JP4778990B2

JP4778990B2 - 抗原濃度検出装置及び抗原濃度検出方法

Info

Publication number: JP4778990B2
Application number: JP2008186042A
Authority: JP
Inventors: 弦岩崎; 倫子瀬山; 剛林; 恒之芳賀; 達三浦; 淳一高橋; 勉堀内
Original assignee: Nippon Telegraph and Telephone Corp
Current assignee: Nippon Telegraph and Telephone Corp
Priority date: 2008-07-17
Filing date: 2008-07-17
Publication date: 2011-09-21
Anticipated expiration: 2028-07-17
Also published as: JP2010025692A

Description

本発明は、光学系を用いて流体状の被測定物質（検体）中の測定物質を定量的かつ定性的に測定する表面プラズモン共鳴センサを用いた抗原濃度検出装置に関する。詳しくは被測定物質に接した金属薄膜での表面プラズモン共鳴現象を利用して、液体やガスなどの試料の屈折率変化を検知し定性・定量測定を行うものであり、フローセル及び抗体を固定した金属薄膜を一体化した表面プラズモン共鳴測定用金属薄膜一体型フローセルを用いた抗原濃度検出装置及び抗原濃度検出方法に関する。

抗原濃度の検出方法として、フローセルの流路部分に露出している金属薄膜（例えば、金薄膜）に抗体を付着させた抗体固定膜を形成し、このフローセルに抗原を含む液体を流すことにより、上記抗体に抗原が付着したことを、プラズモン共鳴センサを用いて、抗原抗体の複合体となったことによる抗体固定膜の屈折率変化を検出し、この屈折率変化の速度により抗原の濃度を検出する方法が用いられる（例えば、特許文献１参照）。
これにより、抗原の濃度に応じて屈折率の変化速度が大きくなるため、この変化速度から抗原濃度を測定している。

測定装置の構成としては、図６に示すように、光源であるＬＥＤ（Light Emitting Diode）１００の放射した光を、レンズ１０１に光束とし、偏光子１０２によりＰ偏光光のみを、シリンドリカルレンズ１０３により集光して、高屈折率のプリズム１０４に入射させる。光源は、ＬＥＤのみでなく、半導体レーザなどを用いても良い。
上記プリズム１０４は、シリンドリカルレンズ１０３により集光されて下部から入射される光が、上部面に形成された表面プラズモン共鳴を起こすための金属薄膜１０５において焦線１０７となるよう構成されている。

上記対向する上部面上には、濃度を測定したい抗原に対応する抗体が金属薄膜１０５上に固定され、抗体固定膜１０６を形成している。
また、プリズムに入射された入射光は、焦線１０７の位置にて、金属薄膜１０５、抗体固定膜１０６及び流路を流れる液体により反射される。この反射光は、レンズ１０８により平行光とされ、偏光子１０９によりＰ偏光光のみがレンズ１１０に入射される。レンズ１１０は、入射される光を受光素子１１１（ＣＣＤ）面へ放射する。

金属薄膜１０５には、測定領域としての上記抗体固定膜１０６において、抗体の固定された抗体固定領域２０１、抗体の固定されていないリファレンス領域２０２から構成される試料領域２００が、図７に示すように、焦線１０７方向（すなわち、ｙ方向）に対して、予め設定された周期にて互い違いに、焦線１０７の直上部に、長尺状に配置されている。図示はしないがフローセルの流路は、上記試料領域２００に検体が接触して流れるように、焦線１０７方向に長尺状に形成されている。
したがって、ＣＣＤ１１１面には、このＣＣＤ１１１の上面図である図８に示すように、焦線１０７の面において、ｙ方向の位置に対応して、焦線１０７の面からの反射光がそれぞれピクセル単位に格子状に配列された受光素子に入力される。

また、ＣＣＤ１１１面におけるｘ方向において、焦線１０７への入射光の入射角度それぞれに対応し、焦線１０７にて反射された反射光が、それぞれピクセル単位に格子状に配列されている受光素子に入力される。これにより、試料領域２００に平行に焦線１０７に入射された光の、各焦線１０７位置におけるそれぞれの入射角度に対応する反射光の強度を、一括して検出することができる。
上述した構成により、各抗体固定領域２０１に固定されている抗体に対して、抗原が反応して結合した場合、抗体固定膜１０６の屈折率が変化し、この屈折率に対応した入射角度における反射率が変化、すなわち抗体に抗原が付着すると屈折率が高くなることにより、反射率が低下する入射角度（ＳＰＲ角度）を、時系列にモニタすることにより、抗体固定膜１０６の屈折率の変化を測定することができる。
特表２００１−５１１２４９号公報

上記従来例においては、上記抗体固定膜１０６における抗体に抗原が結合したことによる上記ＳＰＲ角度の変化が小さく、例えば、各受光素子間隔に対して１／１００程度の分解能にて検出する必要がある。
しかしながら、ＣＣＤ１１１により撮像した画像データにノイズが重畳しているため、上記従来例においては、ＳＰＲ角度の推定値が上記ノイズによりばらつき、精度の高い抗原濃度の測定が行えないという欠点がある。
また、上記試料領域２００において、抗体固定領域２０１の数が一定だが、抗体固定領域２０１の位置はｙ方向にてばらつくため、屈折率の変化を検出する抗体固定領域２０１を、画像処理の対象とするＲＯＩ（Region Of Interest）領域として抽出することができず、ノイズの影響と同様に、精度の高い抗原濃度の測定が行えないという欠点がある。

本発明は、このような事情に鑑みてなされたもので、ＣＣＤなどの受光素子にて受光した画素データにおけるノイズのばらつきを除去するとともに、ＲＯＩ領域の位置、すなわち抗体固定領域の正確な位置を異なるセンサそれぞれの場合にて特定し、高い精度の抗原濃度の測定を可能とする抗原濃度検出装置及び方法を提供することを目的とする。

本発明の抗原濃度検出装置は、長尺状のマイクロフローセル内に、異なる抗体が検体の流れる方向に配列されており、検体に含まれる抗原の濃度を測定する抗原濃度検出装置であり、光発振器と、該光発振器からの出射光による表面プラズモン共鳴を起こすための金属薄膜と、該金属薄膜を固定し、該金属薄膜上に前記光発振器の出射光を、複数の入射角度の入射光に変換して直線状の焦線位置にて集光する集光機構と、前記金属薄膜上に前記焦線位置に重なる位置に抗体を固定した抗体固定領域及び抗体を固定しないリファレンス領域を交互に配置した測定領域と、前記焦線位置において生じた表面プラズモン共鳴による該出射光の前記焦線位置における反射光を、複数の入射光の角度毎に受光する受光素子アレイと、前記焦線位置での前記入射角度毎の反射光の強度からなるフレーム画像データを、一定のサンプリング周期毎に測定するデータ入力部と、フレーム画像データ毎に、入射角度方向の反射光の強度に対し、ローパスフィルタ演算を行うローパスフィルタ部と、前記ローパスフィルタ演算後のフレーム画像データ毎に、前記焦線位置が伸びる方向に対し、前記抗体固定領域の配置周期に対応したバンドパスフィルタ演算を行い、フィルタ演算結果として出力するバンドパスフィルタ部と、前記フィルタ演算結果から、前記焦線位置の伸びる方向の各位置における、最も反射光の強度が低い入射角度であるＳＰＲ角度を求めるＳＰＲ角度算出部と、前記焦線位置の伸びる方向の各位置におけるＳＰＲ角度のサンプリング周期毎の変化状態から、測定領域における抗体が実際に固定されている抗体固定領域を、抗原濃度測定に用いるＲＯＩ領域として検出するＲＯＩ検出部とを有する。

本発明の抗原濃度検出装置は、前記フレーム画像データから、抗体固定領域の配列方向及び入射角度方向それぞれの空間周波数を求める空間周波数成分算出部と、
前記空間周波数から前記ローパスフィルタ部及び前記バンドパスフィルタ部にて行う演算に用いるフィルタパラメータを算出するフィルタパラメータ算出部と
をさらに有することを特徴とする。

本発明の抗原濃度検出装置は、前記バンドパスフィルタ部のフィルタパラメータが前記測定領域の設計値における抗体固定領域の数、幅及び間隔から設定されていることを特徴とする。

本発明の抗原濃度検出装置は、前記ＳＰＲ角度算出部が、ローパスフィルタ演算後のフレーム画像データから、測定領域の位置毎の反射強度の変化曲線に対応するサイン関数を求め、このサイン関数を微分して、微分結果が「０」となる位置に対応する入射角度をＳＰＲ角度とすることを特徴とする。

本発明の抗原濃度検出装置は、前記ＲＯＩ検出部が、各測定領域の位置におけるＳＰＲ角度の時間平均を算出し、この時間平均を測定領域の位置方向に、設計値の抗体固定領域の幅に対応する位置の範囲にて第１の移動平均を算出し、上記範囲の２倍の範囲にて第２の移動平均を算出し、第１の移動平均から第２の移動平均を減算し、減算結果が正の範囲を抗原濃度検出の処理を行うＲＯＩ領域とすることを特徴とする。

本発明の抗原濃度検出方法は、光発振器と、該光発振器からの出射光による表面プラズモン共鳴を起こすための金属薄膜と、該金属薄膜を固定し、該金属薄膜上に前記光発振器の出射光を、複数の入射角度の入射光に変換して直線状の焦線位置にて集光する集光機構と、前記金属薄膜上に前記焦線位置に重なる位置に長尺状のマイクロフローセルが構成され、このマイクロフローセル内に抗体を固定した抗体固定領域及び抗体を固定しないリファレンス領域を交互に配置した測定領域と、前記焦線位置において生じた表面プラズモン共鳴による該出射光の前記焦線位置における反射光を、複数の入射光の角度毎に受光する受光素子アレイと、からなる抗原濃度検出装置により、検体に含まれる抗原の濃度を測定する抗原濃度検出方法であり、データ入力部が、前記焦線位置での前記入射角度毎の反射光の強度からなるフレーム画像データを、一定のサンプリング周期毎に測定するデータ入力過程と、ローパスフィルタ部が、フレーム画像データ毎に、入射角度方向の反射光の強度に対し、ローパスフィルタ演算を行うローパスフィルタ過程と、バンドパスフィルタ部が、前記ローパスフィルタ演算後のフレーム画像データ毎に、前記焦線位置が伸びる方向に対し、前記抗体固定領域の配置周期に対応したバンドパスフィルタ演算を行い、フィルタ演算結果として出力するバンドパスフィルタ過程と、ＳＰＲ角度算出部が、前記フィルタ演算結果から、前記焦線位置の伸びる方向の各位置における、最も反射光の強度が低い入射角度であるＳＰＲ角度を求めるＳＰＲ角度算出過程と、ＲＯＩ検出部が、前記焦線位置の伸びる方向の各位置におけるＳＰＲ角度のサンプリング周期毎の変化状態から、測定領域における抗体が実際に固定されている抗体固定領域を、抗原濃度測定に用いるＲＯＩ領域として検出するＲＯＩ検出過程とを有する。

以上説明したように、本発明によれば、２次元受光部から入力される画素データに対し、入射角度方向にローパスフィルタ演算を行うことにより、受光した画素データにおけるノイズのばらつきを除去することができ、かつ抗体固定領域の配列方向に対し、抗体固定領域の配置周期に対応したバンドパスフィルタ演算を行い、各サンプリング周期毎のフレーム画像データから、ＳＰＲ角度の時間変化を検出して、実際に取得したフレーム画像データにおけるＲＯＩ領域の位置を求めることができ、図７に示す抗体固定領域の位置や幅が製造時にずれたとしても、正確な抗原濃度を測定することが可能となる。
ここで、上記ＲＯＩ領域の位置を求める処理は、フレーム画像データ毎に独立して行うため、複数のフレーム画像データから求める場合に比較し、時間分解能の低下を伴わないため、高い精度にて抗原濃度を測定することができる。

以下、本発明の一実施形態による抗原濃度検出装置を図面を参照して説明する。図１は同実施形態による抗原濃度検出装置の構成例を示すブロック図である。
この図において、図示していないが、本実施形態の抗原濃度検出装置には、図６と同様の表面プラズモン共鳴センサ（以下、ＳＰＲセンサ）が設けられており、このＳＰＲセンサのＣＣＤ１１１から各受光素子の画素データ、すなわち抗体固定領域の配列方向の各位置と、この各位置における予め設定した入射角度範囲における入射角度と、に対応した受光素子の反射強度を示す画素データが、配置フレーム画像データとして入力される。
したがって、本実施形態による抗原濃度検出装置は、上記ＳＰＲセンサ（図６の構成）以外に、データ入力部１１、データ記憶部１２、空間周波数成分算出部１３、統計情報演算部１４、フィルタパラメータ算出部１５、ローパスフィルタ部１６、バンドパスフィルタ部１７、ＳＰＲ角度検出部１８、ＲＯＩ検出部１９を有している。

データ入力部１１は、ＣＣＤ１１１から入力される各受光素子の画素データである電圧値を、対応する階調度に変換し、図２に示す構成のフレーム画像データとして、各受光素子のｙ方向の位置に対応するアドレスＡｙ、Ａｘ方向の位置に対応するアドレスＡｘにより設定されるアドレスに対応して、データ記憶部１２へ各アドレスに対応する受光素子の受光した反射強度を示す階調度のデータを書き込む。
ここで、反射強度が強い場合に階調度が高くなり、反射強度が弱い場合に階調度が低くなる。なお、データ入力部１１は、例えば、実験で得られた最大の反射強度を最大の階調度として規格化し、入力される電圧値を階調度に変換する。

空間周波数成分算出部１３は、フーリエ変換またはウェーブレット変換により（例えば、本実施形態にてはフーリエ変換を利用）、行方向（ｘ方向：各位置がそれぞれ図６のシリンドリカルレンズ１０３における入射角度に対応している）の各受光素子からの階調度のデータから、行単位の周波数成分を算出し、各行の位置に対応させて、データ記憶部１２におけるｘ方向周波数記憶領域に、それぞれの周波数における強度データを、周波数毎に書き込む。
また、空間周波数成分算出部１３は、フーリエ変換またはウェーブレット変換により（例えば、本実施形態にてはフーリエ変換を利用）、列方向（ｙ方向：図６の抗体固定領域２０１の配列方向である）の各受光素子からの階調度のデータから、列単位の周波数成分を算出し、列の位置に対応させて、データ記憶部１２におけるｙ方向周波数記憶領域に、それぞれの周波数における強度データを、周波数毎に書き込む。

上述した行単位の周波数成分は、ＳＰＲ角度を検出する、すなわち最も反射強度の低い入射角度を検出するために用いられる。
また、上述した列単位の周波数成分は、抗体固定領域２０１の配置周期、すなわち画像処理の対象とするＲＯＩ領域を求めるために用いられる。

統計情報演算部１４は、ｘ方向周波数記憶領域に記憶されている行単位の周波数成分の強度データを、周波数毎に加算して行数にて除算することにより、強度データの周波数毎の平均値を算出し、ｘ方向周波数データとしてデータ記憶部１２に書き込む。
また、同様に、統計情報演算部１４は、ｙ方向周波数記憶領域に記憶されている列単位の周波数成分の強度データを、周波数毎に加算して列数にて除算することにより、強度データの周波数毎の平均値を算出し、ｙ方向周波数データとしてデータ記憶部１２に書き込む。

フィルタパラメータ算出部１５は、上記データ記憶部１２からｘ方向周波数データを読み出し、最大の周期を有する周波数成分の帯域を抽出し、この帯域以下の周波数を通過帯域とし、このローパスフィルタのパラメータを求め、すなわち、デジタルフィルタの場合、フィルタの伝達関数の係数を求め、また空間フィルタの場合、ローパスフィルタ演算を行うコンボリューション核の各係数を求める。

また、フィルタパラメータ算出部１５は、ｙ方向周波数データを読み出し、全周波数における強度値の合計値に対し、加算すると当該合計値の１／２となる強度値となる周波数範囲を、パスバンドエッジを求めて通過させる周波数帯域とし、このバンドパスフィルタの演算を行うフィルタパラメータを求め、たとえば、デジタルフィルタの場合、フィルタの伝達関数の係数を求め、また空間フィルタの場合、ローパスフィルタ演算を行うコンボリューション核の各係数を求める。
あるいは、フィルタパラメータ算出部１５は、バンドパスフィルタに対し、設計値としての抗体固定領域２０１の数、この領域の幅、間隔などのデータから、この画像形状に対応したｙ方向のバンドパスフィルタのパラメータを、複数個予め設定しておき、測定対象（抗体固定領域２０１の数）に対応して選択するようにしても良い。

ローパスフィルタ部１６は、データ記憶部１２から画像データを読み出し、フィルタパラメータ算出部１５の生成したローパスフィルタ（行方向のコンボリューション核）により、ｘ方向に対して、ローパスフィルタ演算を行い、ローパスフィルタ処理データをデータ記憶部１２のローパスフィルタ処理データ領域に書き込む。
また、バンドパスフィルタ部１７は、データ記憶部１２のローパスフィルタ演算結果領域から、ローパスフィルタ処理データを読み出し、フィルタパラメータ算出部１５の生成したバンドパスフィルタ（列方向のコンボリューション核）により、ｙ方向に対してバンドパスフィルタ演算を行い、演算結果をフィルタ処理データとして、データ記憶部１２のフィルタ処理データ領域に書き込む。
上述した処理により、ＣＣＤ１１１から入力された受光素子からのデータに重畳しているノイズ成分を低減させることができる。

また、ローパスフィルタ部１６は、デジタルフィルタを用いた場合、ｘ方向周波数記憶領域に記憶されている周波数毎における強度データに対し、行毎にローパスフィルタ演算を行い、設定された周波数以下以外の周波数帯域の強度データを「０」とし、逆フーリエ変換を行い、画像を再生するように構成しても良い。
同様に、バンドパスフィルタ部１７は、ローパスフィルタ部１６が再生した画像を、列方向にフーリエ変換し、周波数変換したデータに対して、列方向（ｙ方向）毎にバンドパスフィルタ演算を行い、設定された周波数範囲以外の強度データを「０」とし、逆フーリエ変換を行い、画像を再生し、フィルタ処理データとして、データ記憶部１２のフィルタ処理データ領域に書き込むように構成しても良い。

ＳＰＲ角度検出部１８は、上記フィルタ処理データを、データ記憶部１２のフィルタ処理結果領域から読み出し、ｘ方向毎に、反射光が最も小さくなる入射角度であるＳＰＲ角度、すなわちｘ方向での位置ｘi（角度に対応した）を求める。
このＳＰＲ角度の算出方法としては、
・凹型の関数を２次元関数により近似させて、極値の位置を求め、この位置をＳＰＲ角度とする
・図形的にｘ方向の波形形状の重心を求める
・凹型の関数をＱ（ｘ）＝Ａ１cos（ｘ）あるいはＱ（ｘ）＝Ａ１cos（ｘ）＋Ａ２cos（２ｘ）にてフィッティングし、フィッティング結果を微分して、Ｑ’（ｘ）＝０となるｘiを求める（Ａ１及びＡ２はフーリエ変換による周波数におけるスペクトルの強度値）
などの方法がある。

入射角度に対応する階調度の波形の変化は、抗原抗体反応により反射強度の低下する位置（ＳＰＲ角度）の波形の形状が変化せずに、極値となる入射角度のみが異なる変化である。したがって、上述した位置ｘiを検出することにより、予め設定されているこの位置ｘiとＳＰＲ角度との対応関係を示すテーブルなどからＳＰＲ角度を求めて、時間的なＳＰＲ角度の変化をモニタすることができる。
そして、ＲＯＩ検出部１９は、ＳＰＲ角度の時間変化に基づいて、抗原濃度を算出するパラメータとなる抗原抗体の反応速度を検出するＲＯＩ領域の抽出を、このＳＰＲ角度の時間変化により検出する（詳細は後述）。

次に、図１及び図３を参照して本実施形態による抗原濃度検出装置の動作を説明する。図３は、図１におけるＲＯＩ領域の抽出処理の動作例を示すフローチャートである。
データ入力部１１は、図６のＣＣＤ１１１の各受光素子からの画素データを、階調度に変更し、図２に示す構成にてデータ記憶部１２に書き込む（ステップＳ１）。
データ入力部１１は、予め設定されている測定期間が終了したか否かを、測定時間と、内部タイマの計時する時間とを比較し（ステップＳ２）、測定期間の終了が検出されるまで、一定のサンプリング周期にてステップＳ１の処理を繰り返して、ＣＣＤ１１１からの画素データを読み込み、このサンプリング周期の順番にてサンプリング周期毎に、図２に示す構成のフレーム画像データとして、測定した画素データの階調度のデータを、データ記憶部１２に書き込む。一方、データ入力部１１は、測定期間の終了が検出されると処理をステップＳ３へ進める。

測定時間が終了すると、空間周波数成分算出部１３は、各サンプリング周期のフレーム画像データを、例えばフーリエ変換により、フレーム画像データ毎に、行方向及び列方向に対してそれぞれ周波数成分の算出を行い、各サンプリング周期に対応させて、行方向の周波数成分毎の強度データをデータ記憶部１２のｘ方向周波数記憶領域に、また列方向の周波数成分毎の強度データをデータ記憶部１２のｙ方向周波数成分記憶領域に書き込む（ステップＳ３）。

次に、統計情報演算部１４は、データ記憶部１２のｘ方向周波数成分記憶領域に記憶されているフレーム画像データの行単位の周波数成分の強度データを、周波数成分毎に加算し、さらにフレーム画像データ毎の加算結果をさらに周波数成分毎に加算し、全サンプリング周期の加算結果を、周期数及び行数の乗数により乗算し、全サンプリング周期のフレーム画像データにおける、行方向の各周波数成分の強度データの平均値として、ｘ方向周波数データを算出する。
同様に、統計情報演算部１４は、データ記憶部１２のｙ方向周波数成分記憶領域に記憶されているフレーム画像データの列単位の周波数成分の強度データを、周波数成分毎に加算し、さらにフレーム画像データ毎の加算結果をさらに周波数成分毎に加算し、周波数全サンプリング周期の加算結果を、周期数及び列数の乗数により乗算し、全サンプリング周期のフレーム画像データにおける、列方向の各周波数成分の強度データの平均値として、ｙ方向周波数データを算出する（ステップＳ４）。

統計情報の計算が終了すると、フィルタパラメータ算出部１５は、上記ｘ方向周波数データにおける最大周期の周波数成分の帯域を抽出し、この帯域以下の周波数を通過帯域とする、行方向にかけるローパスフィルタのコンボリューション核の畳み込み核パラメータを求める。
そして、フィルタパラメータ算出部１５は、上記ｙ方向周波数データにおける最大周期の周波数成分の帯域を抽出し、この帯域以下の周波数を通過帯域とする、列方向にかけるバンドパスフィルタのコンボリューション核の畳み込み核パラメータを求める（ステップＳ５）。例えば、フィルタパラメータ算出部１５は、予め実験から求めた複数の周波数（周波数帯域）毎のコンボリューション核及びその核パラメータをテーブルにて保持しており、抽出した最大周期の周波数成分に対応させ、ｘ方向のローパスフィルタ、及びｙ方向のバンドパスフィルタそれぞれのコンボリューション核及び核パラメータを読み出して用いるようにする。

次に、ローパスフィルタ部１６は、サンプリング周期毎に、データ記憶部１２に記憶されているフレーム画像データを読み込み、上記列方向のコンボリューション核を用いて、フレーム画像データの各画素データに対してｘ方向に向かってローパスフィルタ演算を行い、各フレーム画像データのローパスフィルタ処理データを、サンプリング周期毎にデータ記憶部１２のローパスフィルタ処理データ領域に書き込む。
また、バンドパスフィルタ部１７は、上記ローパスフィルタ処理データをサンプリング周期毎に、データ記憶部１２のローパスフィルタ処理データ領域から読み込み、上記ｙ方向のコンボリューション核を用いて、ローパスフィルタ処理データの画素データに対してｙ方向に向かってバンドパスフィルタ演算を行い、各フレーム画像データのバンドパスフィルタ処理データを、フィルタ処理データとしてサンプリング周期毎にデータ記憶部１２のフィルタ処理データ領域に書き込む（ステップＳ６）。

全サンプリング周期のフレーム画像データに対するｘ方向のローパスフィルタ演算と、ｙ方向のバンドパスフィルタ演算とが終了すると、ＲＯＩ検出部１９は、上記フィルタ処理データをデータ記憶部１２からサンプリング周期毎に読み出し、各々の行単位（ｘ方向）の画素データを用いて、ＳＰＲ角度を求める。ＲＯＩ検出部１９は、全サンプリング周期におけるフィルタ処理データにおいて、各ｘ方向の画素データ（１行分の画素データ）からＳＰＲ角度データを求める。
そして、ＲＯＩ検出部１９は、各ｘ方向の画素データのＳＰＲ角度のサンプリング期間毎の変化を、測定時間範囲内にて一次近似した一次直線を求め、この一次直線に対するＳＰＲ角度の偏差を求めることにより、ＲＯＩ領域の検出を行う（ステップＳ７）。すなわち、抗原抗体反応が発生している場合、抗体固定領域２０１におけるＳＰＲ角度の変化が一次近似より外れることを利用し、一次近似より外れる行部分を抗体固定領域２０１とし、ドリフト変化（単調変化）を行う部分をリファレンス領域２０２として検出する。

次に、上記ステップＳ７において行う本実施形態によるＲＯＩ検出処理を、図４を用いて詳細に説明する。図４は、横軸がｙ方向の位置を示し、縦軸が後述するＳＰＲ角度を用いた計算結果の数値を示している。また、この図４のグラフは、本実施形態の抗原濃度検出装置の表示部に表示される。
ＲＯＩ検出部１９は、ｙ方向の位置毎におけるＳＰＲ角度の測定時間内における時間平均を算出、すなわち測定時間内にサンプリングしたＳＰＲ角度を積算し、サンプリング周期数にて除算し、ｙ方向の位置毎におけるＳＰＲ角度の時間平均Ａ１を算出する。（また、時間平均ではなく、測定時間内にサンプリングしたＳＰＲ角度の中央値、標準偏差、歪度及び尖度のいずれの指標を用いてもよい。）

次に、ＲＯＩ検出部１９は、設計値における抗体固定領域２０１の幅Ｌに対応するｙ方向の画素数単位に、１画素ずつずらしながら上記時間平均Ａ１の幅Ｌの画素数単位の移動平均値Ａ２を求める。
また、ＲＯＩ検出部１９は、抗体固定領域２０１の幅Ｌの２倍に対応するｙ方向の画素数単位に、１画素ずつずらしながら上記時間平均Ａ１の幅２Ｌの画素数単位の移動平均値Ａ３を求める。
そして、ＲＯＩ検出部１９は、各ｙ方向の位置毎（画素毎に）に、移動平均Ａ２から移動平均Ａ３を減算し、それぞれ差分Ａ４を算出する。

差分Ａ４を算出した後、ＲＯＩ検出部１９は、各ｙ方向の位置毎の差分Ａ４の符合の極性Ａ５（すなわち、「正（＋）」か「負（−）」のいずれであるか）を検出する。
検出の結果、ＲＯＩ検出部１９は、符合の極性が正であるｙ方向の位置を抽出し、両端を除いた範囲を、図５に示すようにＲＯＩ領域として設定する。この設定に関して、ＲＯＩ検出部１９が表示する図４において、マウスなどの入力装置を用いて、差分Ａ４が算出されて表示された後、表示画面上においてユーザが選択してＲＯＩ領域の部分を選択する様にしても良い。

このとき、ＲＯＩ検出部１９は、設計されたＳＰＲセンサの抗体固定領域２０１の数と、ＲＯＩ領域として設定された数とを比較し、一致している場合に正常なＳＰＲセンサとして、以降の抗原濃度の検出を行う処理に移行し、一致していない場合に不良のＳＰＲセンサとして、異常であることを示す通知（例えば、装置の表示装置への表示）を行う。
次に、本実施形態の抗原濃度検出装置は、ＲＯＩ領域が検出された後、この部分における抗体に対する抗原の反応速度などから、フローセルに流す検体に含まれる抗原濃度の検出処理を行う。

上述した処理により、本実施形態によれば、ＣＣＤ１１１から入力される画素データに対し、入射角度方向にローパスフィルタ演算を行うことにより、ＣＣＤ１１１にて受光した画素データにおけるノイズのばらつきを除去することができ、かつ抗体固定領域２０１の配列方向に対し、抗体固定領域２０１の配置周期に対応したバンドパスフィルタ演算を行い、各サンプリング周期毎のフレーム画像データから、ＳＰＲ角度の時間変化を検出して、実際に取得したフレーム画像データにおけるＲＯＩ領域の位置を求めることができるため、正確な抗原濃度を測定することが可能となる。

なお、図１における各部の機能を実現するためのプログラムをコンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録して、この記録媒体に記録されたプログラムをコンピュータシステムに読み込ませ、実行することによりＲＯＩ領域の検出処理を行ってもよい。なお、ここでいう「コンピュータシステム」とは、ＯＳや周辺機器等のハードウェアを含むものとする。また、「コンピュータシステム」は、ホームページ提供環境（あるいは表示環境）を備えたＷＷＷシステムも含むものとする。また、「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ等の可搬媒体、コンピュータシステムに内蔵されるハードディスク等の記憶装置のことをいう。さらに「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、インターネット等のネットワークや電話回線等の通信回線を介してプログラムが送信された場合のサーバやクライアントとなるコンピュータシステム内部の揮発性メモリ（ＲＡＭ）のように、一定時間プログラムを保持しているものも含むものとする。

また、上記プログラムは、このプログラムを記憶装置等に格納したコンピュータシステムから、伝送媒体を介して、あるいは、伝送媒体中の伝送波により他のコンピュータシステムに伝送されてもよい。ここで、プログラムを伝送する「伝送媒体」は、インターネット等のネットワーク（通信網）や電話回線等の通信回線（通信線）のように情報を伝送する機能を有する媒体のことをいう。また、上記プログラムは、前述した機能の一部を実現するためのものであっても良い。さらに、前述した機能をコンピュータシステムにすでに記録されているプログラムとの組み合わせで実現できるもの、いわゆる差分ファイル（差分プログラム）であっても良い。

＜ＳＰＲ角度＞
ＬＥＤ１００からプリズム１０４に入射された光は、プリズム１０４と金属薄膜１０５との界面でエバネッセント波を生起させる。エバネッセント波の波数ｋ_ｅｖは、式（１）により定義される。
ｋ_ｅｖ＝ｋ_ｐｎ_ｐsinθ …（１）
ここで、ｋ_ｐは入射光の波数、ｎ_ｐはプリズム１０４の屈折率、θは入射角である。
一方、金属薄膜１０５の表面では、表面プラズモン波が生じる。表面プラズモン波の波数ｋ_ｓｐは、式（２）により定義される。
ｋ_ｓｐ＝（ｃ／ω）｛εｎ2／（ε＋ｎ2）｝1/2 …（２）
ここで、ｃは光速、ωは角振動数、εは金属薄膜１０５の誘電率、ｎは被測定物質１０５の屈折率である。

エバネッセント波の波数ｋ_ｅｖと表面プラズモン波の波数ｋ_ｓｐとが一致する入射角θのときに、エバネッセント波のエネルギーが表面プラズモンの励起に使われ、反射光の強度が減少する。したがって、入射角θを変化させることにより、所定の角度θ0（ＳＰＲ角度）で極小をもつ入射角−反射強度曲線が得られる。すなわち、表面プラズモン共鳴現象による吸収を含んだ反射光が、金属薄膜１０５とプリズム１０４との界面から反射される。
このＳＰＲ現象は、金属薄膜１０５に接する被測定物の検体の抗原と抗体との複合体の屈折率ｎに依存する。このため、極小値をとる角度θ0から、検体に含まれる抗原濃度変化による屈折率変化等を測定することができる。

本発明の一実施形態による抗原濃度検出装置の構成例を示すブロック図である。データ記憶部１２に記憶するフレーム画像データのデータ構成を説明する概念図である。図１の抗原濃度検出装置によるＲＯＩ領域の検出処理を説明するフローチャートである。ＲＯＩ検出部１９が抗体固定領域２０１の配列方向の位置毎のＳＰＲ角度角度の時間平均からＲＯＩ領域の位置を検出する処理を説明するグラフである。抗原濃度検出装置におけるＳＰＲセンサ部分の構成を説明する概念図である。表面に抗体が固定された抗体固定領域と、抗体の固定されていないリファレンス領域とが交互に配置されている測定領域の構成を示す概念図である。ＣＣＤ１１１の各ピクセルに受光される光に対する、抗体固定領域２０１の配列方向と、入射角度の方向との関係を示す概念図である。図７におけるＣＣＤ１１１の２次元に配置された受光素子に入力される金属薄膜１０５からの反射光の分布の構成を示す概念図である。

符号の説明

１１…データ入力部
１２…データ記憶部
１３…空間周波数成分算出部
１４…統計情報演算部
１５…フィルタパラメータ算出部
１６…ローパスフィルタ部
１７…バンドパスフィルタ部
１８…ＳＰＲ角度検出部
１９…ＲＯＩ検出部
１００…ＬＥＤ
１０１，１０８，１１０…レンズ
１０２，１０９…偏光子
１０３…シリンドリカルレンズ
１０４…プリズム
１０５…金属薄膜
１０６…抗体固定膜
１０７…焦線
１１１…ＣＣＤ

Claims

長尺状のマイクロフローセル内に、異なる抗体が検体の流れる方向に配列されており、検体に含まれる抗原の濃度を測定する抗原濃度検出装置であり、
光発振器と、
該光発振器からの出射光による表面プラズモン共鳴を起こすための金属薄膜と、
該金属薄膜を固定し、該金属薄膜上に前記光発振器の出射光を、複数の入射角度の入射光に変換して直線状の焦線位置にて集光する集光機構と、
前記金属薄膜上に前記焦線位置に重なる位置に抗体を固定した抗体固定領域及び抗体を固定しないリファレンス領域を交互に配置した測定領域と、
前記焦線位置において生じた表面プラズモン共鳴による該出射光の前記焦線位置における反射光を、複数の入射光の角度毎に受光する受光素子アレイと、
前記焦線位置での前記入射角度毎の反射光の強度からなるフレーム画像データを、一定のサンプリング周期毎に測定するデータ入力部と、
フレーム画像データ毎に、入射角度方向の反射光の強度に対し、ローパスフィルタ演算を行うローパスフィルタ部と、
前記ローパスフィルタ演算後のフレーム画像データ毎に、前記焦線位置が伸びる方向に対し、前記抗体固定領域の配置周期に対応したバンドパスフィルタ演算を行い、フィルタ演算結果として出力するバンドパスフィルタ部と、
前記フィルタ演算結果から、前記焦線位置の伸びる方向の各位置における、最も反射光の強度が低い入射角度であるＳＰＲ角度を求めるＳＰＲ角度算出部と、
前記焦線位置の伸びる方向の各位置におけるＳＰＲ角度のサンプリング周期毎の変化状態から、測定領域における抗体が実際に固定されている抗体固定領域を、抗原濃度測定に用いるＲＯＩ領域として検出するＲＯＩ検出部と
を有する抗原濃度検出装置。
前記フレーム画像データから、抗体固定領域の配列方向及び入射角度方向それぞれの空間周波数を求める空間周波数成分算出部と、
前記空間周波数から前記ローパスフィルタ部及び前記バンドパスフィルタ部にて行う演算に用いるフィルタパラメータを算出するフィルタパラメータ算出部と
をさらに有することを特徴とする請求項１に記載の抗原濃度検出装置。
前記バンドパスフィルタ部のフィルタパラメータが前記測定領域の設計値における抗体固定領域の数、幅及び間隔から設定されていることを特徴とする請求項１記載の抗原濃度検出装置。
前記ＳＰＲ角度算出部が、ローパスフィルタ演算後のフレーム画像データから、測定領域の位置毎の反射強度の変化曲線に対応するサイン関数を求め、このサイン関数を微分して、微分結果が「０」となる位置に対応する入射角度をＳＰＲ角度とすることを特徴とする請求項１から請求項３のいずれかに記載の抗原濃度検出装置。
前記ＲＯＩ検出部が、各測定領域の位置におけるＳＰＲ角度の時間平均を算出し、この時間平均を測定領域の位置方向に、設計値の抗体固定領域の幅に対応する位置の範囲にて第１の移動平均を算出し、上記範囲の２倍の範囲にて第２の移動平均を算出し、第１の移動平均から第２の移動平均を減算し、減算結果が正の範囲を抗原濃度検出の処理を行うＲＯＩ領域とすることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれかに記載の抗原濃度検出装置。
光発振器と、該光発振器からの出射光による表面プラズモン共鳴を起こすための金属薄膜と、該金属薄膜を固定し、該金属薄膜上に前記光発振器の出射光を、複数の入射角度の入射光に変換して直線状の焦線位置にて集光する集光機構と、前記金属薄膜上に前記焦線位置に重なる位置に長尺状のマイクロフローセルが構成され、このマイクロフローセル内に抗体を固定した抗体固定領域及び抗体を固定しないリファレンス領域を交互に配置した測定領域と、前記焦線位置において生じた表面プラズモン共鳴による該出射光の前記焦線位置における反射光を、複数の入射光の角度毎に受光する受光素子アレイと、からなる抗原濃度検出装置により、検体に含まれる抗原の濃度を測定する抗原濃度検出方法であり、
データ入力部が、前記焦線位置での前記入射角度毎の反射光の強度からなるフレーム画像データを、一定のサンプリング周期毎に測定するデータ入力過程と、
ローパスフィルタ部が、フレーム画像データ毎に、入射角度方向の反射光の強度に対し、ローパスフィルタ演算を行うローパスフィルタ過程と、
バンドパスフィルタ部が、前記ローパスフィルタ演算後のフレーム画像データ毎に、前記焦線位置が伸びる方向に対し、前記抗体固定領域の配置周期に対応したバンドパスフィルタ演算を行い、フィルタ演算結果として出力するバンドパスフィルタ過程と、
ＳＰＲ角度算出部が、前記フィルタ演算結果から、前記焦線位置の伸びる方向の各位置における、最も反射光の強度が低い入射角度であるＳＰＲ角度を求めるＳＰＲ角度算出過程と、
ＲＯＩ検出部が、前記焦線位置の伸びる方向の各位置におけるＳＰＲ角度のサンプリング周期毎の変化状態から、測定領域における抗体が実際に固定されている抗体固定領域を、抗原濃度測定に用いるＲＯＩ領域として検出するＲＯＩ検出過程と
を有する抗原濃度検出方法。