JP4841551B2 - 感光性保護基を含むカップリング剤及び、固体支持体の官能化のためのような、その使用 - Google Patents
感光性保護基を含むカップリング剤及び、固体支持体の官能化のためのような、その使用 Download PDFInfo
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Description
1)In situ合成、これはホスホルアミダイト経路を介する合成原理を利用して固体支持体にON分子を段階的に構築することからなる。特に国際出願WO 97/39151に記載されるこの方法は、高密度のONsを備えた表面の製造を可能にする。さらに、ブランキングプレート(blanking plate)と感光性保護基のセットの使用により、それは該支持体上での様々なONsの標的化を可能にする。しかしながら、この方法は、幾つかの大きな欠点を有する。特に、該支持体に結合されるONsを特徴付けることができず、また、修飾を伴うONs(ONs carrying modifications)を取り込むことが非常に困難である。
i)表面と標的分子の間の直接的フォトグラフティング。この場合、該フォトグラフティングはあまり選択性のないフリーラジカル反応を伴うという欠点を有する;
ii)支持体上での感光性保護基で保護された官能基の遊離、これは標的ONとの引き続く反応を可能にして、それらの結合を生じる。この場合、使用される支持体は一般的には、その一端が該支持体の表面と結合するための官能基と、他端が相補的な化学官能基を有する標的分子と反応する官能基を有する二官能性化合物であるカップリング剤で官能化されており、該カップリング剤の前記反応性官能基は感光性基で保護される。しかし、競合するために、後者のアプローチは幾つかの基準を満たさなければならない。これらの基準は以下である:
−活性化された支持体と標的分子との間の反応が迅速でなければならない;この反応は、カップリング剤の反応性官能基がそれらの保護基から遊離される時にのみ起こり得る(活性化反応)。
−カップリング剤を製造するための合成方法は、できる限り少ない工程を含み、実施されるように簡単でなければならない;
−穏やかな反応条件の使用(例えば、水);
−カップリング剤と標的分子との間で生じる反応は、このように官能化された支持体の非常にフレキシブルな使用を可能にするために、様々な温度及びpH条件下で安定でなければならない。
A−X−B−Proc (I):
(ここで:
− Aは固体支持体に結合するための官能基を表し、前記官能基は、アミン、ホスホルアミダイト、シラン及び活性エステル型の官能基から選択され;
− Xはスペーサーアームを表し;
− Bは、光脱保護の後、オキシアミン(−ONH2)型及び誘導体、或いはヒドラジド(−NH−NH2)及び誘導体の官能基を生じる基から選択される反応性官能基であり、前記官能基BはProc基で保護されている;
−Procは以下の式(II):
− R1及びR2は同じでも異なってもよく、水素原子またはC1−C4アルキル基をで表す)
の感光性保護基である)
のカップリング剤である。
i)− Aはホスホルアミダイト官能基を表し、
− Xは6炭素原子を有する飽和炭化水素ベース鎖を表し、
− Bはオキシアミン官能基(−ONH−)を表し、及び
− R1及びR2は水素原子またはメチル基を表す;
ii)− Aはトリ(C1−C4)アルコキシシランを表し、
− Xは2〜12炭素原子を有する飽和炭化水素ベース鎖を表し、
− Bはオキシアミン官能基(−ONH−)を表し、及び
− R1及びR2は水素原子またはメチル基を表す;
iii)− AはN−ヒドロキシスクシンイミドまたはペンタフルオロベンゼンでエステル化されたカルボキシリック官能基を表し、
− Xは−CH2−を表し、
− Bはオキシアミン官能基(−ONH−)を表し、及び
− R1及びR2は水素原子またはメチル基を表す。
を示す。
(ここで:
− 図1は、非官能化キャピラリーチューブ(タイプb/のキャピラリーチューブ)と比較した、フルオロフォアで標識された相補的なオリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーション後の、本発明に従う方法に従うキャピラリーチューブ型(タイプa/のキャピラリーチューブ)の固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドにより放出された蛍光の写真を表す;
−図2は、非官能化支持体(タイプb/の支持体)と比較した、フルオロフォアで標識された相補的なオリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーション後の、本発明に従う方法に従う平面の固体支持体(タイプa/の支持体)に結合したオリゴヌクレオチドにより放出された蛍光の写真を表す
に関する。
δ ppm = 1.30-1.90 (8H, m, 4CH 2), 3.60 (2H, t, J = 13 Hz, CH 2O), 4.20 (2H, t, J = 13 Hz, CH 2ON), 7.70-7.90 (4H, m, Ar-H).
MS (DCI, positive mode): Mcalc- 263 (C14H17NO4), m/z = 281 [M+NH4]+.
2)第二工程:化合物(2)を製造するための化合物(1)のトリチル化
δ ppm = 1.30-1.90 (8H, m, 4 CH 2), 3.20 (2H, t, J = 13 Hz, CH-2O), 4.20 (2H, t, J = 13 Hz, CH 2ON), 7.70-7.90 (4HAr, m, Ar-H-フタルイミド), 7.20-7.40 (15H, m, Ar-H-トリチル).
MS (ESI, positive mode): MCalc = 505 (C33H-31NO4), m/z = 528 [M+Na]+, m/z = 544 [M+K]+.
3)第三工程:化合物(3)を得るための化合物(2)のヒドラジン分解
MS (ESI, positive mode): Mcalc= 375 (C25H29NO2), m/z = 376 [M+H]+, m/z = 398 [M+Na]+, m/z = 414 [M+K]+.
4)第四工程:化合物(4)を得るための化合物(3)のオキシアミンの保護
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ ppm = 1.30 (3H, d, J = 16 Hz, CH 3), 1.50-1.80 (8H, m, 4 CH 2), 3.0 (2H, t, J = 13 Hz, CH 2O-Tri), 3.70 (2H, m, CH 2ON, 1H, m CH), 4.20 (2H, t, J = 13 Hz, CH 2OCO), 7.10-7.50 (15H, m, Ar-H-トリチル), 7.50-7.80 (4H, m, Ar-H- NPPOC).
MS (ESI, positive mode): Mcalc = 582 (C35H38N2O6), m/z = 605 [M+Na]+, m/z = 621 [M+K]+.
MS (ESI, negative mode): m/z = 581 [M-H]-.
5)化合物(5)を得るための化合物(4)の脱トリチル化
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ ppm = 1.30 (3H, d, J = 16 Hz, CH 3), 1.50-1.80 (8H, m, 4 CH 2), 3.70 (2H, m, CH 2ON, 1H, m, CH), 4.30 (2H, t, CH 2OCO, 2H, t, CH 2OH), 7.50-7.80 (4H, m, Ar-H NPPOC).
MS(DVI, positive mode): Mcalc = 340 (C16H24N2O6), m/z = 454 [M+TFA]+.
6)第六工程:化合物(6)を製造するための化合物(5)のホスフィチル化
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ ppm = 1.20-1.50 (15H, m, 4 CH 3), 1.50-1.85 (8H, m, 4 CH 2), 2.65 (2H, t, CH 2CN), 3.80 (2H, m, CH 2OH, 1H, m, CH, 4 H, m, 2 CH 2OP), 4.30 (2H, m, CH 2OCO, 2H, m, 2 CHN, 7.10-7.70 (4H Ar-H NPPOC).
31P-NMR (200 MHz, CDCl3): δ ppm = 120 (2 diastereoisomers).
実施例2:式(I)に従う活性エステル誘導体(化合物(8))の製造
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ ppm = 1.40 (3H, d, J = 16 Hz, CH 3), 3.70 (1H, m, CH), 4.30 (2H, m, CH 2O) 4.40 (s, 2H, COCH 2O), 7.30-7.60 (4H, m, Ar-H NPPOC).
13C-NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm = 18 (CH2), 33 (CH2), 67 (CH3), 70 (CH3), 75 (CH3), 123 (quat), 137 (quat), 138 (quat), 133 (quat), 136 (CH), 151 (CH), 159 (CH), 172 (CH), 173 (CH).
MS (ESI, positive mode): Mcalc = 298 (C12H14N2O7), m/z = 321 [M+Na]+, m/z = 337 [M+K]+.
MS (ESI, negative mode): m/z = 297 [M-H]-, m/z = 595 [2M-H]-.
2)第二工程:N−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル(8)の製造
実施例3:ペンタフルオロフェノール(9)により活性化された式(I)のエステル誘導体の製造
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ ppm = 1.30 (3H, d, J = 16 Hz, CH 3, 3.70 (1H, m, CH), 4.30 (2 H, m, CH 2O), 4.70 (s, 2H, COCH 2O), 7.30-7.70, (4H, m, Ar-H NPPOC).
19F-NMR (200 MHz, CDCl3): δ ppm = -166.0 (1F, t), -164.0 (1F, d), -162.0 (1F, t), -157.0 (1F, t), -152.50 (1F, d).
実施例4:式(I)のトリエトキシシラン誘導体の製造
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ ppm = 1.40 (d, 6H, Si-CH2-CH 3), 3.70 (q, 1H, Ar-CH-CH3), 4.30 (m, 4H, CH 2O, OCH 2), 5.30 (dd, 2H, CH 2), 5.90 (m, 1H, CH), 7.20 (s, 1H, NH), 7.30-7.80 (m, 4H, H-Ar).
2)第二工程:化合物(11)を製造するためのヒドロシリル化
8mlのトリエトキシシラン中、上記の前工程で得た1.67g(5.6mmol)の化合物(10)の溶液に、20μlのカールステッド触媒を滴下した。60℃で一晩攪拌後、溶媒を真空下、蒸留により蒸発させた。反応粗生成物を溶離剤として1/4(v/v)酢酸エチル/ヘキサン混合液を使用してシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、収率60%で予期した化合物(11)を得た(1.33g)。
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ ppm = 0.65 (m, 2H, CH 2Si), 1.20 (t, 3H, CH 3-CH2-O), 1.40 (d, 3H, CH 3-CH), 1.70 (m, 3H, CH 2, CH-CH3), 3.80 (m, 4H, O-CH 2-CH3, CH 2O), 4.30 (m, 2H, CH 2-O-CO), 7.30-7.80 (m, 5H, NH, H-Ar).
MS (エレクトロスプレー, positive mode): Mcalc = 444, m/e = 44.7 [M+H]+.
以下の固体支持体の製造例は、キャピラリーチューブの形態(長さ3cm及び直径100μmのガラスキャピラリーチューブ)において本発明に従う式(I)のカップリング剤を使用して実施した。しかしながら、これらの例は他のタイプの支持体の平面の形態に置き換えられるということを明確に理解すべきである。
この例において、上記の実施例4で製造した化合物(11)を式(I)のカップリング剤として使用した。
この実施例において、NHS−活性エステル型の結合官能基Aを含む、上記の実施例2で製造した化合物(8)を式(I)のカップリング剤として使用した。
ガラスキャピラリーチューブを1/1 水/エタノール混合液中、6M 水酸化ナトリウム溶液で満たし、次いで該溶液を周囲温度で2時間該キャピラリーチューブに残した。
上記の第一工程で得たキャピラリーチューブを、ジメチルホルムアミド(DMF)中、10mMの化合物(8)の溶液で満たし、そして該溶液を周囲温度で一晩、該キャピラリーチューブに残した。
この実施例において、上記実施例5で得た固体支持体をオリゴヌクレオチド(ONs)の固定化のために使用した。しかしながら、これらの支持体の他の関心ある生物分子の固定化のための使用もまた妥当であると明確に理解すべきである。
(i)露光:これは光作用下で、該固体支持体の表面上の反応性官能基Bを部分的にフリーにすることを可能にする工程である。この官能基Bは生物分子のグラフティングを可能にする。
1)露光工程
上記実施例5で製造した化合物(11)で官能化されたキャピラリーチューブを1/1 ピリジン/水混合液で満たした。
このように第一工程に従い処理されたキャピラリーチューブを、水中、10μMの、アルデヒド官能基を有するONs溶液とインキュベートし、次いで全体を30分間作用させ続けた。
上記の工程2)に従いONsが固定化されたキャピラリーチューブを、CY3フルオロフォアを有する相補的なONs溶液で満たし、次いで全体を40℃の温度で1時間作用させ続けた。
フルオロフォアで標識されたONsが上記の工程3)に従いハイブリダイズしたキャピラリーチューブをガラススライド上に置き、次いでジェノミクスソリューション社(the company Genomic’s Solution)から販売されている蛍光リーダーに導入した。
得られた蛍光画像を添付の図1に表し、ここで露光された部分のみ蛍光していることに気付き得る。さらに、本発明に従う式(I)のカップリング剤で官能化されたキャピラリーチューブ(type a/)のみが、所望のONsの光−局所的固定化に対応する蛍光セグメントを含み、非官能化キャピラリーチューブ(type b/)は完全に非蛍光であることが分かる。
δ ppm = 1.20-1.50 (12 H, m, 6 CH 2); 1.78 (2 H, m, J = 7 Hz, C2 H 3CH2CH 2CH2); 2.02 (2 H, m, C2 H 3CH 2CH2); 4.18 (2 H, t, J = 6 Hz, CH 2ON); 4.95 (2 H, m, CH 2CHCH2); 5.79
(1 H, m, CH2CHCH2); 7.70-7.85 (4 H, m, Ar-H).
MS (ESI, positive mode): Mcalc - 315 (C19H25NO3), m/z = 338 [M+Na]+.
2)第二工程:化合物(13)を製造するための化合物(12)のヒドラジン分解
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ ppm = 1.20-1.50 (12 H, m, 4 CH 2), 1.56 (2 H, m, C2 H 3CH2CH 2CH2), 2.03 (2 H, q, C2 H 3CH 2CH2), 3.65 (2 H, t, J = 6 Hz, CH 2ON), 4.96 (2 H, m, CH 2CHCH2), 5.80 (1 H, m, CH2CHCH2).
MS (ESI, positive mode): Mcalc = 185 (C11H23NO), m/z = 186 [M+H]+.
3)第三工程:化合物(14)を得るための化合物(13)のオキシアミンの保護
1H-NMR (200 MHz, CDCl3):δ ppm = 1.20-1.40 (12 H, m, 6 CH 2), 1.35 (3 H, d, J = 7 Hz, CH 3), 1.56 (2 H, m C3H3CH2CH 2CH2), 2.03 (2 H, m, C2H3CH 2CH2), 3.65 (2 H, m, CH 2ON, 1H, m, CH), 4.28 (2H, m, CH 2OCO), 4.96 (2 H, m, CH 2CHCH2), 5.80 (1 H, m, CH2CHCH2), 7.20-7.80 (4 H, m, Ar-H NPPOC).
MS (ESI, positive mode): Mcalc= 392 (C21H32N2O5), m/z = 415 [M+Na]+, m/z = 410 [M+NH4]+.
4)第四工程:化合物(15)を得るための化合物(14)のヒドロシリル化
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ ppm = 0.6 (2 H, m, CH 2Si), 1.20-1.40 (16 H, m, 6 CH 2, 9H 3 CH3CH2OSi), 1.35 (3 H, d, J = 7 Hz, CH 3), 3.65 (2 H, m, CH 2ON, 1H, m, CH), 4.28 (2 H, m, CH 2OCO), 7.20-7.80 (4 H, m, Ar-H NPPOC).
MS (ESI, positive mode): Mcalc = 556 (C27H48N2O8Si), m/z = 579 [M+Na]+.
実施例9:シラン型の結合官能基Aを含む式(I)のカップリング剤で官能化された平面の固体支持体の製造
この実施例において、上記の実施例8で製造した化合物(15)を式(I)のカップリング剤として使用した。
不活化SiO2官能基を有する固体の平面のケイ素支持体を、4mlの水と3mlのエタノールを含み、さらに水酸化ナトリウム(1g NaOH)を含む溶液に1時間浸漬させた。続いて、該支持体を超純粋で、次いで0.2Nの塩酸溶液で、最終的に水で洗浄して、活性化SiOH官能基を含む表面を生成した。次いで、該支持体をアルゴンで乾燥させた。
このように活性化された支持体をトルエン/トリエチルアミン(v/v:97/3)中、5mMの化合物(15)(7ml)溶液に、一晩、80℃で浸した。続いて、該支持体をトルエンで、次いでエタノールで洗浄し、最終的にアルゴン下で乾燥させた。続いて、このように化合物(15)で官能化された支持体を110℃で3時間、インキュベーターに置いた。
上記の実施例7でまさに述べたように、固体支持体の表面でのONグラフティング及びそれらの存在の確認は4つの工程を含む:露光、固定化、ハイブリダイゼーション及び最終的にスキャナーによる蛍光の検出。
1)第一工程:支持体の露光
上記実施例9に記載された方法に従う化合物(15)で官能化され、その上に光の透過を可能にする100μm×100μmの透明なスポットを含むプラスチックマスクが適用されている固体平面支持体を、1/1(v/v)のピリジン/水混合液の液滴で被覆した。該支持体の表面全体の、従ってマスクを通した露光を、波長365nm、強度4mW/mm2である紫外線A(UVA)放射露光デバイスを使用して15秒間実施し、前記露光デバイスは100Wランプを備えていた。
このように第一工程に従い処理された平面支持体を、水中、10μMの、アルデヒド官能基を有するON溶液とインキュベートし、全体を30分間作用し続けた。
ONsが上記の工程2)に従い固定化された固体支持体を、CY3フルオロフォアを有する相補的なONs溶液で満たし、次いで全体を40℃の温度で1時間作用し続けた。続いて、該支持体を0.2%クエン酸ナトリウム溶液で洗浄した。
フルオロフォアで標識されたONsが上記の工程3)に従いハイブリダイズした支持体をガラススライド上に置き、次いでジェノミクスソリューション社(the company Genomic’s Solution)から販売されている蛍光リーダーに導入した。
得られた蛍光画像を添付の図2に表し、ここで露光された部分のみ蛍光があることに気付き得る。
Claims (20)
- 該スペーサーアームXが、無電荷疎水性鎖または無電荷親水性鎖であることを特徴とする、請求項1に記載のカップリング剤。
- 該スペーサーアームXが、1〜13炭素原子を含む飽和炭化水素鎖、ならびに4〜12炭素原子を含むグリコールエーテルから選択されることを特徴とする、請求項2に記載のカップリング剤。
- R1及びR2が互いに独立して、メチル及びエチル基から選択されるアルキル基を表すことを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載のカップリング剤。
- i)− Aはホスホルアミダイト官能基を表し、
− Xは6炭素原子を有する飽和炭化水素鎖を表し、
− Bはオキシアミン官能基(−ONH−)を表し、
及び
− R1及びR2は水素原子またはメチル基を表す;
ii)− Aはトリ(C1−C4)アルコキシシランを表し、
− Xは2〜12炭素原子を有する飽和炭化水素鎖を表し、
− Bはオキシアミン官能基(−ONH−)を表し、及び
− R1及びR2は水素原子またはメチル基を表す;
iii)− AはN−ヒドロキシスクシンイミドまたはペンタフルオロベンゼンでエステル化されたカルボキシリック官能基を表し、
− Xは−CH2−を表し、
− Bはオキシアミン官能基(−ONH−)を表し、及び
− R1及びR2は水素原子またはメチル基を表す、
ものから選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載のカップリング剤。 - 該化合物iii)が、該官能基Aがトリエトキシシランであり、そしてXが3または11炭素原子を有する飽和炭化水素鎖である化合物から選択されることを特徴とする、請求項5に記載のカップリング剤。
- 固体支持体の官能化のための、請求項1〜6のいずれかに定義された少なくとも一つの式(I)のカップリング剤の使用。
- 少なくとも一つの固体支持体の表面を、請求項1〜6のいずれかに記載の少なくとも一つの式(I)のカップリング剤の溶液と、有機溶媒中で、接触させる少なくとも一つの工程を含むことを特徴とする、官能化された固体支持体の製造方法。
- 式(I)のカップリング剤の溶液と該固体支持体との接触が、4〜80℃間の温度で1〜48時間実施されることを特徴とする、請求項8に記載の方法。
- 該固体支持体が、ガラス、セラミック、シリコンまたはプラスチックから作製される支持体から選択され、前記支持体が、少なくとも一つの水和された、ヒドロキシル化された、シラン化されたまたはアミノ化された表面、あるいは活性エステル型の表面を有することを特徴とする、請求項8または9に記載の方法。
- 該支持体が、少なくとも一つの平面または平面ではない、平滑または構造化された表面を有し、ガラススライド、平面のプラスチックプレートまたはウェルを備えたプラスチックプレート、キャピラリーチューブあるいはポーラスまたは非ポーラスビーズの形態にあることを特徴とする、請求項8〜10のいずれかに記載の方法。
- 請求項1〜6のいずれかに定義された1以上の式(I)のカップリング剤で官能化された少なくとも一つの表面を有することを特徴とする固体支持体。
- 前記固体支持体の表面に存在する式(I)のカップリング剤の反応性官能基Bに対して相補的である化学官能基を含む関心のある生物分子を共有結合で固定化するための、請求項12に記載の少なくとも一つの固体支持体の使用。
- 関心のある生物分子が核酸分子であることを特徴とする、請求項13に記載の使用。
- 固体支持体の表面の少なくとも一部の露光による式(I)の化合物の反応性官能基Bの光−脱保護、続いて、このように活性化された固体支持体を関心のある生物分子の溶液と接触させる第1工程を少なくとも含み、その結果、前記固体支持体上で前記分子に保有され、そして前記式(I)の化合物の反応性官能基Bに対して反応性を有する、少なくとも一つの化学官能基間の共有結合の形成を介する前記分子の固定化を生じさせ、そしてこれらの2つの工程を必要に応じて繰り返すことを特徴とする、請求項14に記載の固体支持体への関心のある生物分子の固定化方法。
- 該光−脱保護工程が、該固体支持体の官能化された表面の一部のみに局在されることを特徴とする、請求項15に記載の方法。
- 該固定化工程が、式(I)の化合物のオキシアミン官能基Bと、関心ある生物分子のカルボニル化官能基との間のオキシム結合の形成を通して実施されることを特徴とする、請求項15または16に記載の方法。
- 該固定化工程が4と7の間のpHで実施されることを特徴とする、請求項17に記載の方法。
- 露光波長が300〜400nm間であることを特徴とする、請求項16〜18のいずれかに記載の方法。
- 請求項15〜19のいずれかに記載の方法に従い得られ、及び請求項1〜6のいずれかに記載の式(I)のカップリング剤の反応性官能基Bと形成された共有結合により関心のある前記生物分子が固定された少なくとも一つの表面を有することを特徴とする固体支持体。
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