物について、全てのパラメーターの解析を行った。群の平均値±SDとしてデータを表す。
【０１７９】
図８：抗酸化剤カクテルを含有する缶詰の乾燥食を８週間与えられたイヌにおける「抗酸化能」を測定するための血漿の第二鉄還元能(ＦＲＡＰ)の測定（対照群ｎ＝２６、試験群ｎ＝１４）。*対照群に対する有意差を示す(p<0.05)。
【０１８０】
*試験群における血漿「抗酸化能」の測定値は、８週間の処置後、対照群よりも有意に高かった。
【０１８１】
図９：抗酸化剤カクテルを含有する缶詰の乾燥食を８週間与えられたイヌにおける血漿ビタミンＥレベルの測定（対照群ｎ＝２６、試験群ｎ＝１４）。*対照群に対する有意差を示す(p<0.05)。
【０１８２】
*試験群における血漿ビタミンＥレベルは、８週間の処置後、対照群よりも有意に高かった。
【０１８３】
基準食の欄
完全栄養食
食品用の完全食、特に完全栄養ペットフード(または食)は、個々の動物の生活様式および生活段階の全ての栄養必要量を満たす食餌である。
【０１８４】
Waltham Book of Dog and Cat Nutrition, Ed. ATB Edney, Chapter by A. Rainsbird, entitled “A Balanced Diet” in pages 57 to 74, Pergoren Press Oxfordに記載のような、当業界で公知の任意の方法に基づいて、食餌または食品を製造することができる。
【０１８５】
以下に、実施例に基づく完全栄養食の組成を示す。
【０１８６】
【表２１】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、50IU/400kcalおよび100IU/400lcalのビタミンＥを補足することによる、イヌにおけるビタミンＥの血漿状態の上昇を示す
【図２】 図２は、食餌のビタミンＣ補足を反映するネコにおけるビタミンＣの血漿状態を示す
【図３】 図３は、食餌のビタミンＥ補足を受けたネコにおけるビタミンＥの血漿状態を示す
【図４】 図４は、補足された食餌または補足されていない食餌を与えた場合における、ワクチン接種後の抗パルボウィルス抗体のレベルを示す
【図５】 図５は、補足された食餌または補足されていない食餌を与えた場合における、ワクチン接種後の抗ジステンパーワクチン反応を示す
【図６】 図６は、補足された食餌または補足されていない食餌を与えた場合における、ワクチン接種後の抗パルボウィルス抗体のレベルを示す
【図７】 図７は、抗酸化剤カクテルを補足されたイヌにおける抗アデノウィルス抗体価の維持を示す
【図８】 図８は、抗酸化食餌を８週間与えられたイヌにおけるＦＲＡＰの測定を示す
【図９】 図９は抗酸化食餌を８週間与えられたイヌにおける血漿ビタミンＥレベルを示す
Claims (9)
- 免疫応答の強化に使用するための、25IU/400kcal以上の濃度のビタミンＥ、10mg/400kcal以上の濃度のビタミンＣ、および80mg/400kcal以上の濃度のタウリンを備えることを特徴とする、イヌまたはネコの食品、食餌またはサプリメント。
- さらに0.01mg/400kcal以上のカロチノイドを提供することを特徴とする請求項１記載の食品、食餌またはサプリメント。
- 前記カロチノイドが、β−カロチン、α−カロチン、リコピン、ルテイン、ゼアキサンチンまたはアスタキサンチンの１つ以上であることを特徴とする請求項２記載の食品、食餌またはサプリメント。
- 癌、老化、心疾患、粥状動脈硬化、関節炎、白内障、炎症性腸疾患、腎臓病、腎不全、神経変性疾患、または免疫低下である酸化的ストレスによる要因を有する疾患の予防または治療において使用するための、請求項１から３いずれか１項記載の食品、食餌またはサプリメント。
- ネコまたはイヌの免疫応答を強化するためのイヌまたはネコの食品、食餌またはサプリメントの製造におけるビタミンＥ、ビタミンＣおよびタウリンの使用であって、ビタミンＥが25IU/400kcal以上の濃度で存在し、ビタミンＣが10mg/400kcal以上の濃度で存在し、タウリンが80mg/400kcal以上の濃度で存在することを特徴とする使用。
- 前記食品、食餌またはサプリメントがさらにカロチノイドを含むことを特徴とする請求項５記載の使用。
- 前記カロチノイドが、β−カロチン、リコピン、ルテイン、ゼアキサンチンまたはアスタキサンチンの１つ以上であることを特徴とする請求項６記載の使用。
- 免疫的攻撃またはワクチン接種に対する反応におけるネコまたはイヌの処置または補助のための請求項５から７いずれか１項記載の使用。
- 請求項１から４いずれか１項記載の食品、食餌またはサプリメントを製造する方法であって、前記食品の少なくとも２つの成分を一緒に混合する工程を含むことを特徴とする方法。
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