JP4933730B2 - 転写因子調節化合物およびその使用法 - Google Patents

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Description

関連出願
本出願は2001年5月4日出願の「Helix-Turn-Helix Protein Modulating Compounds and Methods of Use Thereof」なる表題の米国仮出願第60/288,660号に対する優先権を主張し、その全内容は参照として本明細書に組み込まれる。
発明の背景
細菌の多剤耐性は一般に、異なる耐性メカニズムに対する遺伝的決定因子を有する複数のトランスポゾンおよびプラスミドの獲得によるとされている（Goldら、1996. N. Eng. J. Med. 335:1445）。しかし、多剤耐性を与える固有のメカニズムの記載が現れ始めている。そのうちの最初のものは、大腸菌（E. coli）における染色体上でコードされた多抗生物質耐性（mar）遺伝子座であった（GeorgeおよびLevy、1983. J. Bacteriol. 155:531；GeorgeおよびLevy、1983. J. Bacteriol. 155:541）。大腸菌のMar突然変異体は10-6から10-7の頻度で発生し、テトラサイクリンまたはクロラムフェニコールの阻害レベル以下での増殖により選択された（GeorgeおよびLevy、上記）。これらの突然変異体はテトラサイクリン、クロラムフェニコール、ペニシリン、セファロスポリン、ピューロマイシン、ナリジクス酸、およびリファンピンに対する耐性を示した（GeorgeおよびLevy、上記）。その後、耐性表現型は拡大されてフルオロキノロン（Cohenら、1989. Antimicrob. Agents Chemother. 33:1318）、酸化的ストレス剤（Arizaら、1994. J. Bacteriol. 176:143；Greenbergら、1991. J. Bacteriol. 73:4433）、ならびに最近になって有機溶媒（Whiteら、1997. J. of Bacteriology 179:6122；Asakoら、1997. J. Bacteriol. 176:143）および家庭用消毒薬、例えばパイン油および／または登録商標TRICLOSAN（McMurryら、1998. FEMS Microbiology Letters 166:305；Mokenら、1997. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 41:2770）を含むようになった。
mar遺伝子座は、大腸菌、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、および他の腸内細菌（Enterobacteriacae）における一般的プロモーター/オペレーター領域に隣接する二つの互いに異なる位置にある転写ユニットからなる（AlekshunおよびLevy、1997, Antimicrobial Agents and Chemother. 41: 2067）。一つのオペロンは、明白な機能はまだ持たない内在性膜タンパク質と推定されるが、いくつかの菌株のMar表現型に寄与していると考えられるMarCをコードする。もう一つのオペロンは、marOに結合し、marRABの発現を負に調節するMarリプレッサー（MarR）をコードするmarRAB（Cohenら、1994. J. Bacteriol. 175:1484；MartinおよびRosner 1995. PNAS 92:5456；SeoaneおよびLevy. 1995 J. Bacteriol. 177:530）、染色体上の他の遺伝子、例えばmarレギュロンの発現を制御するアクチベーター（MarA）（Cohenら、1994 J. Bacteriol. 175:1484；Gambinoら、1993. J. Bacteriol. 175:2888；SeoaneおよびLevy、1995 J. Bacteriol. 177:530）、および機能が不明の推定小タンパク質（MarB）を含む。
大腸菌をテトラサイクリンおよびクラムフェニコール（Hachlerら、1991 J Bacteriol 173(17):5532-8；Ariza、1994, J Bacteriol; 176(1):143-8）、サリチル酸ナトリウムおよびその誘導体（Cohen、1993, J Bacteriol; 175(24):7856-62）ならびに酸化的ストレス剤（Seoaneら、1995. J Bacteriol; 177(12):3414-9）を含むいくつかの化学物質に曝露するとMar表現型が誘導される。これらの化学物質の中には、リプレッサーと相互作用してその機能を不活化することによりMarRのレベルで直接作用するものもあれば（Alekshun. 1999. J. Bacteriol. 181:3303-3306）、別のメカニズム、例えば、シグナルトランスダクション経路を通じてmar発現を誘導すると考えられるもの（テトラサイクリンおよびクロラムフェニコールなどの抗生物質）もある（Alekshun. 1999. J. Bacteriol. 181:3303-3306）。
いったん発現されれば、MarAは大腸菌marレギュロンを構成するいくつかの遺伝子の転写を活性化する（Alekshun、1997, Antimicrob. Agents Chemother. 41:2067-2075；Alekshun、1999. J. Bacteriol. 181:3303-3306）。抗生物質感受性の低下に関して、AcrAB/TolC多剤排出系の発現増大（Fralick、1996, J Bacteriol. 178(19):5803-5；Okusu、1996 J Bacteriol;178(1):306-8）および外膜タンパク質であるOmpFの合成減少（Cohen、1988, J Bacteriol.; 170(12):5416-22）が主要な役割を果たす。しかし、有機溶媒耐性はMarAが仲介するAcrAB、TolC、OmpX、および77kDaのタンパク質の発現増大によるとされている（Aono、1998, Extremophiles; 2(3):239-48；Aono、1998 J Bacteriol; 180(4):938-44）が、OmpFレベルとは無関係である（Asako、1999, Appl Environ Microbiol; 65(1):294-6）。
MarAは転写アクチベーターのXylS/AraCファミリーのメンバーである（Gallegosら、1993. Nucleic Acids Res. 21:807）。XylS/AraCファミリーには100を越えるタンパク質があり、このタンパク質群の限定的特徴は二つのヘリックス・ターン・ヘリックス（HTH）DNA結合モチーフがあることである。このファミリー内のタンパク質は多くの異なる遺伝子を活性化し、そのうちのいくつかは抗生物質および酸化的ストレス剤耐性を生じるか、または微生物の代謝および毒性を制御する（Gallegosら、上記）。
発明の概要
本発明は、ヘリックス・ターン・ヘリックスタンパク質調節化合物などであるが、これらに限定されることはない、転写因子調節化合物を同定すること、ならびにMarAファミリーポリペプチドおよびAraCファミリーポリペプチドなどの微生物転写因子を調節する化合物を同定するために用いることができる新規アッセイを提供することによる、先行技術を越える進歩を表す。ヘリックス・ターン・ヘリックスドメイン含有タンパク質などの転写因子調節による遺伝子転写の調節は、様々な細胞プロセスを制御することができる。例えば、原核細胞において代謝、耐性、および毒性などのプロセスを制御することができる。
細菌転写因子を調節することが可能な化合物を同定するためのアッセイは、原核細胞および真核細胞の両方で遺伝子転写を制御するために用いることができるアゴニストおよびアンタゴニストの同定において非常に有益であると考えられる。
一つの態様において、本発明は細胞、例えば真核または原核細胞の抗生物質耐性を低下させる方法に関する。好ましい態様において、細胞は微生物細胞である。一つの態様において、本発明は、細胞を微生物細胞の抗生物質耐性が低下するように転写因子調節化合物と接触させることにより、細胞の抗生物質耐性を低下させる方法に関する。一つの態様において、転写因子調節化合物は式（I）の化合物：
A-E （I）
（式中、Aは極性部分であり；Eは疎水性部分である）、およびその薬学的に許容される塩である。
もう一つの態様において、本発明は転写を調節する方法に関する。この方法は、転写因子を転写因子が調節されるように転写因子調節化合物と接触させる段階を含む。転写因子調節化合物は式（I）の化合物：
A-E （I）
（式中、Aは極性部分であり；かつEは疎水性部分である）、およびその薬学的に許容される塩である。
もう一つの態様において、本発明は転写因子調節化合物の同定法も含む。この方法は、微生物細胞を試験化合物と、化合物と微生物細胞との相互作用を可能にする条件下で接触させる段階と、試験化合物が細胞に影響を与える能力を測定する段階とを含む。微生物細胞は、転写因子応答配列の直接制御下の選択マーカーと転写因子とを含む。
さらにもう一つの態様において、本発明は転写因子調節化合物の同定法も含む。この方法は、1）転写因子応答配列制御下の選択マーカーと、2）転写因子とを含む微生物細胞を試験化合物と、化合物と微生物細胞との相互作用を可能にする条件下で接触させる段階と、試験化合物が細胞の増殖（例えば、インビトロまたはインビボで）または生存に影響を与える能力を測定する段階とを含み、ただし転写因子の不活化はインビトロまたはインビボでの細胞生存の低下につながる。本発明は、転写因子の不活化が細胞生存の増大につながる類似の方法、ならびに転写因子の活性化が細胞生存の増大または低下につながる方法にも関する。
もう一つの態様において、1）guaBまたはpurA遺伝子における染色体欠失と、2）その転写因子応答プロモーター制御下の異種guaBまたはpurA遺伝子と、3）転写因子とを含む微生物細胞を試験化合物と、化合物と微生物細胞との相互作用を可能にする条件下で接触させることによる、転写因子調節化合物の同定法にも関する。この方法は、化合物が転写因子の活性を調節するかどうかの指標として、化合物がレポーターの遺伝子発現または微生物細胞の増殖もしくは生存に影響を与える能力を測定する段階をさらに含む。化合物が転写因子の活性を調節する能力は、遺伝子発現における変化につながり、細胞の増殖または生存に影響を与えることもある。
本発明は、本発明の方法によって同定された転写因子調節化合物、HTHタンパク質調節化合物、およびMarAファミリー調節化合物、これらの化合物の使用法、ならびにこれらの化合物を含む薬学的組成物に関する。本発明の転写因子調節化合物には、式（I）〜（X）ならびに表4および5の化合物が含まれるが、これらに限定されることはない。
本発明は、転写因子調節化合物を同定するためのコンピューターモデリングプログラムの使用法にも関する。例えば、本発明は転写因子調節化合物の同定法に関する。この方法は、転写因子調節化合物の構造を得る段階と、転写因子の一部との相互作用エネルギースコアが-20以下である骨格を使用または同定し、したがって転写因子調節骨格の可能性があるものを同定する段階とを含む。
本発明は、少なくとも部分的には、微生物細胞を構成する転写因子ポリペプチドの活性を調節する転写因子調節化合物を同定するためのキットにも関する。このキットは1）転写因子応答配列制御下の選択マーカーと、2）転写因子とを含む。
本発明は、少なくとも部分的には、転写因子調節化合物の有効量と、選択的に、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物にも関する。
本発明は、バイオフィルムを阻害法であって、バイオフィルムが阻害されるように転写因子調節化合物を含む組成物を投与する段階を含む方法にも関する。
さらなる態様において、本発明は転写因子調節化合物の有効量と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物に関する。転写因子調節化合物は式（II）の化合物：
Figure 0004933730
 （式中
WはOまたはSであり；
Xは選択的にQに連結されたO、S、またはCであり；
A1はC-Z4、O、またはSであり：
A2はC-Z5、またはN-Z5であり：
Z1、Z2、Z3、Z4、およびZ5はそれぞれ独立に水素、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、複素環、アミノ、またはシアノであり；
Z3は水素、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、複素環、アミノ、ニトロ、シアノ、カルボニル、またはチオカルボニルであり；
Qは芳香族または複素環部分である）、およびその薬学的に許容される塩である。
もう一つのさらなる態様において、本発明は転写因子調節化合物の有効量と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物に関する。化合物は式（III）の化合物：
Figure 0004933730
 （式中
Gは置換または無置換芳香族部分、複素環、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボニル、または水素であり；かつ
L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、およびL10はそれぞれ独立に酸素、置換もしくは無置換窒素、硫黄およびまたは置換もしくは無置換炭素である）、およびその薬学的に許容される塩である。
さらにもう一つの態様において、本発明は転写因子調節化合物の有効量と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物に関する。転写因子調節化合物は式（IV）の化合物：
Figure 0004933730
 （式中
Y1およびY2はそれぞれ酸素または硫黄であり；
Jは水素、置換または無置換アルキル、アルケニル、アルキニル、シアノ、ニトロ、アミノ、またはハロゲンであり；
Vは置換または無置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルアミノ、またはアルキルチオであり；
PおよびKはそれぞれ独立に置換または無置換アリールである）、およびその薬学的に許容される塩である。
もう一つの態様において、本発明は薬学的に許容される担体と転写因子調節化合物とを含む薬学的組成物に関する。転写因子調節化合物は式（V）の化合物：
Figure 0004933730
 （式中
T1、T2、T3、T4、T5、およびT6はそれぞれ独立に置換もしくは無置換炭素、酸素、置換もしくは無置換窒素、または硫黄であり；
Mは水素、アルキル、アルケニル、複素環、アルキニル、またはアリールである）、またはその薬学的に許容される塩である。
もう一つの態様において、本発明は薬学的に許容される担体と転写因子調節化合物とを含む薬学的組成物に関する。転写因子調節化合物は式（VI）の化合物：
Figure 0004933730
 （式中
G1、G2、およびG3はそれぞれ独立にO、S、置換もしくは無置換窒素、または置換もしくは無置換炭素であり；
E1、E2、およびE3はそれぞれ独立に水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、またはアシルであり；かつ
E4はアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ハロゲン、シアノ、アミノ、ニトロ、またはアシルである）、およびその薬学的に許容される塩である。
発明の詳細な説明
本発明は、少なくとも部分的には、転写因子（例えば、ヘリックス・ターン・ヘリックス（HTH）タンパク質、AraCファミリーポリペプチド、MarAファミリーポリペプチドなど）を調節する化合物、転写因子調節化合物（例えば、HTHタンパク質調節化合物、AraCファミリーポリペプチド調節化合物、MarAファミリーポリペプチド調節化合物など）の同定法、ならびに化合物の使用法に関する。
1. 転写因子
「転写因子」なる用語は、原核生物および真核生物両方における遺伝子調節に関与するタンパク質を含む。一つの態様において、転写因子は遺伝子発現に対して正の影響を有することがあり、したがって、「アクチベーター」または「転写活性化因子」と呼ぶこともある。もう一つの態様において、転写因子は負の遺伝子発現を行うこともあり、したがって、「リプレッサー」または「転写抑制因子」と呼ぶこともある。アクチベーターおよびリプレッサーは一般に用いられる用語で、それらの機能は当業者によって認識される。
「AraCファミリーポリペプチド」、「AraVC-XylSファミリーポリペプチド」または「AraC-XylSファミリーペプチド」なる用語は、100を越える異なるタンパク質を含む、当技術分野において認められている原核生物の転写因子群を含む（Gallegosら、(1997) Micro. Mol. Biol. Rev. 61: 393；MartinおよびRosner、(2001) Curr. Opin. Microbiol. 4:132）。AraCファミリーポリペプチドは、PROSITE（PS）データベース（http://www.expasy.ch/prosite/）においてプロファイルPS01124として規定されているタンパク質を含む。AraCファミリーポリペプチドは、PS0041、HTH AraCファミリー1、およびPS01124、およびHTH AraCファミリー2に記載のポリペプチドも含む。AraC-XylSファミリーポリペプチド、HTH AraCファミリー1、およびHTH AraCファミリー2の多配列整列化を、それぞれ図1〜3に示す。一つの態様において、AraCファミリーポリペプチドは一般に、一次配列のレベルで、このタンパク質のDNA結合活性を担うと考えられる約100アミノ酸の保存ストレッチからなる（Gallegosら、(1997) Micro. Mol. Biol. Rev. 61: 393；MartinおよびRosner、(2001) Curr. Opin. Microbiol. 4:132）。AraCファミリーポリペプチドは、二つのヘリックス・ターン・ヘリックスDNA結合モチーフを含んでいてもよい（MartinおよびRosner、(2001) Curr. Opin. Microbiol. 4:132；Gallegosら、(1997) Micro. Mol. Biol. Rev. 61: 393；Kwonら、(2000) Nat. Struct. Biol. 7:424；Rheeら、(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95: 10413）。この用語はMarAファミリーポリペプチドおよびHTHタンパク質も含む。一つの態様において、本発明はAraCファミリーポリペプチドを調節する方法であって、AraCファミリーポリペプチドを、DNA結合に関与するポリペプチドの一部と相互作用する試験化合物と接触させることによる方法に関する。さらなる態様において、試験化合物は図2に示すHTH AraCファミリー1タンパク質の保存アミノ酸残基（大文字）と相互作用する。
「ヘリックス・ターン・ヘリックスタンパク質」、「HTHタンパク質」、「ヘリックス・ターン・ヘリックスポリペプチド」、および「HTHポリペプチド」なる用語は、一つまたは複数のヘリックス・ターン・ヘリックスドメインを含むタンパク質を含む。ヘリックス・ターン・ヘリックスドメインは当技術分野において公知で、DNA結合に関係するとされている（Ann Rev. of Biochem. 1984. 53:293）。ヘリックス・ターンドメインのコンセンサス配列の例は、BrunelleおよびSchleif（1989. J. Mol. Biol. 209:607）に見いだすことができる。このドメインは配列
Figure 0004933730
（Xは任意のアミノ酸であり、Phoは疎水性アミノ酸である）で示されている。
ヘリックス・ターン・ヘリックスドメインは最初に認められたDNA結合タンパク質モチーフであった。元来HTHドメインは細菌タンパク質中で同定されたが、それ以来HTHドメインは真核生物および原核生物両方に由来する何百ものDNA結合タンパク質中で見いだされている。これは、「ターン」を構成する短いアミノ酸伸張鎖によって連結された二つのアルファヘリックスから構築される。
一つの態様において、ヘリックス・ターン・ヘリックスドメイン含有タンパク質はMarAファミリーポリペプチドである。「MarAファミリーポリペプチド」なる用語は、MarAに対する配列類似性を有する転写調節タンパク質およびMarAファミリーシグネチャーパターン（MarA family signature pattern）であってXylS/AraCシグネチャーパターンと呼ぶこともできるパターンを含む転写調節タンパク質などの、多くの天然HTHタンパク質を含む。MarAファミリーポリペプチドを規定する例示的シグネチャーパターンは、例えば、PROSITE上に示され、配列：
Figure 0004933730
（Xは任意のアミノ酸である）で表される。MarAファミリーポリペプチドは二つの「ヘリックス・ターン・ヘリックス」ドメインを有する。このシグネチャーパターンは第一の最もアミノ末端のヘリックス・ターン・ヘリックスドメイン（HTH1）に続き、第二の最もカルボキシ末端のヘリックス・ターン・ヘリックスドメイン（HTH2）の全体を含む領域由来のものであった（PROSITE PS00041参照）。
タンパク質のMarAファミリー（「MarAファミリーポリペプチド」）はAraC-XylSファミリーポリペプチドの一つのサブセットであり、MarA、SoxS、Rob、Rma、AarP、PqrAなどのタンパク質を含む。MarAファミリーポリペプチドは一般に、抗生物質、有機溶媒、および酸化的ストレス剤に対する耐性の調節に関与している（AlekshunおよびLevy、(1997) Antimicrob. Agents. Chemother. 41:2067）。他のAraC-XylSファミリーポリペプチドと同様に、MarA様タンパク質も一般に、MarAおよびRob結晶構造により例示される二つのHTHモチーフを含む（Kwonら、(2000) Nat. Struct. Biol. 7:424；Rheeら、(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95: 10413）。MarAファミリーのメンバーは当業者であれば見分けることができ、一般にはMarAのアミノ酸第30〜76残基および第77〜106残基に対する相同性を有するタンパク質で表される（配列番号：1）。
好ましくは、MarAファミリーポリペプチドまたはその一部は第一のMarAファミリーHTHドメイン（HTH1）を含む（Brunelle、1989, J Mol Biol; 209(4):607-22）。もう一つの態様において、MarAポリペプチドは第二のMarAファミリーHTHドメイン（HTH2）を含む（Caswell、1992, Biochem J; 287:493-509）。好ましい態様において、MarAポリペプチドは第一および第二両方のMarAファミリーHTHドメインを含む。
MarAファミリーポリペプチド配列は、一つまたは複数の公知のMarAファミリーのメンバー、好ましくはMarAに「構造的に関連」している。この関連性は、二つのMarAファミリーポリペプチド配列間またはそのようなポリペプチドを規定する二つのMarAファミリーヌクレオチド配列間の配列または構造類似性によって示すことができる。配列類似性は、例えば、比較のための整列化プログラムを用いてMarAファミリーメンバーを最適に整列化し、対応する位置を比較することにより示すことができる。配列間の類似性の程度を調べるために、これらを最適に比較する目的で整列化する（例えば、核酸分子に対する一つのタンパク質の他のタンパク質または核酸分子との最適な整列化のために、そのタンパク質の配列にギャップを導入してもよい）。次いで、アミノ酸残基または塩基および対応するアミノ酸の位置または塩基を比較する。一つの配列の位置が、他の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基または同じ塩基で占有されている場合、それらの分子はその位置で同一である。アミノ酸残基が同一ではない場合、それらは類似でありうる。本明細書において用いられる場合、二つのアミノ酸残基が類似の側鎖を有する同じ残基ファミリーのメンバーであれば、一方のアミノ酸残基はもう一方のアミノ酸残基に「類似」である。塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）を含む類似の側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは、当技術分野において規定されている（例えば、Altschulら、1990. J. Mol. Biol. 215:403参照）。したがって、配列間の類似性の程度（パーセンテージ）は二つの配列が共有する同一または類似の位置の数の関数である（すなわち、相同性％＝同一または類似の位置の数/全位置数×100）。整列化法は当技術分野において公知である。最適配列整列化については、例えば、Altschulら、上記を参照されたい。
MarAファミリーポリペプチドはMarAとある程度のアミノ酸配列類似性を有していると考えられる。MarAならびに他のMarAファミリーポリペプチドの核酸およびアミノ酸配列は当技術分野において入手可能である。例えば、MarAの核酸およびアミノ酸配列は、例えば、GenBank（アクセッション番号M96235またはCohenら、1993. J. Bacteriol. 175:1484、または配列番号：1および配列番号：2において見いだすことができる。
MarAの核酸および／またはアミノ酸配列は、例えば、関連配列を有する他のMarAファミリーメンバーを同定するためにデータベース（例えば、公的または私的のいずれか）検索を行うための「クエリー配列」として用いることができる。そのような検索は、例えば、Altschulら、(1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のNBLASTまたはXBLASTプログラム（第2.0版）を用いて実施することができる。MarAファミリーの核酸分子と相同のヌクレオチド配列を得るために、BLASTヌクレオチド検索を、NBLASTプログラム、スコア＝100、ワード長＝12により実施することができる。本発明のMarAタンパク質分子と相同のアミノ酸配列を得るために、BLASTタンパク質検索を、XBLASTプログラム、スコア＝50、ワード長＝3により実施することができる。比較のためのギャップ整列化を行うために、Gapped BLASTをAltscvhulら、(1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記載のとおりに用いることができる。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを用いる場合、それぞれのプログラム（例えば、XBLASTおよびNLAST）のデフォルトパラメーターを用いることができる。http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。
MarAファミリーメンバーを、それらがMarAを規定する核酸配列に特異的にハイブリダイズする能力に基づいて類似であるとして同定することもできる。そのようなストリンジェントな条件は当業者には公知で、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6において見いだすことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましく、非限定的な例は、6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム（SSC）中、約45℃でハイブリダイゼーションを行った後、0.2×SSC、0.1％SDS中、50〜65℃で一回または複数回洗浄する条件である。ハイブリダイゼーションの条件は、実質的に純粋な二重鎖核酸の分子の半分で観察される融点Tmに大きく依存する。Tmは所与の配列の分子の半分が融解するか、または一重鎖になる温度（℃）である。11から23塩基の配列の核酸では、Tm（℃）は2(A+T残基の数)+4(C+G残基の数)で推定することができる。核酸分子のハイブリダイゼーションまたはアニーリングはTmよりも低い温度、例えば、Tmよりも15℃、20℃、25℃または30℃低い温度で実施するべきである。塩濃度（NaClのM）の影響も計算することができ、例えば、The Encyclopedia of Molec. Biol.、J. Kendrew編、Blackwell Oxford (1994)のBrown, A.、「Hybridization」pp. 503-506を参照されたい。
好ましくは、このようにして同定したMarAファミリーメンバーの核酸配列は、MarAヌクレオチド配列と少なくとも約10％、20％、より好ましくは少なくとも約30％、より好ましくは少なくとも約40％同一、好ましくは少なくとも約50％、または60％同一である。好ましい態様において、MarAファミリーメンバーの核酸配列はMarAヌクレオチド配列と少なくとも約70％、80％、好ましくは少なくとも約90％、より好ましくは少なくとも約95％同一である。好ましくは、MarAファミリーメンバーは、MarAアミノ酸配列と少なくとも約20％、好ましくは少なくとも約30％、より好ましくは少なくとも約40％同一、好ましくは少なくとも約50％、または60％以上同一のアミノ酸配列を有する。好ましい態様において、MarAファミリーメンバーの核酸配列はMarAヌクレオチド配列と少なくとも約70％、80％、より好ましくは少なくとも約90％、またはより好ましくは少なくとも約95％同一である。しかし、微生物の遺伝子転写調節因子の間の配列類似性のレベルは、同じファミリーのメンバーであっても、必ずしも高くはない。これは、配列同一性のレベルが低い、例えば20％未満の異なるゲノム（例えばB.ブルグドルフェリ（B. burgdorferi）と例えば枯草菌（B. subtilis））の場合に特にあてはまる。したがって、MarAファミリーメンバーの間の構造類似性はアミノ酸残基の「三次元対応」に基づいて求めることもできる。本明細書において用いられる場合、「三次元対応」なる用語は、空間的に対応する、例えばX線結晶学により評価して、例えばMarAファミリーポリペプチドメンバーと同じ位置にあるが、直線整列化プログラムを用いて整列化すると対応しないこともある残基を含むことが意図される。「三次元対応」なる用語は、同じ機能を行う、例えば突然変異解析により評価して、例えばDNAに結合する、または同じ補助因子に結合する残基も含む。
例示的MarAファミリーポリペプチドを表1、図1〜3、およびProsite（PS00041）に示し、下記が含まれる：AarP、Ada、AdaA、AdiY、AfrR、AggR、AppY、AraC、CafR、CelD、CfaD、CsvR、D90812、EnvY、ExsA、FapR、HrpB、InF、InvF、LcrF、LumQ、MarA、MelR、MixE、MmsR、MsmR、OrfR、Orf_f375、PchR、PerA、PocR、PqrA、RafR、RamA、RhaR、RhaS、Rns、Rob、SoxS、S52856、TetD、TcpN、ThcR、TmbS、U73857、U34257、U21191、UreR、VirF、XylR、XylS、Xys1、2、3、4、Ya52、YbbB、YfiF、YisR、YzbC、およびYijO。大腸菌Rob分子のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：3および4に示す。
（表１）いくつかの細菌MarA相同体a
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a サイズが87（U34257）から138（OrfR）アミノ酸残基の範囲の小さいMarA相同体は太字で示している。参考文献を括弧内に示し、下記に列挙する。
表1の参考文献：
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「転写因子調節化合物」または転写因子調節剤」なる用語はHTHタンパク質調節化合物、HTHタンパク質調節剤を含む。転写因子調節化合物は、転写因子の活性が調節される、例えば増強または阻害されるように、一つまたは複数の転写因子と相互作用する化合物を含む。この用語はAraCファミリー調節化合物およびMarAファミリー調節化合物の両方も含む。一つの態様において、転写因子調節化合物は転写因子、原核生物転写因子または真核生物転写活性化因子の阻害化合物である。一つの態様において、転写因子調節化合物は当技術分野において公知のアッセイまたは実施例8に記載のものなどのLANCEアッセイにより測定した転写因子の活性を調節する。一つの態様において、転写因子調節化合物は特定の転写因子を、転写因子調節化合物なしの転写因子の活性に比べて約10％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約70％以上、約80％以上、約90％以上、約95％以上、または約100％阻害する。もう一つの態様において、転写因子調節化合物はバイオフィルムの生成を阻害する。一つの態様において、転写因子調節化合物は当技術分野において公知のアッセイまたは実施例7に記載のクリスタルバイオレットアッセイにより測定したバイオフィルム生成を阻害する。一つの態様において、本発明の転写因子はバイオフィルムの生成を、転写因子調節化合物なしのバイオフィルムの生成に比べて約25％以上、50％以上、75％以上、80％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.9％以上、99.99％以上、または約100％阻害する。
「HTHタンパク質調節化合物」または「HTHタンパク質調節剤」なる用語は、HTHタンパク質の活性が調節される、例えば増強または阻害されるように、一つまたは複数のHTHタンパク質と相互作用する化合物を含む。一つの態様において、HTHタンパク質調節化合物はMarAファミリーポリペプチド調節化合物である。一つの態様において、HTHタンパク質の活性は、HTHタンパク質調節化合物と相互作用した場合に増強される。例えば、HTHタンパク質の活性は、HTH調節化合物なしのHTHタンパク質の活性の10％を越えて、20％を越えて、50％を越えて、75％を越えて、80％を越えて、90％を越えて、または100％増大することもある。もう一つの態様において、HTHタンパク質の活性は、HTHタンパク質調節化合物との相互作用によって減少する。一つの態様において、HTHタンパク質の活性は、本明細書に記載の技術およびアッセイを用いて、本発明のHTH調節化合物と接触しないときのHTHタンパク質の活性に比べて、約25％以上、50％以上、75％以上、80％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.9％以上、99.99％以上、または約100％低下する。本明細書に含まれる値および範囲ならびに／または本明細書に記載の値の中間値も、本発明の範囲内であることが意図される。
「MarAファミリーポリペプチド調節化合物」または「MarAファミリー調節化合物」なる用語は、MarAファミリーペプチドの活性が増強または阻害されるように、一つまたは複数のMarAファミリーポリペプチドと相互作用する化合物を含む。一つの態様において、MarAファミリーポリペプチド調節化合物は阻害化合物である。さらなる態様において、MarAファミリー阻害化合物はMarA、Rob、および／またはSoxSの阻害剤である。もう一つの態様において、MarAファミリーポリペプチド調節化合物は、実施例9に記載のルシフェラーゼアッセイにおいてルシフェラーゼの発現を調節する。一つの態様において、MarAファミリーポリペプチド調節化合物はルシフェラーゼ発現を10％を越えて、20％を越えて、30％を越えて、40％を越えて、50％を越えて、60％を越えて、70％を越えて、80％を越えて、90％を越えて、または約100％低下させる。
「ポリペプチド」なる用語は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合によって互いに結合した複数のアミノ酸を含むペプチドまたはタンパク質を意味する。「ポリペプチド」は、一般にペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーと呼ばれる短鎖、ならびに一般にタンパク質と呼ばれる長鎖の両方を含む。ポリペプチドは、20の遺伝子によってコードされるアミノ酸以外のアミノ酸を含むこともある。「ポリペプチド」は、プロセッシングおよび他の翻訳後修飾などの自然過程によって改変されたものを含むが、化学修飾技術によって改変されたものも含む。そのような改変は基本の教科書、およびより詳細な研究書、ならびに大部の研究文献に詳しく記載されており、当業者には公知である。同種の改変が所与のポリペプチドのいくつかの部位に同程度または異なる程度で存在しうることが理解されると思われる。また、所与のポリペプチドは多くの種類の改変を含むこともある。改変は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖、およびアミノまたはカルボキシル末端を含むポリペプチドのどこにでも起こりうる。改変には、例えば、アセチル化、アシル化、ADP-リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合による架橋形成、システインの形成、ピログルタミン酸エステルの形成、ホルミル化、ガンマ-カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、蛋白分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ-カルボキシル化、ヒドロキシル化およびADP-リボシル化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などの転移RNA仲介性のアミノ酸のタンパク質への付加、ならびにユビキチン結合が含まれる。例えば、Proteins--Structure And Molecular Properties、第2版、T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company、New York (1993)およびPosttranslational Covalent Modification Of Proteins、B. C. Johnson編、Academic Press, New York (1983)のWold, F.、Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects、p.1-12；Seifterら、Meth. Enzymol. 182:626-646 (1990)およびRattanら、Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann. N.Y. Acad. Sci. 663: 48-62 (1992)を参照されたい。ポリペプチドは分枝または分枝を有する、もしくは有していない環状であってもよい。環状、分枝および分枝環状ポリペプチドは、翻訳後の自然過程から生じることもあり、同様に完全に合成的な方法によって作られることもある。
好ましいポリペプチド（およびそれらをコードする核酸分子）は「天然」である。本明細書において用いられる「天然」分子とは、自然に出現するアミノ酸またはヌクレオチド配列を有する分子（例えば、天然ポリペプチド）を意味する。加えて、天然ポリペプチドと同じ機能的活性（標的核酸分子（例えば、marboxを含む）またはポリペプチド（例えば、RNAポリメラーゼ）に結合する能力など）を保持するポリペプチドおよび核酸分子の天然または非天然変異型が提供される。そのような免疫学的交差反応性は、例えば、変異型がMarAファミリーポリペプチド応答配列に結合する能力によって示すことができる。そのような変異型は、例えば、当技術分野において公知の技術を用いた突然変異によって作製することができる。または、変異型は化学的に合成することもできる。
本明細書において用いられる「変異型」なる用語は、基準核酸分子またはポリペプチドと配列が異なるが、その本質的性質を保持している核酸分子またはポリペプチドを含む。変異型のヌクレオチド配列における変化は、基準核酸分子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変えることもあれば、変えないこともある。ヌクレオチドまたはアミノ酸の変化は、天然の基準配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸の置換、付加、欠失、融合、および切断を引き起こすこともある。ポリペプチドの典型的な変異型は基準ポリペプチドとアミノ酸配列が異なる。一般に、差は限定されており、基準ポリペプチドおよび変異型の配列は全体として非常に類似しており、多くの領域で同一である。変異型および基準ポリペプチドは、一つまたは複数の置換、付加、および／または欠失の任意の組み合わせでアミノ酸配列が異なっていることもある。
核酸分子またはポリペプチドの変異型は、対立遺伝子による変異型などの天然に生じるものであってもよく、または天然に生じることが知られていない変異型であってもよい。核酸分子およびポリペプチドの非天然変異型は、基準核酸分子またはポリペプチドから、突然変異誘発技術により、直接合成により、および当業者には公知の他の組換え法により作製することができる。または、変異型は化学的に合成することもできる。例えば、機能的に等価（例えば、MarAファミリーポリペプチド応答配列と相互作用する能力を有する）である自己ポリペプチドの人工または突然変異型は、当技術分野において公知の技術を用いて製造することができる。
突然変異は、例えば、置換を起こしうる、または少なくとも一つの欠失もしくは挿入による、少なくとも一つの別個の点突然変異を含みうる。例えば、突然変異は無作為突然変異誘発により、またはカセット突然変異誘発を用いて作製することもできる。前者の場合、分子の全コード領域にいくつかの方法（化学的、PCR、ドープオリゴヌクレオチド合成）の一つによって突然変異を誘発し、無作為に突然変異した分子群を選択またはスクリーニング法に供する。後者では、規定された構造または機能決定因子いずれかに対応するポリペプチドの別個の領域を飽和または半無作為突然変異誘発に供し、これらの突然変異誘発されたカセットをそれ以外は野生型の対立遺伝子の環境に再導入する。一つの態様において、PCR突然変異誘発を用いることができる。例えば、メガプライマーPCRを用いることができる（O.H. Landt、1990. Gene 96:125-128）。
好ましい態様において、MarAファミリーポリペプチドは一つまたは複数のXylS、AraC、およびMelRを除外する。他の好ましい態様において、MarAファミリーポリペプチドは抗生物質耐性に関与している。特に好ましい態様において、MarAファミリーポリペプチドはMarA、RamA、AarP、Rob、SoxS、およびPqrAからなる群より選択される。
「転写因子の活性」なる用語は、転写因子がDNAと相互作用する、例えば、転写因子応答プロモーターに結合する、またはそのようなプロモーターから転写を開始する能力を含む。この用語はAraCファミリーポリペプチド、HTHタンパク質およびMarAファミリーポリペプチドの活性を特に含む。
「MarAファミリーポリペプチドの活性」なる用語は、MarAファミリーポリペプチドがDNAと相互作用する、例えば、MarAファミリーポリペプチド応答プロモーターに結合する、またはそのようなプロモーターから転写を開始する能力を含む。MarAは転写アクチベーター（例えば、inaA、galT、micFなどの上方制御遺伝子）およびリプレッサー（例えば、fecA、purA、guaBなどの下方制御遺伝子）の両方として機能する（(Alekshun、1997, Antimicrob. Agents Chemother. 41:2067-2075；Barbosa & Levy、J. Bact. 2000, Vol. 182, p. 3467-3474；Pomposielloら、J. Bact. 2001, Vol 183, p. 3890-3902）。
「転写因子応答配列」なる用語は、微生物においてオペロンの転写開始に関与するプロモーターまたはエンハンサーと相互作用しうる核酸配列を含む。この用語はmarAファミリーポリペプチド応答配列を含む。
「marAファミリーポリペプチド応答配列」なる用語は、微生物において核酸配列の転写制御に関与するmarAの例えばプロモーターまたはエンハンサーと相互作用しうる核酸配列を含む。MarA応答配列は約16塩基対のmarbox配列、すなわちMarAのその標的への結合にとって非常に重要な配列を含む。加えて、第一のmarboxの上流の、第二の部位であるアクセサリーmarboxは、基準および抑制解除されたmar転写に寄与する。marboxは順方向または逆方向のいずれかで位置していてもよい。（Martin、1999, Mol. Microbiol. 34:431-441）。marRABオペロンにおいて、marboxは逆方向であり、したがってmarRABに関してセンス鎖上に局在する（Martin、1999, Mol. Microbiol. 34:431-441）。特定のプロモーターのmarbox配列内のわずかな相違は、MarAおよび他の関連する、例えば、SoxSおよびRob転写因子による区別的制御の原因となりうる（Martin、2000, Mol Microbiol; 35(3):623-34）。一つの態様において、MarAファミリー応答配列は、marAプロモーターに構造的または機能的に関連する、例えば、MarAまたはMarA関連タンパク質と相互作用するプロモーターである。好ましくは、marAファミリーポリペプチド応答配列はmarRABプロモーターである。例えば、marオペロンにおいて、本明細書の定義のとおり、いくつかのプロモーターはmarAファミリーポリペプチド応答プロモーターであり、例えば、marO領域からの405塩基対のThaI断片はmarAファミリー応答プロモーターである（Cohenら、1993. J. Bact. 175:7856）。加えて、MarAは16塩基対のMarA結合部位（marO内の「marbox」と呼ばれている）に結合することが明らかにされている（Martinら、1996. J. Bacteriol. 178:2216）。MarAはacrA；micF；mlr 1、2、3；slp；nfo；inaA；fpr；sodA；soi-17、19；zwf；fumC；またはrpsFプロモーターからの転写にも影響をおよぼす（AlekshunおよびLevy、1997. antimicrobial Agents and Chemother. 41:2067）。他のmarAファミリー応答プロモーターが当技術分野において公知で、AraCによって活性化されるaraBAD、araE、araFGHおよびaraC；XylSによって活性化されるPm；MelRによって活性化されるmelAB；ならびにRobによって結合されるoriCが含まれる。
「MarAファミリーポリペプチド応答プロモーター」なる用語は、MarAファミリーメンバータンパク質との相互作用により転写を活性化するのに十分な前述のプロモーターの部分も含む。その活性のために最低限要求される任意のMarAファミリーポリペプチド応答プロモーターの部分は、当業者であれば、例えば、突然変異誘発を用いて容易に決定することができる。例示的技術はGallegosら（1996, J. Bacteriol. 178:6427）によって記載されている。「MarAファミリーポリペプチド応答プロモーター」は、天然のMarAファミリープロモーターと同じ機能を有する非天然のMarAファミリーポリペプチド応答プロモーター変異型も含む。好ましくはそのような変異型は、天然のMarAファミリーポリペプチド応答プロモーターと少なくとも30％以上、40％以上、または50％以上のヌクレオチド配列同一性を有する。好ましい態様において、そのような変異型は、天然のMarAファミリーポリペプチド応答プロモーターと少なくとも約70％のヌクレオチド配列同一性を有する。より好ましい態様において、そのような変異型は、天然のMarAファミリーポリペプチド応答プロモーターと少なくとも約80％のヌクレオチド配列同一性を有する。特に好ましい態様において、そのような変異型は、天然のMarAファミリーポリペプチド応答プロモーターと少なくとも約90％のヌクレオチド配列同一性、好ましくは少なくとも約95％のヌクレオチド配列同一性を有する。さらに他の態様において、MarAファミリーポリペプチド応答プロモーターの変異型をコードする核酸分子は、ストリンジェントな条件下で天然のMarAファミリーポリペプチド応答プロモーターをコードする核酸分子とハイブリダイズすることができる。
「相互作用」なる用語は、測定可能な影響をもたらす分子間の密接な接触、例えば、一つの分子のもう一つの分子との結合を含む。例えば、MarAファミリーポリペプチドはMarAファミリーポリペプチド応答配列と相互作用して、DNAの転写レベルを変えることができる。同様に、化合物はMarAファミリーポリペプチドと相互作用して、MarAファミリーポリペプチドの活性を変えることができる。
「誘導性プロモーター」なる用語は、活性化されてそれらが制御する遺伝子の合成を誘導するプロモーターを含む。本明細書において用いられる「構成性プロモーター」なる用語は、誘導物質の存在を必要としない、例えば、常に活性なプロモーターを含む。
「異種DNA」または「異種核酸」なる用語は、それが存在する細胞内で天然に（例えば、ゲノムの一部として）出現しない、またはそれが天然に出現するものと異なるゲノム中の一つまたは複数の位置で見いだされる、またはそれが天然では通常連結しないDNA（すなわち、異種プロモーターに操作可能に連結されている遺伝子）に操作可能に連結されるDNAを含む。異種DNAは、1）特定の位置（例えば、ゲノム中の特定の位置）に天然に出現しない、または2）それが導入される細胞にとって内在性ではないが、他の細胞から得られたものである。異種DNAは同じ種由来でも、異なる種由来でもよい。それが発現される細胞にとって異種または外来性であると当業者が認める、または考えるいかなるDNAも、本明細書において異種DNAなる用語に含まれる。
「異種タンパク質」、「組換えタンパク質」、および「外来性タンパク質」なる用語は本明細書の全体を通して交換可能に用いられ、一般にポリペプチドをコードするDNAを適当な発現ベクターに挿入し、次にこのベクターを用いて宿主細胞を異種タンパク質を産生するように転換する、組換え技術によって産生されるポリペプチドを意味する。すなわち、ポリペプチドは異種核酸分子から発現される。
「微生物」なる用語は、転写因子、araCファミリーポリペプチド、HTHタンパク質、またはmarAファミリーポリペプチドを発現する、または発現させられる微生物を含む。「微生物」は幾分かの経済的重要性があり、例えば、環境的に重要であるか、またはヒトの病原体として重要である。例えば、一つの態様において、微生物は環境問題、例えば、汚損もしくは腐敗の原因となり、または植物物質の分解などの有用なはたらきをする。もう一つの態様において、微生物は哺乳動物の中または上に生息する生物で、医学的に重要である。好ましくは、微生物は単細胞生物で、細菌、真菌、または原生動物を含む。もう一つの態様において、本発明で用いるのに適した微生物は多細胞生物、例えば、寄生生物または真菌である。好ましい態様において、微生物はヒト、動物、または植物にとって病原性である。微生物は完全な細胞として、または無細胞アッセイのための原料として用いることができる。一つの態様において、微生物は原核生物を含む。他の態様において、微生物は真核生物を含む。
選択マーカーなる用語は、細胞によって発現された時に指標として役立つ、例えば選択可能またはスクリーニング可能な特徴を提供するポリペプチドを含む。「選択マーカー」なる用語は、選択可能なマーカーおよび対抗選択可能なマーカーの両方を含む。本明細書において用いられる「選択可能なマーカー」なる用語は、アッセイの試験パラメーターを満たす化合物または分子が存在する場合に、増殖上好都合となるマーカーを含む。「対抗選択可能なマーカー」なる用語は、対抗選択可能なマーカーを発現させる条件を妨害する化合物または分子が存在しないかぎり、増殖上不都合となるマーカーを含む。例示的な選択マーカーには、細胞毒性遺伝子産物、抗生物質耐性を与える遺伝子産物、増殖に必須の遺伝子産物、特定の代謝基質存在下で発現された場合に選択的に増殖上不都合となる遺伝子産物（例えば、URA3遺伝子の発現は5-フルオロオロチン酸存在下で増殖上不都合である）が含まれる。
「試験化合物」なる用語は、本発明のアッセイにおいて用いられ、転写因子、例えば、AraCファミリーポリペプチド、HTHタンパク質、またはMarAファミリーポリペプチドの活性に影響をおよぼす能力について、例えば、それが相互作用するポリペプチドまたは分子への結合によりアッセイされる、いかなる試薬または試験物質も含む。スクリーニングアッセイにおいて、一つより多くの化合物、例えば複数の化合物を、それらが転写因子、例えば、AraCファミリーポリペプチド、HTHタンパク質、またはMarAファミリーポリペプチドの活性を調節する能力について、同時に試験することができる。有利な態様において、試験化合物はMarAファミリー調節化合物である。
本アッセイで試験することができる試験化合物には、抗生物質および非抗生物質の化合物が含まれる。一つの態様において、試験化合物には候補洗浄剤または消毒化合物が含まれる。活性についてスクリーニングすることができる例示的試験化合物には、ペプチド、非ペプチド化合物、核酸、炭水化物、有機小分子（例えば、ポリケチド）、および天然物抽出ライブラリが含まれる。「非ペプチド試験化合物」なる用語は、少なくとも部分的には、天然のペプチド結合で連結された天然のL-アミノ酸残基とは異なる分子構造からなる化合物を含む。しかし、「非ペプチド試験化合物」は、全体または部分的に、D-アミノ酸、非天然L-アミノ酸、修飾ペプチド主鎖などのペプチド様構造からなる化合物、ならびに全体または部分的に、天然のペプチド結合で連結された天然のL-アミノ酸残基とは無関係の分子構造からなる化合物も含む。「非ペプチド試験化合物」は、天然物を含むことも意図される。
「アンタゴニスト」なる用語は、転写因子に結合して不活化することにより（例えば、AraCファミリー調節化合物、MarAファミリーポリペプチド調節化合物など）、転写因子が相互作用する核酸標的（例えば、MarAについてはmarbox）に結合することにより、特定のレギュロンの活性化（例えば、MarについてはMarRの不活化またはMarA合成の活性化）を担うシグナルトランスダクション経路を妨害することにより、および／または重要なタンパク質-タンパク質相互作用（例えば、MarAが転写因子として機能するために必要とされるMarA-RNAポリメラーゼ相互作用）を妨害することにより、転写因子の活性を阻害する転写因子調節化合物（例えば、AraCファミリーポリペプチド調節化合物、HTHタンパク質調節化合物、MarAファミリーポリペプチド調節化合物など）を含む。アンタゴニストには、例えば、細胞浸透性有機小分子、核酸インターキレーター（interchelator）、ペプチドなどの天然または化学合成化合物が含まれる。
「アゴニスト」なる用語は、転写因子に結合して活性化することにより（例えば、AraCファミリー調節化合物、MarAファミリーポリペプチド調節化合物など）、転写因子が相互作用する核酸標的（例えば、MarAについてはmarbox）に結合することにより、特定のレギュロンの活性化（例えば、MarについてはMarRの不活化またはMarA合成の活性化）を担うシグナルトランスダクション経路を促進することにより、および／または重要なタンパク質-タンパク質相互作用（例えば、MarAが転写因子として機能するために必要とされるMarA-RNAポリメラーゼ相互作用）を促進することにより、転写因子の活性を促進する転写因子調節化合物（例えば、AraCファミリーポリペプチド調節化合物、HTHタンパク質調節化合物、MarAファミリーポリペプチド調節化合物など）を含む。アゴニストには、例えば、細胞浸透性有機小分子、核酸インターキレーター、ペプチドなどの天然または化学合成化合物が含まれる。
II. MarAファミリーポリペプチドヘリックス・ターン・ヘリックスドメイン
ヘリックス・ターン・ヘリックスドメインは当技術分野において公知で、DNA結合に関係するとされている（Ann Rev. of Biochem. 1984. 53:293）。ヘリックス・ターンドメインのコンセンサス配列の一例は、BrunelleおよびSchleif（1989, J. Mol. Biol. 209:607）に見いだすことができる。ドメインは配列
Figure 0004933730
（Xは任意のアミノ酸であり、Phoは疎水性アミノ酸である）で例示されている。
MarAの結晶構造が明らかにされており、MarAの第一の（最もアミノ末端）HTHドメインはアミノ酸31付近からアミノ酸52付近までを含むと同定されており、MarAの第二のHTHドメインはアミノ酸79付近からアミノ酸102付近までを含むと同定されている（Rheeら、1998. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95:10413）。
他のMarAファミリーメンバーならびに他のHTHタンパク質におけるヘリックス・ターン・ヘリックスドメインの位置は、当業者であれば容易に見いだすことができる。例えば、MarAタンパク質配列および整列化プログラム、例えばProDomプログラムまたは他の当技術分野において公知のプログラム、例えばMarAの一つまたは両方のHTHドメインを含むMarAアミノ酸配列の一部（MarAのアミノ酸30付近からアミノ酸107付近までなど）を用いて整列化を行う。そのような整列化を用いて、MarAのHTHドメインに対応するアミノ酸配列を他のMarAファミリーメンバータンパク質中で同定することができる。MarAファミリーポリペプチドの第一のヘリックス・ターン・ヘリックスドメインの例示的コンセンサス配列は
Figure 0004933730
（Xは任意のアミノ酸である）と例示することができる。MarAファミリーポリペプチドの第二のヘリックス・ターン・ヘリックスドメインの例示的コンセンサス配列は
Figure 0004933730
（Xは任意のアミノ酸である）と例示することができる。好ましくは。MarAファミリーポリペプチドの第一のヘリックス・ターン・ヘリックスドメインはコンセンサス配列
Figure 0004933730
を含む。好ましくは。MarAファミリーポリペプチドの第二のヘリックス・ターン・ヘリックスドメインはコンセンサス配列
Figure 0004933730
を含む。
一つの態様において、MarAファミリーメンバーHTHドメインはMarA HTHドメインである。MarAの第一および第二のヘリックス・ターン・ヘリックスドメインは、それぞれ、
Figure 0004933730
および
Figure 0004933730
である。他の例示的MarAファミリーヘリックス・ターン・ヘリックスドメインには下記が含まれる：MelRのアミノ酸210付近からアミノ酸229付近まで、およびアミノ酸259付近からアミノ酸278付近まで；AraCのアミノ酸196付近からアミノ酸215付近まで、およびアミノ酸245付近からアミノ酸264付近まで；ならびにXylSのアミノ酸230付近からアミノ酸249付近まで（または233〜253）、およびアミノ酸281付近からアミノ酸301付近まで（または282〜302）（例えば、Brunelleら、1989. J. Mol. Biol. 209:607；Nilandら、1996. J. Mol. Biol. 264:667；Gallegosら、1997. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 61:393参照）。
「MarAファミリーポリペプチドヘリックス・ターン・ヘリックスドメイン」は前述のMarAファミリーポリペプチドにおいて見いだされるヘリックス・ターン・ヘリックスドメイン由来であるか、またはこれと相同である。好ましい態様において、MarAファミリーポリペプチドは一つまたは複数のXylS、AraC、およびMelRを除外する。特に好ましい態様において、MarAファミリーポリペプチドはMarA、RamA、AarP、Rob、SoxS、およびPqrAからなる群より選択される。
MarAファミリーポリペプチドに存在するヘリックス・ターン・ヘリックスドメインは両方ともタンパク質のカルボキシ末端にある。これらのドメインのいずれか、または両方を含むタンパク質またはその一部を本発明の方法で用いることができる。特定の態様において、化合物のスクリーニングに用いられるポリペプチドは、それが由来するMarAファミリーポリペプチドのカルボキシ末端に最も近いヘリックス・ターン・ヘリックスドメイン（HTH2）を含む。他の態様において、そのようなポリペプチドは、それが由来するMarAファミリーポリペプチドのアミノ末端に最も近いヘリックス・ターン・ヘリックスドメイン（HTH1）を含む。一つの態様において、他のポリペプチド配列、例えば、ドメインを支持体上に固定化するのを助ける配列、またはドメインの精製を容易にする配列も存在してもよい。
一つの態様において、そのようなポリペプチドは本質的に、それが由来するMarAファミリーポリペプチドのカルボキシ末端に最も近いヘリックス・ターン・ヘリックスドメインからなる。他の好ましい態様において、そのようなポリペプチドは本質的に、それが由来するMarAファミリーポリペプチドのアミノ末端に最も近いヘリックス・ターン・ヘリックスドメインからなる。
一つの態様において、そのようなポリペプチドは、それが由来するAraCファミリーポリペプチドまたはMarAファミリーポリペプチドのカルボキシ末端に最も近いヘリックス・ターン・ヘリックスドメインからなる。他の好ましい態様において、そのようなポリペプチドは、それが由来するAraCファミリーポリペプチドまたはMarAファミリーポリペプチドのアミノ末端に最も近いヘリックス・ターン・ヘリックスドメインからなる。
MarAファミリーポリペプチドまたはAraCファミリーポリペプチドヘリックス・ターン・ヘリックスドメインは、当技術分野において公知の技術を用いて作製することができる。MarAファミリーポリペプチドなどの、転写因子の核酸およびアミノ酸配列は、例えばGenBankから入手可能である。本明細書において提供されるこの情報、ヘリックス・ターン・ヘリックスコンセンサスモチーフ、および突然変異解析を用いて、当業者であればMarAファミリーまたはAraCファミリーポリペプチドヘリックス・ターン・ヘリックスドメインを同定することができる。
本発明の特定の態様において、転写因子またはその一部（例えば、HTHタンパク質ヘリックス・ターン・ヘリックスドメイン、AraCファミリーヘリックス・ターン・ヘリックスドメイン、MarAファミリーヘリックス・ターン・ヘリックスドメインまたはその突然変異型）をコードする「単離または組換え」核酸分子を得ることが望ましい。「単離または組換え」とは、（1）例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によりインビトロで増幅された；（2）クローニングにより組換え産生された、もしくは（3）切断およびゲル分離により精製された；または（4）例えば、化学合成により合成された核酸分子を意味する。そのような核酸分子は、天然ではゲノム中でそれに隣接する配列から、および細胞成分から単離される。
次いで、下記に詳細に論じるとおり、転写因子（例えば、HTHタンパク質ヘリックス・ターン・ヘリックスドメイン、AraCファミリーヘリックス・ターン・ヘリックスドメイン、MarAファミリーヘリックス・ターン・ヘリックスドメインまたはその突然変異型）をコードする単離または組換え核酸分子を、例えば結合アッセイに用いる、細胞中で発現させる、またはファージの表面上で発現させることができる。
本発明のさらに他の態様において、実質的に精製された、または組換えHTHタンパク質ヘリックス・ターン・ヘリックスドメイン（例えば、MarAファミリーヘリックス・ターン・ヘリックスドメインまたはその突然変異型）を得ることが望ましいと考えられる。そのようなポリペプチドは、例えば、HTHタンパク質ヘリックス・ターン・ヘリックスドメイン（例えば、MarAファミリーヘリックス・ターン・ヘリックスドメインまたはその突然変異型）をコードする単離または組換え核酸分子を発現するよう操作された細胞から精製することができる。例えば、下記に詳細に記載するとおり、細菌細胞をMarAファミリーヘリックス・ターン・ヘリックスドメインをコードするプラスミドにより形質転換することができる。次いで、MarAファミリーヘリックス・ターン・ヘリックスタンパク質を細菌細胞から精製し、例えば、本明細書に記載の無細胞アッセイで用いることができる。
HTHタンパク質ヘリックス・ターン・ヘリックスドメイン（例えば、MarAファミリーヘリックス・ターン・ヘリックスドメイン）の精製は、当技術分野において公知の技術を用いて達成することができる。例えば、カラムクロマトグラフィを用いることもでき、または例えばカラム上もしくはパニングアッセイにおいてドメインもしくはドメインに融合させたポリペプチドに特異的な抗体を用いることもできる。
好ましい態様において、精製のためにHTHタンパク質ヘリックス・ターン・ヘリックスドメイン（例えば、MarAファミリーヘリックス・ターン・ヘリックスドメインまたはその突然変異型）を発現させるために用いる細胞、例えば宿主細胞は、いかなる内在性HTHタンパク質も非機能的とする、または内在性タンパク質が発現されないようにする突然変異を含む。他の態様において、宿主細胞のMarRまたは関連遺伝子において、MarAファミリーポリペプチドと同じプロモーターに結合するリプレッサータンパク質が宿主細胞によって発現されないように突然変異を誘導することもできる。
本発明の特定の態様において、HTHタンパク質ヘリックス・ターン・ヘリックスドメインの突然変異型、例えば、活性が変更されている、例えば、野生型MarAファミリーポリペプチドヘリックス・ターン・ヘリックスドメイン活性を保持していない、または野生型MarAファミリーポリペプチドヘリックス・ターン・ヘリックスドメインと比べて活性が低下している、もしくはより活性である、MarAファミリーヘリックス・ターン・ヘリックスドメインの非天然型を用いることが望ましいと考えられる。
そのような突然変異型は、当技術分野において公知の技術を用いて作製することができる。例えば、無作為突然変異誘発を用いることができる。無作為突然変異誘発を用いて分子全体に突然変異を誘発することもでき、またはカセット突然変異誘発によって行うこともできる。前者の場合、分子の全コード領域にいくつかの方法（化学的、PCR、ドープオリゴヌクレオチド合成）の一つによって突然変異を誘発し、無作為に突然変異した分子群を選択またはスクリーニング法に供する。第二のアプローチでは、規定された構造または機能決定因子いずれかに対応するタンパク質の別個の領域（例えば、ヘリックス・ターン・ヘリックスドメインの第一または第二のアルファヘリックス）を飽和または半無作為突然変異誘発に供し、これらの突然変異誘発されたカセットをそれ以外は野生型の対立遺伝子の環境に再導入する。
好ましい態様において、PCR突然変異誘発を用いる。例えば、実施例2は、marA遺伝子のヘリックスA（第1989位）およびヘリックスB（第2016位）両方の中心にNheI制限部位を導入するために用いるメガプライマーPCR（O.H. Landt、1990. Gene 96:125-128）の使用を記載する。
一つの態様において、そのような突然変異ヘリックス・ターン・ヘリックスドメインはMarAファミリーポリペプチド分子のカルボキシ末端に最も近いヘリックス・ターン・ヘリックスドメイン（HTH2）における一つまたは複数の突然変異を含む。好ましい態様において、突然変異はMarAファミリーポリペプチドのカルボキシ末端に最も近いヘリックス・ターン・ヘリックスドメインのヘリックスAおよびヘリックスBへの挿入を含む。一つの態様において、そのような突然変異ヘリックス・ターン・ヘリックスドメインはMarAファミリーポリペプチド分子のアミノ末端に最も近いヘリックス・ターン・ヘリックスドメイン（HTH1）における一つまたは複数の突然変異を含む。好ましい態様において、突然変異はMarAファミリーポリペプチドのアミノ末端に最も近いヘリックス・ターン・ヘリックスドメインのヘリックスAおよびヘリックスBへの挿入を含む。特に好ましい態様において、突然変異はMarAの第33位付近に対応するアミノ酸での挿入およびmarAの第42位付近に対応するアミノ酸の位置での挿入からなる群より選択される。「対応する」アミノ酸は、例えばヘリックス・ターン・ヘリックスドメインの整列化を用いて決定することができる。
MarAファミリーヘリックス・ターン・ヘリックスモチーフのそのような突然変異型は、抗感染化合物のMarAファミリーヘリックス・ターン・ヘリックスドメインに対する特異性を確認するための対照として、または抗感染物質に対する耐性に影響をおよぼす遺伝子座同定のための対照として有用である。例えば、添付の実施例に記載の突然変異MarAファミリーヘリックス・ターン・ヘリックスドメインは、第一のHTHドメインにおけるヘリックスAまたはヘリックスBいずれかでMarAを挿入により不活化すると、大腸菌およびスメグマ菌（M. smegmatis）両方の多剤耐性表現型が破壊されることを示している。MarAファミリーポリペプチドヘリックス・ターン・ヘリックスドメインが抗生物質耐性を増大させる能力を有し、かつこれらのドメインの突然変異型は同じ影響を有していないことを示す、実施例2に記載のものなどのアッセイ系を用いることにより、同定されたいかなる遺伝子座の応答もMarAファミリーヘリックス・ターン・ヘリックスドメインに特異的であることを明白に示すことができる。
III. ポリペプチドまたはその一部の発現
AraCポリペプチド、HTHタンパク質、例えばMarAファミリーポリペプチドなどの転写因子または選択可能なマーカー（または完全長ポリペプチドの活性を保持する、例えば転写因子応答配列に結合することができる、もしくはそれらの指標機能を保持する、その一部）をコードする核酸を、ベクターを用いて細胞中で発現することができる。ほとんどいかなる通常の送達ベクターも用いることができる。そのようなベクターは広く市販されており、所与の微生物細胞と共に用いるのに適したベクターを選択することは、当業者の知識および自由裁量の範囲内である。これらのドメインをコードする配列を自己複製ベクター上の細胞に導入することもでき、または相同組換えを用いて、もしくはトランスポゾンなどの挿入配列により、微生物の染色体に導入することもできる。
これらの核酸は、標準的技術を用いて、例えば塩化カルシウムまたはエレクトロポレーションを用いた形質転換により微生物細胞に導入することができる。そのようなDNAの微生物への導入のための技術は当技術分野において公知である。一つの態様において、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によってインビトロで増幅された；クローニングにより組換え産生されたか、もしくは切断およびゲル分離によって精製された；または例えば化学合成によって合成された核酸分子を用いて、MarAファミリーポリペプチドを産生することができる（George, A. M. & Levy, S. B. (1983)J. Bacteriol. 155, 541-548；Cohen, S. P.ら、(1993) J Infect. Dis. 168, 484-488；Cohen, S. Pら(1993) J Bacteriol. 175, 1484-1492；Sulavick, M. C.ら、(1997) J. Bacteriol. 179, 1857-1866）。
宿主細胞を遺伝子操作して、本発明の核酸分子を組み込むことができる。一つの態様において、転写因子を規定する核酸分子をベクター中に置くことができる。「ベクター」なる用語は、それが連結されたもう一つの核酸分子を輸送することができる核酸分子を意味する。「発現ベクター」または「発現系」なる用語は、細胞による発現に適した形（例えば、プロモーターに連結されている）の遺伝子構築物を含むいかなるベクター（例えば、プラスミド、コスミドまたはファージ染色体）も含む。プラスミドはベクターの一般に用いられる形であるため、本明細書において「プラスミド」および「ベクター」は交換可能に用いられる。さらに、本発明は等価の機能を提供する他のベクターも含むことが意図される。本発明のポリペプチドを産生するために、多様な発現系を用いることができる。そのようなベクターには、特に、染色体、エピソームおよびウイルス由来ベクター、例えば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入配列由来、酵母染色体配列由来、バキュロウイルス、SV40などのパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスなどのウイルス由来ベクター、ならびにコスミドおよびファージミドなどのプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素由来のものなどのその組み合わせ由来ベクターが含まれる。
適当なベクターは広く市販されており、所与の宿主細胞と共に用いるのに適したベクターを選択することは、当業者の知識および自由裁量の範囲内である。例えば、MarAファミリーポリペプチドなどの転写因子をコードする配列を自己複製ベクター上の細胞に導入することもでき、または相同組換えを用いて、もしくはトランスポゾンなどの挿入配列により、微生物の染色体に導入することもできる。
発現系構築物は発現を調節する制御領域を含んでいてもよい。「転写調節配列」は、それらが機能的に連結されたポリペプチドコード配列の転写を誘導または制御する、開始シグナル、エンハンサー、オペレーター、およびプロモーターなどのDNA配列を意味する専門用語である。転写因子遺伝子、例えばHTHタンパク質遺伝子またはAraCファミリーポリペプチド、例えばMarAファミリーポリペプチドをコードする組換え遺伝子は、天然の転写因子遺伝子の転写を制御する配列と同じ、または異なっている転写調節配列の制御下にありうることも理解されると思われる。例示的調節配列は、Goeddel；Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記載されている。例えば、機能的に連結された場合にDNA配列の発現を制御する、様々な発現制御配列のいずれでも、これらのベクター中で用いてポリペプチドをコードするDNA配列を発現することができる。
一般に、この点に関しては宿主内で核酸分子を維持、増殖もしくは発現する、および／またはポリペプチドを発現するのに適したいかなる系またはベクターも、発現のために用いることができる。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual（上記）に記載のものなどの様々な公知の日常的技術のいずれによっても、適当なDNA配列を発現系に挿入することができる。
ポリペプチドをコードし、細菌、例えばグラム陽性菌、グラム陰性菌、または酵母菌属（Saccharomyces）もしくはピチア属（Pichia）などの単純な真核生物である真菌の細胞、または昆虫、鳥類、哺乳類、もしくは植物などの陰核生物の細胞において複製可能な遺伝子の例示的発現ベクターは当技術分野において公知である。そのようなベクターは、発現のための宿主、例えばストレプトマイセス属（Streptomyces）、ならびに遺伝子操作およびベクター構築のための宿主、例えば大腸菌の両方のための機能的複製規定配列（レプリコン）を有していてもよい。例えば、米国特許第4,745,056号を参照されたい。様々な生物に適したベクターはAusubel, F.ら、Short Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York (1995)に記載されており、例えばピチア属のためのものはInvitrogen（カリフォルニア州カールスバッド）から入手可能である。
有用な発現制御配列には、例えば、SV40の初期および後期プロモーター、アデノウイルスまたはサイトメガロウイルスの前初期プロモーター、lac系、trp系、TACまたはTRC系、発現がT7 RNAポリメラーゼによって支配されているT7プロモーター、ファージラムダの主要オペレーターおよびプロモーター領域、fdコートポリペプチドの制御領域、3-ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の糖分解酵素、酸性ホスファターゼのプロモーター、例えばPho5、酵母交配因子のプロモーター、バキュロウイルス系の多角体プロモーターと、原核もしくは真核細胞またはそれらのウイルスの遺伝子発現を制御することが知られている他の配列、ならびにその様々な組み合わせが含まれる。有用な翻訳エンハンサー配列は米国特許第4,820,639号に記載されている。
一つの態様において、本発明のポリペプチドを発現するために誘導性プロモーターを用いることになる。例えば、一つの態様において、trp（トリプトファンにより誘導）、tac（ラクトースにより誘導）、またはtet（テトラサイクリンにより誘導）を細菌細胞において用いることができ、またはGAL1（ガラクトースにより誘導）を酵母細胞において用いることができる。
もう一つの態様において、本発明のポリペプチドを発現するために構成性プロモーターを用いることができる。
発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択および／または発現が望まれるポリペプチドの種類などの因子に依存しうることが理解されるべきである。適当な宿主の代表的な例には、グラム陽性菌、グラム陰性菌細胞などの細菌細胞；酵母細胞およびアスペルギルス属（Aspergillus）細胞などの真菌細胞；ショウジョウバエ（Drosophila）S2およびスポドプテラ(Spodoplera)Sf9細胞などの昆虫細胞；CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、293およびボーズ黒色腫細胞などの動物細胞；ならびに植物細胞が含まれる。
一つの態様において、本発明の異種ポリペプチドを発現するために用いる細胞は、AraCファミリーポリペプチドもしくはMarAファミリーポリペプチドなどの一つもしくは複数の内在性転写因子を非機能的にするか、または一つもしくは複数の内在性ポリペプチドが発現されない原因となる、突然変異を含む。この様式で遺伝的背景を操作することにより、MarAファミリーメンバーもしくはAraCファミリーメンバーなどの特定の転写因子、または複数の転写因子を調節する化合物のスクリーニングが可能となる。
他の態様において、宿主細胞の他の関連遺伝子において、内在性宿主遺伝子座からの干渉がないように突然変異を生成することもできる。さらにもう一つの態様において、従属栄養体を作製するために染色体遺伝子において突然変異を生成することもできる。
宿主細胞への核酸分子の導入（「形質転換」）は、Davisら、Basic Methods In Molecular Biology, (1986)およびSambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)などの多くの標準的実験マニュアルに記載の方法によって行うことができる。例には、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング (scrape loading)、弾丸導入(ballistic introduction)、および感染が含まれる。
ポリペプチド、例えば組換えにより発現させたポリペプチドの精製は、当技術分野において公知の技術を用いて達成することができる。例えば、ポリペプチドを細胞から分泌される形で発現させる場合、培地を回収することができる。または、ポリペプチドを細胞が保持する形で発現させる場合、宿主細胞を溶解してポリペプチドを放出させることもできる。そのような使用済み培地または細胞溶解物を用いて、ポリペプチドを濃縮し、精製することができる。例えば、培地または細胞溶解物をカラム、例えばポリペプチドに特異的な抗体を結合させたカラムを通過させてもよい。または、そのような抗体は、第一のポリペプチドの精製を容易にするために、（例えばタグとして）第一のポリペプチドに融合した第二のポリペプチドに特異的であってもよい。ポリペプチド精製する他の手段は当技術分野において公知である。
IV. 転写因子の活性を調節する抗菌/抗感染化合物の同定法
一つの態様において、本発明は転写因子（例えば、HTHタンパク質、MarAファミリーポリペプチド、AraCファミリーポリペプチドなど）の活性を調節する試験化合物の同定法であって、転写因子（またはその一部）を発現する細胞を試験化合物と、試験化合物と細胞との相互作用を可能にする条件下で接触させることによる方法を提供する。試験化合物が転写因子の活性を調節する能力は、下記に詳細を示すとおり、様々な方法で調べることができる。本発明を用いて同定した化合物は、例えば微生物が、例えば表面上もしくは宿主内で増殖する、または宿主において感染を引き起こす能力を妨害するために有用である。
アッセイ
一つの態様において、選択的に増殖上不都合または致死的となる選択可能なマーカーの発現をmarAを発現する細胞においてMarA応答配列の直接制御下におく。
一つの態様において、marAはプラスミドによりコードされる。一つの態様において、宿主生物の遺伝的背景を、例えば、一つまたは複数の染色体marA遺伝子またはmarA相同体遺伝子を欠失するよう操作する。
一つの態様において、marAの発現を高度に調節された誘導性プロモーターによって制御する。例えば、一つの態様において、細菌細胞中のtrp、tac、もしくはtet、または酵母細胞中のGAL1からなる群より選択されるプロモーターを用いることができる。
もう一つの態様において、marAの発現は構成性である。
一つの態様において、選択マーカーは細胞毒性の遺伝子産物（例えば、ccdB）である。
もう一つの態様において、選択マーカーは抗生物質耐性を与える遺伝子（例えば、kan、cat、またはbla）である。
もう一つの態様において、選択マーカーは必須遺伝子（例えば、プリンまたはグアニン従属栄養体におけるpurAまたはguaB）である。
さらにもう一つの態様において、選択マーカーは特定の代謝基質存在下で選択的に増殖上不都合となる遺伝子（例えば、酵母における5-フルオロオロチン酸［5-FOA］存在下でのURA3の発現）である。
一つの態様において、転写因子（例えば、HTHタンパク質、AraCファミリーポリペプチド、またはMarAファミリーポリペプチド）を調節する化合物を、ワンハイブリッドスクリーニングアッセイを用いて同定する。本明細書において用いられる「ワンハイブリッドスクリーン」なる用語は、タンパク質-核酸相互作用の破壊を検出するアッセイを含む。これらのアッセイは、転写因子（例えば、HTHタンパク質、AraCファミリーポリペプチド、またはMarAファミリーポリペプチド）の特定の標的、例えばMarAに対してはmarboxを含むDNAへの結合を、標的自体のレベルで、例えば標的に結合して転写活性化因子がこの部位と相互作用または結合することを防ぐことにより、妨害する物質を同定する。
もう一つの態様において、本発明の化合物をツーハイブリッドスクリーニングアッセイを用いて同定する。本明細書において用いられる「ツーハイブリッドスクリーン」なる用語は、タンパク質-タンパク質相互作用の破壊を検出するアッセイを含む。そのようなツーハイブリッドアッセイを用いて、重大なタンパク質-転写因子相互作用（例えば、HTHタンパク質相互作用、AraCファミリーポリペプチド相互作用、MarAファミリーポリペプチド相互作用）を妨害することができる。一例は、MarAファミリーポリペプチドが転写因子として機能する（陽性作用または陰性作用のいずれでも）ために必須のRNAポリメラーゼ-MarAファミリーポリペプチドの接触を防止することである。
さらにもう一つの態様において、本発明の化合物をスリーハイブリッドスクリーニングアッセイを用いて同定する。本明細書において用いられる「スリーハイブリッドスクリーン」なる用語は、興味対象となる特定のレギュロンの活性化に要求されるシグナルトランスダクション経路の破壊を検出するアッセイを含む。一つの態様において、スリーハイブリッドスクリーンを用いて、Marレギュロンの活性化、すなわちMarAの合成に要求されるシグナルトランスダクション経路の破壊を検出する。（LiおよびPark、J. Bact. 181:4824）。アッセイを用いて転写因子発現の活性化を担うと考えられる化合物を同定し、例えば抗生物質によるMar誘導はこの様式で進行すると考えられる。
アッセイの一つの態様において、選択マーカー（例えば、ccdB、cat、bla、kan、guaB、URA3）の発現を活性化可能なMarA応答活性化可能プロモーター（例えば、inaA、galT、micF）の直接制御下におく。MarA非存在下では、選択マーカーの発現はサイレントとなる。例えば、細胞毒性遺伝子ccdBの調節の場合、遺伝子はサイレントとなり、細胞は生存することになる。適当な宿主における誘導性プラスミドからのMarAの合成は、MarA応答活性化可能プロモーターの活性化および選択マーカーの発現を引き起こすことになる。ccdBの場合、遺伝子が発現され、細胞死にいたる。MarAを阻害する化合物を、MarA発現の条件下で細胞を生存させておくものとして同定する。
もう一つの態様において、例えば、MarA応答活性化プロモーターの発現がURA3などの遺伝子を調節する場合、異なる結果が得られると考えられる。この場合、MarA非存在下で、したがってURA3発現の非存在下では、細胞は5-FOA存在下で増殖することになる。MarA発現が活性化され、したがってURA3が合成されることにより、細胞はURA3による5-FOAの毒性代謝物への変換後に死滅することになる。
もう一つの態様において、選択可能なマーカーを抑制可能なMarA応答プロモーター（例えば、fecA）の直接制御下におく。この例において、構成性MarA合成の条件下、例えば構成性mar（marc）突然変異体において、選択可能なマーカーの発現はサイレントとなる。ccdBの場合、これは細胞が生存可能なまま残ることを意味する。MarAの不活化後、選択可能なマーカーが発現され、細胞死を引き起こす。
もう一つの態様において、大腸菌において染色体guaBまたはpurA遺伝子の不活化により、プリンまたはグアニン従属栄養体を構築することができる。次いで、guaBまたはpurA遺伝子をその天然プロモーターの活性化の制御下で適当なベクター中にクローニングする。次いで、この構築物を従属栄養宿主中に転換する。MarA発現が構成性である場合、および細胞をプリンまたはグアニンを含まない培地上で培養する場合、従属栄養体は増殖しない。これは、MarAが媒介するguaBまたはpurA合成の抑制によるものでありうる。MarAの阻害化合物候補は、増殖を回復した、すなわちMarAが媒介するguaBまたはpurA発現の抑制を軽減した化合物として同定することができる。もう一つの態様において、インビボ、例えば感染の動物モデルにおける増殖に必要とされる遺伝子。
好ましい態様において、本アッセイを用いて同定されたいかなる化合物も、タンパク質合成を阻害するため、単に転写因子の活性を調節するように見えるのではないことを確認するために、対照を含めることもできる。例えば、化合物がMarAファミリー応答配列の活性化によって転写されるRNAから翻訳されるタンパク質の合成を阻害するように見える場合、対照、例えばMarAファミリー応答配列の活性化によって転写されないRNAから翻訳されるタンパク質の合成が同じ化合物の添加によって影響されないことを示すことが望ましいと考えられる。例えば、生成されるMarAファミリーポリペプチドの量および生成される内在性タンパク質の量と比較される。もう一つの態様において、微生物を、MarAファミリー応答プロモーターではないプロモーターおよびそのプロモーターに機能的に連結されたタンパク質を含むもう一つのプラスミドで形質転換することができる。対照タンパク質の発現を用いて、化合物存在下および非存在下で産生されたタンパク質の量を正規化することができる。
V. 試験に適した微生物
多くの異なる微生物が、本アッセイにおける試験に適している。したがって、それらを完全な細胞として、または原料、例えば本明細書に記載の核酸分子もしくはポリペプチドとして用いることができる。
好ましい態様において、特許請求された方法において用いるために微生物はグラム陰性菌またはグラム陽性菌の細菌である。特に、抗生物質に対して耐性となることが示されている、例えばMar表現型を示すいかなる細菌も、または感染性もしくは感染性となる可能性があるいかなる細菌も、特許請求された方法において用いるのに好ましい。
試験に適した微生物の例には下記が含まれるが、これらに限定されることはない：緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）、シュードモナス・アシドボランス（Pseudomonas acidovorans）、シュードモナス・アルカリゲネス（Pseudomonas alcaligenes）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）、バークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）、アエロモナス・ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophilia）、大腸菌、シトロバクター・フロインディ（Citrobacter freundii）、ネズミチフス菌、チフス菌（Salmonella typhi）、パラチフス菌（Salmonella paratyphi）、腸炎菌（Salmonella enteritidis）、志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）、フレクスナー赤痢菌（Shigella flexneri）、ソネ赤痢菌（Shigella sonnei）、汚物腸内菌（Enterobacter cloacae）、アエロゲネス腸内菌（Enterobacter aerogenes）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）、霊菌（Serratia marcescens）、野兎病菌（Francisella tularensis）、モルガン菌（（Morganella morganii）、ミラビリス変形菌（Proteus mirabilis）、尋常変形菌（Proteus vulgaris）、プロビデンシア・アルカリファシエンス（Providencia alcalifaciens）、プロビデンシア・レットゲリ（Providencia rettgeri）、プロビデンシア・スチュアルティイ（Providencia stuartii）、アシネトバクター・カルコアセチカス（Acinetobacter calcoaceticus）、アシネトバクター・ヘモリチカス（Acinetobacter haemolyticus）、エルシニア・エンテロコリチカ（Yersinia enterocolitica）、ペスト菌（Yersinia pestis）、偽結核エルシニア菌（Yersinia pseudotuberculosis）、エルシニア・インターメディア（Yersinia intermedia）、百日咳菌（Bordetella pertussis）、パラ百日咳菌（Bordetella parapertussis）、気管支敗血症菌（Bordetella bronchiseptica）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、パラインフルエンザ菌（Haemophilus parainfluenzae）、ヘモフィルス・ヘモリチカス（Haemophilus haemolyticus）、ヘモフィルス・パラヘモリチカス（Haemophilus parahaemolyticus）、ヘモフィルス・デュクレイ（Haemophilus ducreyi）、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）、パスツレラ・ヘモリチカ（Pasteurella haemolytica）、カタル球菌（Branhamella catarrhalis）、ピロリ菌（Helicobacter pylori）、カンピロバクター・フィタス（Campylobacter fetus）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、カンピロバクター・コリ（Campylobacter coli）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、イブリオ・パラヘモリティカス(Yibrio parahaemolyticus)、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）、リステリア菌（Listeria monocytogenes）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、ガードネレラ・バジナリス（Gardnerella vaginalis）、バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）、バクテロイデス・ディスタソニス（Bacteroides distasonis）、バクテロイデス3452A相同群（Bacteroides 3452A homology group）、バクテロイデス・ブルガタス（Bacteroides vulgatus）、バクテロイデス・オバーラス（Bacteroides ovalus）、バクテロイデス・シータイオタオミクロン（Bacteroides thetaiotaomicron）、バクテロイデス・ユニフォルミス（Bacteroides uniformis）、バクテロイデス・エガーシイ（Bacteroides eggerthii）、バクテロイデス・スプランクニクス（Bacteroides splanchnicus）、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、鳥結核菌（Mycobacterium avium）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Mycobacterium intracellulare）、ライ菌（Mycobacterium leprae）、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）、コリネバクテリウム・ウルセランス（Corynebacterium ulcerans）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Streptococcus agalactiae）、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）、スタフィロコッカス・サプロフィチカス（Staphylococcus saprophyticus）、スタフィロコッカス・インタメジウス（Staphylococcus intermedius）、スタフィロコッカス・ヒイカス亜種ヒイカス（Staphylococcus hyicus subsp. hyicus）、スタフィロコッカス・ヘモリチカス（Staphylococcus haemolyticus）、スタフィロコッカス・ホミニス（Staphylococcus hominis）、およびスタフィロコッカス・サッカロリチカス（Staphylococcus saccharolyticus）。
一つの態様において、試験に適した微生物は腸内細菌科の細菌である。好ましい態様において、化合物は下記からなる群より選択される属の細菌に対して有効である：エシェリキア属（Escherichia）、プロテウス属（Proteus）、サルモネラ属（Salmonella）、クレブシエラ属（Klebsiella）、プロビデンシア属（Providencia）、エンテロバクター属（Enterobacter）、バークホルデリア属（Burkholderia）、シュードモナス属（Pseudomonas）、アエロモナス属（Aeromonas）、ヘモフィルス属（Haemophilus）、エルシニア属（Yersinia）、ナイセリア属（Neisseria）、およびマイコバクテリア属（Mycobacteria）。
さらに他の態様において、試験する微生物はグラム陽性菌であり、下記からなる群より選択される属からのものである：乳酸桿菌属（Lactobacillus）、アゾリゾビウム属（Azorhizobium）、ストレプトマイセス属（Streptomyces）、ペジオコックス属（Pediococcus）、発光菌属（Photobacterium）、桿菌属（Bacillus）、腸球菌属（Enterococcus）、ブドウ球菌属（Staphylococcus）、クロストリジウム属（Clostridium）、および連鎖球菌属（Streptococcus）。
他の態様において、試験する微生物は真菌である。好ましい態様において、真菌はケカビ属またはカンジダ属からのもので、例えばムコール・ラクメオサス（Mucor racmeosus）またはカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）である。
さらに他の態様において、試験する微生物は原生動物である。好ましい態様において、微生物はマラリア原虫またはクリプトスポリジウム寄生虫である。
VI. 転写因子調節化合物および試験化合物
本発明の方法で試験する化合物は、様々な異なる供給源から得ることができ、公知であっても新規であってもよい。一つの態様において、本発明の方法で化合物のライブラリを試験して、転写活性化因子調節化合物、例えば、HTHタンパク質調節化合物、AraCファミリーポリペプチド調節化合物、MarAファミリーポリペプチド調節化合物などを同定する。もう一つの態様において、本発明の方法で公知の化合物を試験して、転写因子調節化合物（例えば、HTHタンパク質調節化合物、AraCファミリーポリペプチド調節化合物、MarAファミリーポリペプチド調節化合物など）を同定する。一つの態様において、環境保護局により一般に安全と見なされる（GRAS）化合物のリスト中の化合物を本発明の方法で試験する。もう一つの態様において、調節化合物によって調節される転写因子は原核微生物のものである。
医薬品化学における最近の傾向は、ライブラリと呼ばれる化合物の混合物の製造を含む。ペプチドのライブラリの使用は当技術分野において十分確立されているが、ベンゾジアゼピン（Buninら、1992. J. Am. Chem. Soc. 114:10987；DeWittら、1993. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909）、ペプトイド（Zuckermann、1994. J. Med. Chem. 37:2678）、オリゴカーバメート（Choら、1993. Science. 261:1303）、およびヒダントイン（DeWittら、上記）などの他の化合物混合物の製造を可能にする新しい医術が開発されている。Rebekらは104〜105の多様な有機小分子の分子ライブラリ合成のためのアプローチを記載している（Carellら、1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059；Carellら、Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1994. 33:2061）。
本発明の化合物は、下記を含む当技術分野において公知のコンビナトリアルライブラリ法における多数のアプローチのいずれを用いても得ることができる：生物学的ライブラリ；空間的に位置づけ可能な（spatially addressable）平行固相または液相ライブラリ、逆重畳積分を必要とする合成ライブラリ法、「1ビーズ1化合物」ライブラリ法、およびアフィニティクロマトグラフィ選択を用いた合成ライブラリ法。生物学的ライブラリアプローチはペプチドライブラリに限定されるが、他の4つのアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマー、または小分子の化合物ライブラリに適用可能である（Lam, K.S. Anticancer Drug Des. 1997. 12:145）。
活性についてスクリーニングすることができる例示的化合物には、ペプチド、核酸、炭水化物、有機小分子、および天然物抽出物ライブラリが含まれるが、これらに限定されることはない。一つの態様において、試験化合物はペプチドまたはペプチド様物質である。もう一つの好ましい態様において、化合物は小さい有機非ペプチド化合物である。
分子ライブラリ合成の他の例示的方法は当技術分野において、例えば、Erbら、1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422；Horwellら、1996 Immunopharmacology 33:68；およびGallopら、1994. J. Med. Chem. 37:1233に見いだすことができる。
化合物のライブラリは溶液中（例えば、Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421）、またはビーズ上（Lam (1991) Nature 354:82-84）、チップ上（Fodor (1993) Nature 364:555-556）、細菌上（Ladner、米国特許第5,223,409号）、胞子上（Ladner、米国特許第'409号）、プラスミド上（Cullら、(1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869）もしくはファージ上（ScottおよびSmith (1990) Science 249:386-390）；（Devlin (1990) Science 249:404-406）；（Cwirlaら、(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382）；（Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310）；（Ladner、上記）にあってもよい。他の種類のペプチドライブラリも示すことができ、例えば、米国特許第5,270,181号および第5,292,646号を参照されたい。さらにもう一つの態様において、コンビナトリアルポリペプチドをDNAライブラリから製造することもできる。
他の態様において、化合物は核酸分子でありうる。好ましい態様において、試験のための核酸分子は小さいオリゴヌクレオチドである。そのようなオリゴヌクレオチドは無作為に生成されたオリゴヌクレオチドライブラリであってもよく、または転写因子、例えばHTHタンパク質、MarAファミリーポリペプチド、もしくはAraCファミリーポリペプチドの活性を低下させるよう特に設計されていてもよい。例えば、一つの態様において、これらのオリゴヌクレオチドはセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。一つの態様において、試験のためのオリゴヌクレオチドは特定の転写因子、例えばMarAファミリーポリペプチドヘリックス・ターン・ヘリックスドメインの結合部位に対してセンスである。MarAファミリーポリペプチドなどの特定の転写因子ポリペプチドの配列を与えられて、そのようなオリゴヌクレオチドを設計する方法は、当技術分野の範囲内である。
さらにもう一つの態様において、コンピュータープログラムを用いて、転写因子活性、例えばHTHタンパク質、AraCファミリーポリペプチド、またはMarAファミリーポリペプチド活性を調節する確率が高い個々の化合物または化合物群を同定することができる。そのようなプログラムは、選択した転写因子と適当な分子的および化学的相補性を有する化合物をスクリーニングすることができる。この様式で、前述のアッセイにおける転写因子調節化合物のスクリーニングの有効性を高めることができる。
VII. 転写因子調節化合物を同定するためのコンピューターモデリング技術
本発明は、一つまたは複数の転写因子（例えば、原核または真核生物のもの）と結合または相互作用可能な、転写因子調節化合物、例えばHTHタンパク質調節化合物、AraCファミリー調節化合物、MarAファミリー調節化合物、またはMarA調節化合物を設計するための分子設計技術の使用にも関する。本発明は、この方法によって同定された転写因子調節化合物ならびにモデリング法の両方、およびこの方法によって同定された化合物を含む組成物に関する。
一つの態様において、本発明は転写因子調節化合物の同定法に関する。この方法は、興味対象となる転写因子の構造を得ること、およびGLIDEを用いて転写因子の一部との相互作用エネルギースコアが-20以下（例えば-40以下、例えば-60以下）の骨格を同定することを含む。
本発明は、少なくとも部分的には、HTHタンパク質、AraCファミリーポリペプチド、MarAファミリーポリペプチド、例えばMarAなどの転写因子に全体で、または部分的に結合することができる化学的実体または化合物の小分子データベースのコンピューターによるスクリーニングに関する。このスクリーニングにおいて、そのような実体または化合物の結合部位への適合の質は、形状の相補性、または推定相互作用エネルギーのいずれかによって判断することができる（Meng, E. C.ら、1992, J. Coma. Chem., 13:505-524）。そのような方法により、転写因子調節化合物の可能性がある非常に大きなライブラリを、選択したタンパク質またはタンパク質群との適当な分子的および化学的相補性についてスクリーニングすることが可能となる。コンピュータースクリーニングを通じて同定された転写因子調節化合物を後に、さらなるスクリーニングとして本明細書に記載のインビボアッセイにかけることもできる。例えば、コンピュータースクリーニングにより同定されたMarA阻害化合物を、MarA活性化プロモーターの制御下で対抗選択可能なマーカーを含む細胞系における細胞の生存を促進する能力について試験することができると考えられる。前述のアッセイにおける細胞生存の促進は、転写アクチベーターとしてMarAの活性を阻害する化合物の指標となる。他の適当なアッセイは実施例中および本明細書を通じて記載される。
MarA（PDB IDコード1BL0）およびその相同体Rob（PDB IDコード1DY5）両方の結晶構造はタンパク質データバンク（http://www.rcsb.org/pdb/）から入手可能である。これらの構造を用いて、小分子化学的阻害化合物によって標的とされうるタンパク質上の部位を同定した。小分子が結合する可能性のある部位として、合計で少なくともMarA上に8つの小分子結合部位（表2）およびRob上に4つの部位（表3）が同定された。本発明は、少なくとも部分的には、下記のMarAの部位のいずれか一つと相互作用するMarA調節化合物に関する（配列番号：2に示す配列に基づく）。
（表２）
Figure 0004933730
次いで、GLIDEドッキング法を用いてコンビナトリアルケミストリ骨格をこれらの部位に適合させ、それぞれについて相互作用エネルギーを計算した。8つの骨格が、トリプトファン42からリシン50までのアミノ酸を含む部位1に結合し、その相互作用エネルギースコアは-60以下であると推定された。これらの骨格を以下に示す：
Figure 0004933730
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3つの骨格がMarAの部位2（例えば、ヒスチジン54からセリン62までの残基）に対して同定された。
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4つの骨格がMarAの部位3（例えば、セリン55からメチオニン65までの残基）に対して同定された。
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6つの骨格が部位6（例えば、ロイシン24からグルタミン酸35までの残基）に対して同定された。
Figure 0004933730
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次いで、これらの骨格を用いて、600,000を越える非所有化学構造のCambridgeSoft ACX-SCデータベースを検索し、この骨格に類似の化学物質の数を求めた。
「骨格」なる用語は、コンピューターモデリングプログラムによって同定された化合物を含む。これらの化合物はそれ自体が転写因子調節化合物であってもよく、そうでなくてもよい。当業者であれば、コンピューターモデリングプログラムから得た骨格を分析し、生じる化合物が最初の骨格化合物よりも高い化学的性質を有する、例えば、投与に際して安定性が高く、毒性が低く、特定の転写因子に対する親和性が高くなるように、骨格を修飾することができると思われる。本発明は、同定された骨格のみならず、骨格を用いて開発された転写因子調節化合物にも関する。
表3に、調節化合物に対して相互作用する可能性がある部位として同定されたRobの部分を示す。本発明は、少なくとも部分的には、Robのこれらの領域に結合するよう設計されたいかなる化合物にも関する。番号は配列番号：4に記載のものに対応している。
（表３）
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これらの骨格が、MarAファミリーポリペプチドであるRobの部位1（残基37〜45）との調節化合物となる可能性があるとして同定された。
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これらの骨格が、MarAファミリーポリペプチドであるRobの部位2（残基43〜52）と相互作用しうる小分子として同定された。
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転写因子に結合する、これらを調節する、または阻害する化合物の設計は一般に二つの考察を含む。第一に、化合物は物理的および構造的に特定の転写因子と結合することが可能でなければならない。転写因子と調節化合物との結合において重要な非共有分子相互作用には、水素結合、ファンデルワールスおよび疎水相互作用が含まれる。
第二に、調節化合物は選択された転写因子との結合を可能にする立体配座をとることができなければならない。阻害化合物の特定の部分は、この転写因子との結合に直接関与しないことになるが、それらの部分はなお分子の全体の配座に影響すると考えられる。その結果、これは効力に重大な影響をおよぼす可能性がある。そのような立体配座の条件には、MarAなどの特定の転写因子の結合部位全体または一部、例えば活性部位または補助的結合部位、または特定の転写因子と直接相互作用するいくつかの化学的実体を含む化合物の官能基間の間隔に関して、化学的実体または化合物の全体の三次元構造および配向が含まれる。
さらなる態様において、選択された転写因子（例えば、HTHタンパク質、AraCファミリーポリペプチド、MarAファミリーポリペプチド、例えばMarA）に対して化学化合物が有する可能性がある調節効果を、その実際の合成およびコンピューターモデリング技術を用いての試験前に分析する。所与の化合物の理論的構造から、その化合物と選択された転写因子との間の相互作用および結合が不充分であると示唆される場合、化合物の合成および試験を回避する。しかし、コンピューターモデリングにより強い相互作用が示されれば、分子を合成し、選択された転写因子に結合し、転写因子の活性を調節する能力について試験することができる。
化学的実体または断片が転写因子の個々の小分子結合部位または他の領域と結合する能力をコンピューターによりスクリーニングし、選択することによって、転写因子調節化合物または他の結合化合物（例えば、HTHタンパク質調節化合物、AraCファミリーポリペプチド調節化合物、またはMarAファミリー阻害化合物、例えばMarA阻害化合物）を評価し、設計することができる。
当業者であれば、化学的実体または断片が選択された転写因子、特に特定の転写活性化因子の個々の小分子結合部位と結合する能力をスクリーニングするために、いくつかの方法を用いることができる。この方法は、コンピューターのスクリーン上で転写因子の結晶の原子配位に基づき転写因子の構造を目視検査することによって始めることができる。次いで、選択された化学的実体を転写因子の個々の結合部位内で様々な配向で置く、すなわちドッキングする。ドッキングはQuantaおよびSybylなどのソフトウェアを用いて実施することができ、続いてCHARMS（Brooks, B. R.ら、1983, J. Comp. Chem., 4:187-217）またはAMBER（Weiner, S. J.ら、1984, J. Am. Chem. Soc., 106:765-784）などのプログラムを用いて標準の分子力学または動力学によるエネルギー最小化を行う。
特殊コンピュータープログラムにより、選択された転写因子（例えば、HTHタンパク質、AraCファミリーポリペプチド、またはMarAファミリーポリペプチド、例えばMarA）に結合する分子選択法を補助することもできる。プログラムには下記が含まれるが、これらに限定されることはない：
1. GRID (Goodford, P. J., 1985、「A Computational Procedure for Determining Energetically Favorable Binding Sites on Biologically Important Macromolecules」J. Med. Chem., 28:849-857。GRIDは英国オックスフォードのオックスフォード大学から入手可能である。
2. AUTODOCK (Goodsell, D. S. and A. J. Olsen, 1990、「Automated Docking of Substrates to Proteins by Simulated Annealing」Proteins: Structure. Function, and Genetics, 8:195-202。AUTODOCKはカリフォルニア州ラホイヤのScripps Research Instituteから入手可能である。AUTODOCKは阻害化合物を選択された転写因子に、Monte Carlo擬似アニーリングアプローチを用いたフレキシブルな様式でドッキングする際の助けとなる。この方法により、研究者による偏りのない探索が可能になる。
3. MCSS（Miranker, A.およびM. Karplus, 1991、「Functionality Maps of Binding Sites: A Multiple Copy Simultaneous Search Method」Proteins: Structure, Function and Genetics, 11:29-34）。MCSSはマサチューセッツ州バーリントンのMolecular Simulationsから入手可能である。
4. MACCS-3D（Martin, Y. C., 1992, J. Med. Chem., 35:2145-2154）は3Dデータベースシステムで、カリフォルニア州サンレアンドロのMDL Information Systemsから入手可能である。
5. DOCK（Kuntz, I. D.ら、1982、「A Geometric Approach to Macromolecule-Ligand Interactions」J. Mol. Biol., 161:269-288）。DOCKはカリフォルニア州サンフランシスコのカリフォルニア大学から入手可能である。DOCKは、阻害化合物によって充填されるべきである分子（すなわち選択された転写因子）の空間充填表示のネガティブ画像の記述に基づいている。DOCKはエネルギー評価のための力場、限定された配座のフレキシビリティおよびエネルギー評価における疎水性の考察を含む。
6. MCDLNG（Monte Carlo De Novo Ligand Generator）（D. K. Gehlhaarら、1995. J. Med. Chem. 38:466-472）。MCDLNGは構造（すなわち、X線結晶構造）によって開始し、結合部位を密に充填されたジェネリック原子のアレイでふさぐ。次いで、モンテカルロ法を用いて無作為に回転させる、動かす、結合タイプを変更する、原子タイプを変更する、原子を出現させる、結合を出現させる、原子を消失させる、結合を消失させるなどする。MCDLNGが用いるエネルギー関数は環形成および特定の結合配置に有利である。脱溶媒和ペナルティをヘテロ原子に与えるが、ヘテロ原子は結合部位との水素結合から恩恵を受けることもある。
本発明の一つの態様において、InsightII（Molecular Simulations Inc., 1996、カリフォルニア州サンディエゴ、現在のAccelrys Inc.）内のAffinityプログラムを用いることによってドッキングを実施する。Affinityはリガンド（すなわち、転写因子調節化合物）をレセプター（すなわち、転写因子）に自動的にドッキングするための一組のプログラムである。Affinityのコマンドはリガンド/レセプター複合体のエネルギーに基づき、リガンドのレセプターに対する最良の結合構造を見つけ出す。下記に記載するとおり、Affinityはフレキシブル-フレキシブルドッキングのシミュレーションを可能にする。
Affinityは、Insight IIプログラムのDockingモジュールにおける新しいプルダウンAffinityの下の二つのコマンド、GridDockingおよびfixedDockingからなる。コマンドはいずれも、ゲスト分子（すなわち、HTHタンパク質調節化合物）をホスト（すなわち、転写因子）にドッキングするために、同じモンテカルロ型の方法を用いる。これらは、規定の結合（活性）部位にない原子と定義されるレセプター（すなわち、転写因子）の「大部分」はドッキング過程の間は固定されるが、結合部位の原子およびリガンド原子は可動性であるという共通の特徴を有する。しかし、これらのコマンドは、非結合相互作用の処理において異なる。GridDockingでは、大部分の原子と可動性原子との間の相互作用は、Lutyら、1995. J. Comp. Chem. 16:454によって開発された非常に正確で効率的な分子力学/グリッド（MM/Grid）法によって近似させるが、可動性原子間の相互作用は正確に処理する。GridDockingはStoutonら、1993. Molecular Simulation 10:97の溶媒和法も含む。一方、fixedDockingコマンドは、Discoverプログラムの方法（カットオフ法および細胞多重極法）を用いて非結合相互作用を計算し、溶媒和項はまったく含まない。
Affinityは一般に、ドッキング中にユーザーのいかなる介入も必要としない。これは自動的にリガンド（すなわち、調節化合物）を動かし、エネルギーを評価し、構造が許容されるかどうかをチェックする。さらに、探索中、リガンドおよびレセプターの結合部位（すなわち、選択された転写調節物質）はフレキシブルである。
文献中のほとんどのドッキング法は記述子または経験則に基づいている（総説については、Kuntzら、1994. Acc. Chem. Res. 27:117を参照されたい。いくつかの例を挙げると、これらはDOCK（Kuntzら、1982. J. Mol. Biol. 161:269、Shoichetら、1992. J. Compt. Chem. 13:380、Oshiroら、1995. J. Comp. Aided Molec. Design 9:113）、CAVEAT（Bartlettら、1989. 「Chemical and Biological Problems in Molecular Recognition」Royal Society of Chemistry: Cambridge, pp. 182-196、Lauri & Bartlett. 1994. J. Comput. Aided Mol. Design 8:51）、FLOG（Millerら、1994. J. Comp. Aided Molec. Design 8:153）、およびPRO_LIGAND（Clarkら、1995. J. Comp. Aided Molec. Design 9:13）を含む。Affinityはこれらの方法とはいくつかの面で異なる。
第一に、Affinityはドッキングした構造を探索し、評価する際に完全な分子力学を用いる。これに対して記述子による方法は、通常は水素結合、疎水性相互作用、および立体効果だけを考慮に入れる経験則を用いる。この単純化されたリガンド/レセプター相互作用の記述は不充分である場合もある。例えば、Mengら、1992. J. Compt. Chem. 13:505はDOCKにより生成されたドッキング構造の評価において三つのスコアリング法を試験した。これにより、分子力学からの力場スコアだけが実験的結合幾何学に最も近い構造を正しく同定するが、立体因子または静電因子だけを考慮するスコアリング関数はあまり良好でないことが明らかとなった。Mengら、1992. J. Compt. Chem. 13:505による試験において、ドッキングはなお記述子を用いて行われていたことに留意されたい。一方、Affinityはドッキングとスコアリングのいずれにおいても分子力学を用い、したがってより一貫性がある。
第二に、Affinityでは、レセプターの大部分は固定されているが、定義された結合部位は自由に動き、それによりレセプターを異なるリガンドまたは同じリガンドの異なる結合様式の結合に適合させる。これに対して、記述子による方法はほとんどすべて、レセプター全体を固定する。
第三に、Affinityではリガンド自体はフレキシブルで、異なる配座のリガンド（すなわち、転写因子調節化合物）のレセプター（すなわち、転写因子）へのドッキングを可能にする。最近になって、Oshiroら（1995 J. Comp. Aided Molec. Design 9;113）はDOCKを拡張してフレキシブルなリガンドを扱えるようにした。FLOGも、各構造の異なる配座をデータベースに含めることにより、フレキシブルなリガンドを扱うことができる（Millerら、1995. J. Comp. Aided Molec. Design. 8:153）。他の方法はほとんどが固定されたリガンドに限られている。
少数のエネルギーに基づくドッキング法もある（Kuntzら、1994. Acc. Chem Res. 27:117）。これらの方法は、分子力学（特に擬似アニーリング）またはモンテカルロ法のいずれかを用いる。例えば、Caflischら、1992. Proteins: Struct. Funct. and Genetics 13:223）はフレキシブルリガンドをドッキングするための二段階法を開発した。この方法では、リガンドとレセプターとの間の不良の接触を効率的に除去するために設計された特定のエネルギー関数を用いて、リガンドをまずドッキングする。次いで、分子力学を用いてドッキングした構造をリファインするために、モンテカルロ最小化（Li & Scheraga. 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:6611）を行う。HartおよびRead、1992. Proteins: Struct. Funct. and Genetics 13:206もリガンドをドッキングするために二段階を用いている。彼らは、第一段階でレセプター幾何学に基づくスコア関数を用いてリガンドをほぼドッキングし、次いで第二段階でCaflischら、1992. Proteins: Struct. Funct. and Genetics 13:223のものに類似のモンテカルロ最小化を用いている。Mizutaniら（1994. J. Mol. Biol. 243:310）の方法は、この二段階法のもう一つの変法である。
Affinityはリガンドのドッキングにモンテカルロ法を用いるが、先行技術の方法とは重要な差異がある。第一に、Affinityにおいてモンテカルロ法はエネルギー最小化（Li & Scheraga. 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:6611のモンテカルロ最小化法を模倣するため）または分子力学（ハイブリッドモンテカルロ法、Clampら、1994. J. Comput. Chem. 15:838、またはスマートモンテカルロ法、Senderowitzら、1995. J. Am. Chem. Soc. 117:8211を模倣するため）のいずれかと共に用いることができる。この柔軟性により、Affinityを様々なドッキング問題に適用することができる。第二に、ドッキングした構造の初期スクリーニングにおいて、Affinityは分子力学から得られたエネルギーの差を用いるが、前述の方法は経験則または記述子を用いる。したがって、Affinityは、ドッキングした構造の初期スクリーニングと最終リファインメントの両方で分子力学を用いるため、より一貫性がある。第三に、Affinityはレセプターの結合部位を弛緩させるが、前述の方法はレセプター全体を固定する。第四に、Affinityは二つの新しい非結合技術を用いており、これらはいずれも正確で、ドッキングを実用的とするために有効である。一つはLutyらのGrid/MM法で、グリッドによってレセプターの大部分を表す（Lutyら、1995. J. Comp. Chem. 16:454）。この方法は正確さをほとんど失うことなく、非カットオフ法よりも10〜20倍速い。この方法はStoutenら（1993. Molecular Simulation 10:97）の溶媒和法も組み込んでいる。もう一つは細胞多重極法である。この方法はGrid/MM法よりも約50％遅いが、グリッドを設定する必要がない。したがって、典型的なドッキングの計算はIndigo R4400ワークステーション上で約1〜3時間のCPU時間を要する。
いったん適当な化学断片を選択すれば、それらを単一の化合物または阻害化合物にアセンブリすることができる。アセンブリはコンピュータースクリーンの三次元画像表示上で、特定の転写因子、例えばMarAの構造座標に対して断片相互の関係を目視検査することにより進めることができる。この後、QuantaまたはSybylなどのソフトウェアを用いて手動によるモデル構築を行ってもよい。
個々の化学断片を連結する際に当業者の助けとなる有用なプログラムには下記が含まれる：
1. MACCS-3D（カリフォルニア州レアンドロのMDL Information Systems。この分野はMartin, Y. C.、1992、「3D Database Searching in Drug Design」、J. Med. Chem., 35, pp. 2145-2154に総説が記載されている）などの3Dデータベースシステム。
2. CAVEAT（Molecular Recognition in Chemical and Biological Problems」、Special Pub., Royal Chem. Soc., 78, pp. 182-196のBartlett, P. A.ら、1989、「CAVEAT: A Program to Facilitate the Structure-Derived Design of Biologically Active Molecules」）。CAVEATはカリフォルニア州バークレーのカリフォルニア大学から入手可能である。CAVEATは所望の結合ベクターに基づきMarAに対する阻害化合物を示唆する。
3. HOOK（マサチューセッツ州バーリントンのMolecular Simulationsから入手可能である）。HOOKは同時探索において官能基の複数のコピーを用いることによりドッキング部位を提示する。
もう一つの態様において、転写因子調節化合物を、空の活性部位を用いるか、または既知の阻害化合物のいくつかの部分を選択的に含めて、全体として、または「新たに」設計することができる。これらの方法には下記が含まれる：
1. LUDI（Bohm, H.-J.、「The Computer Program LUDI: A New Method for the De Novo Design of Enzyme Inhibiting compounds」、J. ComR. Aid. Molec. Design, 6, pp. 61-78 (1992)）。LUDIはカリフォルニア州サンディエゴのBiosym Technologiesから入手可能である。LUDIは記述子ではなく断片に基づくプログラムである。LUDIは高分子の相互作用部位に適合する幾分大きい断片を提示し、Cambridge Structural Database（CSD）、Protein Data Bank（PDB）からの幾何学的基準および結合データに基づく基準に基づいてそのヒットを評価する。LUDIはライブラリに基づき断片を結合部位にドッキングする方法である。断片を4方向の相互作用部位（親油性-脂肪族、親油性-芳香族、水素供与体、および水素受容体）で整列化し、その重なりの程度について評価する。次いで、断片を連結する（すなわち、適当な長さのリンカーを断片の各末端原子に結合する）。配座のフレキシビリティは、ライブラリ中の特定の断片の複数の配座を含めることによってのみ説明することができる。
2. LEGEND（Nishibata, Y.およびA. Itai、Tetrahedron, 47, p. 8985 (1991)）。LEGENDはマサチューセッツ州バーリントンのMolecular Simulationsから入手可能である。
3. CoMFA（Conformational Molecular Field Analysis）（J. J. Kaminski. 1994. Adv. Drug Delivery Reviews 14:331-337）。CoMFAは疎水性領域、立体化学、および静電学などの特性を表すために、三次元分子形状記述子を決定する。次いで、データベースからの化合物を3Dファルマコフォアモデルに重ね、その重なりの程度について評価する。探索する小分子データベースには、ACD（1,000,000を越える化合物）、Maybridge（約500,000の化合物）、NCI（約500,000の化合物）、およびCCSDが含まれる。適合の良好性の評価において、分子を3D分子形状記述子または既知の阻害化合物の活性配座に合わせることができる。
4. LeapFrog（ミズーリ州セントルイスのTripos Associatesから入手可能である）。
FlexX（（著作権）1993-2002 GMD German National Research Center for Information Technology; Rarey, M.ら、J. Mol. Biol., 261:407-489）は、リガンドを転写因子の活性部位に配置するための漸増構築アルゴリズムを用いる迅速でフレキシブルなドッキング法である。活性部位に「適合」可能なリガンド（例えば、転写因子調節化合物）を利用可能な任意の数のスコアリング法に従って評価し、活性部位とリガンドとの間の相補性の質を調べる。
他の分子モデリング技術も本発明に従って用いることができる。例えば、Cohen, N. C.ら、「Molecular Modeling Software and Methods for Medicinal Chemistry, J. Med. Chem., 33, pp. 883-894 (1990)を参照されたい。またNavia, M. A.およびM. A. Murcko「The Use of Structural Information in Drug Design」、Current Opinions in Structural Biology, 2, pp. 202-210 (1992)も参照されたい。
転写因子調節化合物候補をその調節、例えば阻害活性について、通常の技術を用いて評価することができ、これらの技術は所与の部分の位置および結合近接性、結合した阻害化合物の占有空間、所与の化合物の結合の変形エネルギーおよび静電相互作用エネルギーを調べることを含むと考えられる。前述の評価において有用な従来の技術には、量子力学、分子動力学、モンテカルロサンプリング、系統的探索および距離幾何学法が含まれるが、これらに限定されることはない（Marshall, G. R., 1987, Ann. Ref. Pharmacol. Toxicol., 27:193）。そのような用途のためのコンピュータープログラムの例には、Gaussian 92、改訂E2（ペンシルバニア州ピッツバーグのGaussian, Inc.）、AMBER version 4.0（サンフランシスコのカリフォルニア大学）、QUANTA/CHARMM（マサチューセッツ州バーリントンのMolecular Simulations, Inc.）、およびInsight II/Discover（カリフォルニア州サンディエゴのBiosym Technologies Inc.）が含まれるが、これらに限定されることはない。これらのプログラムは、例えば、Silicon Graphics Indigo2ワークステーションまたはIBM RISC/6000ワークステーションモデル550を用いて実行することができる。他のハードウェアシステムおよびソフトウェアパッケージは当業者には公知で、適用性は明らかであると思われる。
前述の方法でいったん化合物を設計および選択すれば、その化合物が特定の転写因子に結合する効率をコンピューター評価により試験し、最適化することができる。有効な転写因子調節化合物は、その結合状態と遊離状態との間でエネルギー差が比較的小さい（すなわち、結合の変形エネルギーが小さい）ものでなければならない。転写因子調節化合物は選択された転写因子と、全体の結合エネルギーが類似している複数の配座で相互作用することができる。その場合、結合の変形エネルギーは、遊離化合物のエネルギーと阻害化合物が酵素に結合した時に観察される配座の平均エネルギーとの間の差と考えることができる。
選択された転写因子、例えばMarAファミリーポリペプチド、例えばMarAと相互作用するように設計または選択された化合物を、その結合状態で好ましくは標的酵素と反発する静電相互作用をしないように、さらにコンピューターにより最適化することもできる。そのような非相補的（例えば、静電）相互作用には、反発する電荷-電荷、双極子-双極子、および電荷-双極子相互作用が含まれる。特に、調節化合物が選択された転写因子に結合している場合、調節化合物と酵素との間のすべての静電相互作用の合計は好ましくは結合エンタルピーに中立の、または有利な寄与をする。
化合物変形エネルギーおよび静電相互作用を評価するために特定のコンピューターソフトウェアが当技術分野において入手可能である。そのような用途のために設計されたプログラムの例には下記が含まれる：Gaussian 92、改訂C［M. J. Frisch、Gaussian, Inc.、ペンシルバニア州ピッツバーグ（著作権）1992］；AMBER, version 4.0［P. A. Kollman、サンフランシスコのカリフォルニア大学（著作権）1994］；QUANTA/CHARMM［Molecular Simulations, Inc.、マサチューセッツ州バーリントン（著作権）1994］；およびInsight II/Discover（Biosysm Technologies Inc.、カリフォルニア州サンディエゴ（著作権）1994）。これらのプログラムは、例えば、Silicon Graphicsワークステーション、IRIS 4D/35またはIBM RISC/6000ワークステーションモデル550を用いて実行することができる。他のハードウェアシステムおよびソフトウェアパッケージは当業者には公知である。
前述のとおり、いったん転写因子調節化合物を最適に選択または設計すれば、その結合特性を改善または改変するために、その原子または側鎖のいくつかで置換を行ってもよい。最初の置換は好ましくは保存的である、すなわち置換基は元の基とほぼ同じサイズ、形状、疎水性、および電荷を有することになる。配座を変えるための当技術分野において公知の置換は避けるべきである。次いで、そのような置換化合物を、前述と同じコンピューター法により、選択された転写因子への適合効率について解析することができる。
化合物のファンデルワールス表面と結合部位の残基によって規定される表面との間の非占有（水性）空間を同定するために、コンピュータープログラムを用いることができる。原子-原子接触におけるこれらのギャップは、リード化合物を改変したものの新しい官能基によって占有されうる容積を表している。そのような変化の全体のエネルギーが有利であれば、結合部位の非占有空間をより効率的に利用することで、より強い化合物が得られると考えられる。共有結合した炭素原子と同等またはそれより大きい基の体積に合わせるのに十分大きい非占有容積を有する結合ポケットの領域を、官能基置換のための有望な位置として同定することができる。この領域での官能基置換は、酸素などの炭素原子以外の何かの置換を構成することができる。体積が炭素原子よりも大きい基に合わせるのに十分大きい場合、この領域のタンパク質残基と相互作用する見込みが大きい、異なる官能基を選択してもよい。タンパク質残基との相互作用および有望な置換の同定に寄与する特徴には、疎水性、サイズ、剛性および極性が含まれる。ドッキング、Ki推定、および改善のために立体的に許される余地の視覚的表現の組み合わせによって、強力な誘導体の予測が可能となる。
類似性スクリーニング
いったん転写因子調節化合物を選択または設計すれば、他の分子に対する全体の同様または類似性を評価するためのコンピューターによる方法を用いて、類似の生化学的挙動を有する追加の化合物を探索することができる。そのような方法において、例えば、HTS由来のヒットを試験して、それらが特定の活性部位に対する真のリガンドであることを確認し、特定のヒットがスクリーニング法のアーチファクトである可能性を排除することができる。現在、化合物の仮想データベースのメンバーに対する特定の化合物の類似性を調べるためのいくつかの方法およびアプローチがある。一つの例は、Triposパッケージ、SYBYL（（著作権）1991-2002 Tripos, Inc.、ミズーリ州セントルイス）において配布されているOPTISIM法である。OPTISIMは、それぞれの分子の三次元表示を2次元の断片群に分解し、あらかじめ定義されたバイナリ列にコードすることができるという事実を利用している。結果として、特定の組の各化合物は、分類および比較などの数学的操作に適用できる特有の数字コードまたはフィンガープリントによって表されることになる。OPTISIMは、例えばTanimoto係数として知られている形式を用いて差のパーセントを自動で計算し、報告する。例えば、他の化合物に構造が類似している化合物は高い係数を共有することになる。市販の化合物または仮定的化合物の大きい仮想データベースを迅速にスクリーニングして、高いTanimoto係数を有する化合物を同定することができる。
CoMFA/QSAR
いったん前述の方法によって一連の類似の転写因子調節化合物を同定し、拡大すれば、実験的に調べたそれらの生物学的活性をいくつかの入手可能な統計パッケージを用いてそれらの構造的特徴と相関させることができる。産業上の典型的プロジェクトにおいて、プログラムのSYLBYLスート（Tripos Associates、ミズーリ州セントルイス）内のCoMFA（Comparative Molecular Field Analysis）およびQSAR（Quantitative Structure Activity Relationship）パッケージを用いる。CoMFAでは、活性測定された特定の化合物群が、それらが活性部位と相互作用するとその配置をエミュレートすると考えられる様式で共に整列化される。次いで、三次元格子またはグリッドを構築して、そのように整列化された化合物の集まりを含める。格子の各点で、ポテンシャルエネルギーの評価を行い、作表する-典型的には、電場および立体場を模倣するポテンシャルを求めるが、他のポテンシャル関数も利用可能である。PLS（Partial Least Squares）などの統計学的方法を用いて、グリッド点の測定した活性とポテンシャルエネルギー値との間の相関を求め、一次方程式に合計して、全体の分子相関またはQSARモデルを生成することができる。CoMFAの特に有用な特徴は、各グリッド点に対する個々の寄与がわかることである。すなわち、全体の相関におけるグリッド点の重要性をCoMFA場と呼ばれるグラフに視覚化することができる。この場を元の化合物整列化と組み合わせると、モデルが誘導される個々の化合物の活性を有理化し、基準化合物の化学修飾がどのように引き起こされるかを予測する、強力なツールとなる。一例として、前述の方法を用いて92のベンゾジアゼピン群についてQSARモデルを作製した。代表的CoMFA場を図4に示す。網目で示している領域（基準トリアジノキシアゼピンに隣接の）は、立体的かさの増大によって特徴づけられる化学修飾が転写因子調節における有利な効果を引き出す領域である。
本発明は本質的に、転写因子調節化合物の同定法のみならず、本発明の方法によって同定された化合物ならびに同定された化合物の使用法にも関する。
VIII. MarAファミリー調節化合物、およびその使用法
一つの態様において、本発明は転写因子、例えばHTHタンパク質、AraCファミリーポリペプチド、またはMarAファミリーポリペプチドを調節する方法に関する。この方法は、転写因子、例えばMarAファミリーポリペプチドを式（I）の転写因子調節化合物：
Figure 0004933730
 （式中、Aは極性部分であり、Eは疎水性部分である）、およびその薬学的に許容される塩と接触させる段階を含む。転写因子調節化合物、例えばMarAファミリー調節化合物は、一つまたは複数の極性部分および／または一つまたは複数の疎水性部分を含みうる。
もう一つの態様において、本発明は微生物細胞の抗生物質耐性を低下させる方法に関する。この方法は、細胞を転写因子調節化合物、例えばMarAファミリー調節化合物に、細胞の抗生物質耐性が低下するように接触させる段階を含む。
もう一つの態様において、本発明は転写因子を転写因子調節化合物に、転写が阻害されるように接触させる段階を含む、転写を阻害することに関する。さらなる態様において、原核細胞の転写が阻害される。もう一つのさらなる態様において、転写因子調節化合物は式（1）〜（X）のいずれか一つの化合物である。
「抗生物質耐性」なる用語は、微生物細胞の抗生物質化合物、特に類似の微生物をうまく処理するためにこれまで用いられてきた抗生物質化合物に対する耐性を含む。
「極性部分」なる用語は、少なくとも一つの複素環を有する部分を含む。この用語は、ヒドロキシル、ハロゲン、チオエーテル、カルボン酸、金属（例えば、アルカリ、アルカリ金属、Au、Hg、Ag、Mn、Co、Cu、Znなど）、ニトロ、アミノ、アルコキシ、および化合物のその意図される機能の実行を可能にする他の部分などの部分を含むが、これらに限定されることはない。「極性部分」なる用語は、転写因子調節化合物のその意図される機能の実行、例えば、転写因子、例えばAraCファミリーポリペプチドまたはMarAファミリーポリペプチドの調節を可能にする部分を含む。複素環極性部分は一つまたは複数の環を含んでいてもよく、その一つまたは複数は芳香族であってもよい。一つの態様において、極性部分の一つまたは複数の環は縮合されている。複素環極性部分は二環式であってもよい。
複素環極性部分は一つまたは複数の窒素、硫黄、または酸素原子を含むことができる。複素環の例には、ベンゾジオキサゾール、ベンゾフラン、ベンゾイミダゾール、ベンズオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾチオフェン、クロメノン、デアザプリン、フラン、イミダゾール、イミダゾピリジン、インドール、インドリジン、イソオキサゾール、イソチアゾール、イソキノリン、メチレンジオキシフェニル、ナフトリジン(napthridine)、オキサゾール、プリン、ピラジン、ピラゾール、ピリダジン、ピリジン、ピリミジン、ピロール、ピロリジン、キノリン、テトラゾール、チアゾール、チオフェン、トリアゾール、およびトリアゾールテトラゾールが含まれる。
さらに、極性部分は化学的に可能な場合には置換されていてもよい。例えば、極性部分はアルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシ、ホスフェート、ホスホナート、ホスフィナート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくは複素芳香族部分などの一つまたは複数の置換基で置換されていてもよい。置換基の例には、ニトロ、アルコキシ、アリール、アミジル、エステル、チオエステル、アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチルなど）、アラルキル（例えば、置換または無置換ベンジル）、ヒドロキシ、ハロゲン（例えば、フッ素、臭素、塩素、ヨウ素など）も含まれる。
「疎水性部分」なる用語は、転写因子調節化合物（例えば、HTHタンパク質調節化合物、AraCファミリーポリペプチド調節化合物、MarAファミリーポリペプチド調節化合物など）のその意図される機能の実行、例えば、転写因子の調節を可能にするような部分を含む。疎水性部分の例には、例えば、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、およびアリール部分が含まれる。疎水性部分は無置換でもよく、または化学的に可能な（例えば、水素ではない）場合には置換されていてもよい。一つの態様において、疎水性部分は置換または無置換フェニルである。置換基の例には、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ハロゲン、アミノ、チオール、ヒドロキシ、ニトロ、アリール、およびヘテロアリールが含まれる。置換基は置換されていても無置換でもよい。一つの態様において、フェニル疎水性部分はパラ置換、例えば、アルキル（メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチルなど）、ハロゲン（例えば、フッ素、臭素、塩素、ヨウ素など）、ヒドロキシ置換されている。
もう一つの態様において、疎水性部分は複素環である。複素環疎水性部分の例にはイミダゾピリジン、キノリニル、ピリジニルなどが含まれる。
一つの態様において、転写因子調節化合物（例えば、MarAファミリーポリペプチド調節化合物、AraCファミリーポリペプチド調節化合物など）は式（VII）の化合物：
Figure 0004933730
 （式中
WはNH、OまたはSであり；
Xは選択的にQに連結されたO、S、またはCであり；
A1はC-Z1、O、またはSであり；
A2はC-Z2、O、またはSであり；
A3はC-Z3、O、またはSであり；
A4はC-Z4、O、またはSであり；
A5はC-Z5、またはN-Z5であり；
Z1、Z2、Z3、およびZ4はそれぞれ独立に水素、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、およびアルキルからなる群より選択され；
Z5は水素、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル、またはカルボニルであり；
Qは水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシ、アリールである）、およびその薬学的に許容される塩である。
さらにもう一つの態様において、転写因子調節化合物（例えば、MarAファミリーポリペプチド調節化合物、AraCファミリーポリペプチド調節化合物など）は式（II）の化合物：
Figure 0004933730
 （式中
WはOまたはSであり；
Xは選択的にQに連結されたO、S、またはCであり；
A1はC-Z4、O、またはSであり；
A2はC-Z5、またはN-Z5であり；
Z1、Z2、Z3、Z4およびZ5はそれぞれ独立に水素、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、複素環、アミノ、またはシアノであり；
Z3は水素、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、複素環、アミノ、ニトロ、シアノ、カルボニル、またはチオカルボニルであり；
Qは芳香族または複素環部分である）、およびその薬学的に許容される塩である。
さらなる態様において、Wは酸素であってもよく、Xは酸素であってもよい。さらに、A1およびA2はそれぞれC-Z4およびC-Z5であってもよい。Z4およびZ5の例には水素およびヒドロキシが含まれる。Z1およびZ2の例には水素およびヒドロキシが含まれる。Z2の他の例にはハロゲン、例えばフッ素、塩素、臭素、およびヨウ素も含まれる。Z3の例には、例えば、水素、アルコキシおよびヒドロキシが含まれる。Qの例には置換および無置換フェニルが含まれる。フェニルはパラ置換されていてもよい。置換基の例にはヒドロキシル、ハロゲン（例えば、フッ素、臭素、塩素、ヨウ素など）、アミノ、アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチルなど）、ニトロ、シアノなどが含まれる。一つの態様において、転写因子調節化合物はMarA調節化合物であり、さらなる態様において、MarA阻害化合物である。
もう一つの態様において、転写因子調節化合物（例えば、AraCファミリーポリペプチド調節化合物、MarAファミリーポリペプチド調節化合物など）は式（VIII）の化合物：
Figure 0004933730
 （式中：
Gは置換または無置換芳香族部分、複素環、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボニル、または水素であり；
L1、L2、L3、L4、L9、およびL10はそれぞれ独立に酸素、硫黄、置換または無置換窒素、および置換または無置換炭素であり；かつ
L5およびL6はそれぞれ独立に水素、置換または無置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アシル、複素環、アミノ、ニトロ、ヒドロキシ、シアノ、アルコキシ、またはアリールであり、またL5およびL6は選択的に原子1から6個の鎖に連結されて縮合環を形成してもよい）、およびその薬学的に許容される塩である。
もう一つの態様において、転写因子調節化合物（例えば、AraCファミリーポリペプチド調節化合物、MarAファミリーポリペプチド調節化合物など）は式（IX）の化合物：
Figure 0004933730
 （式中：
Gは置換または無置換芳香族部分、複素環、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボニル、または水素であり；
L1、L2、L3、およびL4はそれぞれ独立に酸素、硫黄、置換または無置換窒素、および置換または無置換炭素であり；かつ
R9、L5およびL6はそれぞれ独立に水素、置換または無置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アシル、複素環、アミノ、ニトロ、ヒドロキシ、シアノ、アルコキシ、またはアリールであり、またL5およびL6は選択的に原子1から6個の鎖に連結されて縮合環を形成してもよい）、およびその薬学的に許容される塩である。
もう一つの態様において、転写因子調節化合物（例えば、AraCファミリーポリペプチド調節化合物、MarAファミリーポリペプチド調節化合物など）は式（III）の化合物：
Figure 0004933730
 （式中
Gは置換または無置換芳香族部分、複素環、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボニル、または水素であり；かつ
L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、およびL10はそれぞれ独立に酸素、置換もしくは無置換窒素、硫黄およびまたは置換もしくは無置換炭素である）、およびその薬学的に許容される塩である。
さらなる態様において、L9は、R9が水素、置換または無置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アシル、またはアリールである、N-R9である。もう一つの態様において、L10は酸素である。一つの態様において、R9は水素である。もう一つの態様において、Gは置換または無置換フェニルまたはヘテロアリールである。さらなる態様において、Gはシクロアルケニル、例えばシクロヘキセニルである。一つの態様において、L1、L2、L3、およびL4はそれぞれ置換または無置換炭素であり、かつL5、L6、およびL8はそれぞれ窒素である。L7は置換炭素であってもよく、例えばチオエーテル部分で置換されていてもよい。もう一つの態様において、L9、およびL10はそれぞれ窒素である。もう一つの態様において、本発明は式（III）の化合物（式中、L9は窒素であり、L10は酸素であり、L1〜L8はそれぞれC-Hであり、点線は二重結合を表し、かつGは水素でもメチルでもない）に関する。
もう一つの態様において、転写因子調節化合物（例えば、AraCファミリーポリペプチド調節化合物、MarAファミリーポリペプチド調節化合物など）は式（X）の化合物：
Figure 0004933730
 （式中
Y1およびY2はそれぞれ酸素、硫黄または置換もしくは無置換炭素であり；
J1、J2、J3、およびJ4はそれぞれ酸素、窒素、または選択的に置換された炭素である）、およびその薬学的に許容される塩である。
もう一つの態様において、転写因子調節化合物（例えば、AraCファミリーポリペプチド調節化合物、MarAファミリーポリペプチド調節化合物など）は式（IV）の化合物：
Figure 0004933730
 （式中
Y1およびY2はそれぞれ酸素または硫黄であり；
Jは水素、置換または無置換アルキル、アルケニル、アルキニル、シアノ、ニトロ、アミノ、またはハロゲンであり；
Vは置換または無置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルアミノ、またはアルキルチオであり；
PおよびKはそれぞれ独立に置換または無置換アリールである）、およびその薬学的に許容される塩である。
さらなる態様において、Y1およびY3はそれぞれ酸素であり、Vはアルコキシであり、かつJは低級アルキルである。もう一つの態様において、Pは置換または無置換フェニルである。Kは置換または無置換ヘテロアリールであってもよい。
もう一つの態様において、転写因子調節化合物（例えば、AraCファミリーポリペプチド調節化合物、MarAファミリーポリペプチド調節化合物など）は式（V）の化合物：
Figure 0004933730
 （式中
T1、T2、T3、T4、T5、およびT6はそれぞれ独立に置換もしくは無置換炭素、酸素、置換もしくは無置換窒素、または硫黄であり；
Mは水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、複素環、またはアリールである）、またはその薬学的に許容される塩である。
さらなる態様において、T5は、Wがアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、複素環、アシル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルクチオ、アミノ、ニトロ、ハロゲン、または水素である、N-WまたはC-Wである。もう一つのさらなる態様において、T6はNである。
さらなる態様において、Mは置換または無置換アリールである。Wは置換または無置換アルキルであってもよい。もう一つの態様において、T1、T2、T3、およびT4はそれぞれ置換または無置換炭素炭素である。さらなる態様において、T1、T2、T3、およびT4の少なくとも一つは窒素であり、かつ残りのT部分は置換または無置換炭素炭素である。
もう一つの態様において、転写因子調節化合物（例えば、AraCファミリーポリペプチド調節化合物、MarAファミリーポリペプチド調節化合物など）は式（VI）の化合物：
Figure 0004933730
 （式中
G1、G2、およびG3はそれぞれ独立にO、S、置換もしくは無置換窒素、または置換もしくは無置換炭素であり；
E1、E2、およびE3はそれぞれ独立に水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、またはアシルであり；かつ
E4はアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ハロゲン、シアノ、アミノ、ニトロ、またはアシルである）、およびその薬学的に許容される塩である。
さらなる態様において、G1、G2、およびG3はそれぞれ酸素である。
他の転写因子調節化合物を表3に示す。本発明は、これらの各化合物、各化合物の使用法（治療用およびその他の両方）、および表4、表5、または式（I）、（II）、（III）、（IV）、（V）、（VI）、（VII）、（VIII）、（IX）もしくは（X）の化合物の少なくとも一つを含む組成物に関する。
本発明は、下記の各化合物にも関する：
2-(4-イソプロピルフェニル)-4H-クロメン-4-オン；
2-(3,4-ジヒドロキシ-フェニル)-3,5,7-トリヒドロキシ-クロメン-4-オン
N-イソプロピル-2-[(4-メチル-5-キノリン-6-イル-4H-1,2,4-トリアゾル-3-イル)チオ]アセトアミド；
4-ヒドロキシ-6-メチル-5,6-ジヒドロ-2H-ピラノ[3,2-c]キノリン-2,5-ジオン；
5,7-ジヒドロキシ-2-(4-ヒドロキシ-フェニル)-クロメン-4-オン；
2-[4-(ジメチルアミノ)フェニル]-4H-クロメン-4-オン；
1-(ベンジルオキシ)-2-フェニル-1H-イミダゾ[4,5-b]ピリジン；
2-(ベンジルチオ)-4-フェニル-5-(1-フェニル-1H-1,2,3,4-テトラアゾル-5-イル)ピリミジン；
6-フルオロ-2-フェニル-4H-クロメン-4-オン；
7-メトキシ-2-フェニル-4H-クロメン-4-オン；
4-(1,3-ジオキソ-1,3-ジヒドロ-2H-インデン-2-イリデン)-2-フェニル-6-(2-ピリジニル)テトラヒドロピロロ[3,4-c]ピロール-1,3(2H,3aH)-ジオン；
2-(2-ヒドロキシ-3-オキソ-5-p-トリル-2,3-ジヒドロ-フラン-2-イル)-マロンアミド酸エチルエステル；
2-[(6-ニトロ-2-フェニル-1H-1,3-ベンズイミダゾル-1-イル)オキシ]酢酸；
2-(4-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン；
1-メトキシ-2-(4-メチルフェニル)-1H-イミダゾ[4,5-b]ピリジン；
6-(5-ヨード-フラン-2-イル)-3-メチルスルファニル-6,7-ジヒドロ-5-オキサ-1,2,4,7-テトラアザ-ジベンゾ[a,c]シクロヘプテン；
6-(4-エトキシ-フェニル)-3-メチルスルファニル-6,7-ジヒドロ-5-オキサ-1,2,4,7-テトラアザ-ジベンゾ[a,c]シクロヘプテン；
3-メチルスルファニル-6-(5-ニトロ-フラン-2-イル)-6,7-ジヒドロ-5-オキサ-1,2,4,7-テトラアザ-ジベンゾ[a,c]シクロヘプテン；
3-メチルスルファニル-6-[5-(4-ニトロ-フェニル)-フラン-2-イル)-6,7-ジヒドロ-5-オキサ-1,2,4,7-テトラアザ-ジベンゾ[a,c]シクロヘプテン；
4-(3-エチルスルファニル-6,7-ジヒドロ-5-オキサ-1,2,4,7-テトラアザ-ジベンゾ[a,c]シクロヘプテン-6-イル)-ベンゼン-1,2-ジオール；
6-(4-ベンジルオキシ-フェニル)-3-プロピルスルファニル-6,7-ジヒドロ-5-オキサ-1,2,4,7-テトラアザ-ジベンゾ[a,c]シクロヘプテン；
6-ベンゾ[1,3]ジオキソル-5-イル-3-メチルスルファニル-6,7-ジヒドロ-5-オキサ-1,2,4,7-テトラアザ-ジベンゾ[a,c]シクロヘプテン；
3-ブチルスルファニル-6-(2,4-ジメトキシ-フェニル)-6,7-ジヒドロ-5-オキサ-1,2,4,7-テトラアザ-ジベンゾ[a,c]シクロヘプテン；
6-(4-アリルオキシ-フェニル)-3-ブチルスルファニル-6,7-ジヒドロ-5-オキサ-1,2,4,7-テトラアザ-ジベンゾ[a,c]シクロヘプテン；
3-ブチルスルファニル-6-(4-エトキシ-フェニル)-6,7-ジヒドロ-5-オキサ-1,2,4,7-テトラアザ-ジベンゾ[a,c]シクロヘプテン；
6-(4-メトキシ-フェニル)-3-プロピルスルファニル-6,7-ジヒドロ-5-オキサ-1,2,4,7-テトラアザ-ジベンゾ[a,c]シクロヘプテン；
6-[5-(3-ニトロ-フェニル)-フラン-2-イル]-3-プロピルスルファニル-6,7-ジヒドロ-5-オキサ-1,2,4,7-テトラアザ-ジベンゾ[a,c]シクロヘプテン；
2-(3-フェニル-1H-ピラゾル-4-イルメチレン)-ベンゾ[4,5]イミダゾ[2,1-b]チアゾル-3-オン；
2-[5-(3-カルボキシ-フェニル)-フラン-2-イルメチレン]-5-(2-メトキシ-ナフタレン-1-イル)-7-メチル-3-オキソ-2,3-ジヒドロ-5H-チアゾロ[3,2-a]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル；
5-(4-ジメチルアミノ-フェニル)-7-メチル-2-[5-(2-メチル-4-ニトロ-フェニル)-フラン-2-イルメチレン]-3-オキソ-2,3-ジヒドロ-5H-チアゾロ[3,2-a]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル；
5-ベンゾ[1,3]ジオキソル-5-イル-7-メチル-2-[5-(2-メチル-4-ニトロ-フェニル)-フラン-2-イルメチレン]-3-オキソ-2,3-ジヒドロ-5H-チアゾロ[3,2-a]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル；
5-(3,4-ジメトキシ-フェニル)-7-メチル-2-[5-(2-メチル-4-ニトロ-フェニル)-フラン-2-イルメチレン]-3-オキソ-2,3-ジヒドロ-5H-チアゾロ[3,2-a]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル；
7-メチル-2-[5-(2-メチル-4-ニトロ-フェニル)-フラン-2-イルメチレン]-5-(4-メチルスルファニル-フェニル)-3-オキソ-2,3-ジヒドロ-5H-チアゾロ[3,2-a]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル；
2-[5-(4-カルボキシ-フェニル)-フラン-2-イルメチレン]-5-(2-メトキシ-ナフタレン-1-イル)-7-メチル-3-オキソ-2,3-ジヒドロ-5H-チアゾロ[3,2-a]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル；
5-ベンゾ[1,3]ジオキソル-5-イル-2-[5-(4-エトキシカルボニル-フェニル)-フラン-2-イルメチレン]-7-メチル-3-オキソ-2,3-ジヒドロ-5H-チアゾロ[3,2-a]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル；
7-メチル-3-オキソ-5-フェニル-2-[5-(3-トリフルオロメチル-フェニル)-フラン-2-イルメチレン]-2,3-ジヒドロ-5H-チアゾロ[3,2-a]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル；
7-メチル-2-[5-(2-メチル-4-ニトロ-フェニル)-フラン-2-イルメチレン]-3-オキソ-5-フェニル-2,3-ジヒドロ-5H-チアゾロ[3,2-a]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル；
2-[5-(3-カルボキシ-フェニル)-フラン-2-イルメチレン]-5-(4-ジメチルアミノ-フェニル)-7-メチル-3-オキソ-2,3-ジヒドロ-5H-チアゾロ[3,2-a]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル；
5-(4-ジメチルアミノ-フェニル)-7-メチル-2-[5-(4-メチル-3-ニトロ-フェニル)-フラン-2-イルメチレン]-3-オキソ-2,3-ジヒドロ-5H-チアゾロ[3,2-a]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル；
2-[5-(3-カルボキシ-フェニル)-フラン-2-イルメチレン]-7-メチル-5-(4-メチルスルファニル-フェニル)-3-オキソ-2,3-ジヒドロ-5H-チアゾロ[3,2-a]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル；
[1,2]ナフトキノン1-[O-(6-オキソ-6H-アントラ[1,9-cd]イソキサゾル-5-イル)-オキシム]；
3-アセチル-2,5,7-トリフェニル-1H-1,3a,4,8-テトラアザ-7a-アゾニア-シクロペンタ[a]インデン；
1-アミノ-3-ベンゾ[1,3]ジオキソル-5-イル-ベンゾ[4,5]イミダゾ[1,2-a]ピリジン-2,4-ジカルボニトリル；
2-[2-(5-フラン-2-イル-4-フェニル-4H-[1,2,4]トリアゾル-3-イルスルファニル)-アセチルアミノ]-安息香酸メチルエステル；
6,7-ジメチル-2-(3-フェニル-1H-ピラゾル-4-イルメチレン)-ベンゾ[4,5]イミダゾ[2,1-b]チアゾル-3-オン；
2-(5-ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾル-5-イル-4-メチル-4H-[1,2,4]トリアゾル-3-イルスルファニル)-N-(3-メチルスルファニル-フェニル)-アセトアミド；
4-(1,3-ジオキソ-インダン-2-イリデン)-2-フェニル-6-ピリジン-2-イルテトラヒドロ-ピロロ[3,4-c]ピロール-1,3-ジオン；
6-ニトロ-2-フェニル-1-(3-トリフルオロメチル-ベンジルオキシ)-1H-ベンゾイミダゾール；
(6-ニトロ-2-フェニル-ベンゾイミダゾル-1-イルオキシ)-酢酸；
1-ベンジルオキシ-6-ニトロ-2-フェニル-1H-ベンゾイミダゾール；
1-(4-メチル-ベンジルオキシ)-6-ニトロ-2-フェニル-1H-ベンゾイミダゾール；
6,8-ジメチル-2-(4-ニトロ-フェニル)-5-フェニル-5H,6H-1-オキサ-3,5,6,8-テトラアザ-シクロペンタ[a]ナフタレン-4,7,9-トリオン；
6,8-ジメチル-5-フェニル-2-p-トリル-5H,6H-1-オキサ-3,5,6,8-テトラアザ-シクロペンタ[a]ナフタレン-4,7,9-トリオン；
2-[3-(4-フルオロ-フェニル)-1-フェニル-1H-ピラゾル-4-イルメチレン]-ベンゾ[4,5]イミダゾ[2,1-b]チアゾル-3-オン；
コバルト5,10,15,20-テトラ-ピリジン-4-イル-ポルフィリン；
2-[3-(4-フルオロ-フェニル)-1-フェニル-1H-ピラゾル-4-イルメチレン]-5-メチル-6-ビニル-イミダゾ[2,1-b]チアゾル-3-オン；
コバルト5,10,15,20-テトラ-ピリジン-3-イル-ポルフィリン；
亜鉛5,10,15,20-テトラ-ピリジン-4-イル-ポルフィリン；
2-(4-ヒドロキシフェニル）-4H-クロメン-4-オン、およびその薬学的に許容される塩。
さらなる態様において、転写因子調節化合物はアピゲニンではない。もう一つの
「アルキル」なる用語には、直鎖アルキル基（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなど）、分枝鎖アルキル基（イソプロピル、tert-ブチル、イソブチルなど）、シクロアルキル（脂環式）基（シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロへプチル、シクロオクチル）、アルキル置換シクロアルキル基、およびシクロアルキル置換アルキル基を含む、飽和脂肪族基が含まれる。アルキルなる用語は、炭化水素主鎖の一つまたは複数の炭素に代わる酸素、窒素、硫黄またはリン原子をさらに含みうるアルキル基をさらに含む。特定の態様において、直鎖または分枝鎖アルキルはその主鎖に6個以下の炭素原子を有し（例えば、直鎖の場合C1〜C6、分枝鎖の場合C3〜C6）、より好ましくは4個以下を有する。同様に、好ましいシクロアルキルはその環構造に3〜8個の炭素原子を有し、より好ましくは環構造に5または6個の炭素を有する。C1〜C6なる用語は、1から6個の炭素原子を含むアルキル基を含む。
さらに、アルキルなる用語は「無置換アルキル」および「置換アルキル」の両方を含み、その後者は炭化水素主鎖の一つまたは複数の炭素上の水素に代わる置換基を有するアルキル部分を意味する。そのような置換基には、例えば、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナート、ホスフィナート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくは複素芳香族部分が含まれうる。シクロアルキルは、例えば前述の置換基でさらに置換されていてもよい。「アルキルアリール」または「アリールアルキル」部分はアリールで置換されたアルキル（例えば、フェニルメチル（ベンジル））である。「アルキル」なる用語は天然および非天然アミノ酸の側鎖も含む。
「アリール」なる用語は、ゼロから4個のヘテロ原子を含んでいてもよい5および6員単環式芳香族基、例えば、ベンゼン、フェニル、ピロール、フラン、チオフェン、チアゾール、イソチアゾール、イミダゾール、トリアゾール、テトラゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン、およびピリミジンなどを含む。さらに、「アリール」なる用語は多環式アリール基、例えば、三環式、二環式、例えば、ナフタレン、ベンゾキサゾール、ベンゾジオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾイミダゾール、ベンゾチオフェン、メチレンジオキシフェニル、キノリン、イソキノリン、ナフトリジン、インドール、ベンゾフラン、プリン、ベンゾフラン、デアザプリン、またはインドリジンを含む。環構造にヘテロ原子を有するアリール基は「アリール複素環」、「複素環」、「ヘテロアリール」または「複素芳香族」と呼ばれることもある。芳香環は一つまたは複数の環状の位置で前述のような置換基、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アリールアルキルアミノカルボニル、アルケニルアミノカルボニル、アリールカルボニル、アリールカルボニル、アリールアルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、ホスフェート、ホスホナート、ホスフィナート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくは複素芳香族部分で置換されていてもよい。アリール基は芳香族ではない脂環式または複素環と縮合または架橋されて多環（例えばテトラリン）を形成してもよい。「アリール」なる用語はポルフィリン、フタロシアニンなどの多環式アリール基も含む。
「アルケニル」なる用語は、前述のアルキルと長さおよび可能な置換において類似しているが、少なくとも一つの二重結合を含む不飽和脂肪族基を含む。
例えば、「アルケニル」なる用語は、直鎖アルケニル基（例えば、エチレニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニルなど）、分枝鎖アルケニル基、シクロアルケニル（脂環式）基（シクロプロペニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、シクロオクテニル）、アルキルまたはアルケニル置換シクロアルケニル基、およびシクロアルキルまたはシクロアルケニル置換アルケニル基を含む。アルケニルなる用語は、炭化水素主鎖の一つまたは複数の炭素に代わる酸素、窒素、硫黄またはリン原子を含むアルケニル基をさらに含む。特定の態様において、直鎖または分枝鎖アルケニル基はその主鎖に6個以下の炭素原子を有する（例えば、直鎖の場合C2〜C6、分枝鎖の場合C3〜C6）。同様に、シクロアルケニル基はその環構造に3〜8個の炭素原子を有し、より好ましくは環構造に5または6個の炭素を有する。C2〜C6なる用語は、2から6個の炭素原子を含むアルケニル基を含む。
さらに、アルケニルなる用語は「無置換アルケニル」および「置換アルケニル」の両方を含み、その後者は炭化水素主鎖の一つまたは複数の炭素上の水素に代わる置換基を有するアルケニル部分を意味する。そのような置換基には、例えば、アルキル基、アルキニル基、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナート、ホスフィナート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくは複素芳香族部分が含まれうる。
「アルキニル」なる用語は、前述のアルキルと長さおよび可能な置換において類似しているが、少なくとも一つの三重結合を含む不飽和脂肪族基を含む。
例えば、「アルキニル」なる用語は、直鎖アルキニル基（例えば、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、オクチニル、ノニニル、デシニルなど）、分枝鎖アルキニル基、およびシクロアルキルまたはシクロアルケニル置換アルキニル基を含む。アルキニルなる用語は、炭化水素主鎖の一つまたは複数の炭素に代わる酸素、窒素、硫黄またはリン原子を含むアルキニル基をさらに含む。特定の態様において、直鎖または分枝鎖アルキニル基はその主鎖に6個以下の炭素原子を有する（例えば、直鎖の場合C2〜C6、分枝鎖の場合C3〜C6）。C2〜C6なる用語は、2から6個の炭素原子を含むアルキニル基を含む。
さらに、アルキニルなる用語は「無置換アルキニル」および「置換アルキニル」の両方を含み、その後者は炭化水素主鎖の一つまたは複数の炭素上の水素に代わる置換基を有するアルキニル部分を意味する。そのような置換基には、例えば、アルキル基、アルキニル基、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナート、ホスフィナート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくは複素芳香族部分が含まれうる。
炭素数が特に規定されないかぎり、本明細書において用いられる「低級アルキル」とは前述のとおりであるが、その主鎖構造に1から5個の炭素原子を有するアルキル基を意味する。「低級アルケニル」および「低級アルキニル」は、例えば2〜5炭素原子の鎖長を有する。
「アシル」なる用語は、アシルラジカル（CH3CO-）またはカルボニル基を含む化合物および部分を含む。「置換アシル」なる用語は、一つまたは複数の水素原子が例えばアルキル基、アルキニル基、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナート、ホスフィナート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくは複素芳香族部分で置換されたアシル基を含む。
「アシルアミノ」なる用語は、アシル部分がアミノ基に結合された部分を含む。例えば、この用語はアルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイド基を含む。
「アロイル」なる用語は、カルボニル基に結合されたアリールまたは複素芳香族部分を有するカルボニルおよび部分を含む。アロイル基の例にはフェニルカルボキシ、ナフチルカルボキシなどが含まれる。
「アルコキシアルキル」、「アルキルアミノアリール」および「チオアルコキシアルキル」なる用語は、炭化水素主鎖の一つまたは複数の炭素に代わる酸素、窒素または硫黄原子、例えば酸素、窒素または硫黄原子をさらに含む、前述のアルキル基を含む。
「アルコキシ」なる用語は、酸素原子に共有結合された置換および無置換アルキル、アルケニル、およびアルキニル基を含む。アルコキシ基の例には、メトキシ、エトキシ、イソプロピルオキシ、プロポキシ、ブトキシ、およびペントキシ基が含まれる。置換アルコキシ基の例にはハロゲン化アルコキシ基が含まれる。アルコキシ基は、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナート、ホスフィナート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくは複素芳香族部分などの基で置換されていてもよい。ハロゲン置換アルコキシ基の例には、フルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシ、クロロメトキシ、ジクロロメトキシ、トリクロロメトキシなどが含まれるが、これらに限定されることはない。
「アミン」または「アミノ」なる用語は、窒素原子が少なくとも一つの炭素またはヘテロ原子に共有結合された化合物を含む。「アルキルアミノ」なる用語は、窒素が少なくとも一つの追加のアルキル基に結合された基および化合物を含む。「ジアルキルアミノ」なる用語は、窒素原子が少なくとも二つの追加のアルキル基に結合された基を含む。「アリールアミノ」および「ジアリールアミノ」なる用語は、それぞれ窒素原子が少なくとも一つまたは二つのアリール基に結合された基を含む。「アルキルアリールアミノ」、「アルキルアミノアリール」または「アリールアミノアルキル」なる用語は、少なくとも一つのアルキル基および少なくとも一つのアリール基に結合されたアミノ基を意味する。「アルカミノアルキル」なる用語は、アルキル基に結合された窒素原子に結合されたアルキル、アルケニル、またはアルキニル基を意味する。
「アミド」または「アミノカルボキシ」なる用語は、カルボニルまたはチオカルボニル基の炭素に結合された窒素原子を含む化合物または部分を含む。この用語は、カルボキシ基に結合されたアミノ基に結合されたアルキル、アルケニル、またはアルキニル基を含む「アルカミノカルボキシ」基を含む。これは、カルボニルまたはチオカルボニル基の炭素に結合されたアミノ基に結合されたアリールまたはヘテロアリール基を含むアリールアミノカルボキシ基を含む。「アルキルアミノカルボキシ」、「アルケニルアミノカルボキシ」、「アルキニルアミノカルボキシ」、および「アリールアミノカルボキシ」なる用語は、それぞれアルキル、アルケニル、アルキニルおよびアリール部分が窒素原子に結合され、その窒素原子はカルボニル基の炭素に結合されている部分を含む。
「カルボニル」または「カルボキシ」なる用語は、酸素原子に二重結合で連結された炭素を含む化合物および部分を含む。カルボニルを含む部分の例にはアルデヒド、ケトン、カルボン酸、アミド、エステル、酸無水物などが含まれる。
「チオカルボニル」または「チオカルボキシ」なる用語は、硫黄原子に二重結合で連結された炭素を含む化合物および部分を含む。
「エーテル」なる用語は、二つの異なる炭素原子またはヘテロ原子に結合された酸素を含む化合物または部分を含む。例えば、この用語は「アルコキシアルキル」を含み、これは別のアルキル基に共有結合された酸素に共有結合されたアルキル、アルケニル、またはアルキニル基を意味する。
「エステル」なる用語は、カルボニル基の炭素に結合された酸素に結合された炭素またはヘテロ原子を含む化合物または部分を含む。「エステル」なる用語は、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル、ペントキシカルボニルなどのアルコキシカルボニル基を含む。アルキル、アルケニル、またはアルキニル基は前述のとおりである。
「チオエーテル」なる用語は、二つの異なる炭素原子またはヘテロ原子に結合された硫黄原子を含む化合物または部分を含む。チオエーテルの例には、アルクチオアルキル、アルクチオアルケニル、およびアルクチオアルキニルが含まれるが、これらに限定されることはない。「アルクチオアルキル」なる用語は、アルキル基に結合された硫黄原子に結合されたアルキル、アルケニル、またはアルキニル基を含む。同様に「アルクチオアルケニル」および「アルクチオアルキニル」なる用語は、アルキル、アルケニル、またはアルキニル基がアルキニル基に共有結合された硫黄原子に結合されているカルボニルまたは部分を意味する。
「ヒドロキシ」または「ヒドロキシル」なる用語は、-OHまたは-O-を有する基を含む。
「ハロゲン」なる用語は、フッ素、臭素、塩素、ヨウ素などを含む。「過ハロゲン化された」なる用語は一般に、スキーム井部手の水素がハロゲン原子で置換された部分を意味する。
「ポリシクリル」または「多環式ラジカル」なる用語は、複数の炭素が二つの隣接する環に共通である複数の環（例えば、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリールおよび／またはヘテロシクリル）を意味し、例えば環は「縮合環」である。非隣接原子を通じて連結されている環は「架橋」環と呼ばれる。多環の各環は前述のような置換基、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アリールアルキルアミノカルボニル、アルケニルアミノカルボニル、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アリールアルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナート、ホスフィナート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキル、アルキルアリール、または芳香族もしくは複素芳香族部分で置換されていてもよい。
「ヘテロ原子」なる用語は、炭素または水素以外のいかなる元素の原子も含む。好ましいヘテロ原子は窒素、酸素、硫黄およびリンである。
本発明のいくつかの化合物の構造は、不斉炭素原子を含むことに留意されると思われる。したがって、そのような不斉から生じる異性体（例えば、すべての鏡像異性体およびジアステレオマーは、特に記載のないかぎり、本発明の範囲内に含まれることが理解されるべきである。そのような異性体は伝統的な分離法および立体化学的に制御された合成によって実質的に純粋な形で得ることができる。さらに、本明細書において議論される構造ならびに他の化合物および部分は、そのすべての互変異性体も含む。
構造式中で
Figure 0004933730
によって表される結合は、結合が一重または二重結合のいずれかでありうることを意味する。
IX. 転写因子調節化合物を含む製剤
本発明は、転写因子調節化合物および／または本発明のアッセイのいずれかで同定された化合物の治療上有効な量または用量ならびに一つまたは複数の担体（例えば、薬学的に許容される添加物および／または希釈剤）を含む組成物を提供する。本発明の薬学的組成物は、本明細書において転写因子調節化合物、AraCファミリーポリペプチド調節化合物、MarAファミリーポリペプチド調節化合物、MarAファミリー阻害化合物、marA阻害化合物、式（I）、（II）、（III）、（IV）、（V）、（VI）、（VII）、（VIII）、（IX）、（X）、表４、表5、骨格などの化合物として記載されるいかなる化合物を含んでいてもよい。これらの各化合物は、本発明の薬学的組成物の一部として単独または組み合わせで用いることができる。さらに、組成物は第二の抗菌剤、例えば抗生物質を含むこともできる。
本発明は、転写因子調節化合物（例えば、MarAファミリーポリペプチド調節化合物またはAraCファミリーポリペプチド調節化合物）の有効量、および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物に関する。一つの態様において、転写因子調節化合物は式（II）の化合物：
Figure 0004933730
 （式中
WはOまたはSであり；
Xは選択的にQに連結されたO、S、またはCであり；
A1はC-Z4、O、またはSであり：
A2はC-Z5、またはN-Z5であり：
Z1、Z2、Z3、Z4、およびZ5はそれぞれ独立に水素、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、複素環、アミノ、またはシアノであり；
Z3は水素、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、複素環、アミノ、ニトロ、シアノ、カルボニル、またはチオカルボニルであり；
Qは芳香族または複素環部分である）、およびその薬学的に許容される塩である。
もう一つの態様において、本発明の薬学的組成物は式（III）の転写因子調節化合物：
Figure 0004933730
 （式中
Gは置換または無置換芳香族部分、複素環、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボニル、または水素であり；かつ
L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、およびL10はそれぞれ独立に酸素、置換もしくは無置換窒素、硫黄およびまたは置換もしくは無置換炭素である）、およびその薬学的に許容される塩の有効量を含む。
さらにもう一つの態様において、本発明の薬学的組成物は薬学的に許容される担体（選択的）ならびに式（IV）の転写因子調節化合物：
Figure 0004933730
 （式中
Y1およびY2はそれぞれ酸素または硫黄であり；
Jは水素、置換または無置換アルキル、アルケニル、アルキニル、シアノ、ニトロ、アミノ、またはハロゲンであり；
Vは置換または無置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルアミノ、またはアルキルチオであり；
PおよびKはそれぞれ独立に置換または無置換アリールである）、およびその薬学的に許容される塩の有効量を含む。
さらにもう一つの態様において、本発明の薬学的組成物は薬学的に許容される担体（選択的）ならびに（V）の転写因子調節化合物：
Figure 0004933730
 （式中
T1、T2、T3、T4、T5、およびT6はそれぞれ独立に置換もしくは無置換炭素、酸素、置換もしくは無置換窒素、または硫黄であり；
Mは水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアリールである）、またはその薬学的に許容される塩の有効量を含む。
さらにもう一つの態様において、本発明の薬学的組成物は薬学的に許容される担体（選択的）ならびに式（VI）の転写因子調節化合物：
Figure 0004933730
 （式中
G1、G2、およびG3はそれぞれ独立にO、S、置換もしくは無置換窒素、または置換もしくは無置換炭素であり；
E1、E2、およびE3はそれぞれ独立に水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、またはアシルであり；かつ
E4はアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ハロゲン、シアノ、アミノ、ニトロ、またはアシルである）、およびその薬学的に許容される塩の有効量を含む。
さらにもう一つの態様において、本発明の薬学的組成物は下記または表4もしくは表5に記載の転写因子調節化合物：
2-(4-イソプロピルフェニル)-4H-クロメン-4-オン；
2-(3,4-ジヒドロキシ-フェニル)-3,5,7-トリヒドロキシ-クロメン-4-オン
N-イソプロピル-2-[(4-メチル-5-キノリン-6-イル-4H-1,2,4-トリアゾル-3-イル)チオ]アセトアミド；
4-ヒドロキシ-6-メチル-5,6-ジヒドロ-2H-ピラノ[3,2-c]キノリン-2,5-ジオン；
5,7-ジヒドロキシ-2-(4-ヒドロキシ-フェニル)-クロメン-4-オン；
2-[4-(ジメチルアミノ)フェニル]-4H-クロメン-4-オン；
1-(ベンジルオキシ)-2-フェニル-1H-イミダゾ[4,5-b]ピリジン；
2-(ベンジルチオ)-4-フェニル-5-(1-フェニル-1H-1,2,3,4-テトラアゾル-5-イル)ピリミジン；
6-フルオロ-2-フェニル-4H-クロメン-4-オン；
7-メトキシ-2-フェニル-4H-クロメン-4-オン；
4-(1,3-ジオキソ-1,3-ジヒドロ-2H-インデン-2-イリデン)-2-フェニル-6-(2-ピリジニル)テトラヒドロピロロ[3,4-c]ピロール-1,3(2H,3aH)-ジオン；
2-(2-ヒドロキシ-3-オキソ-5-p-トリル-2,3-ジヒドロ-フラン-2-イル)-マロンアミド酸エチルエステル；
2-[(6-ニトロ-2-フェニル-1H-1,3-ベンズイミダゾル-1-イル)オキシ]酢酸；
2-(4-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン；
1-メトキシ-2-(4-メチルフェニル)-1H-イミダゾ[4,5-b]ピリジン；
6-(5-ヨード-フラン-2-イル)-3-メチルスルファニル-6,7-ジヒドロ-5-オキサ-1,2,4,7-テトラアザ-ジベンゾ[a,c]シクロヘプテン；
6-(4-エトキシ-フェニル)-3-メチルスルファニル-6,7-ジヒドロ-5-オキサ-1,2,4,7-テトラアザ-ジベンゾ[a,c]シクロヘプテン；
3-メチルスルファニル-6-(5-ニトロ-フラン-2-イル)-6,7-ジヒドロ-5-オキサ-1,2,4,7-テトラアザ-ジベンゾ[a,c]シクロヘプテン；
3-メチルスルファニル-6-[5-(4-ニトロ-フェニル)-フラン-2-イル)-6,7-ジヒドロ-5-オキサ-1,2,4,7-テトラアザ-ジベンゾ[a,c]シクロヘプテン；
4-(3-エチルスルファニル-6,7-ジヒドロ-5-オキサ-1,2,4,7-テトラアザ-ジベンゾ[a,c]シクロヘプテン-6-イル)-ベンゼン-1,2-ジオール；
6-(4-ベンジルオキシ-フェニル)-3-プロピルスルファニル-6,7-ジヒドロ-5-オキサ-1,2,4,7-テトラアザ-ジベンゾ[a,c]シクロヘプテン；
6-ベンゾ[1,3]ジオキソル-5-イル-3-メチルスルファニル-6,7-ジヒドロ-5-オキサ-1,2,4,7-テトラアザ-ジベンゾ[a,c]シクロヘプテン；
3-ブチルスルファニル-6-(2,4-ジメトキシ-フェニル)-6,7-ジヒドロ-5-オキサ-1,2,4,7-テトラアザ-ジベンゾ[a,c]シクロヘプテン；
6-(4-アリルオキシ-フェニル)-3-ブチルスルファニル-6,7-ジヒドロ-5-オキサ-1,2,4,7-テトラアザ-ジベンゾ[a,c]シクロヘプテン；
3-ブチルスルファニル-6-(4-エトキシ-フェニル)-6,7-ジヒドロ-5-オキサ-1,2,4,7-テトラアザ-ジベンゾ[a,c]シクロヘプテン；
6-(4-メトキシ-フェニル)-3-プロピルスルファニル-6,7-ジヒドロ-5-オキサ-1,2,4,7-テトラアザ-ジベンゾ[a,c]シクロヘプテン；
6-[5-(3-ニトロ-フェニル)-フラン-2-イル]-3-プロピルスルファニル-6,7-ジヒドロ-5-オキサ-1,2,4,7-テトラアザ-ジベンゾ[a,c]シクロヘプテン；
2-(3-フェニル-1H-ピラゾル-4-イルメチレン)-ベンゾ[4,5]イミダゾ[2,1-b]チアゾル-3-オン；
2-[5-(3-カルボキシ-フェニル)-フラン-2-イルメチレン]-5-(2-メトキシ-ナフタレン-1-イル)-7-メチル-3-オキソ-2,3-ジヒドロ-5H-チアゾロ[3,2-a]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル；
5-(4-ジメチルアミノ-フェニル)-7-メチル-2-[5-(2-メチル-4-ニトロ-フェニル)-フラン-2-イルメチレン]-3-オキソ-2,3-ジヒドロ-5H-チアゾロ[3,2-a]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル；
5-ベンゾ[1,3]ジオキソル-5-イル-7-メチル-2-[5-(2-メチル-4-ニトロ-フェニル)-フラン-2-イルメチレン]-3-オキソ-2,3-ジヒドロ-5H-チアゾロ[3,2-a]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル；
5-(3,4-ジメトキシ-フェニル)-7-メチル-2-[5-(2-メチル-4-ニトロ-フェニル)-フラン-2-イルメチレン]-3-オキソ-2,3-ジヒドロ-5H-チアゾロ[3,2-a]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル；
7-メチル-2-[5-(2-メチル-4-ニトロ-フェニル)-フラン-2-イルメチレン]-5-(4-メチルスルファニル-フェニル)-3-オキソ-2,3-ジヒドロ-5H-チアゾロ[3,2-a]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル；
2-[5-(4-カルボキシ-フェニル)-フラン-2-イルメチレン]-5-(2-メトキシ-ナフタレン-1-イル)-7-メチル-3-オキソ-2,3-ジヒドロ-5H-チアゾロ[3,2-a]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル；
5-ベンゾ[1,3]ジオキソル-5-イル-2-[5-(4-エトキシカルボニル-フェニル)-フラン-2-イルメチレン]-7-メチル-3-オキソ-2,3-ジヒドロ-5H-チアゾロ[3,2-a]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル；
7-メチル-3-オキソ-5-フェニル-2-[5-(3-トリフルオロメチル-フェニル)-フラン-2-イルメチレン]-2,3-ジヒドロ-5H-チアゾロ[3,2-a]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル；
7-メチル-2-[5-(2-メチル-4-ニトロ-フェニル)-フラン-2-イルメチレン]-3-オキソ-5-フェニル-2,3-ジヒドロ-5H-チアゾロ[3,2-a]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル；
2-[5-(3-カルボキシ-フェニル)-フラン-2-イルメチレン]-5-(4-ジメチルアミノ-フェニル)-7-メチル-3-オキソ-2,3-ジヒドロ-5H-チアゾロ[3,2-a]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル；
5-(4-ジメチルアミノ-フェニル)-7-メチル-2-[5-(4-メチル-3-ニトロ-フェニル)-フラン-2-イルメチレン]-3-オキソ-2,3-ジヒドロ-5H-チアゾロ[3,2-a]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル；
2-[5-(3-カルボキシ-フェニル)-フラン-2-イルメチレン]-7-メチル-5-(4-メチルスルファニル-フェニル)-3-オキソ-2,3-ジヒドロ-5H-チアゾロ[3,2-a]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル；
[1,2]ナフトキノン1-[O-(6-オキソ-6H-アントラ[1,9-cd]イソキサゾル-5-イル)-オキシム]；
3-アセチル-2,5,7-トリフェニル-1H-1,3a,4,8-テトラアザ-7a-アゾニア-シクロペンタ[a]インデン；
1-アミノ-3-ベンゾ[1,3]ジオキソル-5-イル-ベンゾ[4,5]イミダゾ[1,2-a]ピリジン-2,4-ジカルボニトリル；
2-[2-(5-フラン-2-イル-4-フェニル-4H-[1,2,4]トリアゾル-3-イルスルファニル)-アセチルアミノ]-安息香酸メチルエステル；
6,7-ジメチル-2-(3-フェニル-1H-ピラゾル-4-イルメチレン)-ベンゾ[4,5]イミダゾ[2,1-b]チアゾル-3-オン；
2-(5-ベンゾ[1,2,5]オキサジアゾル-5-イル-4-メチル-4H-[1,2,4]トリアゾル-3-イルスルファニル)-N-(3-メチルスルファニル-フェニル)-アセトアミド；
4-(1,3-ジオキソ-インダン-2-イリデン)-2-フェニル-6-ピリジン-2-イルテトラヒドロ-ピロロ[3,4-c]ピロール-1,3-ジオン；
6-ニトロ-2-フェニル-1-(3-トリフルオロメチル-ベンジルオキシ)-1H-ベンゾイミダゾール；
(6-ニトロ-2-フェニル-ベンゾイミダゾル-1-イルオキシ)-酢酸；
1-ベンジルオキシ-6-ニトロ-2-フェニル-1H-ベンゾイミダゾール；
1-(4-メチル-ベンジルオキシ)-6-ニトロ-2-フェニル-1H-ベンゾイミダゾール；
6,8-ジメチル-2-(4-ニトロ-フェニル)-5-フェニル-5H,6H-1-オキサ-3,5,6,8-テトラアザ-シクロペンタ[a]ナフタレン-4,7,9-トリオン；
6,8-ジメチル-5-フェニル-2-p-トリル-5H,6H-1-オキサ-3,5,6,8-テトラアザ-シクロペンタ[a]ナフタレン-4,7,9-トリオン；
2-[3-(4-フルオロ-フェニル)-1-フェニル-1H-ピラゾル-4-イルメチレン]-ベンゾ[4,5]イミダゾ[2,1-b]チアゾル-3-オン；
コバルト5,10,15,20-テトラ-ピリジン-4-イル-ポルフィリン；
2-[3-(4-フルオロ-フェニル)-1-フェニル-1H-ピラゾル-4-イルメチレン]-5-メチル-6-ビニル-イミダゾ[2,1-b]チアゾル-3-オン；
コバルト5,10,15,20-テトラ-ピリジン-3-イル-ポルフィリン；
亜鉛5,10,15,20-テトラ-ピリジン-4-イル-ポルフィリン；
2-(4-ヒドロキシフェニル)-4H-クロメン-4-オン、およびその薬学的に許容される塩の有効量を含む。
もう一つの態様において、被検者における細菌関連状態を予防する方法であって、被検者に転写因子調節化合物の有効量を細菌関連状態が予防されるように投与する段階を含む方法。
「被検者」なる用語は、細菌関連障害を患うことができる植物および動物（例えば、脊椎津物、両生類、魚類、哺乳類、例えばネコ、イヌ、ウマ、ブタ、ウシ、ヒツジ、齧歯類、ウサギ、リス、クマ、霊長類（例えば、チンパンジー、ゴリラ、およびヒト）を含む。「被検者」なる用語は、感染の高リスク状態になりうる、免疫無防備状態の被検者も含む。
「予防」なる用語は、細菌関連状態の発生を防ぐために転写因子調節化合物の有効量を投与することを意味する。
「細菌関連状態」なる用語は、本発明の転写因子調節化合物の投与によって予防することができる、細菌の存在によって特徴づけられる状態を含む。この用語は、被検者上または被検者内のバイオフィルム関連状態および他の感染症または細菌の望ましくない存在を含む。
下記に詳細に記載するとおり、薬学的組成物を、下記に適合させたものを含む固体または液体剤形での投与のために製剤することができる：（1）経口投与、例えば、水性もしくは非水性液剤、懸濁剤、錠剤、巨丸剤、散剤、顆粒剤、ペースト；（2）非経口投与、例えば、滅菌液剤もしくは懸濁剤として、例えば、皮下、筋肉内もしくは静脈内注射による；（3）局所適用、例えば、皮膚に適用するクリーム、軟膏もしくは噴霧剤として；（4）腟内もしくは直腸内、例えば、ペッサリー、クリーム、フォーム、もしくは坐剤として；または（5）エアロゾル、例えば、化合物を含む水性エアロゾル、リポソーム製剤もしくは固体粒子。
本明細書において用いられる「薬学的に許容される担体」なる語句は、本発明の抗感染物質または化合物を、一つの臓器または体の一部から、もう一つの臓器または体に一部に、その生物学的効果に影響をおよぼすことなく運搬または輸送することに関与する、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル化材料などの薬学的に許容される材料、組成物または媒体を意味する。各担体は、組成物の他の成分と適合性であり、被検者に対して有害ではないという意味で「許容される」べきである。薬学的に許容される担体として役立ちうる材料のいくつかの例には下記が含まれる：（1）乳糖、グルコースおよびショ糖などの糖；（2）トウモロコシデンプンおよび馬鈴薯デンプンなどのデンプン；（3）カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体；（４）粉末トラガカント；（5）麦芽；（6）ゼラチン；（7）タルク；（8）カカオ脂および坐剤用ワックスなどの賦形剤；（9）落花生油、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油などの油；（10）プロピレングリコールなどのグリコール；（11）グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール；（12）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；（13）寒天；（14）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；（15）アルギン酸；（16）発熱物質を含まない水；（17）等張食塩水；（18）リンガー液；（19）エチルアルコール；（20）リン酸緩衝液；ならびに（21）薬学的組成物において用いられる他の非毒性適合性物質。適当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用、分散剤の場合には要求される粒径の維持、および界面活性剤の使用によって維持することができる。
これらの組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などの補助剤を含むこともできる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを組み込むことによって確実にすることができる。組成物に糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を組み込むことも望ましい。加えて、注射用製剤の持続吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅らせる物質を組み込むことによって可能となる。
いくつかの場合には、薬物の効果を持続させるために、薬物の皮下または筋肉内注射からの吸収を遅らせることが望ましい。これは、水溶性が低い結晶またはアモルファス材料の懸濁液を用いることによって達成される。薬物の吸収速度はその溶解速度に依存し、溶解速度は結晶サイズおよび結晶形に依存することになる。または、非経口投与した剤形の遅延吸収は、薬物を油媒体に溶解または懸濁することによって達成される。
本発明の薬学的組成物は、体の上皮表面に経口、非経口、局所、直腸内、鼻内、腟内、大槽内投与することができる。組成物は当然のことながら、それぞれの投与経路に適した剤形で投与する。例えば、これらは錠剤またはカプセル型で、注射、吸入、眼ローション、軟膏などにより、注射、注入、または吸入による投与；ローションまたは軟膏による局所投与；および直腸または膣坐剤で投与する。
本明細書において用いられる「非経口投与」および「非経口で投与した」なる語句は、腸内および局所以外、通常は注射による投与様式を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内および胸骨内の注射および注入が含まれるが、これらに限定されることはない。
本明細書において用いられる「全身投与」、「全身に投与した」、「末梢投与」および「末梢に投与した」なる語句は、八硫酸スクロースおよび／または抗菌性の薬物もしくは中枢神経系に直接入るもの以外の他の材料の、被検者の全身に入り、したがって代謝および他の同様の過程にかけられるような投与、例えば皮下投与を意味する。
いくつかの方法において、本発明の組成物はいかなる上皮表面にも局所投与することができる。本発明による「上皮表面」とは、体の外面をカバーする、または管腔構造を裏打ちする組織の領域と定義され、皮膚および粘膜表面が含まれるが、これらに限定されることはない。そのような上皮表面には、口、咽頭、食道、肺、眼、耳、鼻、口腔、舌、膣、頚、尿生殖器、消化管、および肛門直腸表面が含まれる。
組成物は局所適用に用いられる様々な通常の剤形に製剤することができる。これらには、例えば、液剤または懸濁液、坐剤、圧注、浣腸、ゲル、クリーム、乳剤、ローション、スラリー、散剤、噴霧剤、リップスティック、フォーム、ペースト、練り歯磨き、軟膏、膏薬、香膏、圧注、滴剤、トローチ、チューインガム、ロゼンジ、含嗽剤、リンスなどの半固体および液体剤形が含まれる。
局所適用のために通常用いられる担体には、ペクチン、ゼラチンおよびその誘導体、ポリ乳酸もしくはポリグリコール酸ポリマーまたはそのコポリマー、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、または酸化セルロースなどのセルロース誘導体、グアールゴム、アカシアゴム、カラヤゴム、トラガカントゴム、ベントナイト、寒天、カルボマー、ヒバマタ（Bladderwrack）、イナゴマメ、デキストランおよびその誘導体、ガッチゴム、ヘクトライト、イスパキュラハスク、ポリビニルピロリドン、シリカおよびその誘導体、キサンタンゴム、カオリン、タルク、デンプンおよびその誘導体、パラフィン、水、植物および動物油、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、グリセロール、エタノール、プロパノール、プロピレングリコール（グリコール、アルコール）、固定油、ナトリウム、カリウム、アルミニウム、マグネシウムまたはカルシウム塩（塩化物、炭酸塩、重炭酸塩、クエン酸塩、グルコン酸塩、乳酸塩、酢酸塩、グルセプチン酸塩または酒石酸塩）が含まれる。
そのような組成物は、例えば、有害細胞、例えば膣淋菌または口唇ヘルペスを含む口腔感染症、眼、皮膚、もしくは腸管下部の感染症の治療または予防のために特に有用でありうる。薬物の持続性および滞留時間を高めるため、ならびに得られる予防効果を改善するために、局所用薬剤のための標準的組成物戦略を抗感染化合物およびその薬学的に許容される塩に適用することができる。
腸管下部または膣で用いるための局所適用のために、直腸坐剤、適当な浣腸、ゲル、軟膏、液剤、懸濁剤または挿入剤を用いることができる。局所経皮パッチも用いることができる。経皮パッチは本発明の組成物を体に制御送達する追加の利点を有する。そのような剤形は、薬剤を適当な媒質に溶解または分散させることにより製造することができる。
本発明の組成物は、直腸または腟内投与のために坐剤の形で投与することもできる。これらは薬剤を、室温では固体であるが、直腸温度では液体であり、したがって直腸または腟内で融解して薬物を放出する適当な非刺激性担体と混合することによって調製することができる。そのような材料には、カカオ脂、蜜蝋、ポリエチレングリコール、坐剤ワックスまたはサリチル酸塩が含まれ、これらは室温では固体であるが、体温では液体であり、したがって直腸または腟腔内で融解して活性薬物を放出することになる。
膣内投与に適した組成物には、当技術分野において適当であることが公知の担体などを含むペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム、フィルム、または噴霧組成物も含まれる。八硫酸スクロース／避妊薬において用いられる担体は、腟内投与および／または避妊具のコーティングに適合性であるべきである。組み合わせは、ペッサリー、ゼリー、圧注、フォーム、フィルム、軟膏、クリーム、香膏、ゲル、膏薬、ペースト、スラリー、膣坐剤、性交用潤滑剤、ならびにコンドーム、避妊用スポンジ、頚部キャップおよびペッサリーなどの器具用コーティングなどの固体、半固体および液体剤形でありうる。
眼適用のために、薬学的組成物はpH調節した滅菌等張食塩水中の微粉化懸濁液、または好ましくはpH調節した滅菌等張食塩水中の溶液として、塩化ベンジルアルコニウムなどの保存剤と共にまたは保存剤なしで製剤することができる。または、眼への使用のために、組成物をワセリンなどの軟膏中で製剤することができる。例示的眼用組成物には、眼軟膏、散剤、液剤などが含まれる。
散剤および噴霧剤は、八硫酸スクロースおよび／または抗生物質もしくは避妊薬に加えて、乳糖、タルク、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物などの担体を含むことができる。噴霧剤は、クロロフルオロハイドロカーボンならびにブタンおよびプロパンなどの揮発性無置換炭化水素などの通常の噴射剤をさらに含むことができる。
通常は、水性エアロゾルは、薬剤の水性溶液または懸濁液を通常の薬学的に許容される担体および安定化剤と共に製剤することによって製造する。担体および安定化剤は、特定の化合物の要求に応じて異なるが、典型的には非イオン界面活性剤（トウィーン、プルロニック、またはポリエチレングリコール）、血清アルブミンのようなタンパク質、ソルビタンエステル、オレイン酸、レシチン、グリシンなどのアミノ酸、緩衝液、塩、糖または糖アルコールが含まれる。エアロゾルは一般に等張溶液から調製する。
本発明の組成物は、それぞれあらかじめ決められた量の八硫酸スクロースおよび／または活性成分としての抗生物質もしくは避妊薬を含む、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、ロゼンジ（着香基剤、通常はショ糖およびアカシアまたはトラガカントを用いて）、散剤、顆粒剤を含むが、これらに限定されることはない、任意の経口により許容される剤形で、または水性もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁剤として、または水中油もしくは油中水乳濁液として、またはエリキシル剤もしくはシロップ剤として、または香錠（ゼラチンおよびグリセリンなどの不活性基剤、またはスクロースおよびアカシアを用いて）として、ならびに／または含嗽剤などとして経口投与することもできる。化合物は巨丸剤、舐剤またはペーストとして投与することもできる。経口使用のための錠剤の場合、一般に用いられる担体には乳糖およびトウモロコシデンプンが含まれる。ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤も典型的に添加される。カプセル剤形での経口投与のために、有用な希釈剤には乳糖および乾燥トウモロコシデンプンが含まれる。経口使用のために水性懸濁剤が要求される場合、活性成分を乳化剤および懸濁化剤と組み合わせる。望まれる場合には、特定の甘味料、着香料または着色剤を加えてもよい。
錠剤、ならびに糖衣丸、カプセル剤、丸剤および顆粒剤などの他の固体剤形は刻み目を入れてもよく、または腸溶コーティングおよび医薬品製剤技術分野では公知の他のコーティングなどのコーティングおよび外皮と共に調製してもよい。これらは、例えば、所望の放出特性を提供するために様々な比率のヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリクス、リポソームおよび／またはミクロスフェアを用いて、その中の活性成分を遅延または制御放出するように製剤することもできる。これらは、例えば、細菌保持フィルターを通してのろ過により、または使用直前に滅菌水もしくはいくつかの他の滅菌注射用媒質に溶解することができる滅菌固体組成物の形での滅菌剤の組込みにより、滅菌することができる。これらの組成物は、不透明化剤を選択的に含んでいてもよく、かつ胃腸管の特定の部分で、選択的に遅延された様式で、活性成分だけ、または活性成分を優先的に放出する組成物であってもよい。用いることができる埋込み組成物の例には、ポリマー物質およびワックスが含まれる。活性成分は、適当であれば、一つまたは複数の前述の賦形剤と共にマイクロカプセル化された剤形であってもよい。
経口投与のための液体剤形には、薬学的に許容される乳剤、マイクロエマルション、液剤、懸濁剤、シロップ剤およびエリキシル剤が含まれる。活性成分に加えて、液体剤形は、例えば水または他の溶媒、可溶化剤ならびにエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、油（特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステルと、その混合物などの乳化剤などの、当技術分野において一般的に用いられる不活性希釈剤を含むこともできる。
不活性希釈剤の他に、経口組成物は湿潤剤、乳化および懸濁化剤、甘味料、着香料、着色剤、芳香剤ならびに保存剤などの補助剤を含むこともできる。
懸濁剤は、抗感染剤に加えて、例えばエトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天およびトラガカント、ならびにその混合物などの懸濁化剤を含んでいてもよい。
本発明の組成物の滅菌注射剤形は水性懸濁剤でも油性懸濁剤でもよい。これらの懸濁剤は、適当な分散または湿潤剤および懸濁化剤を用いて、当技術分野において公知の技術により製剤することができる。湿潤剤、乳化剤と、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、ならびに着色剤、遊離剤、コーティング剤、甘味料、着香および芳香剤、保存剤および抗酸化剤も組成物中に存在してもよい。
滅菌注射製剤は、非毒性の非経口により許容される希釈剤または溶媒中の、例えば1,3-ブタンジオール溶液として、滅菌注射用液剤または懸濁剤であってもよい。用いることができる許容される媒体および溶媒の中には水、リンガー液および等張塩化ナトリウム溶液がある。加えて、滅菌固定油が溶媒または懸濁媒質として通常用いられる。この目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含む、いかなる無刺激性の固定油も用いることができる。オレイン酸などの脂肪酸およびそのグリセリド誘導体は、オリーブ油またはヒマシ油、特にそれらのポリオキシエチル化物などの天然の薬学的に許容される油と同様に、注射剤の製剤において有用である。これらの油溶液または懸濁液は、Ph.Helvまたは類似のアルコールなどの長鎖アルコール希釈剤または分散剤を含んでいてもよい。
抗感染剤またはその薬学的に許容される塩は、液剤または懸濁液、坐剤、圧注、浣腸、ゲル、クリーム、乳剤、ローション、スラリー、セッケン、シャンプー、洗剤、散剤、噴霧剤、リップスティック、フォーム、ペースト、練り歯磨き、軟膏、膏薬、香膏、圧注、滴剤、トローチ、ロゼンジ、含嗽剤、リンスその他を含む、組み合わせ製剤を形成する材料中の他の剤形において、全用量のいくらかの割合に相当することになる。例えば、クリームおよびゲルは典型的に送達媒質の物理化学的性質により、20％（すなわち、200mg/g）未満の濃度に限定される。特定の用途のために、はるかに低濃度の製剤を調製することもできる（例えば、小児適用のための低パーセント製剤）。例えば、本発明の薬学的組成物は八硫酸スクロースを全製剤の0.001〜99重量％、典型的には0.01〜75重量％、より典型的には0.1〜20重量％、特に1〜10重量％の量で含むことができる。特に、製剤中のその好ましい濃度は0.5〜50％、特に1〜10％などの0.5〜25％である。これは治療または予防する状態の種類および重症度に応じて、1日に1〜10回適当に適用することができる。
抗潰瘍薬としての何十年もの臨床使用を通して、抗感染剤またはその薬学的に許容される塩の毒性が低いことを考慮すると［W.R. Garnett、Clin. Pharm. 1:307-314 (1982)；R.N. Brogdenら、Drugs 27:194-209 (1984)；D.M. McCarthy、New Eng J Med., 325:1017-1025 (1991)、治療上有効な用量の上限は重大な問題ではない。
予防用の適用のために、本発明の薬学的組成物を感染の可能性の前に適用することができる。感染の可能性の前の適用のタイミングは、化合物の予防上の有効性を最大化するよう最適化することができる。適用のタイミングは、投与様式、適用する上皮表面、表面積、用量、上皮表面のpHにおける組成物の安定性および有効性、適用頻度、例えば単回適用であるか複数回適用であるか、に応じて変動することになる。当業者であれば、化合物の予防上の有効性を最大化するために要求される最適な時間間隔を決定することができると思われる。
本発明の実施は、特に記載がないかぎり、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、遺伝学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の通常の技術を用い、これらは当技術分野の範囲内である。そのような技術は文献に詳細に説明されている。例えば、Genetics; Molecular Cloning A Laboratory Manual、第2版、Sambrook, J.ら編(Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))；Short Protocols in Molecular Biology、第3版、Ausubel, F.ら編(Wiley, NY (1995))；DNA Cloning、第IおよびII巻(D. N. Glover ed., 1985)；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait編(1984))；Mullisら、米国特許第4,683,195号；Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins編(1984))；論文、Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y)；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (MayerおよびWalker編、Academic Press, London (1987))；Handbook Of Experimental Immunology、第I〜IV巻(D. M. WeirおよびC. C. Blackwell編(1986))；ならびにMiller, J. Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1972))を参照されたい。
X. バイオフィルムにおける転写活性化因子ポリペプチドの役割
一つの態様において、本発明は表面上または領域内のバイオフィルムの生成を分散または予防する方法であって、転写因子調節化合物、例えばHTHタンパク質調節化合物、AraCファミリーポリペプチド調節化合物、AraCファミリーポリペプチド調節化合物またはMarA阻害化合物の有効量を投与することによる方法に関する。
MarAおよびその相同体の不在は大腸菌におけるバイオフィルム生成に対して負の効果を有することが見いだされた。この知見を遺伝的に確認するために、marAをコードするプラスミドをmarA、soxS、およびrobを欠失した大腸菌株（トリプルノックアウト）に形質転換した。このトリプルノックアウトにおけるMarAの発現は、この宿主におけるバイオフィルム生成を野生型宿主に匹敵するレベルにまで回復した。
「バイオフィルム」なる用語は、水性および他の環境の界面に発生し、存続する生物学的フィルムを含む。バイオフィルムは、定住微生物により分泌される一つまたは複数のマトリクスポリマーからなる有機ゲル状構造に埋め込まれた微生物からなる。「バイオフィルム」なる用語は、検出するのに十分な数で表面に接着した細菌または表面に接着した微生物群集も含む（Costerton, J. W.ら、(1987) Ann. Rev. Microbiol. 41:435-464；Shapiro, J. A. (1988) Sci Am. 256:82-89；O'Toole, G.ら、(2000) Annu Rev Microbiol. 54:49-79）。
もう一つの態様において、本発明は被検者のバイオフィルム関連状態の治療法であって、被検者に転写因子調節化合物、例えばMarAファミリー阻害化合物の有効量を、バイオフィルム関連状態が治療されるように投与することによる方法に関する。
「バイオフィルム関連状態」なる用語は、細菌バイオフィルムの存在または存在の可能性によって特徴づけられる障害を含む。多くの医学的に重要な病原体がバイオフィルムを生成し、バイオフィルムの生成は感染過程の一成分であることが多い（Costerton, J. W.ら、(1999) Science 284:1318-1322）。バイオフィルム関連状態の例には、中耳感染症、嚢胞性線維症、骨髄炎、ざ瘡、歯の空洞、および前立腺炎が含まれるが、これらに限定されることはない。バイオフィルム関連状態には、一つまたは複数の細菌、例えば緑膿菌による被検者の感染症も含まれる。バイオフィルム生成の一つの結果は、バイオフィルム内の細菌が一般に、そのプランクトン様の対応物に比べて一連の異なる抗生物質に対して感受性が低いことである。
さらに、本発明は、表面上または領域内のバイオフィルムの生成を予防する方法であって、領域を転写因子調節化合物、例えばMarAファミリー阻害化合物などの有効量に接触させることによる方法に関する。
工業施設は工業用水系の生物汚損を防止する多くの方法を用いている。多くの微生物が工業用水内のバイオフィルム生成に関与している。工業用水系における粘液生成細菌の増殖は、熱伝達の低下、ラインおよびバルブの汚損および遮断、ならびに表面の腐食または分解を含む問題を引き起こす。過去における細菌増殖の制御は、殺生物剤によって行われていた。多くの殺生物剤および殺生物製剤が当技術分野において公知である。しかし、これらの多くは環境上有害または有毒であり、分解に対して抵抗性であることが多い成分を含む。
AraCファミリー阻害化合物およびMarAファミリー阻害化合物などであるが、これらに限定されることはない、本発明の転写因子阻害化合物は、工業、臨床、家庭、および個人ケアを含む様々な環境において有用である。本発明の組成物は、標的生物に対して単独、相加的、または相乗的に作用する活性成分として、一つまたは複数の本発明の化合物を含むことができる。
本発明のMarAファミリー阻害化合物および調節化合物は、工業、薬剤学、家庭、および個人ケアを含む環境において用いるのに適した組成物に製剤することができる。一つの態様において、本発明の化合物は水溶性である。調節化合物を許容される担体系と共に適用または送達することができる。組成物は、適当な担体と共に、活性成分（例えば、MarAファミリー調節化合物、例えばMarAファミリーポリペプチド阻害剤化合物などの本発明の転写因子調節化合物）を、これが直接または間接投与した場合に、都合よく利用できる形で存在するように、安定な様式で分散または溶解しうるように、適用または送達することができる。
同様に、本発明の組成物の別の成分を、治療成分の所望の濃度レベルを得るための規定の用量に従い、成分が最終的には互いに密接な混合物になるかぎり、あらかじめ混合することもでき、または各成分を同じ環境に別々に加えることもできる。さらに、本発明は持続的または間欠的に投与または送達することもできる。
本発明の転写因子調節化合物、例えば、MarAファミリー調節化合物は、組成物中に存在する場合、一般には約0.000001％から約100％、より好ましくは約0.001％から約50％、最も好ましくは約0.01％から約25％の量で存在することになる。
担体を含む本発明の組成物としては、本組成物は、少なくとも一つの担体を重量で、例えば約1%から約99%、好ましくは約50%から約99%、最も好ましくは約75%から約99%含む。
本発明の転写因子調節化合物、例えば、AraCファミリーポリペプチド阻害化合物は、任意の適当な担体と共に製剤し、液剤、マイクロエマルション、懸濁剤またはエアロゾルなどの剤形で送達するために調製することができる。エアロゾルまたは本発明のいかなる他の送達手段の生成も、当技術分野において公知の方法のいずれかによって達成することができる。例えば、エアロゾル送達の場合、化合物を適当な担体と共に細分した形で、噴射剤と共に供給する。液化噴射剤は典型的に周囲環境では気体であり、加圧下で凝縮される。噴射剤は、プロパンおよびブタン、または5炭素までのアルカンなどの他の低級アルカンを含む、当技術分野において許容され、知られているいかなるものでもよい。組成物は適当な噴射剤を含み、バルブを備えた容器内に入れ、バルブの動きによって放出されるまでは高圧に維持される。
本発明の組成物は、軟膏、ペースト、ゲル、噴霧剤および液剤などの局所または局部適用に適しているが、これらに限定されることはない、通常の剤形に、安定化剤、浸透剤、および担体または希釈剤を化合物と共に当技術分野において公知の技術によって組み込むことにより、製剤することができる。これらの製剤は、腸内、非経口、局所または吸入適用に適した通常の剤形に製剤することができる。
本発明は、家庭内使用に適した組成物において用いることができる。例えば、本発明の化合物はクレンザー、洗剤、消毒薬、台所用洗剤、セッケンおよび洗剤などの家庭用製品における活性抗菌成分としても有用である。一つの態様において、本発明の転写因子調節化合物は微生物の予防、除去、または停止のために有効な量および剤形で送達することができる。
家庭内使用のための本発明の組成物は、例えば、少なくとも一つの本発明の転写因子調節化合物および少なくとも一つの適当な担体を含む。例えば、組成物は全組成物の重量パーセンテージに基づき、約0.00001重量％から約50重量％、好ましくは約0.0001重量％から約25重量％、最も好ましくは約0.0005重量％から約10重量％の調節化合物を含むことができる。
本発明の転写因子調節化合物は、個人ケアのための衛生組成物において用いることもできる。例えば、本発明の化合物を化粧クレンザー、収斂剤、ボディ洗剤、シャンプー、コンディショナー、化粧品および他の衛生製品などの個人ケア製品中の活性成分として用いることができる。衛生組成物は、本発明の化合物の効果が損なわれないかぎり、所望の剤形（固体、液体、半固体またはエアロゾルなど）を得るために当技術分野において公知のいかなる担体または媒体も含むことができる。衛生組成物の調製は本明細書には詳細に記載しないが、当技術分野において公知である。そのような方法の議論のために、The CTFA Cosmetic Ingredient Handbook、第2版、1992、およびA Formulary of Cosmetic Preparations (第2巻、7〜16章)の5〜484ページを参照として本明細書に組み込む。
個人ケアにおいて用いるための衛生組成物は一般に少なくとも一つの本出願の調節化合物および少なくとも一つの適当な担体を含む。例えば、組成物は全組成物の重量パーセンテージに基づき、約0.00001重量％から約50重量％、好ましくは約0.0001重量％から約25重量％、より好ましくは約0.0005重量％から約10重量％の本発明の転写因子調節化合物を含むことができる。
本発明の転写因子調節化合物は、工業において用いることもできる。工業的状況において、微生物は工業的混入および生物汚損の原因となることが多く、微生物の存在が問題となりうる。工業適用のための本発明の組成物は、工業用途の組成物中に本発明の化合物の有効量を、そのような系の処理において有用であることが当技術分野において公知の、少なくとも一つの許容される担体または媒体と共に含むことができる。そのような担体または媒体は、希釈剤、解膠剤、浸透剤、展着剤、界面活性剤、懸濁化剤、湿潤剤、安定化剤、適合促進剤（compatibility agent）、粘着剤、ワックス、油、共溶媒、カップリング剤、フォーム、消泡剤、天然または合成ポリマー、エラストマー、および相乗剤を含むことができる。そのような組成物の調製法、送達系および担体は本明細書には詳細に記載しないが、当技術分野において公知である。そのような方法の議論のために、米国特許第5,939,086号を参照として本明細書に組み込む。さらに、用いる組成物の好ましい量は、活性成分および組成物を適用する状況に応じて変動しうる。
本発明の転写因子調節化合物、例えばMarAファミリーポリペプチド阻害化合物、および組成物は、非水性環境においても有用でありうる。そのような非水性環境には、その中で化合物または組成物が状況に適した様式および量で適用される地上環境、乾燥表面、または半乾燥表面が含まれるが、これらに限定されることはない。
本発明の転写因子調節化合物、例えばMarAファミリーポリペプチド調節化合物、例えばMarA阻害化合物は、個人ケア製品（歯ブラシ、コンタクトレンズケースおよび歯科器具など）、ヘルスケア製品、家庭用製品、食品表面および包装、ならびに実験室および科学装置を含む様々な基体上の接触死滅コーティングまたは層を形成するために用いることもできる。さらに、他の基体にはカテーテル、泌尿器用器具、採血および血液移動装置、気管切開器具、眼内レンズ、創傷ドレッシング、縫合糸、外科用止金、膜、シャント、手袋、組織パッチ、人工器官（例えば、心臓弁）ならびに創傷排液管などの医用器具が含まれる。さらに、他の基体にはカーペットおよび生地などの織物製品、塗料ならびに接合剤が含まれる。さらなる用途は抗菌土壌燻蒸剤としてである。
本発明の転写因子調節化合物は、多糖（セルロース、セルロース誘導体、デンプン、ペクチン、アルギネート、キチン、グアール、カラギーナン）、グリコールポリマー、ポリエステル、ポリウレタン、ポリアクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリアミド（例えばナイロン）、ポリオレフィン、ポリスチレン、ビニルポリマー、ポリプロピレン、シルクまたは生体ポリマーなどのポリマーに組み込むこともできる。調節化合物は下記の特定の官能基を有するものなどのいかなるポリマー材料にも結合することができる：1）カルボン酸、2）アミノ基、3）ヒドロキシル基、および／または4）ハロアルキル基。
非水性環境の処理用の組成物は、少なくとも一つの本出願の転写因子調節化合物および少なくとも一つの適当な担体を含むことができる。一つの態様において、組成物は全組成物の重量パーセンテージに基づき、約0.001重量％から約75重量％、有利には約0.01重量％から約50重量％、好ましくは約0.1重量％から約25重量％の本発明の転写因子調節化合物を含む。
本発明の転写因子調節化合物および組成物は、水性環境においても有用でありうる。「水性環境」には、湖または池などの天然水域；スイミングプールおよび風呂などの人工的レクリエーション水域；ならびに井戸などの飲料貯水池を含むがこれらに限定されることはない、水を含むいかなる種類の系も含まれる。本発明の組成物は、これらの水性環境での微生物増殖を処理する際に有用であると考えられ、例えば、水面またはその近くに適用することができる。
非水性環境の処理用の組成物は、少なくとも一つの本発明の転写因子調節化合物および少なくとも一つの適当な担体を含むことができる。一つの態様において、組成物は全組成物の重量パーセンテージに基づき、約0.001重量％から約50重量％、有利には約0.003重量％から約15重量％、好ましくは約0.01重量％から約5重量％の本発明の化合物を含む。
本発明は工業用途のための抗生物汚損組成物を生産するための方法も提供する。そのような方法は、少なくとも一つの当技術分野において公知の工業的に許容される任意の担体を、本発明の転写因子調節化合物との密接な混合物とする段階を含む。担体は前述の、または当技術分野において公知のいかなる適当な担体であってもよい。
適当な抗生物汚損組成物は、少なくとも一つの生存微生物を有する可能性があるか、または有している部位に組成物を送達するための、いかなる許容される剤形であってもよい。抗生物汚損組成物は、本明細書において前述された少なくとも一つの適当に選択された担体と共に、標準的製剤を用いて送達することができる。送達様式は、少なくとも一つの生存微生物を有する可能性があるか、または有している部位で抗生物汚損組成物の結合を阻害するのに有効な量を有するようなものであってもよい。本発明の抗生物汚損組成物は、これらの水性環境でスカムまたは粘液生成などの生物汚損の原因となる微生物増殖を処理する際に有用である。これらの化合物が有効でありうる工業プロセスの例には、冷却水システム、逆浸透膜、パルプおよび紙システム、空気洗浄器システム、ならびに食品加工産業が含まれる。抗生物汚損組成物は、微生物の予防、除去、または停止のために有効な量および剤形で送達することができる。
本発明の抗生物汚損組成物は一般に、少なくとも一つの本発明の化合物を含む。組成物は全組成物の重量パーセンテージに基づき、約0.001重量％から約50重量％、より好ましくは約0.003重量％から約15重量％、最も好ましくは約0.01重量％から約5重量％の本発明の化合物を含むことができる。
抗生物汚損組成物の量は、約1mg/lから約1000mg/l、有利には約2mg/lから約500mg/l、好ましくは約20mg/lから約140mg/lの量で送達することができる。
水処理のための抗生物汚損組成物は一般に、本発明の転写因子調節化合物を全組成物の約0.001重量％から約50重量％の量で含む。抗生物汚損組成物における他の成分（0.1％から50％で用いられる）には、例えば、2-ブロモ-2-ニトロプロパン-1,3-ジオール（BNPD）、β-ニトロスチレン（BNS）、塩酸ドデシルグアニジン、2,2-ジブロモ-3-ニトリロプロピオンアミド（DBNPA）、グルタルアルデヒド、イソチアゾリン、メチレンビス(チオシアネート)、トリアジン、塩化n-アルキルジメチルベンジルアンモニウム、リン酸3ナトリウム系抗菌剤、酸化トリブチルスズ、オキサゾリジン、硫酸テトラキス(ヒドロキシメチル)ホスホニウム（THPS）、フェノール、クロム化ヒ酸銅、ピリチオン亜鉛もしくは銅、カーバメート、次亜塩素酸ナトリウムもしくはカルシウム、臭化ナトリウム、ハロヒダントイン（Br、Cl）、またはその混合物が含まれうる。
本発明の組成物における他の可能な成分には、生物分散剤（全組成物の約0.1重量％から約15重量％）、水、グリコール（約20〜30％）、またはプルロニック（全組成物の約7重量％）が含まれる。持続的または半持続的使用のための、抗生物汚損組成物の濃度は約5から約70mg/lである。
工業用水処理のための抗生物汚損組成物は、全組成物の重量に基づき、約0.001％から約50％の量の本発明の化合物を含むことができる。水処理のための抗生物汚損組成物における本発明の化合物の量は、特定の環境に応じて調節することができる。ショック用量の範囲は一般に約20から約140mg/lで、半持続的使用のための濃度はこれらの濃度の約0.5倍である。
本発明は、少なくとも部分的には、バイオフィルム発生の調節法にも関する。この方法は、本発明の転写因子調節化合物を含む組成物を投与する段階を含む。組成物は、組成物のバイオフィルムを分解する能力を増強する他の成分を含んでいてもよい。
組成物は洗浄製品、例えば、バイオフィルム発生を除去、予防、阻害、または調節するための家庭用または工業用クリーナーとして調合することもできる。有利なことに、バイオフィルムは本発明の化合物の投与によって不利な影響を受け、例えば、バイオフィルム発生が減弱される。これらの組成物は、消毒薬、セッケン、洗剤、ならびに他の界面活性剤などの化合物を含むこともできる。界面活性剤の例には、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム；四級アンモニウム化合物；ヨウ化アルキルピリジニウム；トウィーン80、トウィーン85、トリトンX-100；ブリジ56；生物界面活性剤；ラムノリピド、スルファクチン、ビスコンシン、およびスルホネートが含まれる。本発明の組成物は、排水管、シャワーカーテン、グラウト、洗面所および床板を含むがこれらに限定されることはない、消毒が必要であることがわかっている領域および表面に適用することができる。特定の適用は、病院表面および医用機器である。本発明の消毒薬は、シュードモナス科（Pseudomonadaceae）、アザトバクター科（Azatobacteraceae）、リザビアセア（Rhizabiaceae）、ムチロコッカセアエ（Mthylococcaceae）、ハロバクテリウム科（Halobacteriaceae）、アセトバクター科（Acetobacteraceae）、レジオネラ科（Legionellaceae）、ナイセリア科（Neisseriaceae）、および他の属などであるが、これらに限定されることはない細菌に対する消毒薬として有用でありうる。
本発明はコンタクトレンズの洗浄および消毒法にも関する。この方法はコンタクトレンズを、許容される担体中の少なくとも一つの本発明の化合物の溶液と接触させる段階を含む。本発明は、溶液をコンタクトレンズの洗浄用に用いるための指示書と共に包装された、化合物を含む溶液にも関する。
本発明は、医用留置器具の処理法も含む。この方法は、少なくとも一つの本発明の化合物を医用留置器具と、バイオフィルムの生成を防止または実質的に阻害するなどのために接触させる段階を含む。医用留置器具の例にはカテーテル、整形外科用器具およびインプラントが含まれる。
本発明の化合物を含む歯磨剤または含嗽剤を、本発明の化合物を歯磨剤および含嗽剤の製剤に加えることにより、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、第18版、Mack Publishing Co., 1990、109章（その全体が参照として本明細書に組み込まれる）に記載のとおりに製剤することができる。歯磨剤はゲル、ペースト、粉末またはスラリーとして製剤することができる。歯磨剤は結合剤、研磨剤、着香剤、発泡剤および湿潤剤を含んでいてもよい。含嗽製剤は当技術分野において公知で、本発明の化合物をこれらに都合よく加えることができる。
一つの態様において、本発明は本明細書において表4および5、ならびに式（I）〜（X）に記載の各転写因子調節化合物に関する。
本明細書の全体を通して引用されたすべての文献、特許出願、および特許の内容は、参照として本明細書に明白に組み込まれる。本明細書において開示された各文献はどの全体が参照として本明細書に組み込まれる。本出願が優先権を主張するいかなる特許出願も、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。
本発明は下記の実施例によってさらに例示されるが、これらの実施例はさらに限定的であると解釈されるべきではない。
発明の例示
実施例1：試験化合物の合成
本出願における転写調節化合物は、当技術分野において認められている技術により、または本明細書に記載の方法を用いて、合成することができる。
6-(2-アミノ-フェニル)-3-チオキソ-3,4-ジヒドロ-2H-[1,2,4]トリアジン-5-オン
Figure 0004933730
 この化合物を文献法（Doleschall, G.; Lempert, K. Tetrahedron 1973, 29, 639-649）の改変版により調製した。イサチン（10g、67.96mmol）を約10％のKOH水溶液（9.9g/100mL水）に溶解し、次いでチオセミカルバジド（6.28g、68.90mmol）で処理した。115℃（浴温）で1時間加熱した後、反応混合物を氷上に注ぎ、氷酢酸をpH約5になるまで滴加して処理した。黄色のふわふわした沈殿をろ過し、大量の水（8x50mL）で洗浄し、まず風乾し、次いで高減圧下で乾燥して、黄色固体を得た（12.9g）。
6-(2-アミノ-フェニル)-3-ブチルスルファニル-2H-[1,2,4]トリアジン-5-オン
Figure 0004933730
 この化合物を文献法（Doleschall, G.; Lempert, K. Tetrahedron 1973, 29, 639-649）の改変版により調製した。前実験からの生成物（8.0g、36.3mmol）を約10％のKOH水溶液（10.3g/100mL水）に溶解し、nBuI（7mL）で処理した。これにエタノール（70mL）を加え、反応混合物を終夜撹拌した。反応混合物をエーテル（100mL）および水（70mL）で希釈した。エーテル層を分離し、水相をエーテル（3x100mL）でさらに洗浄し、次いで氷上に注いだ。0〜4℃で激しく撹拌しながら氷酢酸を注意深く滴加すると黄色沈殿が得られ、これをろ過し、水（4x20mL）と次いでエーテル（2x10mL）で洗浄し、乾燥した。収量：5.12g。
同様の方法に従い、ヨウ化n-ブチルの代わりに他のハロゲン化アルキルまたは置換アルキルを用いた。
3-メチルスルファニル-6-(G)-6,7-ジヒドロ-5-オキサ-1,2,4,7-テトラアザ-ジベンゾ[a,c]シクロヘプテン
Figure 0004933730
 この化合物を文献法（Doleschall, G.; Lempert, K. Tetrahedron 1973, 29, 639-649）の改変版により調製した。無水エタノール（3〜4mL）中、化合物2（または2の類縁体）（約0.384mmol、1当量）の懸濁液に、氷酢酸（25μL）を加え、続いて約1.1当量の対応するアルデヒド（G-CHO（式中、G＝置換または無置換脂肪族、芳香族、または複素環基））を加えた。反応混合物を約5〜7分間還流して暗赤色〜暗赤橙色溶液を得た。室温まで冷却すると、橙色〜橙黄色固体が溶液から析出し、これをろ過し、冷（約-30℃）メタノール（2x1mL）および／またはエーテルで洗浄し、乾燥した。いくつかの場合には、粗生成物をDMF/エーテルまたはメタノール/エーテルから再結晶した。ほとんどの場合に、前述のとおりに調製した粗生成物は純度＞95％であった。様々なケトン（GCOG'）を2（または2の類縁体）と同様の方法で反応させて、構造タイプ4の化合物を得た。最終化合物はすべて1H NMR、LC-MS、HPLC（C18カラム、流動層としてアセトニトリル/0.01％トリエチルアミンを含む水）、およびCHN分析により特徴分析した。
オルトエステルの一般合成、GC(OR)3；R＝Me
Figure 0004933730
 所望のオルトエステルの合成を文献法の改変版により多段階で達成した（McClelland, R. A.ら、J. Org. Chem. 1981, 46, 1011-1012）。この方法でいくつかの新規オルトエステルを調製した。酸塩化物のジクロロメタン溶液に、N-メチルアニリンをゆっくり加え、続いてトリエチルアミンおよび触媒量の4-ジメチルアミノピリジンを加えた。これを約12時間撹拌した後、反応混合物をエーテルで希釈し、沈殿をろ過し、エーテルで洗浄して乾燥した。このようにして調製したアミドをジクロロメタン中でメチルトリフレートと共に終夜撹拌し、エーテルで希釈し、沈殿をろ過し、洗浄し、乾燥してイミダトニウムトリフレート塩を得た。この塩をジクロロメタンに溶解し、0℃に冷却し、ナトリウムメトキシドの冷（0℃）無水メタノール溶液に約30〜60分かけて撹拌しながらゆっくり加えた。溶媒を蒸発乾固し、残渣をn-ヘキサンで抽出した。ヘキサンを蒸発させて白色固体を得、これを無水メタノールに溶解し、氷酢酸で処理した。10分間撹拌した後、過剰の酸を炭酸カリウム（固体）で中和し、溶媒を減圧下で除去した。残渣をエーテルで抽出し、水で洗浄し、炭酸カリウムで乾燥した。エーテルを蒸発させて粗製材料を得、フラッシュクロマトグラフィまたは分別蒸留のいずれかによってさらに精製した。
3-メチルスルファニル-6-(G)-5-オキサ-1,2,4,7-テトラアザ-ジベンゾ[a,c]シクロヘプテン
Figure 0004933730
 タイプ2の化合物（0.384mmol、1当量）をエタノール（2〜3mL）に懸濁し、氷酢酸（100μL）と、続いて一般式G-C(OR)3（式中、G＝置換または無置換脂肪族、芳香族、または複素環基、R＝H、置換または無置換脂肪族、芳香族、または複素環基）のオルトエステル（2当量）で処理した。反応混合物を70〜180分間還流し、室温まで冷却した。生成物が溶液から析出するものもあったが、それ以外の場合には粗反応混合物を蒸発乾固し、最少量のメタノールに再度溶解し、エーテルで希釈した。固体をエーテル（冷、0〜4℃；1x1mL）で洗浄し、減圧下で乾燥した。
4-ヨード-3-ニトロチオアニソール
Figure 0004933730
 フラスコに4-ヨードチオアニソール（10g）および硫酸ジメチル（5.5mL）を加え、約90℃で120分間加熱した。得られた溶液を濃硫酸（30mL）に溶解し、約0〜4℃に冷却し、その後厳重に注意して反応温度を4℃未満に維持しながら、濃HNO3（約2mL）でゆっくり処理した。約10分間撹拌後、反応混合物を約90℃で約3日間撹拌した。反応をHPLC、TLC、およびLC-MSでモニターし、必要があれば少量の硝酸を反応混合物に加えて、反応を完了させた。発煙硝酸の使用も役立つ。芳香族出発物質が完全に消費された後、反応混合物を冷却し、砕氷上に注ぎ、4℃で30％過塩素酸による処理を行った。淡い色の沈殿をろ過し、水で徹底的に洗浄し、減圧下で乾燥した。過塩素酸塩を飽和NaCl水溶液と共に95℃で3〜6時間撹拌した。室温まで冷却し、沈殿をろ過し、水で徹底的に洗浄していかなる無機塩も除去し、減圧下で乾燥して、4-ヨード-3-ニトロチオアニソールを＞80％の収率で得た。
4-ヨード-3-アミノチオアニソール
Figure 0004933730
 4-ヨード-3-ニトロチオアニソール（約7g）を無水エタノールに溶解し、12％HCl水溶液中、SnCl2.2H2Oの溶液でゆっくり処理した。反応混合物を50℃で25〜30分間撹拌し、この時点でHPLCモニタリングにより反応の完了が示された。反応混合物を砕氷上に注ぎ、NaOH水溶液で処理してpH8とした。沈殿をろ過し、水で洗浄し、風乾した。粗製材料のエタノール（最少量）溶液を10％HCl水溶液で処理し、終夜冷却（4℃）することにより結晶化させた。結晶性材料を高減圧下でさらに乾燥し、所望のアミンをその塩酸塩として＞70％の収率で得た。
4-メチルスルファニル-2'-ニトロ-ビフェニル-2-イルアミン
Figure 0004933730
 4-ヨード-3-アミノチオアニソール（1mmol）、Pd(OAc)2（0.01mml）のメタノール/ジオキサン（20mL/5mL）溶液/懸濁液をアルゴンで約5分間パージした。この溶液にEt3N（3mmol）および水（5mL）を加え、アルゴンでさらに5分間パージした。前述の溶液に2-アミノフェニルボロン酸（2mmol、DMF（5mL）溶液、アルゴンパージ）を加え、反応混合物を70℃（油浴温）で2時間加熱した。反応をHPLCおいびLC-MSでモニターして生成物の生成を追跡した。次いで反応混合物を室温まで冷却し、珪藻土を通してろ過した。ろ液を濃縮し、調製用HPLCを用いて精製した。
4-メチルスルファニル-2'-アミノ-ビフェニル-2-イルアミン
Figure 0004933730
 フラスコに4-メチルスルファニル-2'-ニトロ-ビフェニル-2-イルアミン（約1mmol）、エタノール（15mL）、およびPtO2（0.1mmol）を加え、40psiの水素雰囲気下で10分間撹拌した。反応混合物を珪藻土を通してろ過し、エタノールで洗浄し、合わせた有機層を蒸発乾固した。粗製材料を調製用HPLCで精製した。同じ材料を前の方法（スズキカップリング条件）により4-ヨード-3-アミノチオアニソールから出発し、調製用HPLCで精製して調製することもできる。
6-(G)-3-メチルスルファニル-5H-ジベンゾ[d,f][1,3]ジアゼピン
Figure 0004933730
 2,2'-ビフェニルジアミン（0.093g；0.51mmol）のエタノール（2mL）溶液に、氷酢酸（50μL）および一般式GC(OR)3のオルトエステル（2当量）を加えた。ジアミンのTFA塩の場合、反応混合物に酢酸を加える必要はなかった。反応混合物を3時間還流し、室温まで冷却し、蒸発乾固した。残渣を無水HClで飽和したメタノールに懸濁し、数分間撹拌し、ろ過し、メタノールおよび最後にエーテルで洗浄した。ジアゼピンの塩酸塩を減圧下で乾燥して淡黄色固体を得た。ジアゼピンの遊離塩基を得るために、前述の塩酸塩をメタノールに懸濁し、10％NaOH水溶液で処理した。室温で約10分間撹拌後、沈殿をろ過し、水で洗浄し、減圧下で乾燥した。
3-(6-ニトロ-2-フェニル-ベンゾイミダゾル-1-イル)-プロピオニトリルおよび3-(5-ニトロ-2-フェニル-ベンゾイミダゾル-1-イル)-プロピオニトリル
Figure 0004933730
Figure 0004933730
 5-ニトロ-2-フェニルベンズイミダゾール（1g、4.2mmol）、アクリロニトリル（50mL）およびN,N-ジメチルピリジン（25mg）の混合物を70℃で4時間加熱した。過剰のアクリロニトリルを蒸発させ、油状残渣をヘキサン-酢酸エチル（75：25v/v）を溶離剤として用いてシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィにかけた。位置異性体の構造を1H NOESY試験を用いて決定した。6-ニトロ異性体（0.25g、20％）および5-ニトロ異性体（0.23g、18.9％）を得た。
3-(6-ニトロ-2-フェニル-ベンゾイミダゾル-1-イル)-プロピオン酸および3-(5-ニトロ-2-フェニル-ベンゾイミダゾル-1-イル)-プロピオン酸
Figure 0004933730
Figure 0004933730
 6-ニトロニトリル（0.15g、0.51mmol）に濃HCl（5mL）を加え、得られた混合物を50℃で0.5時間加熱した。酸を減圧下で蒸発させ、生成物をHPLCで精製した。収量34mg（21％）。同じ方法を用いて5-ニトロニトリルから出発し、生成物（22mg、13.8％）を得た。
実施例2：
本実施例では、選択マーカー（例えば、ccdB）の発現をMarAにより活性化したプロモーター（例えば、inaA、galT、またはmicF）の直接制御下で行う。MarA非存在下では、選択マーカーの発現はサイレントで、細胞は生存する。細菌または酵母細胞中での誘導性プラスミドからのMarAの合成により、inaAプロモーターの活性化、ccdBの発現が引き起こされ、続いて細胞死をきたす。MarAを阻害する化合物は、MarA発現の条件下で細胞生存を可能にするものである。このアッセイの結果を表4に示す。表4において、*はMarAの良好な阻害を示し、、**はMarAの非常に良好な阻害を示す。
実施例3：
本実施例では、構成性にMarAを発現している細胞においてルシフェラーゼの発現をMarAにより活性化したプロモーター（例えば、inaA、galT、またはmicF）の直接制御下で行う。MarA非存在下では、細胞は発光する。MarA活性を調節することにより、レポーターの発現が変化する。
（表４）
Figure 0004933730
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実施例4：
本実施例では、選択マーカー（例えば、ccdB）の発現をMarAにより抑制したプロモーター（例えば、fecA、purA、guaB）の直接制御下で行う。構成性MarA合成の条件下（例えば、構成性mar（marc）を用いて）で、ccdBの発現はサイレントである。MarAの不活化後、ccdBの合成により細胞死が引き起こされる。
実施例5：
本実施例では、選択マーカー（例えば、URA3）の発現をMarAにより抑制したプロモーター（例えば、fecA、purA、guaB）の直接制御下で行う。構成性MarA合成の条件下（例えば、構成性mar（marc）を用いて）で、URA3の発現はサイレントである。MarAの不活化後、5-FOA存在下、URA3の合成により細胞死が引き起こされる。
実施例6：
本実施例では、大腸菌において染色体guaBまたはpurA遺伝子のいずれかの不活化によりプリンまたはグアニン従属栄養体を構築する。次いでguaBまたはpurA遺伝子をその天然プロモーターの制御下で適当なベクターにのせ、従属栄養宿主に形質転換する。
実施例7：大腸菌バイオフィルムアッセイ
バイオフィルムアッセイにより、試験化合物が細菌のバイオフィルム生成を阻害する能力についてスクリーニングする。
材料：
M9培地（「M9」）はM9、カザミノ酸、およびグルコースを含んでいた。試験化合物を10mg/mL DMSO保存溶液に溶解した。
方法：
接種材料の調製
実験日にコロニーまたはグリセロール保存溶液穿刺材料を2mLのM9に加えることによって接種材料を開始した。試験管を37℃の振盪インキュベーター中で約4〜6時間培養した。この接種材料を「スターター接種材料」と呼んだ。接種材料を振盪インキュベーターから取り出し、M9中で1x106細胞/mLに希釈した。
対照の調製
典型的には、陽性および陰性対照を含むそれぞれ8つの対照があった。陽性および陰性対照の両方で、2.5μLのDMSOを200μLのM9に加えた。アッセイプレート中の50μLのM9に25μLの希釈DMSOを加えた。
試験化合物の調製
試験化合物を20μg/mLでスクリーニングした。10mg/mLの保存溶液を含むプレートから2.5μLの試験化合物を取って200μLのM9に加え、混合した。25μLの希釈試験化合物をアッセイプレート中の50μLのM9に加えた。得られた試験化合物濃度は40μg/mLであった。
プレートの調製
1x106細胞/mLの接種材料75μLを化合物および陽性対照を含む各ウェルに加えた。75μLのM9を陰性対照に加えた。試験化合物の最終濃度は20μg/mLで、接種材料の最終濃度は2x105細胞/mLであった。次いで、プレートをマイクロプレート読み取り器（Wallac Victor2V）に置き、OD535を読み取った（「初期増殖値」）。次いでプレートを35℃のインキュベーターで終夜培養した。
翌朝、プレートをマイクロプレート読み取り器でOD535を読み取った（「最終増殖値」）。
クリスタルバイオレットの添加
次いで接種材料をウェルから除去し、プレートを水道水で数回洗浄した。150μLのクリスタルバイオレット（0.02％で水に溶解したクリスタルバイオレット）を各ウェルに加えた。
エタノールの添加
次いでクリスタルバイオレットを除去し、プレートを水道水で数回洗浄した。混合後、150μLのエタノールを各ウェルに加えた。次いで、プレートをマイクロプレート読み取り器に置き、OD535を読み取った。これは「クリスタルバイオレット」値と呼んだ。
データ解析
試験化合物が増殖を阻害したかどうかを評価するために、初期増殖値を最終増殖値から減じた（「減算増殖」）。同じことを陽性対照に対しても行い、平均した。増殖阻害％を下記の式によって求めた：
100-(100*試料の減算増殖/陽性対照の平均増殖)
試験化合物がバイオフィルム生成を阻害したかどうかを評価するために、バイオフィルム生成阻害％を下記の式を用いて求めた：
100-(100*試料のクリスタルバイオレット値/陽性対照の平均クリスタルバイオレット値)
クリスタルバイオレットアッセイの結果を表5にまとめている。表5において、NDはCVアッセイにおいて所与の化合物がバイオフィルム生成を阻害しなかったことを示している。*は試験化合物がバイオフィルム生成をある程度阻害したことを示し、**は化合物がバイオフィルム生成を強く阻害したことを示している。
実施例8：MarA、SoxS、またはRobのDNA結合阻害剤についてのLANCEスクリーニングアッセイ
本実施例は、インビトロ系でMarA、SoxS、および／またはRobなどの精製転写因子の標的DNA配列との相互作用を阻害する試験化合物を同定する方法について記載する。そのような分子はインビボでこの相互作用を阻害することができ、これらの因子による転写調節の阻害、および最終的にはMarA、SoxS、およびRobに関連する薬剤耐性および／または病原性表現型の阻害につながることが期待される。
材料
6His標識MarA、SoxS、およびRobをそれぞれのプロトコルに従って精製した。N末端ビオチン化二本鎖DNAは
Figure 0004933730
の配列を有する。用いた抗体はLANCE Eu標識抗6xHis抗体（Eu-aHis）（Perkin Elmerカタログ#AD0110）で、これは抗体一つにつき少なくとも6つのユーロピウム分子を有する。登録商標SureLight-Allophycocyanin（SA-APC）に結合したストレプトアビジンをPerkin Elmer（カタログ#CR130-100）から入手した。アッセイ緩衝液は20mM Hepes pH7.6、1mM EDTA、10mM (NH4)2SO4、および30mM KCl、ならびに0.2％トウィーン-20を含んでいた。
方法
試験する化合物のプレートまたはバイアルを解凍した。これらの保存溶液はDMSO中10mg/mlの濃度であった。溶液を完全に解凍し、プレートをTitermix上で短時間振盪して沈殿した化合物があれば再度溶解した。-80℃で保存した保存溶液からのMarA、SoxS、およびRobタンパク質ならびに-20℃で保存したジチオスレイトールの1M保存溶液の解凍した一定量を氷上に置いた。
新しい96穴ポリスチレンプレートに化合物を1：100で希釈した。希釈液は100％DMSOで調製し、最終濃度100μg/mlの溶液とした。希釈液をTitermix上でボルテックスにかけた。
新鮮DTTを25〜50mLのアッセイ緩衝液に加えて最終濃度1mMとした。次に、90μlのアッセイ緩衝液を各タンパク質10μlの一定量に加え、溶液をピペッティングによって混合した。これらのタンパク質を希釈して各希釈タンパク質の必要量を得、ウェルごとに希釈タンパク質20μlとした。溶液を調製する際に、対照ウェルに対しても十分となるように20％過剰に調製した。典型的には、タンパク質調製物および実施した初期結合曲線に応じて、ウェルごとに各タンパク質1000〜2000fmolが必要とされた。希釈タンパク質溶液を氷上に置いた。
化合物のプレートごとに三つの試験プレート（MarA、SoxS、およびRobのために）を調製した。マルチチャネルピペットを用いて、5μlの化合物を各ウェルに加えた。5μlのDMSOをブランクおよび対照ウェルに加え、5μlの対照阻害剤をそｒぞれのウェルに加えた。
マルチチャネルピペットを用いて、20μlのタンパク質を「ブランク」と示されたものを除くすべてのウェルに加えた。これらのブランクウェルには、20μlのアッセイ緩衝液を加えた。プレートをプレートシーラーで覆い、Titermix上で振盪しながら室温で30分間インキュベートした。
次に、DNA溶液を、試験するものよりも少なくとも20％多いウェルに十分であるように調製した。15μl（0.4fmol）をウェルごとに加えた。次いでDNAをアッセイ緩衝液で希釈し、短時間ボルテックスにかけて混合した。プレートシーラーを除去し、15μlのDNA溶液をすべてのウェルに加えた。次いでプレートを再度シールし、Titermixに戻してさらに30分間インキュベートした。
25分後、抗体溶液を調製した。0.4fmolのSA-APCおよび0.125fmolのEu-aHisをウェルごとに全量10μlで加えた。少なくとも20％過剰に十分な量を調整した。プレートシーラーを除去し、10μlの抗体溶液をすべてのウェルに加えた。続いてプレートを再度シールし、Titermix上に置き、アルミホイルで覆った。プレートを1時間混合した。次いでプレートをWallac Victor V上で、LANCE 615/665プロトコルを用いて読み取った。
データ処理
各プレートについて、平均対照（すなわち、阻害なしのタンパク質およびDNAからのシグナル）、平均ブランク（タンパク質なしのバックグラウンドシグナル）および平均阻害剤（P001407）LANCE665カウントを求めた。各分子（各試験ウェル）による阻害パーセントを下記の式に従って求めた：
阻害％＝100-(((試験-平均ブランク)/(平均対照-平均ブランク)*100)
40％以上の阻害を示した化合物をヒットとし、IC50について再度スクリーニングした。
IC50スクリーニング
用いたプロトコルは、プレートごとに10化合物しかアッセイしなかったという以外は、前述のプロトコルと同じであった。試験濃度は10μg/mlから開始し、10から0.078μg/mlまで2倍希釈した。
IC50データ処理
阻害パーセントを前述のとおりに計算した。次いで、Graph pad Prismソフトウェアを用いて阻害パーセントを阻害剤濃度の対数に対してプロットした。IC50濃度は50%阻害を生じる濃度として決定した。
本実施例からのデータも表5にまとめている。***は特定の試験化合物が特定の細菌を非常に強く阻害したことを示し、**は特定の試験化合物が特定の細菌を強く阻害したことを示し、*は特定の試験化合物が特定の細菌をある程度阻害したことを示している。
実施例9：ルシフェラーゼアッセイ
ルシフェラーゼアッセイを用いて試験した化合物のいずれかが発光シグナルを低下させるかどうかを調べる。これは、試験化合物が、Marによって調節されるmicFの調節に影響をおよぼすことを示している。
材料
用いた細菌は大腸菌AG112KmicF-Lucであった。陰性対照菌は大腸菌AG112であった。試験化合物を10mg/mL DMSO保存溶液中で調製した。
方法
接種材料の調製
接種材料（または「スターター接種材料」）を実験日の前夜に、コロニーまたはグリセロール保存溶液の穿刺材料を2mLのLB培地に加えることによって開始した。スターター接種材料を37℃の振盪インキュベーターに入れ、終夜培養した。
翌日、スターター接種材料を振盪器から取り出し、新鮮LB培地に加えた。アッセイする各プレートに対し、加えるLB1mLあたり5〜10μLのスターター接種材料を加えて6mLのLB培地を調製し、「試験接種材料」とした。典型的には、4つの試験化合物プレートをアッセイした。この典型的実施例において、各プレートに6mLのLB培地、または24mLのLBを用い、続いて5μL/mLのスターター接種材料、または120μLのスターター接種材料を加えて試験接種材料とした。
試験接種材料の調整後、試験接種材料を37℃の振盪器に入れ、約4時間インキュベートした。試験接種材料の細菌増殖を、分光光度計で535nmのODを読み取ることによりモニターした。ODが0.6から1.5に達すれば、試験接種材料を取り出すべきである。
対照の調製
陽性および陰性対照を、2μLのDMSOを198μLのLB培地に加えることにより調製した。対照それぞれに少なくとも4つを調製した。典型的には、それぞれ8つであった。50uLの希釈DMSOをアッセイプレート中の50uLのLB培地に加えた。
化合物の調製
化合物を25ug/mLでスクリーニングした。化合物それぞれで二つの同じプレートを用意した：1つは増殖用の透明のプレート（「透明プレート」）、1つは発光用の白色のプレート（「白色プレート」）。次に、各化合物2μLを娘プレート（10mg/mL保存溶液を含む）から取り、198μLのLB培地に加えた。試料を混合した。次に、すべてのアッセイプレート中の25μLのLB培地に25μLの希釈試験化合物を加えた。この段階の化合物濃度は50μg/mLであった。
プレートの調製
50μLの試験接種材料をプレートの陰性対照用以外の各ウェルに加えた。陰性対照の半分には50μLのAG112を加え、残りの半分には50μLのLB培地を加えた。試験化合物の最終濃度は25μg/mLであった。
透明プレートをプレート読み取り器に置き、OD535で読み取った。これが「初期」増殖値であった。次いでプレートを37℃で5時間インキュベートした。5時間後、プレートをインキュベーターから取り出した。透明プレートをプレート読み取り器に置き、OD535で読み取った。これが「最終」増殖値であった。
100μLのPromega Steady-Glo試薬を白色プレートの各ウェル（すべての対照を含む）に加えた。プレートをアルミホイルで覆い、1000rpmに設定したプレート振盪器で10分間振盪した。次いでプレートをプレート読み取り器に置き、発光をウェルごとに1秒間測定した。これが発光値であった。
データ解析
試験化合物が増殖を阻害したかどうかを評価するために、初期増殖値を最終増殖値から減じた。これが減算増殖であった。同じ計算を陽性対照に対しても行った。陽性対照の結果を平均した。増殖阻害％を下記の式によって求めた：
100-(100*試料の減算増殖/陽性対照の平均増殖)
化合物がルシフェラーゼを阻害したかどうかを評価するために、下記の式を用いる：
100-(100*化合物の発光/陽性対照の平均発光)
NDはこの特定のアッセイにおいて特定の試験化合物が発光を低下させないようであったことを示している。*は発光がある程度低下したことを示し、**は発光がかなり低下したことを示している。このアッセイの結果も表5に示している。
等価物
当業者であれば、日常的な実験だけを用いて、本明細書に記載の特定のポリペプチド、核酸、方法、アッセイおよび試薬に対する多くの等価物を理解または確認することができると思われる。そのような等価物は本発明の範囲内であり、添付の特許請求の範囲の対象であると考えられる。
（表５）
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AraC-XylSファミリーポリペプチドの多配列整列化を示す図である。 PROSITE PS00041およびAraCファミリーポリペプチドの多配列整列化を示す図である。 PROSITE PS01124およびAraCファミリーポリペプチドの多配列整列化を示す図である。 代表的トリアジンオキサゼピンのCoMFA等高線図を示す図である。

Claims (7)

  1. 転写因子を調節する化合物を含む、微生物細胞の抗生物質耐性を低下させるための薬学的組成物であって、該化合物が、式（Ｖ）の化合物：
    Figure 0004933730
    （式中
    Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、およびＴ６はそれぞれ独立に置換もしくは無置換炭素、酸素、置換もしくは無置換窒素、または硫黄であり；
    Ｍはアルキル、アルケニル、複素環、アルキニル、または置換もしくは無置換アリールである）、またはその薬学的に許容される塩であり、
    該式（Ｖ）の化合物が以下の群から選択される、薬学的組成物。
    Figure 0004933730
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  2. 転写因子を調節する化合物を含む、転写を調節するための薬学的組成物であって、該化合物が、式（Ｖ）の化合物：
    Figure 0004933730
    （式中
    Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、およびＴ６はそれぞれ独立に置換もしくは無置換炭素、酸素、置換もしくは無置換窒素、または硫黄であり；
    Ｍはアルキル、アルケニル、複素環、アルキニル、または置換もしくは無置換アリールである）、またはその薬学的に許容される塩であり、
    該式（Ｖ）の化合物が以下の群から選択される、薬学的組成物。
    Figure 0004933730
    Figure 0004933730
    Figure 0004933730
    Figure 0004933730
    Figure 0004933730
    Figure 0004933730
    Figure 0004933730
  3. 転写因子を調節する化合物を含む、バイオフィルム生成の阻害のための薬学的組成物であって、該化合物が、式（Ｖ）の化合物：
    Figure 0004933730
    （式中
    Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、およびＴ６はそれぞれ独立に置換もしくは無置換炭素、酸素、置換もしくは無置換窒素、または硫黄であり；
    Ｍはアルキル、アルケニル、複素環、アルキニル、または置換もしくは無置換アリールである）、またはその薬学的に許容される塩であり、
    該式（Ｖ）の化合物が以下の群から選択される、薬学的組成物。
    Figure 0004933730
    Figure 0004933730
    Figure 0004933730
    Figure 0004933730
    Figure 0004933730
    Figure 0004933730
    Figure 0004933730
  4. 転写因子を調節する化合物を含む、コンタクトレンズを洗浄または消毒するための薬学的組成物であって、該化合物が、式（Ｖ）の化合物：
    Figure 0004933730
    （式中
    Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、およびＴ６はそれぞれ独立に置換もしくは無置換炭素、酸素、置換もしくは無置換窒素、または硫黄であり；
    Ｍはアルキル、アルケニル、複素環、アルキニル、または置換もしくは無置換アリールである）、またはその薬学的に許容される塩であり、
    該式（Ｖ）の化合物が以下の群から選択される、薬学的組成物。
    Figure 0004933730
    Figure 0004933730
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  5. 転写因子を調節する化合物を含む、医用留置器具の処理のための薬学的組成物であって、該化合物が、式（Ｖ）の化合物：
    Figure 0004933730
    （式中
    Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、およびＴ６はそれぞれ独立に置換もしくは無置換炭素、酸素、置換もしくは無置換窒素、または硫黄であり；
    Ｍはアルキル、アルケニル、複素環、アルキニル、または置換もしくは無置換アリールである）、またはその薬学的に許容される塩であり、
    該式（Ｖ）の化合物が以下の群から選択される、薬学的組成物。
    Figure 0004933730
    Figure 0004933730
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  6. 転写因子を調節する化合物を含む、細菌感染を予防するための薬学的組成物であって、該化合物が、式（Ｖ）の化合物：
    Figure 0004933730
    （式中
    Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、およびＴ６はそれぞれ独立に置換もしくは無置換炭素、酸素、置換もしくは無置換窒素、または硫黄であり；
    Ｍはアルキル、アルケニル、複素環、アルキニル、または置換もしくは無置換アリールである）、またはその薬学的に許容される塩であり、
    該式（Ｖ）の化合物が以下の群から選択される、薬学的組成物。
    Figure 0004933730
    Figure 0004933730
    Figure 0004933730
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    Figure 0004933730
  7. 前記化合物が以下の群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
    Figure 0004933730
    Figure 0004933730
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