JP4952669B2 - Ｇｅナノ粒子、及び生体物質標識剤 - Google Patents

Description

本発明は、赤外発光性のＧｅナノ粒子、及び該Ｇｅナノ粒子を用いた生体物質標識剤に関する。

生体物質を標識する手段として、分子標識物質をマーカー物質に結合した生体物質標識剤を用いる方法が検討されている。標識剤に蛍光材料が用いられる場合には、励起光として用いられる波長の短い紫外域の光が細胞にダメージを与えることが問題となっており、ダメージの少ない長波長励起、発光の蛍光体が求められている。

一方、特に近年、小動物を対象としたｉｎ ｖｉｖｏ光イメージングが注目されており、小動物の生体内の細胞を外部より、生体を傷つけることなく（非侵襲で）観察するような光学系装置が各メーカから販売され始めている。これは、生体内の観察したい部位に選択的に集まるような標識をつけた蛍光材料を生体内に注入し、外部より励起光を照射し出てきた発光を外部でモニターする方法である。

このように生体内の蛍光材料を励起し、発光を外部に取り出すためには励起光、発光が生体を透過する必要がある。紫外光、可視光は生体の吸収が高く、ほとんど透過することが出来ないので好ましくない。また、１０００ｎｍ以上の波長では水の吸収が立ち上がり、透過率が低くなり、好ましくない。

しかしながら、近赤外線の７００〜１０００ｎｍは「生体の窓」、「分光領域の窓」と呼ばれる生体の透過率が特異的に高い領域であり、この範囲内で励起、発光を示す蛍光材料が求められている。

上記方法で従来使用されてきた有機蛍光色素などのマーカー物質は、励起光照射時の劣化が激しく寿命が短いことが欠点であり、また発光効率が低く、感度も十分ではなかった。

そのため、近年、上記マーカー物質として半導体ナノ粒子を用いる方法が注目されている。例えば、極性官能基を有する高分子を半導体ナノ粒子の表面に物理的及び／または化学的に接合した生体物質標識剤が検討されている（例えば、特許文献１参照）。また、有機分子をＳｉ／ＳｉＯ_２型半導体ナノ粒子の表面に結合した生体物質標識剤が検討されている（例えば、特許文献２参照）。更に、高速スパッタリング法を用いた作製されたナノシリコンが知られている（例えば、特許文献３〜７参照）。
特開２００３−３２９６８６号公報 特開２００５−１７２４２９号公報 特開２００４−２９６７８１号公報 特開２００５−２６８３３７号公報 特開２００６−７００８９号公報 特開２００７−６３３７８号公報 特開２００７−６７１０４号公報

本発明の目的は、発光効率に優れるＧｅナノ粒子、更にはそれを用いた生体物質標識剤を提供することである。

本発明の上記目的は、下記構成により達成される。

１．高速スパッタリング法により形成されたＧｅナノ粒子であって、粒子サイズが５〜５０ｎｍであり、且つ７００〜１７００ｎｍの赤外光を発光することを特徴とするＧｅナノ粒子。

２．前記Ｇｅナノ粒子が７００〜１５００ｎｍの赤外光により励起発光することを特徴とする前記１に記載のＧｅナノ粒子。

３．前記Ｇｅナノ粒子がＧｅ：ＧｅＯ_２膜中に含有されていることを特徴とする前記１または２に記載のＧｅナノ粒子。

４．前記Ｇｅナノ粒子を含有するＧｅ：ＧｅＯ_２膜をアルカリ液中に浸漬することでＧｅナノ粒子を溶液中に取り出すことを特徴とする前記３に記載のＧｅナノ粒子。

５．前記Ｇｅナノ粒子の表面が親水化処理されていることを特徴とする前記１〜３のいずれか１項に記載のＧｅナノ粒子。

６．前記１〜５のいずれか１項に記載のＧｅナノ粒子と分子標識物質とを有機分子を介して結合させることを特徴とする生体物質標識剤。

７．前記分子標識物質がヌクレオチド鎖であることを特徴とする前記６に記載の生体物質標識剤。

８．前記有機分子がビオチン及びアビジンであることを特徴とする前記６または７に記載の生体物質標識剤。

本発明により、発光効率に優れるＧｅナノ粒子、更にはそれを用いた生体物質標識剤を提供することができた。

以下、本発明について詳述する。

本発明は、高速スパッタリング法により形成されたＧｅナノ粒子であって、粒子サイズが５〜５０ｎｍであり、且つ７００〜１７００ｎｍの赤外光を発光する（７００〜１５００ｎｍの赤外光により励起発光）ことを特徴とする。

本発明のＧｅナノ粒子は化学的安定性に優れ、発光量子効率が高く、光照射を続けた場合の発光強度の低下が小さい。高速スパッタリング法では、高温での熱処理工程を経るために結晶性のよい粒子が得ることができることが、発光量子効率が高くなる理由であると考えられる。

〔高速スパッタリング法によるＧｅナノ粒子の作製〕
本発明において、高速スパッタリング法を用いるＧｅナノ粒子の作製は以下の通りである。

高速スパッタリング法の後、熱処理（アニール）を行うことによって、ＧｅＯ_２膜中にＧｅナノ粒子が得られる。次に、得られたＧｅＯ_２膜中Ｇｅナノ粒子をアルカリ処理することによって、Ｇｅナノ粒子単独のものが得られる。この際、ＧｅＯ_２はアルカリに溶解する。更にＧｅナノ粒子の粒径をより厳密に制御する場合には、サイズ排除クロマトグラフィーを用いる。

高速スパッタリング法では、ターゲット材料に酸化ゲルマニウムとゲルマニウム（Ｇｅ）の混合材料を用い、酸化ゲルマニウムＧｅＯ_ｘ（０＜ｘ＜２）を基板上に堆積させる。このとき、酸化ゲルマニウムとゲルマニウムの比率を変えることで、出来上がりのＧｅナノ粒子のサイズをコントロールすることができる。

次に、上記酸化ゲルマニウム膜を不活性ガス（アルゴン等）の雰囲気中で熱処理して、該膜内に所定粒子サイズのＧｅナノ粒子を多数形成する。

上記熱処理の際、熱処理温度は９００〜１２００℃とするが、好ましくは１０００〜１１００℃である。また、熱処理時間は１５〜１００分であるが、好ましくは３０〜８０分、更に好ましくは５０〜６０分である。熱処理温度、熱処理時間により、Ｇｅナノ粒子のサイズをコントロールすることが可能である。

〔Ｇｅナノ粒子の親水化処理〕
上述した赤外発光性のＧｅナノ粒子は集積体として得られるが、集合体表面は一般的には疎水性であるため、例えば、生体物質標識剤として使用する場合は、このままでは水分散性が悪く、粒子が凝集してしまう等の問題があるため当該Ｇｅナノ粒子の表面を親水化処理することが好ましい。親水化処理の方法としては、例えば、表面の親油性基をピリジン等で除去した後に、粒子表面に表面修飾剤を化学的及び／または物理的に結合させる方法がある。

表面修飾剤としては、親水基としてカルボキシル基、アミノ基を持つものが好ましく用いられ、具体的にはメルカプトプロピオン酸、メルカプトウンデカン酸、アミノプロパンチオールなどが挙げられる。具体的には、Ｇｅナノ粒子１０^−５ｇをメルカプトウンデカン酸０．２ｇが溶解した純水１０ｍｌ中に分散させて、４０℃、１０分間攪拌することでＧｅナノ粒子の表面をカルボキシル基で修飾することができる。

〔生体物質標識剤〕
本発明に係る生体物質標識剤は、上述した親水化処理された近赤外発光蛍光体ナノ粒子と分子標識物質と有機分子とを介して結合させて得られる。

〈分子標識物質〉
本発明に係る生体物質標識剤は、分子標識物質が目的とする生体物質と特異的に結合及び／または反応することにより、生体物質の標識が可能となる。該分子標識物質としては、例えば、ヌクレオチド鎖、抗体、抗原及びシクロデキストリン等が挙げられる。

〈有機分子〉
本発明の生体物質標識剤は、親水化処理された赤外発光性のＧｅナノ粒子と分子標識物質とが有機分子により結合されている。該有機分子としては、Ｇｅナノ粒子と分子標識物質とを結合できる有機分子であれば特に制限はないが、例えば、タンパク質中でもアルブミン、ミオグロビン及びカゼイン等、またタンパク質の１種であるアビジンをビオチンと共に用いることも好適に用いられる。

上記結合の態様としては特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着及び化学吸着等が挙げられる。結合の安定性から共有結合などの結合力の強い結合が好ましい。

具体的には、Ｇｅナノ粒子をメルカプトウンデカン酸で親水化処理した場合は、有機分子としてアビジン及びビオチンを用いることができる。この場合、親水化処理された当該Ｇｅナノ粒子のカルボキシル基はアビジンと好適に共有結合し、アビジンが更にビオチンと選択的に結合し、ビオチンが更に生体物質標識剤と結合することにより生体物質標識剤となる。

以下、本発明を実施例で説明するが、これらに限定されるものではない。

実施例１
〔Ｇｅナノ粒子１〜６の作製〕
（高速スパッタリング）
真空チャンバー内にアルゴンガスを導入し、高周波コントローラによりイオン化されたアルゴンイオンを酸化ゲルマニウム板にＧｅ薄片を貼り付けたターゲット材料に衝突させ、これから放出された原子及び分子を半導体基板上に体積し、アモルファスＧｅを含む酸化ゲルマニウム膜を形成する。Ｇｅ／ＧｅＯ_２の比率は表１に示す通りである。

（アニール処理）
得られた酸化ゲルマニウム膜を、アルゴン雰囲気中において表１に示す温度まで急速に昇温し熱処理を行い、膜中のゲルマニウム原子をナノサイズまで凝集させる。熱処理時間も表１に示す。

（溶解処理）
得られたＧｅナノ粒子含有酸化ゲルマニウム膜を６Ｍ−ＮａＯＨ溶液に浸漬し、Ｇｅナノ粒子分散液を得ることができる。

（分離処理）
サイズ排除クロマトグラフィーにより、溶解処理液中からＧｅナノ粒子を分離し、水溶液中に回収する。

以上の方法により作製されたＧｅナノ粒子水溶液を、堀場社製蛍光光度計ＳＰＥＸ Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ−３を用いて発光スペクトルの測定を行った。励起光波長は７５０ｎｍとした。粒径測定は高分解能ＴＥＭを用いて行った。５０個の粒子の粒径を測定し、その平均値を平均粒径とした。

〔Ｇｅナノ粒子７の作製〕
トルエン１００ｍｌに界面活性剤ＴＯＡＢ１．０ｇを溶解した溶液中に、溶液温度６０℃でＧｅＣｌ_４を１００μｌ滴下した。溶液を温度６０℃で２時間攪拌し、逆ミセルを形成した後、温度６０℃で還元剤として１ＭのＬｉＡｌＨ_４のトルエン溶液を１ｍｌ滴下し、０．５時間攪拌してＧｅナノ粒子を形成した。

得られた反応混合物からロータリーエバポレーションで全ての溶剤を取り除き、Ｇｅナノ粒子を含む固形分を得た。その後、Ｇｅナノ粒子を含む固形分をヘキサン２５ｍｌ中に再分散し、この液と純水１００ｍｌとを混合して洗浄した。このような洗浄をすることで生成したＧｅナノ粒子はヘキサン相に存在したままで、未反応物や副生成物等は水相に移行する。その後静置して、水相をヘキサン相から除去することで精製したＧｅナノ粒子のヘキサン分散液を得た。更に得られたＧｅナノ粒子のヘキサン分散液をロータリーエバポレーションで蒸発させてＧｅナノ粒子の粉体を得た。これをＧｅナノ粒子７とする。

Ｇｅナノ粒子１及びＧｅナノ粒子７について、発光量子効率を測定した。発光量子効率は標準試料としてローダミン１０１、１０^−５ｍｏｌ／Ｌエタノール溶液を用い、標準試料の収率を１００％として測定を行った。

表２より、高速スパッタリング法で作製された本発明のＧｅナノ粒子１は、逆ミセル法で作製された比較のＧｅナノ粒子７より発光量子効率において優れていることが分かる。

実施例２
Ｇｅナノ粒子１、１．０×１０^−５ｍｏｌ／Ｌの水分散液にアビジン２５ｍｇを添加し、４０℃で１０分間攪拌を行い、アビジンコンジュゲートナノ粒子を作製した。

得られたアビジンコンジュゲートナノ粒子溶液に、ビオチン化された塩基配列が既知であるオリゴヌクレオチドを混合攪拌し、ナノ粒子でラベリングされたオリゴヌクレオチドを作製した。

様々な塩基配列を持つオリゴヌクレオチドを固定化したＤＮＡチップ上に、上記のラベリングしたオリゴヌクレオチドを滴下、洗浄したところ、ラベリングされたオリゴヌクレオチドと相補的な塩基配列をもつオリゴヌクレオチドのスポットのみが赤外線照射により赤外発光した。

このことより、Ｇｅナノ粒子でのオリゴヌクレオチドのラベリングを確認することができた。

Claims (8)

1. 高速スパッタリング法により形成されたＧｅナノ粒子であって、粒子サイズが５〜５０ｎｍであり、且つ７００〜１７００ｎｍの赤外光を発光することを特徴とするＧｅナノ粒子。
2. 前記Ｇｅナノ粒子が７００〜１５００ｎｍの赤外光により励起発光することを特徴とする請求項１に記載のＧｅナノ粒子。
3. 前記Ｇｅナノ粒子がＧｅ：ＧｅＯ_２膜中に含有されていることを特徴とする請求項１または２に記載のＧｅナノ粒子。
4. 前記Ｇｅナノ粒子を含有するＧｅ：ＧｅＯ_２膜をアルカリ液中に浸漬することでＧｅナノ粒子を溶液中に取り出すことを特徴とする請求項３に記載のＧｅナノ粒子。
5. 前記Ｇｅナノ粒子の表面が親水化処理されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のＧｅナノ粒子。
6. 請求項１〜５のいずれか１項に記載のＧｅナノ粒子と分子標識物質とを有機分子を介して結合させることを特徴とする生体物質標識剤。
7. 前記分子標識物質がヌクレオチド鎖であることを特徴とする請求項６に記載の生体物質標識剤。
8. 前記有機分子がビオチン及びアビジンであることを特徴とする請求項６または７に記載の生体物質標識剤。