JP4847445B2 - バイオロジカルソイル検出器およびその使用方法 - Google Patents
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Description
固体支持部材と、
固体支持部材に固定された特異的指標であって、血液の存在に対して敏感な材料を含む特異的指標と、を含み、
固体支持体および特異的指標が、表面の接触に用いられた液体との接触を容易にすべく検出器に対して配置されているバイオロジカルソイル検出器を提供するものである。
表面を液体と接触させるステップと、
液体が表面と接触した後に、この液体を本願明細書にて記載の検出器の固体支持部材および特異的指標と接触させるステップと、
固体支持部材の検出可能な反応を検査して、特異的指標がバイオロジカルソイルと相互作用したか否かを判断するステップと、を含む、表面に関連したバイオソイルを検出するための方法を提供するものである。
固体支持部材と、
固体支持部材に固定された特異的指標と、を含み、
固体支持体および特異的指標が、表面の接触に用いられる液体との接触を容易にすべく配置されているバイオロジカルソイル検出器を提供するものである。
固体支持部材および特異的指標を表面と接触させるステップと、
固体支持部材を表面から後退させるステップと、
検出器の固体支持体に検出可能な反応がないかどうかを調べることで、固体支持体に固定された特異的指標がバイオロジカルソイルの成分と相互作用したか否かを判断するステップと、を含む方法に利用できるものである。
表面を液体と接触させるステップと、
液体が表面と接触した後に、この液体を固体支持部材および特異的指標と接触させるステップと、
固体支持部材の検出可能な反応を検査して、特異的指標がバイオロジカルソイルと相互作用したか否かを判断するステップと、を含む、表面に関連したバイオソイルを検出するための方法が得られる。
BCIP12.5μL、NBT50μL、TRIS緩衝液50μLおよび水37.5μLを組み合わせて、BCIP/NBT3成分ホスファターゼ支持体系(キルケガードアンドペリーラボラトリーズインコーポレイテッド(Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.))を用いて溶液を生成した。BCIP/NBT3成分ホスファターゼ支持体系から得た溶液5μLをたらすマイクロピペットを利用してバイオダインBフィルムの粗い側にスポットを付け、30分間空気乾燥させた。このスポットを付けたフィルムに、アルカリホスファターゼ(カルバイオケム(Calbiochem))5μLを用いて3.6単位/mLの濃度で再度スポットを付けた。
0.1MのTRISを脱イオン水に入れたもの50mL、0.1NのHCl7mLおよび脱イオン水43mLを混合して、pH=8.9の0.05MのTRIS緩衝液を調製した。BCIPを25mgと、1,2−プロパンジオール3mL、グリセロール2mL、0.05MのTRIS緩衝液(pH=8.9)5mLの混合物とを組み合わせて、第1の溶液を調製した。NBT50mgと、1,2−プロパンジオール3mL、グリセロール2mL、0.05MのTRIS緩衝液(pH=9)5mLとを組み合わせて、第2の溶液を調製した。次に、第1の溶液100μLを、第2の溶液100μL、0.1mg/mLのMnCl2を水に入れたもの100μL、pH=9のTRIS緩衝液1mLと混合した。このようにして得られる溶液を、5μLのスポットを作るマイクロピペットでバイオダインBフィルムの粗い側にスポットし、このフィルムを室温にて30分間空気乾燥させた。次に、濃度3.5単位/mLまたは1.7単位/mLのアルカリホスファターゼ(カルバイオケム)からなる5μLのスポットを、すでにスポットを付けてあるフィルムにのせた。
3種類の溶液A、BおよびCを別々に調製した。溶液Aについては、バイオシンス(Biosynth)から得たBCIP25mgを脱イオン水10mLに溶解させて調製した。溶液Bについては、NBT50mgを脱イオン水10mLに溶解させて調製した。溶液Cについては、MgCl2100mgとMnCl2100mgを実施例2で説明したようにして調製したTRIS緩衝液10mLに加えて調製した。溶液Aを400μLと溶液Bを100μL、溶液Cを500μL組み合わせて、実験1〜10用の溶液を調製した。また、溶液A800μL、と溶液B100μLおよび溶液C100μLで組み合わせて、実験11〜20用の溶液を調製した。さらに、溶液A300μL、溶液B300μLおよび溶液C400μLを組み合わせて、実験21〜30用の溶液を調製した。このようにして得られる溶液各々5マイクロリットルを、マイクロピペットを使ってバイオダインBフィルムの上にスポットし、室温にて30分間空気乾燥させた。実験6〜10、16〜20、26〜30では、乾燥後のフィルムを水道水の流水ですすぎ、再度室温にて30分間空気乾燥させた。実験1〜30を乾燥させた後、濃度3.5、1.79、0.89、0.45、0.1単位/mLのアルカリホスファターゼ(カルバイオケム)溶液5μLを各々乾燥後のスポットにのせ、これによって灰色−黒色が認められるようになるまでの時間を記録した。表1に示す結果は3つのスポットの平均とした。
製造業者の指示(キルケガードアンドペリーラボラトリーズインコーポレイテッド)に従って1倍濃度の50μLBCI−gal/鉄緩衝溶液2mLを調製した。2倍濃度の100μLBCI−gal/鉄緩衝溶液2mLを調製した。次に、4倍濃度の100μLBCI−gal/鉄緩衝溶液1mLを調製した。1倍、2倍、4倍の各溶液を、10μLの滴をたらすマイクロピペットで正に荷電したオスモニクスナイロン膜にスポットし、フィルムを室温にて30分間空気乾燥させた。次に、濃度5.9、0.59、0.059、0.0059単位/スポットまたは0.5、0.05、0.005、0.0005mg/スポットのβ−ガラクトシダーゼ(シグマ−アルドリッチ(Sigma−Aldrich)から590単位/mLで供給)10μLの滴をたらした。発色に必要な時間を秒単位で記録した。結果を表2に示す。
エスクリン(1mg/mL)/FeCl3(1mg/mL)の溶液を、5μLの滴をたらすマイクロピペットでバイオダインBフィルムの粗い側にスポットし、フィルムを室温にて30分間空気乾燥させた。次に、濃度625、312.5、156.25、78.125、39.0625のβ−グルコシダーゼ5μLの滴をエスクリン/FeCl3スポットにたらし、発色に必要な時間を記録した。エスクリンは純な酵素系でうまく作用した。結果を表3に示す。
試験管にエスクリン(1mg/mL)/FeCl3(1mg/mL)の溶液100μLを満たした。次に、濃度5、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.05、0.025、0.0025単位/mLのβ−グルコシダーゼ100μLを、エスクリン/FeCl3溶液の入った試験管に滴下し、緑から黒への発色の変化に必要な時間を記録した。結果を表4に示す。
エスクリン(1mg/mL)/FeCl3(1mg/mL)の溶液を、5μLの滴をたらすマイクロピペットを使ってバイオダインBフィルムの粗い側にスポットし、フィルムを室温にて30分間空気乾燥させた。ミネソタ州ロチェスターのメイヨークリニック(Mayo Clinic)にて結腸処置法で結腸鏡の生検組織ルーメンを用いてリン酸緩衝生理食塩水10mLをフラッシュし、臨床内視鏡ソイル標本(患者のソイル)を収集した。続いて、臨床内視鏡ソイル標本100μLをエスクリン/FeCl3スポットの上にのせ、発色のために必要な時間を記録した。発色には10分を超える時間を要した。
メトリセル(Metricel)SB−6407膜の標本4つに、スポット1個あたりBCIP/NBT溶液10μLをたらすマイクロピペットを使ってスポットを付けた。これらのスポットを室温にて空気乾燥させた。スポットを付けた膜1つに、スポット1個あたりアルカリホスファターゼ(シグマ−アルドリッチ)溶液(500μg/mLアルカリホスファターゼを蒸留水に加えたもの)10μLで再度スポットを付けた。BCIP/NBTでスポットを付けた膜2つに、手作業での洗浄の前と手作業での洗浄の後で、使用済みの胃腸用内視鏡から得られた流体標本10μL(スポット1個あたり)で再度スポットを付けた。4番目のBCIP/NBTでスポットを付けた膜に、スポット1個あたり蒸留水10μLで再度スポットを付けた。
水焼き浴に押し出す代わりに、米国特許第5,120,594号明細書に記載されているように押出後の膜を冷却したパターン付きキャスティングホイールに巻き取ったこと以外は、米国特許第4,539,256号明細書(実施例23)に記載されている方法に従ってHDPE TIPS膜を作成した。
マイクロピペットを用いて、スポット1個あたりBCIP/NBT溶液約5マイクロリットルをシリカゲルガラス支持TLCプレート(2.54cm×7.62cm)にたらした。これらのスポットを、モデル番号HG−751ヒートガン(マスターアプリアンスコーポレーション(Master Appliance Corp.)、ウィスコンシン州ラシーヌ)からの温風で乾燥させた。スポットを付けたガラスプレートのうちの1枚を対照として利用し、水浴に入れずにおいた。他のスポットを付けたガラスプレート(試験プレート)を水浴(25℃)に2分間入れ、これを取り出し、ヒートガンを使って再度乾燥させた。次に、アルカリホスファターゼ(シグマ−アルドリッチ)溶液(25mgホスファターゼ/1mL水)5マイクロリットルを試験プレートおよび対照のプレート上の指標スポットにたらした。すべての酵素指標の組み合わせで、指標が反応したことによる紫色が2分以内で目立った。続いて、対照のプレートと試験プレートの両方で色のついたスポットはいずれも、水浴(25℃)に入れても色が洗い流されなかった。この実験の結果から、スポットのある酵素指標は水で洗った後もシリカに結合したまま残り、結合状態で酵素と反応することが分かった。さらに、実験では反応後の酵素指標は水の存在下でシリカに結合したまま残ることが分かった。
実施例1と同様にして、メトリセルSB−6407膜(第4級アンモニウム基を含み、ポールから入手可能)にBCIP/NBTのスポットを付け、水道水の流水ですすぎ、乾燥させ、アルカリホスファターゼ(シグマ−アルドリッチ)と反応させた。酵素と指標との反応生成物による青紫色が、酵素の添加後2分以内に現れ、これを水で洗い流すことはできなかった。
テックスワイプ(TexWipe)スワブ(ニュージャージー州アッパーサドルリバーのテックスワイプカンパニーインコーポレイテッド(Texwipe Co, Inc.)の品番TX712A)を、実施例11のメトリセル膜と同じように処理した。実施例11のようにスワブを水で洗うと、指標がスワブから洗い流された。さらに、テックスワイプスワブでの指標と酵素との反応による色も、水道水の流水ですすぐと簡単に洗い流されてしまった。
以下のステップで、コーティングなしのPP TIPS膜からなる支持材を作成した。乾燥ステップの間の収縮を回避するために膜を輪状にして固定し、膜にX−glc溶液2mLをDMF中0.0003g/mLの濃度でロードし、この膜を58℃で20分間乾燥させた。続いて、ロードした膜にマイクロピペットを使って100単位/mLの濃度で純粋なβ−グルコシダーゼ溶液10μlのスポットをたらし、発色のために必要な時間を記録して膜の比色反応を試験した。酵素水溶液を表面にスポットしても膜は湿らなかった。反応は何も観察されなかった。
60:40イソプロピルアルコール:水)に入れたEVAL溶液(2.8%(w/w)EVAL約1mLをプラスチックピペットで分注し、均一に塗りひろげて、HDPE TIPS膜をコーティングした。以下のステップで、さらにコーティング後の膜を作成した。乾燥ステップの間の収縮を回避するために膜を直径10.08cmの輪状にして固定し、膜にX−glc溶液2mLを0.15g/mLの濃度でロードし、この膜をインキュベータ(マサチューセッツ州アンドーバーのGCAコーポレーション(GCA Corporation)のプレサイションメカニカルコンベクションインキュベータ(Precision Mechanical Convection Incubator))にて58℃で20分間乾燥させた。
以下のステップでレーヨン/PP不織支持体を作成した。乾燥ステップの間の収縮を回避するために不織材を輪状にして固定し、不織支持体にX−glc溶液2.5mLをDMF中0.15g/mLの濃度でロードし、この膜を58℃で20分間乾燥させた。次に、試薬グレードの水中100、50、25、12.5、6.3、3.1単位/mLの濃度のスポットで、ロード後の支持材にβ−グルコシダーゼ溶液10μLをたらすマイクロピペットを使い、発色のために必要な時間を記録して、X−glcをロードした。不織支持体の比色反応を室温にて試験した。実験6では、室温で21分経過後も発色しなかった場合に、実験1〜6を含む膜を10分間インキュベータで58℃まで加熱した。続いて、インキュベータから膜を取り出し、室温まで冷ました。室温にて一晩、発色させ続けた。比色反応とテクスチャのある背景とのコントラストから、実施例12のTIPS膜支持材の場合よりも色の検出が一層顕著で短時間に行われた。結果を表8に示す。
HDPE TIPS膜支持材を以下のステップで作成した。乾燥ステップの間の収縮を回避するために膜を輪状にして固定し、プラスチックピペット(SAMCOトランスファーピペット(SAMCO Transfer Pipettes)、カリフォルニア州サンフェルナンド)を使って60:40イソプロピルアルコール:水中2.8%(w/w)EVALでEVAL溶液を膜にスポットし、スポットを付けた膜を25℃で一晩空気乾燥させ、DMF中0.22g/mLの濃度でX−glc化学物質2mLのスポットを膜にロードし、スポットを付けた膜を58℃で20分間乾燥させた。この膜は、EVALを表面にスポットした場合に限って酵素水溶液で湿った。
HDPE TIPS膜支持材を以下のステップで作成した。乾燥ステップの間の収縮を回避するために膜を輪状にして固定し、プラスチックピペットを使って60:40イソプロピルアルコール:水中2.8%(w/w)EVALでEVAL溶液を膜にスポットし、スポットを付けた膜を25℃で一晩乾燥させ、DMF中0.15g/mLの濃度でX−glc25μLのいくつかの親水性スポットあるいは、DMF中0.15g/mLの濃度でX−gal(バイオシンスAGインコーポレイテッド(Biosynth AG, Inc.))25μLのいくつかの親水性スポットを膜にロードし、スポットを付けた膜を58℃で5分間乾燥させ、膜上の他の親水性スポットにクーマシープラス(Coomassie Plus)(登録商標)タンパク質アッセイ試薬25μLをロードし、58℃で20分間乾燥させた。
HDPE TIPS膜支持材を以下のステップで作成した。乾燥ステップの間の収縮を回避するために膜を輪状にして固定し、プラスチックピペットを使って60:40イソプロピルアルコール:水中2.8%(w/w)EVALでEVAL溶液を膜にスポットし、スポットを付けた膜を25℃で一晩乾燥させ、膜上の6個の親水性スポットに、X−glc、X−gal(バイオシンスAGインコーポレイテッド)、X−phos−p−tol化学物質の組み合わせ20μLを各々DMF中0.07g/mLの濃度でロードし、膜上の別の6個の親水性スポットに、マゼンタ(Magenta)(登録商標)−glc、マゼンタ(登録商標)−gal、マゼンタ(登録商標)−phos−p−tol化学物質の組み合わせ20μlを各々DMFで各0.06g/mLの濃度でロードし、58℃で20分間乾燥させた。
実施例15で説明したようにして、HDPE TIPS膜支持材を輪状にし、EVAL溶液のスポットを付け、乾燥させた。次に、スポットを付けた膜に、ヘキサデカン中1:1000のω−サッカリンアミドウンデシルトリクロロシラン1.5mLをコーティングし、20分間反応させ、MEKで洗浄し、3回空気乾燥させた。乾燥後、処理後の膜上の親水性スポットに、支持体全体/mL(0.07gX−化学物質/各化学物質1mL)0.2gの濃度で、DMF中X−glc、X−gal(バイオシンスAGインコーポレイテッド)、X−phos−p−tol化学物質の組み合わせ20μLでスポットを付け、約20分間反応させた。0.14MのNaCl(EMサイエンス(EM Science)、ニュージャージー州ギブスタウン)、0.006MのK2HPO4(シグマ−アルドリッチ)、0.02MのKH2PO4(シグマ−アルドリッチ)とを組み合わせて、pH7.4のPBS緩衝液を調製した。処理後の膜をPBS緩衝液と1%トゥイーン(Tween)(登録商標)80で2回洗浄し、空気乾燥させた。
乾燥ステップの間の収縮を回避するために膜を輪状にして固定し、実施例12で説明したようなEVALで膜をコーティングし、コーティング後の膜に4−MU−β−D−glc化学物質2mLを0.0003g/mLの濃度でロードし、58℃で20分間乾燥させて、HDPE TIPS膜支持材を作成した。
乾燥ステップの間の収縮を回避するために不織材を輪状にして固定し、この不織材に4−MU−β−D−glc化学物質3mLをDMF中0.0003g/mLの濃度でコーティングし、58℃で20分間乾燥させて、レーヨン/PP不織支持体を作成した。次に、ロード後の膜に、純粋なβ−グルコシダーゼ(シグマ−アルドリッチ)溶液10μLで、試薬グレードの水中50、25、12.5、6.3,3.1単位/mL希釈物の濃度でスポットを付け、蛍光反応が起こるまで膜をUV光(365nm)に曝露し、時間を記録して、膜の蛍光反応を試験した。結果を表11に示す。
HDPE TIPS膜支持材を輪状にし、実施例18で説明したようにしてEVAL溶液でコーティングした後、ヘキサデカン中1:1000のω−サッカリンアミドウンデシルトリクロロシラン1.5mLでコーティングし、20分間反応させ、MEKで洗浄し、3回空気乾燥させた。乾燥後、処理後の膜に、DMF中0.0003g/mLの濃度で4−MU−β−D−glc化学物質の溶液20μLをコーティングし、実施例17で説明したようにして調製したpH7.4のPBS緩衝液と1%トゥイーン(登録商標)80で2回洗浄し、空気乾燥させた。
乾燥ステップの間の収縮を回避するために膜を輪状にして固定し、DMF中0.0003g/mLの濃度で4−MU−β−D−glc化学物質3mLを膜にコーティングし、58℃で20分間乾燥させて、GHP−450膜支持材を作成した。次に、試薬グレードの水中、50、25、12.5、6.3、3.1単位/mL希釈物の濃度で、ロード後の膜に純粋なβ−グルコシダーゼ(シグマ−アルドリッチ)溶液10μLをスポットし、蛍光反応が起こるまで膜をUV光(365nm)に曝露し、時間を記録して、この膜の蛍光反応を試験した。結果を表12に示す。
乾燥ステップの間の収縮を回避するために膜を輪状にして固定し、膜に実施例12で説明したようなEVALをコーティングした後、0.8mg/mLの濃度でOPA溶液2mLをコーティングし、58℃で30分間乾燥させて、HDPE TIPS膜支持材を作成した。次に、試薬グレードの水中2、1、0.5、0.25、0.13、0.06mg/mLの濃度で、ロード後の膜にBSA溶液10μLをスポットし、蛍光反応が起こるまで膜をUV光(365nm)に曝露し、時間を記録して、この膜の蛍光反応を試験した。結果を表13に示す。
乾燥ステップの間の収縮を回避するために不織材を輪状にして固定し、0.8mg/mLの濃度でOPA溶液3mLを膜にロードし、58℃で30分間乾燥させて、レーヨン/PP不織支持体を作成した。次に、マイクロピペットを使用して、試薬グレードの水中2、1、0.5、0.25、0.13、0.06mg/mLの濃度でロード後の膜にBSA溶液10μLをスポットし、蛍光反応が起こるまで膜をUV光(365nm)に曝露し、時間を記録して、この不織支持体の蛍光反応を試験した。結果を表14に示す。
まず脱イオン水10mLに5−ブロモ−6−クロロ−3−インドリルホスフェート二ナトリウム塩25mgを溶解させた後、脱イオン水10mLにNBT50mgを溶解させ、2種類の溶液を調製した。次に、実施例2で説明したようにして10mLずつ4種類のTRIS緩衝溶液(A、B、C、D)を調製した。緩衝溶液Aに、MnCl2250mgを加えた。緩衝溶液Bに、MgCl2250mgを加えた。緩衝溶液Cに、MgCl2250mgとMnCl2250mgとを加えた。緩衝溶液Dには金属塩を添加しなかった。5−ブロモ−6−クロロ−3−インドリルホスフェート二ナトリウム塩/水溶液400μLと、NBT/水溶液100μLと、緩衝溶液A、B、CまたはD500μLとを組み合わせて、4種類の5−ブロモ−6−クロロ−3−インドリルホスフェート二ナトリウム塩/NBT/緩衝溶液を調製した。このようにして得られる4種類の指標溶液を、それぞれ指標溶液1、2、3および4とした。4種類の溶液各々5マイクロリットルを、マイクロピペットでバイオダインBフィルムにスポット状にたらした。このスポットを室温にて30分間空気乾燥させた。各スポットに、1.79単位/mLの濃度でアルカリホスファターゼ(カルバイオケム)5マイクロリットルのスポットを再度付けた。発色までに必要な時間、フィルムでの最初の指標スポット色、周囲温度ならびに光のある条件で1日および1週間老化後の指標スポットの色を記録した。
実施例15で説明したようにして、HDPE TIPS膜支持材を輪状にし、EVAL溶液でスポットを付け、乾燥させた。続いて、膜上の各親水性スポットに、X−gal(キルケガードアンドペリーラボラトリーズインコーポレイテッド)200μLと鉄緩衝液1mLとを組み合わせて調製したX−gal溶液10μL、BCIP4mLと、NBT1mLと、TRIS緩衝液5mLとを組み合わせて調製したBCIP/NBT(キルケガードアンドペリーラボラトリーズインコーポレイテッドから入手した3成分ホスファターゼ支持体系)10μL、水0.3g/Lと組み合わせて121℃で15分間オートクレーブし調製した4−MU−β−D−gal10μL、水0.3g/Lを組み合わせて121℃で15分間オートクレーブして調製した4−MU−β−D−glc10μL、あるいは100マイクロリットルのDMFに0.03gを溶解させ、水100mLで希釈して調製した4−MU−phos10μLをロードした。この溶液をマイクロピペットで膜にたらし、室温で空気乾燥させた。
乾燥ステップの間の収縮を回避するために膜を輪状にして固定し、実施例12で説明したようなEVALを膜にコーティングした後、BCIP4mLと、NBT1mLと、TRIS緩衝液5mLとを組み合わせて調製したBCIP/NBT(キルケガードアンドペリーラボラトリーズインコーポレイテッドから入手した3成分ホスファターゼ支持体系)10μL6滴をマイクロピペットを使ってスポット状にたらし、室温で空気乾燥させて、HDPE TIPS膜支持材を作成した。
まず、脱イオン水10mLに5−ブロモ−6−クロロ−3−インドリルホスフェート二ナトリウム塩5mgを溶解させた後、脱イオン水10mLにNBT50mgを溶解させ、2種類の溶液を調製した。次に、実施例2で説明したようにしてTRIS緩衝溶液10mLを調製し、MnCl2100mgとMgCl2100mgとを加えた。続いて、5−ブロモ−6−クロロ−3−インドリルホスフェート溶液300マイクロリットルとNBT溶液300マイクロリットルとを、MgCl2およびMnCl2を含有するTRIS緩衝溶液400マイクロリットルと合わせた。指標溶液5マイクロリットルを用いて、マイクロピペットを使ってバイオダインBフィルム片(1cm×3cm)に30個のスポット(直径1mm、1mm間隔)を形成した。内視鏡の生検組織チャネルの内側をシミュレートしたポリエチレンチューブに、患者の汚れた内視鏡から得た内容物2mLを充填した後、空にした。10秒以内に、スポットを付けたバイオダインBフィルムを汚れたポリエチレンチューブのルーメンを介して押し付けた。20秒以内に比色反応が生じたことから、患者の汚れた内視鏡の内容物で汚れたポリエチレンルーメン中にアルカリホスファターゼが存在していることが分かった。
いくつかの70%レーヨン/30%ポリエステル不織支持体を3種類のアミン含有シランすなわち、(N−トリメトキシシリルプロピル)ポリエチレンイミン、3−アミノプロピルトリエトキシシラン、N−トリメトキシシリルプロピル−N,N,N−トリメチル塩化アンモニウムで処理し、ディップコーティングによって湿潤剤である3−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン(GPS)で処理した。まず、pH=4になるように硫酸を滴下して加えて、95パーセント水/5パーセントエタノールのわずかに酸性の溶液を調製した。この酸性溶液に、それぞれ5/5/90の比でGPSと各アミノシランとを加えた。不織材をアミノシラン溶液のうちのひとつに浸漬させた後、2種類のエタノール浴に連続して浸漬させ、オーブン(モデルLFD1−42−3としてミネソタ州レイクビルのデスパッチ(Despatch)から市販)中にて70℃で1.5から2時間かけて熱硬化させた。アミン含有不織材との比較のため、不織材の標本ひとつを未処理のまま残し、標本ひとつをGPSだけで処理(アミン基なし)した。
実施例28で説明したようにして、いくつかの70%レーヨン/30%ポリエステル不織支持体を、3種類のアミン含有シランすなわち、(N−トリメトキシシリルプロピル)ポリエチレンイミン、3−アミノプロピルトリエトキシシラン、N−トリメトキシシリルプロピル−N,N,N−トリメチル塩化アンモニウムのうちのいずれか1つで処理し、湿潤剤である3−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン(GPS)で処理した。さらに、不織材の標本ひとつを未処理のまま残した。溶液A、溶液B、溶液Cとした3種類の溶液を、実施例3および24で説明した溶液と同じようにして調製した。BCIP25mgを脱イオン水10mLと組み合わせて、溶液Aを調製した。NBT15mgを脱イオン水10mLに溶解させて、溶液Bを調製した。MnCl2およびMgCl2各々250mgを組み合わせて、TRIS緩衝液(pH=8.9)10mLに溶解させて溶液Cを調製した。TRIS緩衝液については、実施例2の説明に従って調製した。溶液Aを400マイクロリットルと、溶液Bを100マイクロリットルと、溶液Cを500マイクロリットルとを組み合わせて、指標溶液を調製し、MnCl2およびMgCl2塩を用いて4:1:5BCIP:NBT:TRIS緩衝液の比とした。マイクロピペットを使って、3種類のアミノシラン処理標本と未処理標本の各々に、4:1:5指標溶液のいくつかの5−マイクロリットル滴をスポット状のパターンにたらした。これらのスポットを室温にて少なくとも30分間空気乾燥させた。次に、1.00、0.50、0.10、0.05、0.01単位/mLの濃度のアルカリホスファターゼ(カルバイオケム)5マイクロリットルを、マイクロピペットを使って指標溶液の乾燥させたスポットにたらした。比較のため、指標溶液の別の乾燥させたスポットに、マイクロピペットを使って脱イオン水(酵素0単位/mL)5マイクロリットルをたらした。特徴的な紫−黒色の第1の見た目に必要な時間を記録し、結果を表20に示す。
実施例28で説明したようにして、いくつかの70%レーヨン/30%ポリエステル不織支持体を、2種類のアミン含有シランすなわち、(N−トリメトキシシリルプロピル)ポリエチレンイミンとN−トリメトキシシリルプロピル−N,N,N−トリメチル塩化アンモニウムで処理し、湿潤剤である3−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン(GPS)で処理した。さらに、不織材の標本ひとつを未処理のまま残した。マイクロピペットを使って、2種類のアミノシラン処理標本と未処理標本の各々に、実施例29で説明したようにして調製した4:1:5指標溶液のいくつかの5−マイクロリットル滴をスポット状のパターンにたらした。これらのスポットを室温にて少なくとも30分間空気乾燥させた。6つ(処理と未処理各々2つずつ)の乾燥標本を使って、2.54cm×7.62cm(1インチ×3インチ)のスライドガラス上のアルカリホスファターゼ(カルバイオケム)(1単位/ミリリットル)の10マイクロリットルの滴の拭き取りに利用した。別の6つ(処理と未処理各々2つずつ)の乾燥標本を完全に湿るまで超純水に浸し、2.54cm×7.62cm(1インチ×3インチ)のスライドガラス上のアルカリホスファターゼ(3.5単位/ミリリットル)の20マイクロリットルの滴の拭き取りに利用した。特徴的な紫−黒色の第1の見た目までの時間を記録した。アミノシラン処理不織材では乾燥した状態と湿った状態のどちらで使用したときにも色の変化が見られ、元の指示滴の形が維持された。対照標本では、酵素との反応後に指標化学物質のしみが生じた。結果を表22に示す。
検尿用のマルチスティックス(登録商標)試薬ストリップ(ニューヨーク州タリタウンのバイエルヘルスケアLLC、診断部門から市販)から血液検出パッドを取り除いた。この血液検出パッドを水道水に浸漬し、1分間、3分間および5分間浸しておいた。続いて、パッドを羊の脱線維血液の1:10,000希釈物(オレゴン州ウィルソンビルのPMLマイクロバイオロジカルズ(PML Microbiologicals)から市販、カタログ番号A0408)に浸漬した。下記の結果から、事前に5分間水に浸したにもかかわらず血液検出パッドが希釈血液を検出可能であったことが分かる。結果を表23に示す。
血液検出パッド以外、検尿用マルチスティックス(登録商標)試薬ストリップ(ニューヨーク州タリタウンのバイエルヘルスケアLLC、診断部門から市販)のすべての検出パッドを取り除いた。血液検出パッドの検出限界は0.015mgヘモグロビン/尿1デシリットルである。3Mスコッチテープ(3M Scotch Tape)(3/4インチ幅のサテン;ミネソタ州セントポールの3Mから市販)を検出パッドの上におき、液体がテープの穴を通り抜けて検出パッドと接触するような方法で、「エグザクト(Exact)」タイプのホビーナイフを使ってテープに約0.5mmの穴をあけた。指標パッドを水道水の中に10分間おいた後、パッドが黄色に見えた。続いて、パッドを1:10,000羊血液中においた。25秒後、上にかぶせたテープの穴があいた部分にある検出パッドに濃い緑のスポットが見えた。
Claims (1)
- 水との接触角が50度未満の表面を備えた固体支持部材と、
前記固体支持部材に固定された特異的指標であって、酵素またはタンパク質と相互作用することで、目視確認可能な色の変化、並びに特異的指標の蛍光特性およびルミネッセント特性の検出可能な変化から選定される検出可能な反応を生じさせる1以上のケミカル化合物である、特異的指標と、
前記固体支持部材および前記特異的指標を支持する保持部材と、を含み、
前記固体支持部材および特異的指標は、表面の接触に用いられる液体との接触を容易にすべく配置され、
前記保持部材は、液体と前記固体支持部材との間の接触を容易にすべく配置され、
前記保持部材は、液体を導くことができる構造を備え、
前記固体支持部材および特異的指標は、前記保持部材を介して液体を導くときに液体と前記固体支持部材との間の接触を容易にすべく前記保持部材内に配置され、
前記保持部材は、液体が前記保持部材に入るときに通る流体入口と、液体が前記保持部材から出るときに通る流体出口とを有する管状部材であり、前記固体支持部材および前記特異的指標は前記流体入口と前記流体出口との間で前記保持部材内に配置される、
バイオロジカルソイル検出器。
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