JP4897054B2 - 流速測定装置、抗原濃度測定装置、流速測定方法、抗原濃度測定方法 - Google Patents

Description

本発明は、流速測定装置、抗原濃度測定装置、流速測定方法、抗原濃度測定方法に関する。
本願は、２００８年１月１６日に日本に出願された特願２００８−００６６５１号と、２００８年７月１７日に日本に出願された特願２００８−１８６０４３号とに基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

抗原濃度の検出方法として、フローセルの流路部分に露出している金属薄膜に抗体を付着させた抗体固定膜を形成し、このフローセルに抗原を含む液体を流すことにより、上記抗体に抗原が付着したことを、表面プラズモン共鳴センサを用いて、抗原抗体の複合体となったことによる抗体固定膜の屈折率変化を検出し、この屈折率変化の速度により抗原の濃度を検出する方法が用いられる（例えば、非特許文献１参照）。
これにより、抗原の濃度に応じて屈折率の変化速度が大きくなるため、この変化速度から抗原濃度を測定している。

また、近年、光を用いたバイオセンサーとして表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance、以下ＳＰＲとする）測定装置が研究されている（例えば特許文献１、特許文献２参照）。この抗原濃度測定装置では、金や銀などの金属薄膜上に抗体などの被測定物質を固定したものを測定用フローセルとして、このフローセルの抗体と反対側の面から光を入射させ、そのエバネッセンス波と表面プラズモン波とが共鳴する入射角度を測定する。

図１８は従来の抗原濃度測定装置の構成の概要を示すブロック図である。抗原濃度測定装置は、プリズム１００１と、光源１００２と、偏光板１００３と、集光レンズ１００４と、ＣＣＤカメラ１００５とを有する。
単色光の光源１００２から放射された光が偏光板１００３を通過すると、Ｐ偏光光のみが通過する。このＰ偏光光は、集光レンズ１００４で集光されて半球状のプリズム１００１に入射する。プリズム１００１の上面には、フローセル１０００が載置されており、抗体などの被測定物質が固定されている面と反対側の面からＰ偏光光が入射する。このように、Ｐ偏光光をプリズム１００１を介して入射角θでフローセル１０００に入射させることによって、フローセル１０００からの反射光の強度変化をＣＣＤカメラ１００５で検出する。

光源１００２から放射された光は、プリズム１００１とフローセル１０００の金属薄膜との境界でエバネッセント波となる。一方、この金属薄膜表面では、表面プラズモン波が生じる。エバネッセント波と表面プラズモン波の波数が一致する入射角θのとき、エバネッセント波は表面プラズモン波の励起に使われ、反射光として計測される光量が減少する。
このとき、ＣＣＤカメラ１００５によって反射光の強度を測定すると、図１９に示すように、エバネッセンス波と表面プラズモン波の共鳴が起こる入射角で、反射率の低下が観測される。これを入射角−反射率の関係を示す入射角−反射率曲線で見ると、エバネッセンス波と表面プラズモン波の共鳴が起こる入射角の近傍で反射率の低い谷が現れる。

エバネッセンス波と表面プラズモン波の共鳴が起こる角度は、フローセル１０００の金属薄膜に接する被測定物質の屈折率に依存するため、金属薄膜上に抗体などの被測定物質を固定すると、抗原との結合によって抗体の屈折率が変化し、谷の現れる角度が僅かに変化する。この変化を測定することにより、被測定物質の定量を行うことができる。
特開２００１−１９４２９８号公報 特許第３３５６２１３号公報 Milan Mrksich, George B. Sigal, and George M. Whitesides、"Surface Plasmon Resonance Permits in Situ Measurement of Protein Adsorption on Self-Assembled Monolayers of Alkanethiolates on Gold "、American Chemical Society,Langmuir, 1995，11，4383-4385

しかしながら、非特許文献１などの従来の測定にあっては、異なる抗体がフローセルの流れる方向に配置されている場合、フローセルに流れる検体が、それぞれの抗体に達したタイミングがそれぞれ明確に分からないと、抗原の濃度測定がＳＰＲ角度の変化速度により検出されるため、正確な濃度測定が行えないこととなる。
また、ＳＰＲ角度の変化速度を検出するため、入射光に対する反射光の強度を検出する際にＣＣＤカメラを用いた場合、ＣＣＤカメラのフレームレートによっては、ノイズが重畳して、抗原抗体反応の変化の立ち上がり（ＳＰＲ角度の変化点）が見え難い場合がある。
したがって、上記検体がそれぞれの抗体に達したタイミングを正確に知るためにも、検体の流速を正確に測定する必要がある。しかし、ＳＰＲ角度で測定される部分は、金属膜から１μｍ以下の流路壁に近接した部分であり、検体の粘度変化などにより流路内の流速分布が変化するため、ポンプなどの液送機構のみでは、ＳＰＲ角度の測定に影響する実効的流速を決定することができず、ＳＰＲ角度の測定毎に、流路内の流速を測定する必要がある。

本発明は、このような事情に鑑みてなされたもので、フローセル内の検体の流速を正確に測定し、直列に配列された複数の各抗体が固定されている領域において、いずれの抗体の領域に検体が達したかを検出することができる流速測定装置、抗原濃度測定装置、流速測定方法、抗原濃度測定方法を提供することを目的とする。

（１） 本発明の流速測定装置は、長尺状のフローセル内に、抗体が検体の流れる方向に配列されており、前記フローセル内を流れる前記検体の流速を測定する流速測定装置であって、光発振部と、当該光発振部からの出射光による表面プラズモン共鳴を起こすための金属薄膜と、当該金属薄膜を固定し、当該金属薄膜上に前記光発振部の出射光を、複数の入射角度の入射光に変換して直線状の焦線位置にて集光する集光部と、前記金属薄膜上に前記焦線位置に重なる位置に抗体を固定した抗体固定領域及び抗体を固定しないリファレンス領域を交互に配置した測定部と、前記焦線位置において生じた表面プラズモン共鳴による当該出射光の前記焦線位置における反射光を、複数の入射光の角度毎に受光する受光部と、前記測定部における前記抗体固定領域及び前記リファレンス領域毎のＳＰＲ角度の時間変化を求めるＳＰＲ角度算出部と、前記ＳＰＲ角度算出部が求めたＳＰＲ角度の時間変化に基づいて、前記フローセル内を流れる前記検体の流速を演算する流速演算部とを有する。

（２） 本発明の流速測定装置の前記流速演算部は、前記抗体固定領域の一点と前記リファレンス領域の一点とを合わせた２点におけるＳＰＲ角度の 時間変化を示す吸着曲線を、いずれか一方を他方に対して時間方向にずらす波形移動部と、前記２点のＳＰＲ角度の差分が最小となるずらし時間を測定する時間差検出部と、前記２点間の位置を前記ずらし時間にて除算することにより、前記フローセル内における検体の流速を算出する流速算出部とを有することが好ましい。

（３） 本発明の流速測定装置は、前記２点それぞれの吸着曲線を時間微分して微分曲線とする波形微分演算部をさらに有しても良く、前記波形移動部が２点それぞれの前記微分曲線において、いずれか一方を他方に対して時間方向にずらし、前記時間差検出部が２点それぞれの微分曲線におけるＳＰＲ角度の差分が最小となるずらし時間を測定しても良い。

（４） 本発明の流速測定装置は、ＳＰＲ角度の差分データを時間微分する波形微分演算部をさらに有しても良く、前記波形移動部が２点それぞれの前記吸着曲線において、いずれか一方を他方に対して時間方向にずらし、前記波形移動部が前記吸着曲線をずらす毎に、前記波形微分演算部が当該２点それぞれの吸着曲線の差分データを時間微分し、前記時間差検出部が２点それぞれの吸着曲線におけるＳＰＲ角度の時間微分した差分データが最小となるずらし時間を測定しても良い。

（５） 本発明の流速測定装置の前記流速演算部は、前記フローセル内を流れる前記検体の流速をハフ変換を用いて演算しても良い。

（６） 本発明の流速測定装置は、前記金属薄膜上に、前記抗体と、前記検体に含まれる物質のうち前記抗体との反応が期待されるものと異なる物質と反応して屈折率が変化する検体検出物質とが固定されていても良く、前記抗体における前記入射光の入射角と前記反射光の反射率との相関関係に基づいて反射率が最低となる入射角である共鳴角を求め、この共鳴角から前記抗体と前記検体検出物質との反応量を求める反応結果導出部と、前記検体検出物質における入射角と反射率との相関関係に基づいて共鳴角を求め、この共鳴角から前記検体検出物質および反応した検体に含まれる物質の屈折率を求める屈折率導出部と、前記屈折率導出部が求めた屈折率の変化速度から前記検体の流速の誤差量を求め、この流速の誤差量から前記反応結果導出部が求めた反応量の補正量を求めて、前記反応量を前記補正量に基づいて補正する反応結果補正部とを更に有しても良い。

（７） 本発明の流速測定装置は、前記画像処理部が求めた入射角と反射率との相関関係において前記共鳴角を求め、この共鳴角の変化から前記フローセル上に前記検体が流れ始めたことを検出したときに、測定開始信号を出力する測定開始信号出力部と、前記受光部に対して画像取得を指示する画像取得タイミング信号を繰り返し出力し、前記測定開始信号の出力時から一定時間の間は前記画像取得タイミング信号の周期を通常時よりも短くし、一定時間経過後は前記画像取得タイミング信号の周期を通常時の値に戻す画像取得周期制御部とを更に有しても良い。

（８） 本発明の流速測定装置は、前記屈折率の変化速度の理想値と、前記変化速度の誤差量と前記検体の流速の誤差量との関係と、前記流速の誤差量と前記補正量との関係が予め登録された記憶部を更に有しても良く、前記反応結果補正部は、前記屈折率導出部が求めた屈折率の変化速度と前記記憶部に登録された前記変化速度の理想値との誤差量を求め、この変化速度の誤差量に対応する前記流速の誤差量を前記記憶部から取得し、この流速の誤差量に対応する前記補正量を前記記憶部から取得しても良い。

（９） 本発明の抗原濃度測定装置は、長尺状のフローセル内に、抗体が検体の流れる方向に配列されており、前記検体に含まれる抗原の濃度を測定する抗原濃度測定装置であって、光発振部と、前記抗体と、前記検体に含まれる物質のうち前記抗体との反応が期待される抗原と異なる物質と反応して屈折率が変化する検体検出物質とが固定されており、前記光発振部からの出射光による表面プラズモン共鳴を起こすための金属薄膜と、当該金属薄膜を固定し、当該金属薄膜上に前記光発振部の出射光を、複数の入射角度の入射光に変換して直線状の焦線位置にて集光する集光部と、前記金属薄膜上に前記焦線位置に重なる位置に抗体を固定した抗体固定領域及び抗体を固定しないリファレンス領域を交互に配置した測定部と、前記焦線位置において生じた表面プラズモン共鳴による当該出射光の前記焦線位置における反射光を、複数の入射光の角度毎に受光する受光部と、前記測定部における前記抗体固定領域及び前記リファレンス領域毎のＳＰＲ角度の時間変化を求めるＳＰＲ角度算出部と、前記ＳＰＲ角度算出部が求めたＳＰＲ角度の時間変化に基づいて、前記フローセル内を流れる前記検体の流速を演算する流速演算部と、前記抗体における前記入射光の入射角と前記反射光の反射率との相関関係に基づいて反射率が最低となる入射角である共鳴角を求め、この共鳴角から前記抗体と前記検体検出物質との反応量を求める反応結果導出部と、前記検体検出物質における入射角と反射率との相関関係に基づいて共鳴角を求め、この共鳴角から前記検体検出物質および反応した検体に含まれる物質の屈折率を求める屈折率導出部と、前記屈折率導出部が求めた屈折率の変化速度から前記検体の流速の誤差量を求め、この流速の誤差量から前記反応結果導出部が求めた反応量の補正量を求めて、前記反応量を前記補正量に基づいて補正する反応結果補正部と、前記反応結果補正部が補正結果に基づいて、前記検体に含まれる抗原の濃度を算出する抗原濃度算出部とを有する。

（１０） 本発明の流速測定方法は、光発振部と、当該光発振部からの出射光による表面プラズモン共鳴を起こすための金属薄膜と、当該金属薄膜を固定し、当該金属薄膜上に前記光発振部の出射光を、複数の入射角度の入射光に変換して直線状の焦線位置にて集光する集光部と、前記金属薄膜上に前記焦線位置に重なる位置に長尺状のフローセルが構成され、このフローセル内に抗体を固定した抗体固定領域及び抗体を固定しないリファレンス領域を交互に配置した測定部と、前記焦線位置において生じた表面プラズモン共鳴による当該出射光の前記焦線位置における反射光を、複数の入射光の角度毎に受光する受光部と、を有する流速測定装置により、前記フローセル内を流れる前記検体の流速を測定する流速測定方法であって、前記測定部における前記抗体固定領域及び前記リファレンス領域毎のＳＰＲ角度の時間変化を求めるＳＰＲ角度算出過程と、前記ＳＰＲ角度算出過程で求めたＳＰＲ角度の時間変化に基づいて、前記フローセル内を流れる前記検体の流速を演算する流速演算過程とを有する。

（１１） 本発明の抗原濃度測定方法は、光発振部と、抗体と、検体に含まれる物質のうち前記抗体との反応が期待される抗原と異なる物質と反応して屈折率が変化する検体検出物質と、が固定されており、前記光発振部からの出射光による表面プラズモン共鳴を起こすための金属薄膜と、当該金属薄膜を固定し、当該金属薄膜上に前記光発振部の出射光を、複数の入射角度の入射光に変換して直線状の焦線位置にて集光する集光部と、前記金属薄膜上に前記焦線位置に重なる位置に長尺状のフローセルが構成され、このフローセル内に抗体を固定した抗体固定領域及び抗体を固定しないリファレンス領域を交互に配置した測定部と、前記焦線位置において生じた表面プラズモン共鳴による当該出射光の前記焦線位置における反射光を、複数の入射光の角度毎に受光する受光部と、を有する流速測定装置により、前記フローセル内を流れる前記検体の流速を測定する流速測定方法であって、前記測定部における前記抗体固定領域及び前記リファレンス領域毎のＳＰＲ角度の時間変化を求めるＳＰＲ角度算出過程と、前記ＳＰＲ角度算出過程で求めたＳＰＲ角度の時間変化に基づいて、前記フローセル内を流れる前記検体の流速を演算する流速演算過程と、前記抗体における前記入射光の入射角と前記反射光の反射率との相関関係に基づいて反射率が最低となる入射角である共鳴角を求め、この共鳴角から前記抗体と前記検体検出物質との反応量を求める反応結果導出過程と、前記検体検出物質における入射角と反射率との相関関係に基づいて共鳴角を求め、この共鳴角から前記検体検出物質および反応した検体に含まれる物質の屈折率を求める屈折率導出過程と、前記屈折率導出過程で求めた屈折率の変化速度から前記検体の流速の誤差量を求め、この流速の誤差量から前記反応結果導出過程で求めた反応量の補正量を求めて、前記反応量を前記補正量に基づいて補正する反応結果補正過程と、前記反応結果補正過程での補正結果に基づいて、前記検体に含まれる抗原の濃度を算出する抗原濃度算出過程とを有する。

本発明の流速測定装置、抗原濃度測定装置、フローセル、流速測定方法、抗原濃度測定方法では、フローセル内の検体の流速を正確に測定し、直列に配列された複数の各抗体が固定されている領域において、いずれの抗体の領域に検体が達したかを検出することができる。

本発明の第１の実施形態の抗原濃度検出装置３００ａのＳＰＲ角度を測定する光学測定部の構成例を示すブロック図である。 図１の抗体固定膜における焦線１０７上に沿って、焦線１０７に平行に抗体固定領域２０１及びリファレンス領域２０２が交互に配置されたフローセルの構成を示す概念図である。 図１におけるＣＣＤ１１１の２次元に配置された受光素子に入力される金属薄膜１０５からの反射光の分布の構成を示す概念図である。 本実施形態の抗原濃度検出装置３００ａにおいて、フローセル内での検体の流速を検出する構成を示すブロック図である。 ＣＣＤ１１１における各受光素子のＹ１方向の位置、Ｘ１方向の位置に対応するアドレスとして受光素子が受光した反射強度の階調度のデータ記憶部１２における記憶領域の構成を示す概念図である。 抗体固定領域２０１と、リファレンス領域２０２とにおけるＳＰＲ角度の時間変化を示すグラフである。 本実施形態における検体の流速を算出する処理の動作例を示すフローチャートである。 本発明の第２の実施形態における検体の流速を算出する処理の動作例を示すフローチャートである。 本発明の第３の実施形態に係る抗原濃度測定装置の構成を示すブロック図である。 試料セルの一般的な構造を示す平面図である。 試料セルの一般的な構造を示す断面図である。 本施形態に係る抗原濃度測定装置のデータ処理装置の構成例を示すブロック図である。 本実施形態で用いる試料セルの構造を示す平面図である。 本実施形態においてＣＣＤカメラが撮像した画像を模式的に示す図である。 本実施形態において液体サンプル導入後の試料セルの測定で得られる入射角−反射率曲線の変化を示す図である。 本実施形態において屈折率導出部６８が求めた屈折率の時間変化を示す図である。 本発明の第４の実施形態による抗原濃度検出装置のデータ処理装置の制御部１１３ｂの構成を示すブロック図である。 本実施形態において流速を求める方法について説明する図である。 従来の抗原濃度測定装置の構成の概要を示すブロック図である。 従来の抗原濃度測定装置において試料セルの測定で得られる入射角−反射率曲線の１例を示す図である。

符号の説明

１・・・プリズム、２・・・光源、３・・・偏光板、４・・・集光レンズ、５・・・ＣＣＤカメラ、６・・・データ処理装置、７・・・データベース、８・・・ポンプ、９・・・流路、１０・・・試料セル、１１・・・データ入力部、１２・・・データ記憶部、１３・・・ＳＰＲ角度算出部、１４・・・補間演算部、１５・・・波形移動部、１６・・・波形微分演算部、１７・・・波形減算部、１８・・・標準偏差演算部、１９・・・時間差検出部、２０・・・流速算出部、２１ａ、２１ｂ・・・流速演算部、２２・・・抗原濃度算出部、２３・・・波形微分・二乗部、２４・・・直線検出部、２５・・・流速検出部、６０・・・制御部、６１・・・記憶部、６２・・・入力部、６３・・・表示部、６４・・・画像取得周期制御部、６５・・・画像処理部、６６・・・測定開始信号出力部、６７・・・反応結果導出部、６８・・・屈折率導出部、６９・・・反応結果補正部、１００・・・ＬＥＤ、１０１，１０８，１１０・・・レンズ、１０２，１０９・・・偏光子、１０３・・・シリンドリカルレンズ、１０４・・・プリズム、１０５・・・金属薄膜、１０６・・・抗体固定膜、１０７・・・焦線、１１１・・・ＣＣＤ（電荷結合素子）、１１２・・・データ処理装置、１１３ａ、１１３ｂ・・・制御部、３００ａ、３００ｂ・・・抗原濃度検出装置

以下、本発明の各実施形態による抗原濃度測定装置を図面を参照して説明する。始めに、本発明の第１の実施形態について説明する。

＜第１の実施形態＞
図１は本発明の第１の実施形態による抗原濃度測定装置３００ａの光学測定部の構成例を示すブロック図である。
抗原濃度測定装置３００ａ（流速測定装置とも称する）の構成としては、光源（光発振部とも称する）であるＬＥＤ（Light Emitting Diode）１００の放射した光を、レンズ１０１に光束として入射させ、偏光子１０２によりＰ偏光光のみを、シリンドリカルレンズ１０３により集光させ、高屈折率のプリズム１０４に入射させる。光源は、ＬＥＤ１００のみでなく、半導体レーザなどを用いても良い。
上記プリズム１０４は、シリンドリカルレンズ１０３により集光された光が、柱の軸方向に対して平行に、入射する面に対して対向する面に対し、上記光の焦線１０７が到達するように構成されている。

上記対向する面上には、濃度を測定したい抗原に対応する抗体が、表面プラズモン共鳴を起こすための金属薄膜１０５（たとえば、金薄膜）上に固定され、抗体固定膜１０６を形成している。この金属薄膜１０５は、光透過性媒体であるプリズム１０４上に形成されている（固定されている）。
また、プリズム１０４に入射された光は、焦線１０７の位置にて、金属薄膜１０５、抗体固定膜１０６及び流路を流れる液体により反射される。この反射光は、レンズ１０８により平行光とされ、偏光子１０９によりＰ偏光光のみをレンズ１１０へ入射させる。レンズ１１０は、入射される光を受光素子であるＣＣＤ１１１（ＣＣＤ）面へ放射する。これらが、金属薄膜１０５上にＬＥＤ１００の出射光を、複数の入射角度の入射光に変換して直線状の焦線１０７位置にて集光する集光部を構成している。ＣＣＤ１１１で撮像される画素データは、データ処理装置１１２に出力される。データ処理装置１１２は、制御部１１３ａを有する。

金属薄膜１０５には、測定領域（測定部とも称する）として、抗体の固定された抗体固定領域２０１、抗体の固定されていないリファレンス領域２０２から構成される試料領域２００が、図２に示すように、焦線１０７方向（すなわち、Ｙ１方向）に対して、予め設定された周期にて互い違いに、焦線１０７の上部に配置されている。図示はしないがフローセル（マイクロフローセル、試料セルとも称する）の流路は、焦線１０７に平行方向（すなわち、抗体固定領域２０１とリファレンス領域２０２とが互い違いに配置された配列方向）に、抗体固定領域２０１とリファレンス領域２０２との配列を覆い、各抗体固定領域２０１とリファレンス領域２０２とに順次検体が到達するように形成されている。
したがって、ＣＣＤ１１１面には、このＣＣＤ１１１の上面図である図３に示すように、焦線１０７の面において、Ｙ１方向の位置に対応して、焦線１０７の面からの反射光がそれぞれピクセル単位に格子状に配列されている受光素子に入力される。

また、Ｘ１方向には、入射角度に対応した、焦線１０７にて反射された反射光が入力される。これにより、試料領域２００に平行に焦線１０７に照射された光の、各焦線位置におけるそれぞれの入射角度における反射光の強度を、一括して検出することができる。
上述した構成により、各抗体固定領域２０１に固定されている抗体に対して、抗原が反応して結合した場合、抗体固定膜１０６の屈折率が変化し、この屈折率に対応した入射角度における反射率が変化、すなわち抗体に抗原が付着すると屈折率が高くなることにより、反射率が低下する入射角度（ＳＰＲ角度）を、時系列にモニタすることにより、抗体固定膜１０６の屈折率の変化を測定することができる。

すなわち、抗体に対して抗原が吸着するに従い、表面プラズモン共鳴を起こす入射角がシフトすることを利用している。しかしながら、抗原抗体反応とは異なり単なる吸着によっても入射角がシフトするため、抗体が固定されていないリファレンス領域２０２のＳＰＲ角度のシフトを、抗体の固定されている抗体固定領域２０１のＳＰＲシフトから、リファレンス値として減算することにより、抗原抗体反応のみのＳＰＲシフトを検出し、抗原濃度の測定の精度を上げる必要がある。

次に、ＳＰＲ角度について説明する。
ＬＥＤ１００からプリズム１０４に入射された光は、プリズム１０４と金属薄膜１０５との界面でエバネッセント波を生起させる。エバネッセント波の波数ｋ_ｅｖは、式（１）により定義される。
ｋ_ｅｖ＝ｋ_ｐｎ_ｐｓｉｎθ ・・・ （１）
ここで、ｋ_ｐは入射光の波数、ｎ_ｐはプリズム１０４の屈折率、θは入射角である。
一方、金属薄膜１０５の表面では、表面プラズモン波が生じる。表面プラズモン波の波数ｋ_ｓｐは、式（２）により定義される。
ｋ_ｓｐ＝（ｃ／ω）｛εｎ２／（ε＋ｎ２）｝１／２ ・・・ （２）
ここで、ｃは光速、ωは角振動数、εは金属薄膜１０５の誘電率、ｎは被測定対象の屈折率である。

エバネッセント波の波数ｋ_ｅｖと表面プラズモン波の波数ｋ_ｓｐとが一致する入射角θのときに、エバネッセント波のエネルギーが表面プラズモンの励起に使われ、反射光の強度が減少する。したがって、入射角θを変化させることにより、所定の角度θ０（ＳＰＲ角度）で極小をもつ入射角−反射強度曲線が得られる。すなわち、表面プラズモン共鳴現象による吸収を含んだ反射光が、金属薄膜１０５とプリズム１０４との界面から反射される。
このＳＰＲ現象は、金属薄膜１０５に接する被測定対象の検体の抗原と抗体との複合体の屈折率ｎに依存する。このため、極小値をとる角度θ０から、検体に含まれる抗原濃度変化による屈折率変化等を測定することができる。

次に、本実施形態による抗原濃度測定装置３００ａにおける流速を算出する制御部を図面を参照して説明する。図４は同実施形態による流速算出を行う制御部１１３ａの構成例を示すブロック図である。
この図において、制御部１１３ａは、データ入力部１１、データ記憶部１２、ＳＰＲ角度算出部１３、補間演算部１４、波形移動部１５、波形微分演算部１６、波形減算部１７、標準偏差演算部１８、時間差検出部１９、流速算出部２０を有している。
図１におけるＳＰＲセンサのＣＣＤ１１１から、各受光素子の画素データ、すなわち抗体固定領域２０１の配列方向の各位置と、この各位置における予め設定した入射角度範囲における入射角度と、に対応した受光素子の反射強度を示す画素データが、配置フレーム画像データとして入力される。

データ入力部１１は、ＣＣＤ１１１から入力される各受光素子の画素データである電圧値を、対応する階調度に変換し、図５に示す構成の配置フレーム画像データとして、各受光素子のＹ１方向の位置（抗体固定領域２０１及びリファレンス領域２０２の配置）に対応するアドレスＡｙ、Ｘ１方向の位置（入射角度に対応する位置）に対応するアドレスＡｘにより設定されるアドレスに対応させ、各アドレスに対応する受光素子の受光した反射強度を示す階調度のデータを、データ記憶部１２へサンプリング時間毎に読み込んで書き込む。
ここで、反射強度が強い場合に階調度が高くなり、反射強度が弱い場合に階調度が低くなる。なお、データ入力部１１は、例えば、実験で得られた最大の反射強度を最大の階調度として規格化し、入力される電圧値を階調度に変換する。

ＳＰＲ角度算出部１３は、データ記憶部１２に記憶されているデータから、サンプリング時間単位において、抗体固定領域２０１の予め設定された位置毎に、例えば、図２の抗体固定領域２０１（例えば、図２の抗体固定領域２０１Ａ）と、リファレンス領域２０２（例えば、リファレンス領域２０２Ｂ）とにおけるＳＰＲ角度を求め、それぞれＳＰＲ測定データＤＡと、ＳＰＲ測定データＤＢとして、サンプリング時間に対応させてＳＰＲ角度をデータ記憶部１２に書き込む。
また、制御部は、上記ＳＰＲ測定データＡ及びＢを、吸着曲線ＬＡと吸着曲線ＬＢとして表示部に対して図６の様に表示する。

波形微分演算部１６は、吸着曲線ＬＡ及び吸着曲線ＬＢそれぞれを時間により数値微分（以下、時間微分）して、微分曲線ＤＡと微分曲線ＤＢとを生成する。
補間演算部１４は、微分曲線ＤＢを時間Ｄ１単位にて補間、例えば直線補間する。ここで、時間Ｄ１は、サンプリング周期をＴｓとし、１／ｎの分解能にて補間すると
Ｄ１＝Ｔｓ／ｎ
となる。

波形移動部１５は、予め設定された設定時間Ｄ２だけ移動させた後、２×Ｄ２の時間範囲を上記時間Ｄ１づつ移動させる。例えば、本実施形態においては、設定時間Ｄ２を−（１／２）Ｔｓとし、微分曲線ＤＢを設定時間Ｄ２平行移動させる。
また、波形移動部１５は、設定時間Ｄ２に時間Ｄ１を加算し、新たな設定時間Ｄ２とし、設定時間Ｄ２が（１／２）Ｔｓとなるまで、すなわち、移動時間の範囲がＴｓとなるまで設定時間Ｄ２を時間Ｄ１ずつ増加させながら、微分曲線ＤＢを元の位置から＋方向に移動させる操作を繰り返す。

波形減算部１７は、時刻毎に、微分曲線ＤＡのＳＰＲ角度から、微分曲線ＤＢのＳＰＲ角度を、対応する時刻毎に減算し、時刻毎のＳＰＲ差分データを、設定時間Ｄ２の値毎に求める。
標準偏差演算部１８は、吸着曲線ＬＡの測定範囲（Ｔｓ）内における時刻毎のＳＰＲ差分データの標準偏差を、設定時間Ｄ２の値毎に求める。
時間差検出部１９は、時刻毎のＳＰＲ差分データの最も小さな標準偏差を有する設定時間Ｄ２の値を検出する。この設定時間Ｄ２が、抗体固定領域２０１と、リファレンス領域２０２とにそれぞれ検体が到達した時間差である。
流速算出部２０は、上記時間差により、抗体固定領域２０１と、リファレンス領域２０２との距離を除算することにより流速を求める。
なお、波形移動部１５、時間差検出部１９、流速算出部２０をまとめて、流速演算部２１ａとも称する。流速演算部２１ａは、上述したように、ＳＰＲ角度算出部１３が求めたＳＰＲ角度の時間変化に基づいて、フローセル内を流れる検体の流速を演算する。

このフローセル内を流れる検体の流速から、フローセル内に検体の流れる方向に対して、平行な方向に直列に配置された抗体固定領域２０１、リファレンス領域２０２それぞれに到達するタイミングを検出することができ、抗原濃度測定部２２がＳＰＲ角度の変化速度から抗原濃度を算出する。すなわち、上記抗原濃度測定部２２は、予め抗原濃度が明確な検体におけるＳＰＲ角度の時間変化の結果と比較することにより、それぞれの抗体固定領域２０１におけるＳＰＲ角度の時間変化から抗原濃度を推定する。

上述した本実施形態における検体の流速検出方法は、ポンプなどで体積流速を設定する場合と異なり、ＳＰＲ角度測定に影響する実効的流速であり、ＳＰＲ角度測定により検出される金属薄膜表面からの距離が４００ｎｍ以内の局所的領域（金属薄膜表面と検体との界面領域）の流れの速度を測定できる。さらに、流路内において流速分布があっても、図２の抗体固定領域２０１とリファレンス領域２０２とから、隣接する組み合わせを選び、複数の抗体固定領域とリファレンス領域とを設けることにより、それぞれの組の抗体固定領域２０１とリファレンス領域２０２近傍とにおける検体の流速を測定できる。
また、上記吸着曲線ＬＡ及びＬＢには、吸着成分（抗原抗体反応とは無関係な）、及びランダムノイズ成分とが含まれており、吸着成分によるＳＰＲ角度の変化は遅い成分（ドリフト成分）なので、微分操作により重みを低減させ、流速推定精度を向上させることができる。
また、本実施形態においては、微分曲線ＤＡを固定し、微分曲線ＤＢを平行移動させたが、逆に、微分曲線ＤＢを固定し、微分曲線ＤＡを移動させても、同様に、流速を求めることができる。

一方、発明者は、文献（Yuzuru Iwasakil ,2,7, Tatsuya Tobita3, Kazuyoshi Kurihara4,Tsutomu Horiuchi I, Koji Suzuki and Osamu Niwa、”MEASUREMENT SCIENCE AND TECHNOLOGY”、Meas. Sci. Technol.17、2006、p3184-3188）においても、ＳＰＲ角度測定法を用いて流速を求めている。しかしながら、離間して異なる位置にある領域のＳＰＲ角度の変化を用いている訳ではなく、本実施形態に比較して高い精度にて行えない。

次に、図４及び図７を参照して本実施形態による抗原濃度測定装置３００ａの動作を説明する。
図７は、図４の抗原濃度測定装置３００ａにおける流速の推定処理の動作例を示すフローチャートである。
以下の説明においては、すでにデータ入力部１１が入力した階調度データから、抗体固定領域２０１とリファレンス領域２０２とにおけるＳＰＲ角度の時間変化を示す吸着曲線ＬＡ、ＬＢがＳＰＲ角度算出部１３により算出されている。
波形微分演算部１６は、吸着曲線ＬＡ及びＬＢをそれぞれ時間微分し、微分曲線ＤＡ、ＤＢを生成する（ステップＳ１）。

そして、補間演算部１４は、上記微分曲線ＤＢにおけるＳＰＲ角度のデータを、サンプリング周期間において、時間Ｄ１単位にて直線補間する（ステップＳ２）。
波形移動部１５は、設定時間Ｄ２を測定時間Ｔｓの−１／２、すなわち−（１／２）Ｔｓとし（ステップＳ３）、微分曲線ＤＢを時間方向に設定時間Ｄ２分だけ平行移動する（ステップＳ４）。
微分曲線ＤＢが移動されると、波形減算部１７は、微分曲線ＤＡの各時刻のＳＰＲ角度から、微分曲線ＤＢの対応する時刻のＳＰＲ角度を減算し、時刻毎の差分データを算出する（ステップＳ５）。

そして、標準偏差演算部１８は、時刻毎の差分データの標準偏差を求め、このときの設定時間Ｄ２を識別する設定時間識別情報とともに、データ記憶部１２に書き込む（ステップＳ６）。
次に、波形移動部１５は、設定時間Ｄ２が（１／２）Ｔｓとなったか否か、すなわち、元の位置に対して前後にずらした範囲がＴｓとなったか否かの判定を行い（ステップＳ７）、設定時間Ｄ２が（１／２）Ｔｓ未満である場合に処理をステップＳ８へ進め、設定時間Ｄ２が（１／２）Ｔｓ以上である場合に処理をステップＳ１１へ進める。

設定時間Ｄ２が（１／２）Ｔｓ未満である場合、波形移動部１５は、微分曲線ＤＢを平行移動する前の位置に戻す（ステップＳ８）とともに、吸着曲線設定時間Ｄ２に対して時間Ｄ１を加算し、新たな設定時間Ｄ２とし（ステップＳ９）、処理をステップＳ４に戻す。
一方、ステップＳ７において、設定時間Ｄ２が（１／２）Ｔｓ以上である場合、時間差検出部１９は、データ記憶部１２において、設定時間識別情報に対応した各設定時間Ｄ２毎の標準偏差を順次読み込み、読み出した順に比較していくことにより、最も小さな標準偏差を検出し、この標準偏差に対応する設定時間識別情報を抽出し、この設定時間識別情報に対応する設定時間Ｄ２を、抗体固定領域２０１とリファレンス領域２０２とにそれぞれ検体が到達する時刻の時間差として出力する（ステップＳ１１）。

次に、流速算出部２０は、抗体固定領域２０１（例えば、図２の抗体固定領域２０１Ａ）とリファレンス領域２０２（例えば、リファレンス領域２０２Ｂ）とにおける２点の位置の距離を、最も小さな標準偏差に対応する設定時間Ｄ２にて除算し、フローセル内における検体の流速を算出する（ステップＳ１２）。

上述したように、本実施形態によれば、フローセル内にて流れる検体（液体、流体）の流速を正確に測定することができ、抗体固定領域あるいはリファレンス領域に検体が到達するタイミングを検出することができ、それぞれの抗体固定領域における抗原抗体反応の開始時間を精度良く補正することが可能となり、抗原抗体反応の反応速度を正確に測定することができ、抗原濃度を精度良く測定することが可能となる。
また、本実施形態によれば、上述したように、いずれの抗体固定領域２０１及びリファレンス領域２０２それぞれに検体が到達するタイミングを正確に検出することが可能なため、リファレンス領域２０２との差分測定にて、同相ノイズを除去することができ、より抗原濃度の測定を高精度とすることができる。

＜第２の実施形態＞
次に、本発明の第２の実施形態による抗原濃度測定装置について説明する。第２の実施形態も図４の第１の実施形態と同様の構成のため、その説明を省略する。以下、第１の実施形態と異なる動作について説明する。
図１におけるＳＰＲセンサのＣＣＤ１１１から、各受光素子の画素データ、すなわち抗体固定領域の配列方向の各位置と、この各位置における予め設定した入射角度範囲における入射角度と、に対応した受光素子の反射強度を示す画素データが、配置フレーム画像データとして入力される。

補間演算部１４は、吸着曲線ＬＢを時間Ｄ１単位にて補間、例えば直線補間する。ここで、時間Ｄ１は、サンプリング周期をＴｓとし、１／ｎの分解能にて補間すると
Ｄ１＝Ｔｓ／ｎ
となる。
波形移動部１５は、予め設定された設定時間Ｄ２だけ移動させた後、２×Ｄ２の時間範囲を上記時間Ｄ１づつ移動させる。例えば、本実施形態においては、第１の実施形態と同様に、設定時間Ｄ２を−（１／２）Ｔｓとし、吸着曲線ＬＢを設定時間Ｄ２平行移動させる。
また、波形移動部１５は、設定時間Ｄ２に時間Ｄ１を加算し、新たな設定時間Ｄ２とし、設定時間Ｄ２が（１／２）Ｔｓとなるまで、すなわち、移動時間の範囲がＴｓとなるまで設定時間Ｄ２を時間Ｄ１ずつ増加させながら、吸着曲線ＬＢを元の位置から＋方向に移動させる操作を繰り返す。

波形減算部１７は、時刻毎に、吸着曲線ＬＡのＳＰＲ角度から、吸着曲線ＬＢのＳＰＲ角度を、対応する時刻毎に減算し、時刻毎のＳＰＲ差分データを、設定時間Ｄ２の値毎に求める。
波形微分演算部１６は、吸着曲線ＬＡ及び吸着曲線ＬＢの時刻毎の差分を、時間微分して、微分差分データを生成する。
標準偏差演算部１８は、時間微分した結果において、吸着曲線ＬＡの測定範囲（Ｔｓ）内における時刻毎の微分差分データの標準偏差を、設定時間Ｄ２単位にて求める。

時間差検出部１９は、時刻毎の微分差分データの最も小さな標準偏差を有する設定時間Ｄ２の値を検出し、この設定時間Ｄ２を抗体固定領域２０１と、リファレンス領域２０２とにそれぞれ検体が到達した時間差である。
流速算出部２０は、上記時間差により、抗体固定領域２０１と、リファレンス領域２０２との距離を除算することにより流速を求める。
抗原の濃度の測定については、すでに説明した第１の実施形態と同様である。
また、本実施形態においては、吸着曲線ＬＡを固定し、吸着曲線ＬＢを平行移動させたが、逆に、吸着曲線ＬＢを固定し、吸着曲線ＬＡを移動させても、同様に、流速を求めることができる。

次に、図４及び図８を参照して本実施形態による抗原濃度測定装置の動作を説明する。
図８は、図４の抗原濃度測定装置における流速の推定処理の動作例を示すフローチャートである。
以下の説明においては、すでにデータ入力部１１が入力した階調度データから、抗体固定領域２０１とリファレンス領域２０２とにおけるＳＰＲ角度の時間変化を示す吸着曲線ＬＡ、ＬＢがＳＰＲ角度算出部１３により算出されている。
補間演算部１４は、上記微分曲線ＤＢにおけるＳＰＲ角度のデータを、サンプリング周期間において、時間Ｄ１単位にて直線補間する（ステップＳ２１）。

次に、波形移動部１５は、設定時間Ｄ２を測定時間Ｔｓの−１／２、すなわち−（１／２）Ｔｓとし（ステップＳ２２）、吸着曲線ＬＢを時間方向に設定時間Ｄ２分だけ平行移動する（ステップＳ２３）。
吸着曲線ＬＢが移動されると、波形減算部１７は、吸着曲線ＬＡの各時刻のＳＰＲ角度から、吸着曲線ＬＢの対応する時刻のＳＰＲ角度を減算し、時刻毎の差分データを算出した後、差分データを時間微分し、微分差分データを生成する（ステップＳ２４）。
差分データを時間微分した後、標準偏差演算部１８は、時刻毎の微分差分データの標準偏差を求め、このときの設定時間Ｄ２を識別する設定時間識別情報とともに、データ記憶部１２に書き込む（ステップＳ２５）。

次に、波形移動部１５は、設定時間Ｄ２が（１／２）Ｔｓとなったか否か、すなわち、元の位置に対して前後にずらした範囲がＴｓとなったか否かの判定を行い（ステップＳ２６）、設定時間Ｄ２が（１／２）Ｔｓ未満である場合に処理をステップＳ２７へ進め、設定時間Ｄ２が（１／２）Ｔｓ以上である場合に処理をステップＳ２９へ進める。
設定時間Ｄ２が（１／２）Ｔｓ未満である場合、波形移動部１５は、吸着曲線ＬＢを平行移動する前の位置に戻す（ステップＳ２７）とともに、設定時間Ｄ２に対して時間Ｄ１を加算し、新たな設定時間Ｄ２とし（ステップＳ２８）、処理をステップＳ２３に戻す。

一方、ステップＳ２６において、設定時間Ｄ２が（１／２）Ｔｓ以上である場合、時間差検出部１９は、データ記憶部１２において、設定時間識別情報に対応した各設定時間Ｄ２毎の標準偏差を順次読み込み、読み出した順に比較していくことにより、最も小さな標準偏差を検出し、この標準偏差に対応する設定時間識別情報を抽出し、この設定時間識別情報に対応する設定時間Ｄ２を、抗体固定領域２０１とリファレンス領域２０２とにそれぞれ検体が到達する時刻の時間差として出力する（ステップＳ２９）。

次に、流速算出部２０は、抗体固定領域２０１（例えば、図２の抗体固定領域２０１Ａ）とリファレンス領域２０２（例えば、リファレンス領域２０２Ｂ）とにおける２点の位置の距離を、最も小さな標準偏差に対応する設定時間Ｄ２にて除算し、フローセル内における検体の流速を算出する（ステップＳ３０）。

上述したように、本実施形態によれば、第１の実施形態と同様に、フローセル内にて流れる検体（液体、流体）の流速を正確に測定することができ、抗体固定領域あるいはリファレンス領域に検体が到達するタイミングを検出することができ、それぞれの抗体固定領域における抗原抗体反応の開始時間を精度良く補正することが可能となり、抗原抗体反応の反応速度を正確に測定することができ、抗原濃度を精度良く測定することが可能となる。
また、本実施形態によれば、上述したように、いずれの抗体固定領域２０１及びリファレンス領域２０２それぞれに検体が到達するタイミングを正確に検出ことが可能なため、リファレンス領域２０２との差分測定にて、同相ノイズを除去することができ、より抗原濃度の測定を高精度とすることができる。

＜第３の実施形態＞
次に、本発明の第３の実施形態について説明する。図９は本発明の第３の実施形態に係る抗原濃度測定装置３００ｂの構成を示すブロック図である。
本実施形態の抗原濃度測定装置３００ｂ（流速測定装置、ＳＰＲ測定装置とも称する）は、プリズム１と、光源２と、偏光板３と、集光レンズ４と、ＣＣＤカメラ５と、データ処理装置６と、データベース７（記憶部とも称する）と、フローセル１０に対して液体サンプルを送り出すポンプ８と、液体サンプルが流れる流路９とを有する。
本実施形態の抗原濃度測定装置３００ｂ（図９）のプリズム１、光源２、偏光板３、集光レンズ４、ＣＣＤカメラ５、データ処理装置６は、第１の実施形態抗原濃度測定装置３００ａ（図１）のプリズム１０４、ＬＥＤ１００、偏光子１０２、シリンドリカルレンズ１０３、ＣＣＤ１１１、データ処理装置１１２にそれぞれ対応している。

図１０Ａはフローセル１０の一般的な構造を示す平面図、図１０Ｂは図１０Ａのフローセル１０のＩ−Ｉ線断面図である。図１０Ａ、図１０Ｂにおいて、７０はプリズム１と同じ屈折率の材料からなる板状の透明体、７１は透明体７０上にスパッタ、蒸着などによって形成された厚さ４０〜６０ｎｍ程度の金や銀からなる金属薄膜、７２は金属薄膜７１上に固定された抗体などの被測定物質である。

図１１はデータ処理装置６の構成例を示すブロック図である。データ処理装置６は、装置全体を制御する制御部６０と、制御部６０のプログラム等を記憶する記憶部６１と、抗原濃度測定装置３００ｂを使用する使用者が装置に対して指示を与えるための入力部６２と、使用者に対して情報を表示するための表示部６３とを有する。
制御部６０は、画像取得周期制御部６４と、画像処理部６５と、測定開始信号出力部６６と、反応結果導出部６７と、屈折率導出部６８と、反応結果補正部６９とを有する。

次に、本実施形態の抗原濃度測定装置３００ｂの動作について説明する。図１２は本実施形態で用いるフローセル１０の構造を示す平面図である。
本実施形態では、フローセル１０として、透明体７０上に形成された金属薄膜７１と、金属薄膜７１上の被測定物質配置用箇所に固定された被測定物質７２と、金属薄膜７１上の検出物質配置用箇所に固定された液体サンプル検出物質７３（検体検出物質とも称する）とを有するものを用いる。フローセル１０は、被測定物質７２及び液体サンプル検出用物質７３が上向きで、透明体７０がプリズム１と接するようにプリズム１上に載置される。

液体サンプル検出物質７３は、液体サンプル中に含まれる物質のうち被測定物質７２との反応が期待されるものと異なる物質と反応して屈折率が変化する物質である。液体サンプル検出物質７３と反応する物質としては、液体サンプル中に高濃度に存在する物質が好ましく、この物質の例としては、例えば液体サンプルが牛乳である場合、カゼインがある。液体サンプル検出物質７３の例としては、例えば液体サンプルが牛乳である場合、抗カゼイン、抗ＢＳＡ、牛乳が初乳の場合には抗牛ＩｇＧなど、牛乳中に必ず高濃度で存在するタンパク質に対する抗体がある。また、液体サンプル検出物質７３の別の例として、液体サンプルが血液である場合には、抗アルブミンなど、血液中に必ず高濃度で存在するタンパク質に対する抗体がある。

従来と同様に、単色光の光源２から放射された光が偏光板３を通過すると、Ｐ偏光光のみが通過する。このＰ偏光光は、集光レンズ４で集光されてプリズム１に入射し、被測定物質７２が固定されている側と反対の透明体７０の側からフローセル１０に入射する。
一方、牛乳などの液体サンプルを流入させる場合、ポンプ８は、液体サンプルを送り出す。これにより、液体サンプルは流路９内を流れ、フローセル１０上を通過する。

データ処理装置６の画像取得周期制御部６４は、ＣＣＤカメラ５に対して画像取得を指示する画像取得タイミング信号を繰り返し出力する。
ＣＣＤカメラ５は、データ処理装置６から画像取得タイミング信号が出力されると、フローセル１０からの反射光を検出し、濃淡画像データを出力する。

データ処理装置６の画像処理部６５は、ＣＣＤカメラ５から出力された濃淡画像データを取り込み、この濃淡画像データを処理して、図１９に示したような入射角−反射率曲線のデータをフローセル１０の被測定物質７２毎および液体サンプル検出物質７３毎に求める。

図１３は液体サンプルの導入後にＣＣＤカメラ５が撮像した画像を模式的に示す図である。ＣＣＤカメラ５が撮像した画像には、フローセル１０の各所の光の反射率に応じた濃淡が現れる。図１３の２０１は金属薄膜７１に相当する明るい（反射率が高い）領域であり、２０２は被測定物質７２による反射率の谷を示す暗い（反射率が低い）領域、２０３は液体サンプル検出物質７３による反射率の谷を示す暗い領域である。画像領域２０３のＰＸ方向の座標がずれているのは、液体サンプルと液体サンプル検出物質７３との反応によって屈折率が変化し、エバネッセンス波と表面プラズモン波との共鳴が起こる入射角が僅かに変化したためである。

図１３のＰＸ方向は図９のＸ２方向に相当し、光の入射角θを表しているので、画像処理部６５は、濃淡画像データのＰＸ方向の座標を入射角θに換算することが可能である。なお、ここでは、金属薄膜７１に対する法線ではなく、金属薄膜７１の面に対する光の角度を入射角θとする。また、図１３の濃淡画像の明るさはフローセル１０の反射率によって変化するので、画像処理部６５は、濃淡画像データの各画素の輝度値を光の反射率に換算することが可能である。さらに、ＣＣＤカメラ５が撮像した濃淡画像において、フローセル１０の被測定物質配置用箇所の位置および検出物質配置用箇所の位置は既知である。

したがって、画像処理部６５は、被測定物質配置用箇所に相当するＰＹ座標上で入射角−反射率曲線を導出することを被測定物質配置用箇所毎に行うことにより、入射角−反射率曲線のデータを被測定物質７２毎に求めることができる。同様に、画像処理部６５は、検出物質配置用箇所に相当するＰＹ座標上で入射角−反射率曲線を導出することを検出物質配置用箇所毎に行うことにより、データを液体サンプル検出用物質７３毎に求めることができる。画像処理部６５は、以上のような処理をＣＣＤカメラ５から濃淡画像データが出力される度に行う。なお、図１３のＰＹ方向は、図９の紙面に対して垂直なＹ２方向に相当する。

画像取得周期制御部６４とＣＣＤカメラ５と画像処理部６５によるフローセル１０の測定は、液体サンプルが導入される前から既に開始されている。
ここで、データ処理装置６の測定開始信号出力部６６は、画像処理部６５が測定した被測定物質７２の入射角−反射率曲線のデータまたは液体サンプル検出物質７３の入射角−反射率曲線のデータから、反射率が最低となる入射角（以下、共鳴角θｓｐという）を求める。そして、測定開始信号出力部６６は、フローセル１０の上に液体サンプルが流れ始めたと考えられる値に共鳴角θｓｐが達したときに、測定開始信号を出力する。

画像取得周期制御部６４は、測定開始信号が出力されると、この測定開始信号の出力時から一定時間の間は画像取得タイミング信号の周期、すなわち画像取得の周期を通常時よりも短くし、一定時間経過後は画像取得の周期を通常時の値に戻す。このように画像取得の周期を変更する理由については後述する。

次に、データ処理装置６の反応結果導出部６７は、測定開始信号が出力されると、画像処理部６５が測定した被測定物質７２の入射角−反射率曲線のデータから共鳴角θｓｐを求める。共鳴角θｓｐは、被測定物質７２の屈折率および物質７２と反応した液体サンプル中の物質の屈折率に依存する。また、被測定物質７２（抗体）と液体サンプル中の物質（抗原）とが反応すると、入射角−反射率曲線は図１４の特性ＣＡから特性ＣＢへと変化し、共鳴角はθｓｐＡからθｓｐＢへと変化する。

データベース７には、共鳴角θｓｐの変化と、被測定物質７２と液体サンプル中の物質の反応量との関係があらかじめ登録されている。
反応結果導出部６７は、データベース７を参照することにより、共鳴角θｓｐの変化から、被測定物質７２と液体サンプル中の物質との反応量を求めることができる。反応結果導出部６７は、以上のような処理を測定開始信号の出力後に画像処理部６５から入射角−反射率曲線のデータが出力される度に行う。

一方、データ処理装置６の屈折率導出部６８は、測定開始信号が出力されると、画像処理部６５が測定した液体サンプル検出物質７３の入射角−反射率曲線のデータから共鳴角θｓｐ’を求める。共鳴角θｓｐ’は、液体サンプル検出物質７３の屈折率および液体サンプル検出物質７３と反応した液体サンプル中の物質の屈折率に依存する。

データベース７には、共鳴角θｓｐ’と屈折率との関係があらかじめ登録されている。
屈折率導出部６８は、データベース７を参照することにより、共鳴角θｓｐ’から液体サンプル検出物質７３および液体サンプル中の反応物質の屈折率を求めることができる。
屈折率導出部６８は、以上のような処理を測定開始信号の出力後に画像処理部６５から入射角−反射率曲線のデータが出力される度に行う。

図１５は屈折率導出部６８が求めた屈折率の時間変化を示す図である。図１５において、実線で示すＲは屈折率導出部６８が求めた実際の屈折率、破線で示すＲｒｅｆは液体サンプルの流速が一定の場合の理想的な屈折率、丸印で示すＳＴは画像取得タイミングを示している。

液体サンプル検出物質７３との反応が期待される物質は、液体サンプル中に高濃度に存在する物質である。このため、この物質と液体サンプル検出物質７３との反応は、液体サンプル導入後に急激に発生し、屈折率導出部６８が画像取得タイミング毎に求める屈折率Ｒは図１５に示すように急激に上昇してその後に飽和する特性となる。しかし、この屈折率Ｒは、液体サンプルの流速変動のために、理想的な屈折率Ｒｒｅｆからずれている。
ここで、画像取得の周期をΔＴ、周期ΔＴにおける屈折率Ｒの変化量をΔＲとすると、屈折率Ｒの変化速度Ｖ＝ΔＲ／ΔＴは、液体サンプルの流速に比例する。

したがって、液体サンプルの流速が理想値である場合の屈折率の既知の変化速度Ｖｒｅｆと、実際の屈折率Ｒの変化速度Ｖとを比較すれば、変化速度Ｖの誤差量を求めることができ、この誤差量から液体サンプルの流速の理想値に対する実際の流速の誤差量を求めることができる。被測定物質７２と液体サンプル中の物質との反応結果は、液体サンプルの流速（流量）に依存するので、流速の誤差量を求めることができれば、反応結果をどれだけ補正すればよいかが分かる。

データベース７には、屈折率Ｒの変化速度の理想値Ｖｒｅｆが測定開始時刻ｔ０からの経過時間ｔ毎にあらかじめ登録されている。また、データベース７には、変化速度Ｖと理想値Ｖｒｅｆとの誤差量と、流速の誤差量とが対応付けてあらかじめ登録されている。さらに、データベース７には、流速の誤差量と反応量の補正量とが対応付けてあらかじめ登録されている。

反応結果補正部６９は、測定開始信号が出力された時刻ｔ０以降の時間ｔにおいて、現在の屈折率Ｒと１周期前の屈折率Ｒとから変化量ΔＲを計算して、屈折率Ｒの変化速度Ｖ＝ΔＲ／ΔＴを計算し、データベース７を参照して現在の時間ｔにおける変化速度の理想値Ｖｒｅｆを取得して、変化速度Ｖの誤差量を計算する。さらに、反応結果補正部６９は、変化速度Ｖの誤差量に対応する流速の誤差量をデータベース７から取得し、この流速の誤差量に対応する補正量をデータベース７から取得して、反応結果導出部６７が求めた反応量を補正量に従って補正する。反応結果補正部６９は、以上のような処理を測定開始信号の出力後に屈折率導出部６８から屈折率Ｒのデータが出力される度に行う。

こうして、本実施形態では、液体サンプルの流速が変動した場合でも、被測定物質７２の反応結果を補正することができる。
なお、以上の説明から明らかなように、ＣＣＤカメラ５、画像処理部６５、反応結果導出部６７、屈折率導出部６８および反応結果補正部６９は、画像取得の周期毎に動作する。図１５に示したように、屈折率導出部６８が求める屈折率は急激に上昇した後に飽和するので、この上昇区間では測定周期を短くして補正精度を高めることが好ましい。これが、画像取得周期制御部６４が画像取得の周期を変更する理由である。つまり、画像取得周期制御部６４は、測定開始信号が出力された時刻ｔ０から一定時間ｔｈの間は画像取得タイミング信号の周期を通常時よりも短くし、時間ｔｈ経過後は画像取得タイミング信号の周期を通常時の値に戻す。

従来技術による抗原濃度測定装置では、牛乳などの液体サンプルをポンプで送り出して試料セル上に流すことで、例えば牛乳に含まれる菌と試料セルに固定された抗体との反応を検出する。しかしながら、従来技術による抗原濃度測定装置では、液体サンプルの流速に変動があった場合に、反応結果を補正することができないという問題点があった。例えば液体サンプルの流速を高精度に調整することができない簡易型の装置や、液体サンプルの粘度のばらつきなどにより、流速が液送機構で期待される値よりも小さくなった場合は、抗原と抗体の反応量も小さくなり、流速が理想的な値より大きくなった場合は、抗原と抗体の反応量も大きくなる。したがって、液体サンプルの流速が変動すると、正しい測定ができないという問題点があった。

しかし、本実施形態によれば、液体サンプル中に含まれる物質のうち被測定物質との反応が期待されるものと異なる物質と反応して屈折率が変化する液体サンプル検出物質７３を金属薄膜上に固定したフローセル１０に対して、液体サンプルを流した状態で光を照射し、ＣＣＤカメラ５で撮像された画像から求めた液体サンプル検出物質７３の入射角−反射率曲線から光の反射率が最低となる入射角である共鳴角を求め、この共鳴角から液体サンプル検出物質７３および反応した液体サンプル中の物質の屈折率を求め、この屈折率の変化速度から液体サンプルの流速の誤差量を求め、この流速の誤差量から反応量の補正量を求めることにより、反応結果導出部６７が求めた反応量を補正することができる。その結果、本実施形態によれば、液体サンプルの流速変動に応じて測定結果を補正することができる。

また、本実施形態では、画像処理部６５が求めた入射角−反射率曲線において共鳴角を求め、この共鳴角の変化からフローセル１０上に液体サンプルが流れ始めたことを検出したときに、測定開始信号を出力し、測定開始信号の出力時から一定時間の間は画像取得タイミング信号の周期を通常時よりも短くすることにより、測定結果の補正精度を高めることができる。

＜第４の実施形態＞
次に、本発明の第４の実施形態について説明する。本発明が第１の実施形態と同様の部分については、それらの説明を省略する。また、第４の実施形態と第１の実施形態では、フローセル内を流れる検体の流速を求める方法が相違する。よって、以下では、その相違点について説明する。

図１６は、本発明の第４の実施形態による抗原濃度検出装置のデータ処理装置の制御部１１３ｂの構成を示すブロック図である。
制御部１１３ｂは、データ入力部１１、データ記憶部１２、ＳＰＲ角度算出部１３、補間演算部１４、波形微分演算部１６、波形減算部１７、標準偏差演算部１８、波形微分・二乗部２３、直線検出部２４、流速検出部２５を有する。
制御部１１３ｂが、波形微分・二乗部２３、直線検出部２４、流速検出部２５を有している点において、制御部１１３ａが、波形移動部１５、時間差検出部１９、流速算出部２０を有している第１の実施形態と相違する。
なお、波形微分・二乗部２３、直線検出部２４、流速検出部２５をまとめて、流速演算部２１ｂとも称する。

始めに、本実施形態の抗原濃度検出装置は、フローセルの流路を、Ｙ１方向（図１及び図２参照）に、屈折率の低いサンプルを流す。ここでは、このサンプルの屈折率を、Ｎ１とする。
次に、本実施形態の抗原濃度検出装置は、フローセルの流路を、Ｙ１方向に、屈折率の高いサンプルを流す。ここでは、このサンプルの屈折率をＮ２とする。屈折率Ｎ１と屈折率Ｎ２との間には、Ｎ２＞Ｎ１の関係がある。
次に、本実施形態の抗原濃度検出装置は、フローセルの流路を、Ｙ１方向に、屈折率の低いサンプルを流す。このサンプルの屈折率は、Ｎ１である。
このような処理を行なう際に、フローセルのＹ１方向に沿った複数の地点での屈折率の時間変化を測定することにより、各時間と各地点での屈折率を表す配列を得ることができる。この配列を等高線表示すると、図１７（ａ）に示すようなグラフが得られる。
図１７（ａ）において、横軸は時間を示しており、縦軸はフローセルの流路の所定地点を基準とした距離を示している。

図１７（ａ）では、傾きが正の３本の直線が、時刻ｔ１１付近に現れている。また、図１７（ｂ）では、傾きが正の３本の直線が、時刻ｔ１２付近に現れている。それぞれの直線で結ばれた点は、ＳＰＲ角度が同じであることを意味している。
なお、フローセルに流すサンプルの流速が非常に早い場合には、時刻ｔ１１付近の３本の直線と、時刻ｔ１２付近の３本の直線との傾きは、図１７（ａ）の縦軸（Ｙ１軸）の傾きに近づく。つまり、各直線の傾きが、無限大に近づく。
また、フローセルに流すサンプルの流速が遅い場合には、時刻ｔ１１付近の３本の直線と、時刻ｔ１２付近の３本の直線との傾きは、図１７（ａ）の横軸（時間軸）の傾きに近づく。つまり、各直線の傾きが、０に近づく。

図１７（ａ）において、フローセルの所定地点（Ｙ１＝ＹＡとなる地点）に着目すると、図１７（ｂ）に示すようなグラフが得られる。なお、図１７（ｂ）において、横軸は時間を示しており、縦軸はＳＰＲ角度を示している。
図１６の制御部１１３ｂの直線検出部２４は、図１７（ａ）の画像から、直線部分を検出する。本実施形態の直線検出部２４は、既知の画像処理アルゴリズムであるハフ（Hough）変換を用いて、図１７（ａ）の画像から直線部分を検出する。なお、直線検出部２４は、ハフ変換以外の既知の画像処理アルゴリズムを用いて、画像から直線部分を検出しても良い。
波形微分・二乗部２３は、ハフ変換を用いる直線検出部２４が、流速が変化する部分の検出に適するように、図１７（ａ）の配列データを時間方向に微分する。その後、波形微分・二乗部２３は、二乗処理を行なう。
流速検出部２５は、直線検出部２４の演算結果から直線の傾きを求めて、フローセル内を流れる検体の流速を算出する。

第１の実施形態では、抗体固定領域２０１やリファレンス領域２０２などの２点を予め決める必要があり、フローセル内の特定の区間での流速を求めることができた。第４の実施形態では、直線の傾きから流速を求めることができるために、流速の変化を時間的に、フローセル内の位置に依存して求めることができる。したがって、抗原濃度検出装置の処理精度を高度化できる。
なお、第４の実施形態では、流速を求める際にハフ変換を用いる場合について説明したが、この方法を、第２又は第３の実施形態に適用してもよい。

なお、第１〜第４の実施形態による抗原濃度測定装置のデータ処理装置の各部（図４、図１１、図１６）の機能を実現するためのプログラムをコンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録して、この記録媒体に記録されたプログラムをコンピュータシステムに読み込ませ、実行することにより検体の流速の検出処理を行ってもよい。なお、ここでいう「コンピュータシステム」とは、ＯＳや周辺機器等のハードウェアを含むものとする。また、「コンピュータシステム」は、ホームページ提供環境（あるいは表示環境）を備えたＷＷＷシステムも含むものとする。また、「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ等の可搬媒体、コンピュータシステムに内蔵されるハードディスク等の記憶装置のことをいう。さらに「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、インターネット等のネットワークや電話回線等の通信回線を介してプログラムが送信された場合のサーバやクライアントとなるコンピュータシステム内部の揮発性メモリ（ＲＡＭ）のように、一定時間プログラムを保持しているものも含むものとする。

また、上記プログラムは、このプログラムを記憶装置等に格納したコンピュータシステムから、伝送媒体を介して、あるいは、伝送媒体中の伝送波により他のコンピュータシステムに伝送されてもよい。ここで、プログラムを伝送する「伝送媒体」は、インターネット等のネットワーク（通信網）や電話回線等の通信回線（通信線）のように情報を伝送する機能を有する媒体のことをいう。また、上記プログラムは、前述した機能の一部を実現するためのものであっても良い。さらに、前述した機能をコンピュータシステムにすでに記録されているプログラムとの組み合わせで実現できるもの、いわゆる差分ファイル（差分プログラム）であっても良い。

本発明は、フローセル内の検体の流速を正確に測定し、直列に配列された複数の各抗体が固定されている領域において、いずれの抗体の領域に検体が達したかを検出することができる流速測定装置、抗原濃度測定装置、フローセル、流速測定方法、抗原濃度測定方法などに適用できる。

Claims (11)

1. 長尺状のフローセル内に、抗体が検体の流れる方向に配列されており、前記フローセル内を流れる前記検体の流速を測定する流速測定装置であって、
   光発振部と、
   当該光発振部からの出射光による表面プラズモン共鳴を起こすための金属薄膜と、
   当該金属薄膜を固定し、当該金属薄膜上に前記光発振部の出射光を、複数の入射角度の入射光に変換して直線状の焦線位置にて集光する集光部と、
   前記金属薄膜上に前記焦線位置に重なる位置に抗体を固定した抗体固定領域及び抗体を固定しないリファレンス領域を交互に配置した測定部と、
   前記焦線位置において生じた表面プラズモン共鳴による当該出射光の前記焦線位置における反射光を、複数の入射光の角度毎に受光する受光部と、
   前記測定部における前記抗体固定領域及び前記リファレンス領域毎のＳＰＲ角度の時間変化を求めるＳＰＲ角度算出部と、
   前記ＳＰＲ角度算出部が求めたＳＰＲ角度の時間変化に基づいて、前記フローセル内を流れる前記検体の流速を演算する流速演算部と、
   を有する流速測定装置。
2. 前記流速演算部は、
   前記抗体固定領域の一点と前記リファレンス領域の一点とを合わせた２点におけるＳＰＲ角度の時間変化を示す吸着曲線を、いずれか一方を他方に対して時間方向にずらす波形移動部と、
   前記２点のＳＰＲ角度の差分が最小となるずらし時間を測定する時間差検出部と、
   前記２点間の位置を前記ずらし時間にて除算することにより、前記フローセル内における検体の流速を算出する流速算出部と、
   を有する請求項１記載の流速測定装置。
3. 前記２点それぞれの吸着曲線を時間微分して微分曲線とする波形微分演算部をさらに有し、
   前記波形移動部が２点それぞれの前記微分曲線において、いずれか一方を他方に対して時間方向にずらし、前記時間差検出部が２点それぞれの微分曲線におけるＳＰＲ角度の差分が最小となるずらし時間を測定する請求項２記載の流速測定装置。
4. ＳＰＲ角度の差分データを時間微分する波形微分演算部をさらに有し、
   前記波形移動部が２点それぞれの前記吸着曲線において、いずれか一方を他方に対して時間方向にずらし、
   前記波形移動部が前記吸着曲線をずらす毎に、前記波形微分演算部が当該２点それぞれの吸着曲線の差分データを時間微分し、前記時間差検出部が２点それぞれの吸着曲線におけるＳＰＲ角度の時間微分した差分データが最小となるずらし時間を測定する請求項２記載の流速測定装置。
5. 前記流速演算部は、前記フローセル内を流れる前記検体の流速をハフ変換を用いて演算する請求項１記載の流速測定装置。
6. 前記金属薄膜上に、前記抗体と、前記検体に含まれる物質のうち前記抗体との反応が期待されるものと異なる物質と反応して屈折率が変化する検体検出物質とが固定されており、
   前記抗体における前記入射光の入射角と前記反射光の反射率との相関関係に基づいて反射率が最低となる入射角である共鳴角を求め、この共鳴角から前記抗体と前記検体検出物質との反応量を求める反応結果導出部と、
   前記検体検出物質における入射角と反射率との相関関係に基づいて共鳴角を求め、この共鳴角から前記検体検出物質および反応した検体に含まれる物質の屈折率を求める屈折率導出部と、
   前記屈折率導出部が求めた屈折率の変化速度から前記検体の流速の誤差量を求め、この流速の誤差量から前記反応結果導出部が求めた反応量の補正量を求めて、前記反応量を前記補正量に基づいて補正する反応結果補正部と、
   を更に有する請求項１記載の流速測定装置。
7. 前記画像処理部が求めた入射角と反射率との相関関係において前記共鳴角を求め、この共鳴角の変化から前記フローセル上に前記検体が流れ始めたことを検出したときに、測定開始信号を出力する測定開始信号出力部と、
   前記受光部に対して画像取得を指示する画像取得タイミング信号を繰り返し出力し、前記測定開始信号の出力時から一定時間の間は前記画像取得タイミング信号の周期を通常時よりも短くし、一定時間経過後は前記画像取得タイミング信号の周期を通常時の値に戻す画像取得周期制御部と、
   を更に有する請求項６記載の流速測定装置。
8. 前記屈折率の変化速度の理想値と、前記変化速度の誤差量と前記検体の流速の誤差量との関係と、前記流速の誤差量と前記補正量との関係が予め登録された記憶部を更に有し、
   前記反応結果補正部は、前記屈折率導出部が求めた屈折率の変化速度と前記記憶部に登録された前記変化速度の理想値との誤差量を求め、この変化速度の誤差量に対応する前記流速の誤差量を前記記憶部から取得し、この流速の誤差量に対応する前記補正量を前記記憶部から取得する請求項６又は７記載の流速測定装置。
9. 長尺状のフローセル内に、抗体が検体の流れる方向に配列されており、前記検体に含まれる抗原の濃度を測定する抗原濃度測定装置であって、
   光発振部と、
   前記抗体と、前記検体に含まれる物質のうち前記抗体との反応が期待される抗原と異なる物質と反応して屈折率が変化する検体検出物質とが固定されており、前記光発振部からの出射光による表面プラズモン共鳴を起こすための金属薄膜と、
   当該金属薄膜を固定し、当該金属薄膜上に前記光発振部の出射光を、複数の入射角度の入射光に変換して直線状の焦線位置にて集光する集光部と、
   前記金属薄膜上に前記焦線位置に重なる位置に抗体を固定した抗体固定領域及び抗体を固定しないリファレンス領域を交互に配置した測定部と、
   前記焦線位置において生じた表面プラズモン共鳴による当該出射光の前記焦線位置における反射光を、複数の入射光の角度毎に受光する受光部と、
   前記測定部における前記抗体固定領域及び前記リファレンス領域毎のＳＰＲ角度の時間変化を求めるＳＰＲ角度算出部と、
   前記ＳＰＲ角度算出部が求めたＳＰＲ角度の時間変化に基づいて、前記フローセル内を流れる前記検体の流速を演算する流速演算部と、
   前記抗体における前記入射光の入射角と前記反射光の反射率との相関関係に基づいて反射率が最低となる入射角である共鳴角を求め、この共鳴角から前記抗体と前記検体検出物質との反応量を求める反応結果導出部と、
   前記検体検出物質における入射角と反射率との相関関係に基づいて共鳴角を求め、この共鳴角から前記検体検出物質および反応した検体に含まれる物質の屈折率を求める屈折率導出部と、
   前記屈折率導出部が求めた屈折率の変化速度から前記検体の流速の誤差量を求め、この流速の誤差量から前記反応結果導出部が求めた反応量の補正量を求めて、前記反応量を前記補正量に基づいて補正する反応結果補正部と、
   前記反応結果補正部が補正結果に基づいて、前記検体に含まれる抗原の濃度を算出する抗原濃度算出部と、
   を有する抗原濃度測定装置。
10. 光発振部と、当該光発振部からの出射光による表面プラズモン共鳴を起こすための金属薄膜と、当該金属薄膜を固定し、当該金属薄膜上に前記光発振部の出射光を、複数の入射角度の入射光に変換して直線状の焦線位置にて集光する集光部と、前記金属薄膜上に前記焦線位置に重なる位置に長尺状のフローセルが構成され、このフローセル内に抗体を固定した抗体固定領域及び抗体を固定しないリファレンス領域を交互に配置した測定部と、前記焦線位置において生じた表面プラズモン共鳴による当該出射光の前記焦線位置における反射光を、複数の入射光の角度毎に受光する受光部と、を有する流速測定装置により、前記フローセル内を流れる前記検体の流速を測定する流速測定方法であって、
    前記測定部における前記抗体固定領域及び前記リファレンス領域毎のＳＰＲ角度の時間変化を求めるＳＰＲ角度算出過程と、
    前記ＳＰＲ角度算出過程で求めたＳＰＲ角度の時間変化に基づいて、前記フローセル内を流れる前記検体の流速を演算する流速演算過程と、
    を有する流速測定方法。
11. 光発振部と、抗体と、検体に含まれる物質のうち前記抗体との反応が期待される抗原と異なる物質と反応して屈折率が変化する検体検出物質と、が固定されており、前記光発振部からの出射光による表面プラズモン共鳴を起こすための金属薄膜と、当該金属薄膜を固定し、当該金属薄膜上に前記光発振部の出射光を、複数の入射角度の入射光に変換して直線状の焦線位置にて集光する集光部と、前記金属薄膜上に前記焦線位置に重なる位置に長尺状のフローセルが構成され、このフローセル内に抗体を固定した抗体固定領域及び抗体を固定しないリファレンス領域を交互に配置した測定部と、前記焦線位置において生じた表面プラズモン共鳴による当該出射光の前記焦線位置における反射光を、複数の入射光の角度毎に受光する受光部と、を有する流速測定装置により、前記フローセル内を流れる前記検体の流速を測定する流速測定方法であって、
    前記測定部における前記抗体固定領域及び前記リファレンス領域毎のＳＰＲ角度の時間変化を求めるＳＰＲ角度算出過程と、
    前記ＳＰＲ角度算出過程で求めたＳＰＲ角度の時間変化に基づいて、前記フローセル内を流れる前記検体の流速を演算する流速演算過程と、
    前記抗体における前記入射光の入射角と前記反射光の反射率との相関関係に基づいて反射率が最低となる入射角である共鳴角を求め、この共鳴角から前記抗体と前記検体検出物質との反応量を求める反応結果導出過程と、
    前記検体検出物質における入射角と反射率との相関関係に基づいて共鳴角を求め、この共鳴角から前記検体検出物質および反応した検体に含まれる物質の屈折率を求める屈折率導出過程と、
    前記屈折率導出過程で求めた屈折率の変化速度から前記検体の流速の誤差量を求め、この流速の誤差量から前記反応結果導出過程で求めた反応量の補正量を求めて、前記反応量を前記補正量に基づいて補正する反応結果補正過程と、
    前記反応結果補正過程での補正結果に基づいて、前記検体に含まれる抗原の濃度を算出する抗原濃度算出過程と、
    を有する抗原濃度測定方法。

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