JP4834219B2 - アテローム硬化症の予防および／または治療のための組成物 - Google Patents

Description

【０００１】
技術分野
本発明は、アテローム硬化症を予防および／または治療するための経口免疫寛容誘発性組成物に関する。
【０００２】
背景技術
アテローム硬化症およびその臨床続発症は罹患率および死亡率の点で西洋社会にとっても最も危険な傷害の１つである。従って、その早期無痛性進行を遅延もしくは停止させる手段を提供することを目的として原因病理を調査するために広大な努力が費やされてきたことは驚くに当たらない。まだ明確な解答は存在していないが、以前に脂質平衡の調節障害に関して推測されたようにアテローム斑を発生させる原因となるのが１つの単独メカニズムだけではないことは明らかになりつつある。
【０００３】
医師らは身体の様々な部分における動脈の閉塞を生じさせる組織病理学的プロセスを定義するためにアテローム硬化症という表現を使用する。動脈の閉塞は、循環から輸送された大量の脂肪で徐々に充填されつつある様々な起源の種々の細胞の蓄積によって惹起される。主として“悪玉”コレステロールである低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）から構成される脂肪は、血管壁に沈着する主要物質である。アテローム硬化症の後期においては、脂質充填帯域にはカルシウムが蓄積し始める。カルシウムの沈着は動脈をより剛性にかつより低柔軟性にさせるので、それによって結局は“動脈の硬化症”（アテローム硬化症）のよく知られた発現につながる外観であるそれらの“石のような”外観を惹起する。関係する動脈が心臓への血流を遮断すると、人は‘心臓発作’に襲われる：脳動脈が閉塞すると、その人は脳卒中を経験する。四肢への動脈が狭くなると、その結果として重度の疼痛や身体運動能の低下が発生し、さらにもしかすると手足の切断が必要になる。
【０００４】
上記の疾患の進行は多年に渡って検出することができず、進行した段階にしか発現しないことは明白である。これらの発現が検出可能になったときには、疾患が進行期にあるために、治療を行うのは極めて困難になる。
【０００５】
上記のように、アテローム硬化症は血管の壁における脂肪の沈着の結果であり、それによってアテローム斑の層を作り出す。前記層は生きている器官への血液の流れを塞ぎ、それによって脳血管障害、心筋梗塞または末梢血管疾患を引き起こす。この状態の急速な進行に対して知られているリスク因子には、高血圧、糖尿病、肥満、喫煙および運動不足が含まれる。
【０００６】
近年の試験では、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）およびクラミジア肺炎のような感染因子もまたアテローム硬化症の進行に関係している可能性があることが明らかになっている。上記は血管閉塞や再狭窄と抗ＣＭＶ抗原に対する自己抗体力価との相関関係、またはアテローム斑中での感染性微粒子の発見に加えて、アテローム硬化症と歯肉炎を結び付けることによって証明されてきた。
【０００７】
最近１０年間には、アテローム硬化症が有意な感染性自己免疫的性質を有するという理論を支持する一連の証拠が積み重ねられてきた。
【０００８】
自己免疫疾患においては、免疫系は攻撃してくる外部侵入者に加えて自分の身体成分（自己抗原）を攻撃する。自己免疫疾患は自己抗体媒介性または細胞媒介性疾患に分類される。典型的な自己抗体媒介性自己免疫疾患は、重症筋無力症および特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）であり、典型的な細胞媒介性疾患は橋本甲状腺炎およびＩ型糖尿病である。
【０００９】
アテローム硬化症における免疫ネットワークの関与
免疫媒介性プロセスがアテローム硬化性病変内に広く行き渡るという認識は極めて早期においてリンパ球およびマクロファージ、つまり脂肪線条が一貫して観察されることから生じた。早期病変ではＣＤ４＋細胞が優勢な集団（残りはＣＤ８＋細胞）を含有するこれらのリンパ球がマクロファージよりはるかに多量に発見されたが、より進行した病変ではこの比率が逆転する傾向を示す。これらの発見は、それらが可能性のある抗原に対する一次免疫感作を反映しているのか、あるいはまたそれらが以前に誘発された局所的組織損傷の単なる随伴現象として存在するのかについての疑問を引き起こした。早期斑へのこれらの炎症性細胞の補充現象の原因となる因子とは無関係に、それらはＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ−ＤＲおよびインターロイキン（ＩＬ）レセプター並びに白血球共通抗原（ＣＤ４５Ｒ０）および超遅延活性化抗原１（ＶＬＡ−１）インテグリンの随伴発現によって現れる活性化状態を示していると思われる。
【００１０】
アテローム硬化性病変の早期における進行中の炎症反応は、局所細胞（すなわち、内皮細胞、マクロファージ、平滑筋細胞および炎症性細胞）による様々なサイトカイン類の産生をもたらす一次開始事象であるか、またはこの反応が危険なプロセスに向かう身体の防衛免疫系の形のいずれかである可能性がある。常在型細胞によってアップレギュレートされることが証明されているサイトカイン類にはＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮ−γおよび単球化学誘導物質ペプチド−１（ＭＣＰ−１）が含まれる。アテローム斑内のすべての細胞成分によって発現される血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）もまた過剰発現されることが証明されており、従ってもしかすると有糸分裂誘発性かつ化学走化性因子の形での共刺激支援によって先在する炎症反応を強化する可能性がある。極めて近年に、Ｕｙｅｍｕｒａ Ｋ，Ｄｅｍｅｒ ＬＬ，Ｃａｓｔｌｅ ＳＣ ｅｔ ａｌ． Ｃｒｏｓｓ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ＩＬ−１２ ａｎｄ ＩＬ−１０ ｉｎ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ（アテローム硬化症におけるＩＬ−１２およびＩＬ−１０の交差調節の役割）． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９６ ９７；２１３０−２１３８は、正常な動脈と比較してＩＬ−４ ｍＲＮＡは発現しないがＩＦＮ−γが強力に発現することによって実証されたヒトのアテローム硬化性病変における１型Ｔ細胞サイトカインパターンを解明した。さらにその上、主として活性化単球およびＴｈ１サイトカインパターンの選択的誘導物質によって産生するＴ細胞成長因子であるＩＬ−１２は、その主要ヘテロ二量体形であるｐ７０およびｐ４０（その優勢誘導タンパク質）ｍＲＮＡの豊富さによって明らかなように、病変内で過剰発現することが発見された。
【００１１】
アテローム斑内で細胞免疫系が優勢であることについての強力な証拠に類似して、さらにまた局所体液性免疫系の関与を支持する豊富なデータも存在する。従って、常在型マクロファージ内のＣ３ｂおよびＣ３Ｂｉレセプターの強化発現に加えて、斑内での免疫グロブリンと補体成分の沈着が証明されている。
【００１２】
アテローム硬化症の進行に免疫媒介性炎症が寄与することに関する貴重な手がかりは動物モデルによってもたらされる。従って、免疫低下マウス（クラスＩ ＭＨＣ欠損）は免疫コンピテントマウスよりも進行性のアテローム硬化症を発生する傾向があると思われる。さらに、ＩＬ−２転写の強力なサプレッサーであるシクロスポリンＡ用いたＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｅｍｅｓｏｎ ＥＥ，Ｓｈｅｎ ＭＬ． Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｉｎ ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉｃ Ｃ５７ＢＬ／６ ｍｉｃｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ Ａ（シクロスポリンＡを用いて処理された高脂血症性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける進行性アテローム硬化症）． Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １９９３；１４２：１９０６−１９１５）およびＮｅｗ−Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅ系ウサギ（Ｒｏｓｅｌａａｒ ＳＥ，Ｓｃｈｏｎｆｅｌｄ Ｇ，Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ Ａ． Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｉｎ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｆｅｄ ｒａｂｂｉｔｓ ｂｙ ｓｕｐｐｒｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ（細胞媒介性免疫の抑制によるコレステロール飼養ウサギにおける増強されたアテローム硬化症の発生）． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９５； ９６： １３８９−１３９４）の処理は“通常の”リポタンパク質“負荷”下でアテローム硬化症を有意に増大させた。後者の研究はアテローム斑内に居座りつづける炎症プロセスに対抗するときに関与するような免疫系の可能性のある役割についての洞察を提供する可能性がある。
【００１３】
アテローム硬化症は古典的自己免疫疾患ではないが、例えば血管を閉塞させる斑の産生のようなその発現の一部は免疫系作用に関連している可能性がある。古典的自己免疫疾患においては、免疫系に攻撃される自己抗原を極めて明快に定義することができ、免疫系に属していてリンパ球と呼ばれる自己抗原（自己抗体または細胞）を攻撃する免疫系の一部を定義することができる。特に、免疫系のこれらの構成要素の受身伝達によって健常な動物において疾患を誘発することができること、またはヒトの場合には疾患が病気の妊婦から彼女の子孫へ移される可能性があることを証明することができる。上記のうちの多数はアテローム硬化症においては一般的ではない。さらに、この疾患は確実に例えば高血圧、糖尿病、運動不足、喫煙およびその他のような共通リスク因子を有しており、この疾患は高齢者に大きな影響を与え、古典的自己免疫疾患とは相違する遺伝的優勢を有している。
【００１４】
経口寛容を誘発するプロセスは、アレルギー反応を減少させるために今世紀の初頭以降知られてきている。アレルギー患者に低用量の既知のアレルゲンを投与すると、身体の免疫寛容が回復してアレルギー反応が発生しなくなった。
【００１５】
自己免疫疾患における経口寛容
自己免疫疾患においては、経口寛容は自己免疫疾患における免疫反応を鈍くすることを説明するために使用される用語である。動物に‘原因と見なされた’抗原を投与することによって産生する寛容化は免疫応答への‘麻痺させる’作用のために疾患の発生を排除することができる。本発明の発明者らは最近、ヒトβ２ＧＰ１をこの分子による免疫の前に経口投与すると抗リン脂質（ＡＰＳ）同等症候群の改善が生じることを証明した。
【００１６】
経口寛容は、自己抗原に対する免疫反応が実施され、自己抗原に対する免疫系の寛容を回復させる必要がある自己免疫疾患の分野において適応されてきた。これは低用量の自己抗原を被験者に投与することによって実施された。これまでのところ、経口寛容の回復は数種の動物モデルについて報告されている。その中には被験動物に各々コラーゲンおよびＨＳＰ−６５を投与することによってアジュバント関節炎およびコラーゲン関節炎を防止することに加えて、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）と呼ばれる神経膜からのタンパク質を被験動物に投与することによって多発性硬化症（ＭＳ）と同等である実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の発生を防止することが含まれる。Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅと称するボストンに所在する会社は、糖尿病、多発性硬化症、慢性関節リウマチおよびブドウ膜炎を防止するためのヒトを対象とした数種の実験を実施している。ヒトを対象とした実験の結果は非ヒト動物を対象とした実験に比べて印象的ではないが、しかし関節炎の防止に関しては成功が得られている。
【００１７】
抗原成分
Ａ． 酸化低密度リポタンパク質
ＬＤＬはアポリポタンパク質Ｂ、中性および極性脂質並びに親油性抗酸化剤（ビタミンＥおよびβカロチン）を含む高分子量タンパク質の複合体である。天然分子内（分離Ｂ領域内）でのネオエピトープ類の形成を伴うＬＤＬの酸化変性はマクロファージ上でのスカベンジャーレセプターによるその認識をもたらす。アテローム斑内のすべての細胞成分（すなわち、内皮細胞、マクロファージ、平滑筋細胞、リンパ球）が様々な程度のＬＤＬ酸化の産生とともに脂質過酸化を強化できることはあり得るが、それでも各々の相対寄与は未だ決定されていない。これらの細胞の正確な役割とは無関係に、血管壁のレベルでの酸化力と抗酸化力の間の平衡がその後の有害作用を伴うＯｘ ＬＤＬへの曝露の度合いを決定するのであろうと思われる。Ｏｘ ＬＤＬは例えばリソホスファチジルコリン（ＬＰＣ）のような活性誘導体を有しており、さらに分子量がより少ないにもかかわらず、それでもその生物学的活性の一部を保持している。
【００１８】
リソホスファチジルコリン（ＬＰＣ）はヒトのアテローム斑において発現される。これはアテローム発生の第１ステップを誘発できる活性な生物学的物質である。実際に、これはＯｘ ＬＤＬよりはるかに強力でさえある。
【００１９】
Ｏｘ ＬＤＬおよびその副産物がｉｎ−ｖｉｖｏおよびｉｎ−ｖｉｔｒｏでの斑の発生に及ぼす全体的影響は本発明の範囲をはるかに越えているが、Ｏｘ ＬＤＬと免疫系の間のよく知られている関係を述べておくことは重要である。
【００２０】
Ｏｘ ＬＤＬがＴ−細胞および単球に対して化学走化性であることは知られている。Ｏｘ ＬＤＬおよびその副産物はさらにまた、どれもが強力な成長刺激物質である例えば単球化学走化性因子１のような因子の発現、コロニー刺激因子の分泌および血小板活性化特性を誘発することが知られている。
【００２１】
アテローム硬化症における細胞免疫反応の積極的な関与は近年、刺激物質としてのＯｘ ＬＤＬに反応した斑クローン内でＣＤ４＋を単離したＳｔｅｍｍｅ Ｓ，Ｆａｂｅｒ Ｂ，Ｈｏｌｍ Ｊ． Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ ｐｌａｑｕｅｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ ｏｘｉｄｉｅｚｅｄ ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ヒトアテローム斑からのＴリンパ球は酸化低密度リポタンパク質を認識する）． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９５；９２：３８９３−９７によって立証されている。Ｏｘ ＬＤＬに対応するクローン（２７種中の４種）はＩＬ−４ではなくむしろ主としてインターフェロン−γを産生した。上記のＴ細胞クローンが刺激性の強力なイムノゲン（Ｏｘ ＬＤＬ）を含む細胞免疫系との単なる接触を意味するのかどうか、またはこの反応が明白に無痛性アテローム硬化性プロセスと戦う手段を提供するのかについての判定はまだ行われていない。
【００２２】
体液性メカニズムの関与に関するデータおよびそれらの意味はさらに多く議論の余地がある。幾つかの報告はＯｘ ＬＤＬに対する抗体レベル上昇をアテローム硬化症の進行（頸動脈狭窄の程度、末梢血管疾患の重症度等によって現れる）と関連付けている。しかし、これらのデータは他の科学者によっては再現されなかった。それはおそらくＬＤＬに対する抗体を測定するために使用されたアッセイ法に関して標準化が欠如していたためである。いずれの場合においても、アテローム斑内の免疫複合体の形状でのＯｘ ＬＤＬ抗体の存在に関しては意見の一致が見られると思われるが、この発見の真の重要性はまだ確立されていない。
【００２３】
Ｏｘ ＬＤＬに対する抗体は、リポタンパク質代謝において活性な役割を果たすと仮説が立てられている。そこで、Ｏｘ ＬＤＬの免疫複合体およびその対応する抗体はＯｘ ＬＤＬと比較して懸濁液中においてマクロファージによってより効率的に取り込まれることは知られている。アテローム硬化症の病因に関するこの一貫した発見から結論を引き出すことはできないが、それはマクロファージによるＯｘ ＬＤＬの取り込みの加速が有益であるのか有害であるのかという問題がまだ解決されていないためである。
【００２４】
アテローム発生における体液性免疫系の有意性に関する重要なデータは動物モデルによってもたらされる。相同酸化ＬＤＬによるＬＤＬレセプター欠損ラビットの過剰免疫は高レベルの抗Ｏｘ ＬＤＬ抗体の産生を生じさせ、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて過剰免疫された対照群と比較してアテローム硬化性病変の程度における有意な減少と結び付いていたことが発見されている。アテローム斑形成の減少はさらにまた抗コレステロール抗体の付随産生を伴うコレステロールリッチなリポソームによるウサギの免疫によっても達成されたが、この作用には超低密度リポタンパク質コレステロールレベルの３５％低下が付随した。本発明の発明者らは、アポＥノックアウトマウスにおいて相同Ｏｘ ＬＤＬによる繰り返し免疫が抗Ｏｘ ＬＤＬ抗体の産生およびアテローム硬化症の減少を生じさせることを証明した。
【００２５】
Ｂ． 熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）６０／６５
最終的にアテローム硬化症の増強を生じさせる炎症性病変の開始および永続化に対する追加の主要抗原成分は６０Ｋｄの熱ショックタンパク質である。このミトコンドリアタンパク質は様々な種間で高度の配列相同性を示す約２４種のタンパク質から構成されるＨＳＰファミリーのメンバーである。これらのタンパク質は、それらの名称が意味するようにフリーラジカル、熱、機械的剪断応力、感染症、サイトカインその他への曝露を含む種々のストレスの多い傷害へ反応してアップレギュレートされる。ＨＳＰの目的論的重要性は、ストレスの多い刺激によって沈殿した細胞タンパク質の変性に対するそれらの保護的役割から生じる。この役割は分子‘シャペロン（ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ）’としてのそれらの名称をもたらした。しかし、これらのＨＳＰの外見上は好都合な作用はもろ刃の剣である可能性がある。なぜならそれらの過剰発現は、一定条件下では自己免疫反応を促進し、その結果として組織損傷を引き起こす可能性があるからである。ＨＳＰ免疫媒介性損傷の原因となる機序は完全には理解されていないが、隠れたネオエピトープ類が免疫系に曝露させられ、免疫系がもはやネオエピトープ類をそれらのアップレギュレート後の‘自己’とは見なさないことが推定されている。あるいはまた、‘異物’ＨＳＰと自己の構造に対する免疫攻撃を誘発するように機能する感染後に導入された自己ＨＳＰとの間の交差反応が存在することが提案された。
【００２６】
ＨＳＰ ６０はＨＳＰ ６５とともに、上記のＨＳＰファミリー内で個別“クラス”を構成する別個のタンパク質であり、ｉｎ−ｖｉｖｏにサブセットのタンパク質を包み込むための隔離環境を提供する。
【００２７】
哺乳類ＨＳＰ ６０と細菌ＨＳＰ ６５との間には類似性が存在しており、それは宿主の免疫エフェクターによる交差認識を可能にする。
【００２８】
自己免疫にＨＳＰが関与していることについての支持は、数種の自己免疫疾患における強化自己抗体並びにＨＳＰ ６０／６５に対する細胞応答を証明する試験によって提供されている。
【００２９】
ＨＳＰ ６５とアテローム硬化症とのつながりは、最初は１９９０年代初期におけるＧｅｏｒｇ Ｗｉｃｋの研究グループによって実施された先駆的研究（Ｘｕ Ｑ，Ｄｉｅｔｒｉｃｈ Ｈ，Ｓｔｅｉｎｅｒ ＨＪ ＆ ａｌ． Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｉｎ ｎｏｒｍｏｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉｃ ｍｉｃｅ ｒａｂｂｉｔｓ ｂｙ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ６５（熱ショックタンパク質６５を用いた免疫による正常コレステロール血症性マウスおよびウサギにおけるアテローム硬化症の誘発）．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ １９９２；１２：７８９−７９９）に続いて提起された。彼らは、免疫に使用される調製物が完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を含有している場合には、種々の抗原を用いて免疫されたウサギがアテローム硬化症を発生することを発見した。ＣＦＡの主要成分はその主要成分がＨＳＰ−６５である熱で死滅させられた結核菌（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）であるので、彼らはこの成分に対する免疫反応がアテローム硬化症の発生を導いたのであると結論した。この仮説は、動物が引続いてＨＳＰ−６５だけを用いて免疫されて顕著なアテローム硬化症を示したときに確証された。ここでリポタンパク質プロフィールに関してグループ間で有意差が認められないということを強調しておかなければならない。後になってＷｉｃｋの研究グループによって実施された追加の研究は、アテローム硬化症を発生するように誘発されたウサギの病変から抽出されたＴ細胞は各動物からの末梢血と比較してＨＳＰ−６５を過剰発現することが発見され、従ってこれはストレスのかかった動脈血管の近くでの局所的かつ限局的な免疫反応を証明していることを明らかにした。本発明の発明者らは、ＨＳＰ−６５（または結核菌）によるナイーブ（実験未使用）マウスの免疫が脂肪線条形成の加速を生じさせることを証明することによってＷｉｃｋの発見を強化した。
【００３０】
これらの発見はさらに、ＨＳＰ−６５に応答した体液性免疫メカニズムの関与がアテローム硬化症に罹っている患者において観察されたときに実証された。そこで、高レベルの抗ＨＳＰ ６５抗体と超音波検査によって評価された健常者のスクリーンにおける頸動脈狭小化の程度との相関関係が確立されている。
【００３１】
これらの発見は近年、ＨＳＰ−６０／６５が培養内皮細胞に及ぼす影響を評価するために設計されたｉｎ−ｖｉｔｒｏアッセイによって強化された。その結果、内皮細胞をＨＳＰ ６５と一緒に培養すると濃度および時間依存性である単球および顆粒球への付着性を誘発することが証明されている。さらにその上、この作用が内皮細胞Ｅ−セレクチン（Ｃ６２Ｅ）、血管細胞付着分子−１（ＣＤ１０６）および細胞内付着分子−１（ＣＤ５４）の過剰発現によって媒介されることが証明されている。
【００３２】
アテローム硬化症における自己抗原成分としてのリン脂質およびβ_２ＧＰ１
本発明の発明者らは、ヒト抗カルジオリピン抗体（ａＣＬ）を用いた免疫によるＬＤＬ−レセプターノックアウトマウスにおける抗カルジオリピンの産生が早期アテローム硬化症の加速を生じさせることを発見した。この観察はアテローム硬化症における抗カルジオリピン抗体の可能性のある前アテローム発生性役割に関して蓄積されてきた付随的データと一致している。
【００３３】
β_２ＧＰ１は、自己免疫疾患を有する患者からのａＣＬの標的であると証明された分子である。抗β_２ＧＰ１抗体は、実験的ＡＰＳを生じさせ、内皮細胞および血小板を活性化させることが証明されている。本発明の発明者らは、β_２ＧＰ１を用いて免疫されたトランスジェニックＬＤＬ−ＲＤ欠損マウスが各抗体を発生すること、およびＣＤ４＋細胞の局所的蓄積に付随して早期脂肪線条形成が増強されることを証明した。従って、β_２ＧＰ１はアテローム硬化症における自己免疫反応の自己抗原標的として役立つ可能性がある。
【００３４】
動物およびヒト両方の疾患モデルにおいて自己抗原ＨＳＰ ６０−６５およびＯｘ ＬＤＬに対する自己抗体力価とアテローム硬化症のレベルとの間に相関関係が発見されている。Ｏｘ ＬＤＬは天然ＬＤＬの酸化によって身体内で産生し、アテローム硬化症の有害因子であると見なされている。前記毒素に反応して、抗Ｏｘ ＬＤＬ抗体が産生する。β_２ＧＰ−１は凝固プロセスにおいて重要な役割を果たすヒト血液中の天然タンパク質であり、ＨＳＰ ６５は様々なストレス刺激の結果である。
【００３５】
アテローム硬化症の発生に対して素因を有するマウス（ＬＤＬ−Ｒノックアウトマウス）を用いて実施された実験において、マウスに低用量のＯｘ ＬＤＬを投与することによってアテローム硬化症状態における３０％の低下が証明された。
【００３６】
さらにその上、アテローム硬化症の誘発に免疫系が関与しているという事実並びに免疫系（リンパ球および自己抗体）の明白な関与は、例えばＯｘ ＬＤＬ、ＨＳＰ ６０／６５およびβ_２ＧＰ１のような自己抗原を用いて経口寛容を誘発することによって疾患を操作する可能性を指摘している。
【００３７】
米国特許第５，３４８，９４５号は、ストレス下の細胞もしくは組織における死亡率と戦う方法を開示している。この方法はその細胞もしくは組織の生存率を増大させるために効果的な量で細胞もしくは組織に熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ ７０）を接触させるステップを含んでいる。この方法はアテローム硬化症、血管形成術後の再狭窄およびそうした治療が必要なヒトもしくは動物被験者における神経損傷と戦うときに使用できる可能性がある。薬学的に許容可能な調製物中に治療的に有効量のＨＳＰ７０を含有する医薬組成物もまた開示されている。
【００３８】
ＨＳＰ ７０およびＨＳＰ ６０は約２４種の高度に保存された熱ショックタンパク質からなるファミリーに属するが、これらは２つの完全に別個の特徴を表している。例えば、それらの作用機序はストレスの多い刺激からの保護を支配するときに協調して機能するとは思われない。
【００３９】
ＨＳＰ ７０は、最初は熱曝露および例えば虚血性プレコンディショニングのようなその他のストレスの多い傷害中の顕著な誘発のために特許が付与された。実際に、トランスジェニック動物におけるＨＳＰ ７０の過剰発現はストレスの多い危険からの保護と関連している。
【００４０】
このため、米国特許第５，３４８，９４５号は本発明の主題を教示しても提案してもいない。
【００４１】
発明の開示
従って、本発明によれば経口投与のための薬学的に許容可能な担体と組み合わせて変性低密度リポタンパク質、酸化低密度リポタンパク質（Ｏｘ ＬＤＬ）、熱ショックタンパク質６０／６５（ＨＳＰ ６０／６５）、β_２−糖タンパク質−１（β_２ＧＰ−１）、それらの機能的誘導体およびそれらの混合物からなる群から選択された有効成分を含有する、経口投与によってアテローム硬化症を予防および／または治療するための経口免疫寛容誘発性組成物が提供される。
【００４２】
本発明のある好ましい実施態様では、経口投与のための薬学的に許容可能な担体と組み合わせて変性低密度リポタンパク質、酸化低密度リポタンパク質（Ｏｘ ＬＤＬ）、熱ショックタンパク質６０／６５（ＨＳＰ ６０／６５）、β_２−糖タンパク質−１（β_２ＧＰ−１）、それらの機能的誘導体およびそれらの混合物からなる群から選択された有効成分を含有する、経口投与によって心臓発作を予防および／または治療するための経口免疫寛容誘発性組成物が提供される。
【００４３】
本発明のまた別の好ましい実施態様では、経口投与のための薬学的に許容可能な担体と組み合わせて変性低密度リポタンパク質、酸化低密度リポタンパク質（Ｏｘ ＬＤＬ）、熱ショックタンパク質６０／６５（ＨＳＰ ６０／６５）、β_２−糖タンパク質−１（β_２ＧＰ−１）、それらの機能的誘導体およびそれらの混合物からなる群から選択された有効成分を含有する、経口投与によって血管形成術後の再狭窄を予防および／または治療するための経口免疫寛容誘発性組成物が提供される。
【００４４】
本発明のさらに別の好ましい実施態様では、経口投与のための薬学的に許容可能な担体と組み合わせて変性低密度リポタンパク質、酸化低密度リポタンパク質（Ｏｘ ＬＤＬ）、熱ショックタンパク質６０／６５（ＨＳＰ ６０／６５）、β_２−糖タンパク質−１（β_２ＧＰ−１）、それらの機能的誘導体およびそれらの混合物からなる群から選択された有効成分を含有する、経口投与によって脳卒中を予防および／または治療するための経口免疫寛容誘発性組成物が提供される。
【００４５】
本発明のさらになお別の好ましい実施態様では、前記有効成分が変性低密度リポタンパク質であるか、または前記有効成分が酸化低密度リポタンパク質（Ｏｘ ＬＤＬ）であるか、または前記有効成分が酸化低密度リポタンパク質（Ｏｘ ＬＤＬ）の活性誘導体であるか、または前記有効成分が熱ショックタンパク質６０／６５（ＨＳＰ ６０／６５）であるか、または前記有効成分がβ_２−糖タンパク質−１（β_２ＧＰ−１）である経口免疫寛容誘発性組成物が提供される。
【００４６】
本発明は、前記活性誘導体がリソホスファチジルコリン（ＬＰＣ）である経口免疫寛容誘発性組成物を提供する。
【００４７】
本発明はさらにまた前記ＬＤＬがマロンジアルデヒドＬＤＬ（ＭＤＡ−ＬＤＬ）である経口免疫寛容誘発性組成物を提供する。
【００４８】
本発明のまた別の態様では、経口投与のための薬学的に許容可能な担体と組み合わせて変性低密度リポタンパク質、酸化低密度リポタンパク質（Ｏｘ ＬＤＬ）、熱ショックタンパク質６０／６５（ＨＳＰ ６０／６５）、β_２−糖タンパク質−１（β_２ＧＰ−１）、それらの機能的誘導体およびそれらの混合物からなる群から選択された有効成分を含有する経口免疫寛容誘発性組成物を経口投与するステップを含有する、被験者におけるアテローム硬化症を予防および／または治療するための方法が提供される。
【００４９】
本発明のある好ましい実施態様では、経口投与のための薬学的に許容可能な担体と組み合わせて変性低密度リポタンパク質、酸化低密度リポタンパク質（Ｏｘ ＬＤＬ）、熱ショックタンパク質６０／６５（ＨＳＰ ６０／６５）、β_２−糖タンパク質−１（β_２ＧＰ−１）、それらの機能的誘導体およびそれらの混合物からなる群から選択された有効成分を含有する経口免疫寛容誘発性組成物を経口投与するステップを含有する、被験者における心臓発作を予防および／または治療するための方法が提供される。
【００５０】
本発明のまた別の好ましい実施態様では、経口投与のための薬学的に許容可能な担体と組み合わせて変性低密度リポタンパク質、酸化低密度リポタンパク質（Ｏｘ ＬＤＬ）、熱ショックタンパク質６０／６５（ＨＳＰ ６０／６５）、β_２−糖タンパク質−１（β_２ＧＰ−１）、それらの機能的誘導体およびそれらの混合物からなる群から選択された有効成分を含有する経口免疫寛容誘発性組成物を経口投与するステップを含有する、被験者における血管形成術後の再狭窄を予防および／または治療するための方法が提供される。
【００５１】
本発明のさらになお別の好ましい実施態様では、経口投与のための薬学的に許容可能な担体と組み合わせて変性低密度リポタンパク質、酸化低密度リポタンパク質（Ｏｘ ＬＤＬ）、熱ショックタンパク質６０／６５（ＨＳＰ ６０／６５）、β_２−糖タンパク質−１（β_２ＧＰ−１）、それらの機能的誘導体およびそれらの混合物からなる群から選択された有効成分を含有する経口免疫寛容誘発性組成物を経口投与するステップを含有する、被験者における脳卒中を予防および／または治療するための方法が提供される。
【００５２】
本発明のさらになお別の好ましい実施態様では、前記有効成分が変性低密度リポタンパク質であるか、または前記有効成分が酸化低密度リポタンパク質（Ｏｘ ＬＤＬ）であるか、または前記有効成分が酸化低密度リポタンパク質（Ｏｘ ＬＤＬ）の活性誘導体であるか、または前記有効成分が熱ショックタンパク質６０／６５（ＨＳＰ ６０／６５）であるか、または前記有効成分がβ_２−糖タンパク質−１（β_２ＧＰ−１）である被験者におけるアテローム硬化症を予防および／または治療するための方法が提供される。
【００５３】
本発明は、前記活性誘導体がリソホスファチジルコリン（ＬＰＣ）である被験者におけるアテローム硬化症を予防および／または治療するための方法を提供する。
【００５４】
本発明はさらにまた前記ＬＤＬがマロンジアルデヒドＬＤＬ（ＭＤＡ−ＬＤＬ）である被験者におけるアテローム硬化症を予防および／または治療するための方法を提供する。
【００５５】
ここで使用する用語“機能的誘導体”は、可溶形態での標識タンパク質類、複合タンパク質類、融合キメラタンパク質類および精製レセプター類並びに前記タンパク質類のフラグメント、欠失および保存的置換を含むことが意図されている。
【００５６】
マウスおよびウサギにおけるＯｘ ＬＤＬの活性ワクチンがアテローム硬化症の発生を防止できるという証拠と組み合わせて、アテローム硬化症におけるＯｘ ＬＤＬに対する免疫応答の存在およびＯｘ ＬＤＬに対する反応と疾患の重症度との相関関係によって、本発明の発明者らはヒト被験者にＯｘ ＬＤＬを投与することによる免疫寛容の誘発がアテローム硬化症進行率の低下を生じさせることができるという結論するに至った。ここで、経口投与による免疫寛容の誘発のメカニズムはおそらくサイトカインＴＧＦβの刺激と産生および非特異的サプレッサーＴ細胞の発生によって媒介されるのであることを言及しておかなければならない。
【００５７】
本発明の経口寛容化はバイスタンダード抑制作用を生じさせるように広がる可能性がある：つまりアテローム斑の近くで発生してその進行に寄与する他の（非抗原特異的）自己免疫（抗自己）反応を遮断する。
【００５８】
ここで本発明の目的はタンパク質の展開を支援するために血清中における単なる上昇を達成することではなく寛容化を誘発するまたはＨＳＰ ６５に対する免疫応答を麻痺させることであることを言及しておかなければならない。
【００５９】
このため、ある態様では本発明は経口寛容、Ｏｘ ＬＤＬおよび一部には免疫因子によって惹起される疾患であるアテローム硬化症を結合している。Ｏｘ ＬＤＬはマウスおよびウサギにおいてＯｘ ＬＤＬ抗原の免疫反応（免疫寛容を誘発することとは対照的に）およびアテローム硬化症の状態における改善を誘発することが報告されている。これらの動物モデルにおいては、Ｏｘ ＬＤＬが経口投与を用いて実験されたことは報告されておらず、経口寛容については全く提案されていない。
【００６０】
本発明に従った経口投与のための医薬組成物はそれ自体は知られている方法によって調製され、その投与は知られている経口投与方法によって行われる。
上述の疾患を治療するのに有効な量は疾患の性質及び重症度、及び哺乳動物の体重の如き通常の要因に依存する。
【００６１】
経口投与のためには、有効成分は単位用量組成物の形状で投与されるのが好ましい。
【００６２】
そうした組成物は、好ましくは混合によって調製され、錠剤、カプセル剤、経口液状調製物、粉末剤、顆粒剤その他の形状で経口投与のために適切に適合させられる。
【００６３】
経口投与のための錠剤およびカプセル剤は、通常は単位用量で与えられ、さらに例えば結合剤、充填剤、希釈剤、錠剤化剤、潤滑剤、錠剤分解物質、着色料、人工香味料および湿潤剤のような従来型賦形剤を含有する。錠剤は技術においてよく知られた方法に従ってコーティングすることができる。
【００６４】
使用するために適切な充填剤には、セルロース、マンニトール、ラクトースおよびその他の類似の物質が含まれる。適切な錠剤分解物質には、デンプン、ポリビニルピロリドンおよび例えばデンプングリコール酸ナトリウムのようなデンプン誘導体類が含まれる。適切な潤滑剤には、例えばステアリン酸マグネシウムが含まれる。適切な薬学的に許容可能な湿潤剤にはラウリル硫酸ナトリウムが含まれる。
【００６５】
これらの固形経口組成物は混合、充填または錠剤化の従来型方法によって調製することができる。有効物質をこれらの組成物全体に分布させるためには、大量の充填剤を使用して繰り返し混合作業を使用することができる。そうした作業は、もちろん技術において慣習的である。
【００６６】
経口液状調製物は、例えば水性もしくは油性懸濁剤、溶液、乳濁剤、シロップ剤、またはエリキシル剤であってよく、または使用前に水もしくはその他の適切な賦形剤を用いて再構成するための乾燥製剤として与えられてもよい。そうした液状調製物は、例えばソルビトール、シロップ、メチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸ゲルアルミニウムまたは硬化食用脂のような懸濁剤、例えばレクチン、モノオレイン酸ソルビタンもしくはアカシアのような乳化剤のような従来型添加剤；例えばアーモンド油、ヤシ油、例えばグリセリン、プロピレングリコールもしくはエチルアルコールのエステル類のような油性エステル類のような非水性賦形剤（食用脂を含んでいてよい）；例えばｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピルまたはソルビン酸のような保存料および必要な場合は従来型人工甘味料もしくは着色料を含有することができる。
【００６７】
経口調製物にはさらにまた例えば腸溶コーティングを有する錠剤もしくは顆粒剤のような従来型徐放性調製物が含まれている。
【００６８】
最良の実施態様の説明
本発明の態様をより完全に理解かつ認識できるように本発明を下記の実施例において一定の好ましい実施態様と結び付けて説明するが、本発明をこれらの特定実施態様に限定することは意図されていない。それどころか反対に、添付のクレームによって定義されるように本発明の範囲内に含まれるようなすべての代替物、変性物および等価物を含むことが意図されている。従って、好ましい実施態様を含む下記の実施例は、示されている詳細は例示するためおよび本発明の好ましい実施態様の具体的説明を行う目的でのみ記載されており、調製方法並びに本発明の原理および概念的態様の最も有用かつ容易に理解される説明となると考えられるものを提供するために呈示されていると理解すれば、本発明の実践を例証するために役立つであろう。
【００６９】
材料および方法
実験動物
相同的組換えによって１２週齢のＬＤＬ−ＲＤマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系と１２９Ｓｖ系との雑種）を作製する。マウスはＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（バーハーバー、メイン州）から購入する。ＬＤＬ−ＲＤマウスを使用するのは、それらが固形飼料で飼養される場合には高コレステロールレベル（ヒトの数値に類似する）を有しており、高脂肪食が与えられたときにのみアテローム硬化症を有意に発生するためである。ＬＤＬ−ＲＤマウスには重量で４．５％の脂肪（０．０２％コレステロール）を含有する通常の固形飼料または１．２５％コレステロール、７．５％カゼインおよび０．５％（重量で）コール酸ナトリウムを含有するアテローム発生食（Ｈａｒｌａｎ、Ｔｅｋｌａｄ Ｐｒｅｍｉｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｄｉｅｔｓ、マディソン、ワイオミング州）のどちらかを与える。マウスは明暗各１２時間のサイクルで維持し、飼料および水には任意に摂取できるようにさせる。
【００７０】
ＬＤＬの分離、酸化および特性付け
リポタンパク質を分離するための血液は１２時間の絶食後にＥＤＴＡ（１ｍｇ／ｍｌ）中に収集する。ＬＤＬ（密度＝１．０１９−１．０６３ｇ／ｌ）はＫｂｒ⁻を用いた密度調整後に５０型ローターを使用して５０，０００ｒｐｍ／ｍｉｎでの２２時間の沈殿超遠心分離によって血漿から分離する。ＬＤＬ沈殿物は超遠心分離によって洗浄し、ｐＨ７．４の０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡに対して透析し、凝集物を除去するためにアクロディスク（Ａｃｒｏｄｉｓｃ）フィルター（孔径０．２２μｍ）を通過させ、さらに窒素下の暗所に保存する。
【００７１】
ＬＤＬの酸化は前透析されたＬＤＬ（ＥＤＴＡフリーＰＢＳ中のタンパク質１ｍｇ／ｍｌ）を硫酸銅（１０μＭ）と一緒に３７℃で２４時間インキュベーションすることによって実施する。リポタンパク質の酸化は、脂質過酸化試験によってマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）等価物を測定するチオバルビツール酸反応物質（ＴＢＡＲＳ）の分析およびさらにリポタンパク質の共役ジエン含量の分析によっても確認する。
【００７２】
抗Ｏｘ ＬＤＬ抗体力価の測定
天然および銅酸化ＬＤＬの調製を実施する。９６ウェルのポリスチレンプレート（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ、デンマーク）にＯｘ ＬＤＬ、天然ＬＤＬ（ＰＢＳ中で５μｇ／ｍｌの濃度）またはＰＢＳのいずれかを４℃で一晩塗布する。０．０５％のＴｗｅｅｎおよび０．００１％のアプロチニン（Ｓｉｇｍａ、米国）を含有するＰＢＳを用いて４回洗浄した後に、室温で２時間に渡って２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いてプレートをブロックする。血清画分は０．０５％のＴｗｅｅｎおよび０．２％のＢＳＡを含有するＰＢＳ中で１：５０に希釈する。さらに追加して一晩インキュベーションした後、プレートを洗浄し、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｃ．、米国）を添加し、室温で１時間かけて０．０５％のＴｗｅｅｎおよび０．２％のＢＳＡを含有するＰＢＳ中で１：１０，０００に希釈する。多数回の洗浄後に、ｐＨ９．８の１ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含有する５０ｍＭ炭酸塩緩衝液中の１ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェニル−ホスフェート（Ｓｉｇｍａ）を基質として添加する。この反応は１ＭのＮａＯＨを添加することによって３０分後に停止させる。Ｔｉｔｅｒｔｅｋ ＥＬＩＳＡリーダー（Ｓ．Ｌ．Ｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ウィーン、オーストリア）において波長４０５ｎｍで色を読み取り、結果は４０５ｎｍでのＯ．Ｄ．（光学密度）として表す。抗Ｏｘ ＬＤＬ抗体の力価は天然ＬＤＬへの結合から得られた数値をＯｘ ＬＤＬへの結合から得られた数値から差し引くことによって計算する。
【００７３】
抗Ｏｘ ＬＤＬ抗体の特異性を確認するため、およびアテローム硬化症における重要なイムノゲンであるＨＳＰとの可能性のある交差反応性について検査するために阻害検定を実施する。Ｏｘ ＬＤＬへの最高結合の半分を生じさせるＨＳＰ−６５免疫マウス血清の濃度を測定し、濃度を上昇させながら様々な阻害剤（すなわち、ＨＳＰ−６５、ＯｘＬＤＬ、ウシ血清アルブミン）を適用する。
【００７４】
抗ＨＳＰ−６５抗体の検出
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）中の組換えＨＳＰ−６５（１μｇ／ｍｌ）を平底９６−ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ、デンマーク）上に一晩４℃でのインキュベーションによって塗布しておく。０．０２％ Ｔｗｅｅｎを含有するＰＢＳを用いての洗浄およびＰＢＳ中の１％ＢＳＡを用いてのブロックの後に、種々の希釈率（ＰＢＳ中で１：５０、１：１００、１：２００）で血清を添加し、室温で１時間インキュベートする。ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｄａｋｏ Ｌｔｄ，ハイウィカム、英国）を添加し、室温で１時間インキュベートした後に、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎを用いて４回洗浄する。最後に、０．５３ｍｇ／ｍｌの２，２−アジノ−ビス−３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ；Ｓｉｇｍａ）を含有する１００μＬのクエン酸リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ４．２）を添加し、さらに３０分後にＴｉｔｅｒｔｅｋ ＥＬＩＳＡリーダーにおいて４９０ｎｍで吸光度を測定する。
【００７５】
抗リン脂質抗体の検出
マウスおよびヒト抗体のＰＬへの反応性を測定するために変形ＥＬＩＳＡを実施する。マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ、デンマーク）にどれもＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．（セントルイス、ミズーリ州）製の５０μｇ／ｍｌの濃度でエタノールに溶解させたアニオン性ＰＬ［カルジオリピン（ＣＬ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）］および１：３のクロロホルム−メタノールに溶解させたホスファチジルコリン（ＰＣ）のどちらかを塗布する。プレートを真空下で乾燥させ、０．５％ゼラチンを含有するＴＢＳ（三臭化サリチルアニリド）を用いてブロックする。その後ＴＢＳを用いてプレートを３回洗浄し、ヒトβ_２ＧＰ１（５μｇ／ｍｌで３０分間）または０．１％ゼラチン／ＴＢＳ単独を用いて処置されたウェルに種々の濃度のマウス調製物を添加する。抗体の結合は、ヤギ抗マウスアルカリホスファターゼ抱合体および基質（ｐ−ニトロ−フェニルホスフェート）の添加を用いて検出する。結果は４０５ｎｍでの吸光度（ＯＤ_４０５）として表現する。
【００７６】
抗β_２ＧＰ１抗体の検出
１μｇ／ｍｌのβ_２ＧＰ１もしくは相違するＤＭを９６ウェルポリスチレン製プレート（Ｎｕｎｃ製）において５０ｍＭの重炭酸イオン緩衝剤（ｐＨ９．６）中で４℃で一晩インキュベートする。ＴＢＳを用いての３回の洗浄後、０．５％ゼラチン／ＴＢＳを用いて２時間に渡ってブロックを実施する（抗ＰＬ ＥＬＩＳＡに関して）。プレートをその後３回洗浄し、マウス血清（ゼラチン／ＴＢＳ中で１：１００に希釈されている）を添加し、室温で２時間インキュベートする。３回の洗浄後、０．１％ゼラチン／ＴＢＳ中で各々希釈されたアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（１：１０，０００）を２時間に渡って添加する。さらに３回の洗浄後、炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．８）中の基質ｐ−ニトロフェニルホスフェートを添加し、４０５ｎｍで吸光度を読み取る。
【００７７】
脾臓リンパ球の増殖アッセイ
マウスの屠殺後に脾臓を摘出し、さらにリンパ球を単離する。種々の濃度のＨＳＰ−６５、Ｏｘ ＬＤＬ、β_２ＧＰ１またはオボアルブミンの存在下でマイクロタイタープレートのウェル内の０．２ｍｌ培地中で７２時間に渡り１ｍｌ当たり１×１０^６個の細胞を３回ずつインキュベートする。増殖はインキュベーションの最終１２時間中のＤＮＡ内への［^３Ｈ］チミジンの取り込みによって測定する。結果は刺激指数（Ｓ．Ｉ．）：抗原の不在下で得られた平均バックグラウンドｃｐｍに対する抗原の平均ｃｐｍの比率として計算する。
【００７８】
サイトカインレベルの測定
脾細胞は屠殺後に取り出し、脾細胞はＯｘ ＬＤＬ、ＨＳＰ−６５またはオボアルブミンと一緒に３日間インキュベートした後に、上清を収集する。サイトカインプロフィール（ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γおよびＴＧＦ−β）は脾細胞の培養上清で測定する。
【００７９】
実施例
実施例１
この実験で使用するマウスはＬＤＬ−レセプター欠損（ＬＤＬ−ＲＤ）マウスと呼ばれている。これらの動物は身体の全細胞においてＬＤＬに対するレセプターにおける欠損を惹起する遺伝子突然変異を有する。このレセプターは循環から‘悪玉’コレステロール（ＬＤＬ）を排出かつ除去することに責任を負っており、それが欠損している場合はマウスは高脂質血症性となり、彼らが３〜５週間に渡って高脂肪食を摂取したときにはアテローム硬化症を発生する。
【００８０】
３群のマウス（各群１５匹のＬＤＬ−ＲＤマウス）を使用した。飼料は、食道へ挿入できるように設計された、従って飼料物質のほとんどが胃に到達することを保証する特殊器具（カニューラ）によって与えられた。
【００８１】
第１群：マウスにはＰＢＳ中に溶解させた１ｍｇのヒトＯｘ ＬＤＬの１日おきに５回の投与が行われた。最終投与の終了時に、マウスには高脂肪食が与えられ、この食餌が３週間または５週間続けられた後に屠殺された。
【００８２】
第２群：マウスにはＰＢＳ中に溶解された１ｍｇの対照タンパク質（オボアルブミン）の５回の投与が行われ、その後この特別食が３週間または５週間続けられた後に屠殺された。
【００８３】
第３群：マウスには食餌開始前に何も投与されなかった。
【００８４】
マウスを屠殺後にアテローム硬化性病変の発生、血清中コレステロール値およびＯｘ ＬＤＬに対する抗体のレベルについて評価した。
【００８５】
結果：全マウスは試験開始前および終了時に類似の体重を有していた。Ｏｘ ＬＤＬを投与されたマウスはアテローム硬化症を発生することが低いことが発見された（３０％低下）。
【００８６】
本試験では、マウスにおけるアテローム硬化症の誘発にＯｘ ＬＤＬによる経口寛容が及ぼす有益な作用が証明されている。試験結果が例えばアジュバント関節炎（リウマチ様関節炎に類似）、糖尿病、ブドウ膜炎、ＥＡＥ（多発性硬化症に類似）におけるコラーゲンのような様々な自己免疫疾患における経口寛容の有効性を指摘している数多くの試験がある。上記の試験ではヒトを対象とする臨床試験が実施された。近年、リウマチ様関節炎を有する患者に経口コラーゲンＩＩ（経口寛容）が投与されたときに顕著な作用が認められた。様々な自己免疫疾患におけるマウス試験およびヒト試験の間の匹敵する作用はヒトにおける成功が推定されることを示している。この治療には副作用がないことを強調しておかなければならない。
【００８７】
実施例２
ヒトＯｘ ＬＤＬを投与することによるＬＤＬ−レセプター欠損マウスにおける高脂肪食誘発性アテローム硬化症の抑制
ＬＤＬ−ＲＤマウス（ｎ＝１５）に３種類の濃度（１ｍｇ／用量、１００μｇ／用量および１ｍｇ／用量）でヒトＯｘ ＬＤＬを（１日おきに）５回投与する。別のＬＤＬ−ＲＤマウス（１群当たりｎ＝１５）には対照抗原（類似用量のオボアルブミン）を投与する。
【００８８】
最終投与の１日後から、全マウスには５週間に渡って高脂肪食（‘パイゲン’）を与える。
【００８９】
実験の終了時に、抗Ｏｘ ＬＤＬ、抗ＨＳＰ ６５および抗リン脂質抗体の存在について全マウスからの血清を評価し、さらに脂質プロフィール検査（総コレステロール、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＨＤＬおよびトリグリセリド）を実施する。
【００９０】
試験の終了時に全マウスから心臓を摘出し、使用するまで−７０℃で冷凍する（材料および方法の部を参照）。ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、マクロファージ、平滑筋細胞およびリンパ球活性化マーカーに対するモノクローナル抗体を使用して冷凍保存切片についての免疫組織化学試験を実施する。Ｏｘ ＬＤＬの活性誘導体であるＬＰＣを用いて同様の投与プロトコルを実行する。
【００９１】
実施例３
ＨＳＰ−６５を投与することによる結核菌（ＭＴ）誘発性アテローム硬化症の抑制
本発明の発明者らはＭＴを用いていったん免疫したＬＤＬ−ＲＤが早期アテローム硬化症の発生を増大させることを観察している。そこでＬＤＬ−ＲＤマウス（ｎ＝１５）に３種類の濃度（１００ｍｇ／用量、１０μｇ／用量および１μｇ／用量）で組換えＨＳＰ ６５を（１日おきに）５回投与する。別のＬＤＬ−ＲＤマウス（１群当たりｎ＝１５）には対照抗原（類似用量のオボアルブミン）を投与する。
【００９２】
最終投与の翌日から、全マウスは不完全フロイントアジュバント中に乳化させたＭＴの熱死滅懸濁液（１０ｍｇ／ｍｌ；１００μｇ／マウス）を用いて免疫される。マウスはＭＴによる免疫の１２週間後に屠殺する。
【００９３】
実験の終了時に、全マウスからの血清を抗ＨＳＰ ６５抗体の存在について評価し、さらに脂質プロフィール検査（総コレステロール、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＨＤＬおよびトリグリセリド）を実施する。
【００９４】
排液するリンパ節細胞からの増殖性反応はＨＳＰ ６５寛容マウスおよび対照飼料マウスからのＨＳＰ ６５に対して評価する。
【００９５】
サイトカインレベル（ＩＬ−４、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−β）はｉｎ−ｖｉｔｒｏでＨＳＰ ６５を用いてリンパ球が誘発された培地から収集された上清中で評価する。
【００９６】
全マウスから心臓を摘出して−７０℃で冷凍する。アテローム硬化症の程度を判定するために冷凍保存切片検査を実施する（１切片当たり５μｍ）。関連のある切片（大動脈洞領域から）はオイルレッドＯを用いて染色し、アテローム硬化症の程度はグリッドによって計数した面積を計数することによって判定する。
【００９７】
冷凍保存切片に関する免疫組織化学的試験は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、マクロファージ、平滑筋細胞およびリンパ球活性化マーカーに対するモノクローナル抗体を使用して実施する。
【００９８】
実施例４
ヒトβ_２ＧＰ１を投与することによるアテローム硬化症の抑制
この方法はＯｘ ＬＤＬおよびＨＳＰ−６５に対して使用した方法と類似であり、β_２ＧＰ１による免疫が早期アテローム発生を誘発するという観察に基づいている。
【００９９】
アテローム硬化症の程度の評価
アテローム硬化症性脂肪線条病変の定量は、大動脈洞における病変サイズを計算すること（幾つかの変更とともに）によって実施する。手短には、心臓および大動脈の上方切片を動物から取り出し、辺縁の脂肪を注意深く取り除く。上方切片をＯＣＴ培地中に包埋して冷凍する。大動脈洞全体（４００μｍ）の他の各切片（１０μｍの厚さ）を分析のために採取する。大動脈洞の遠位部分は大動脈から心臓への接合部である３弁尖によって認識される。オイルレッドＯを用いて染色した後に切片を脂肪線条病変について評価する。切片毎の病変面積は、試験した標本について何も知らされていない観察者がグリッドを用いて計数する。
【０１００】
アテローム硬化症の程度は大動脈洞の高さで評価する。組織の加工処理および染色を実施する。病変面積はＲｕｂｉｎ ＥＭ，Ｋｒａｕｓ ＲＭ，Ｓｐａｎｇｌｅｒ ＥＡ ＆ ａｌ．（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｅａｒｌｙ ａｔｈｅｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｂｙ ｈｕｍａｎ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａｌ（ヒトアポリポタンパク質Ａｌによるトランスジェニックマウスにおける早期アテローム発生の抑制）． Ｎａｔｕｒｅ １９９１；３５３：２６５−２６７）の変形方法によって定量する。
【０１０１】
アテローム硬化性病変の免疫組織化学
ｍＡｂｓ：ラットモノクローナル抗体Ｈ１２９．１９（Ｌ３Ｔ４）−抗マウスＣＤ４＋およびＳ３−６．７（Ｌｙ−２）−抗マウスＣＤ８ａはＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）から入手する；ＭＣＡ４９７（Ｆ４／８０）抗マウスマクロファージはＳｅｒｏｔｅｃ（オックスフォード、英国）から入手する。
【０１０２】
ＣＤ４、ＣＤ８およびマクロファージに対する免疫組織化学的染色は大動脈洞の厚さ５μｍの冷凍切片について実施する。切片は−２０℃でメタノール中で４分間固定し、その後−２０℃でエタノールと一緒に１０分間インキュベートする。その後非免疫ヤギ血清を用いて室温で１５分間に渡ってブロックし、その後室温で３０分間ＣＡＳブロッキング剤と一緒にインキュベートする。引続いて、ラットモノクローナル抗マウスＣＤ４／ＣＤ８を室温で１時間に渡り添加する。洗浄後、室温で３０分間に渡ってアフィニティー精製ビオチン化ウサギ抗ラットＩｇＧ抗体を添加する。洗浄後、スライドを０．３％Ｈ_２Ｏ_２と一緒にインキュベートし、さらに追加のすすぎ洗いおよび室温で３０分間に渡るストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ抱合体と一緒にインキュベートする。洗浄後、スライドを１５分に渡り３−アミノ−９−エチルカルボナソール（ＡＥＣ）基質（Ｄａｋｏ）を用いて展開させる。ヘマトキシリンを用いて切片を対比染色する。脾切片を陽性対照として使用する。第１または第２抗体が欠如する染色を陰性対照として使用する。
【０１０３】
養子移入実験
試験の各々において寛容および非寛容マウスからＴ細胞（ＣＤ４もしくはＣＤ８細胞のどちらか）を単離し、ＬＤＬ−ＲＤ同腹子へ移し、これらに６週間に渡ってアテローム発生食を投与する。実験の終了時に、アテローム硬化症の評価および免疫組織化学検査のために心臓を取り出す。
【０１０４】
当業者には本発明が上記で具体的に示した実施例の詳細には限定されないこと、および本発明がその重要な特性から逸脱することなく他の特異な形態で具体化できることは明白であろう、および従って本発明の実施態様および実施例はあらゆる面において上記の説明にとってではなく添付のクレームにとっての例示的かつ非制限的な参照であると見なされることが望ましく、さらにクレームの意味および同等性の範囲内に含まれるすべての変更はその中に含まれることが意図されている。

Claims (2)

1. アテローム硬化症を予防および／または治療するための医薬を製造するための、酸化低密度リポタンパク質（Ｏｘ ＬＤＬ）を有効成分として含有する組成物の使用であって、前記医薬が経口投与するために処方されていること、及び前記酸化低密度リポタンパク質がマロンジアルデヒドＬＤＬ（ＭＤＡ−ＬＤＬ）であることを特徴とする使用。
2. アテローム硬化症を予防するための医薬を製造するための、酸化低密度リポタンパク質（Ｏｘ ＬＤＬ）を有効成分として含有する組成物の使用であって、前記医薬が経口投与するために処方されていること、及び前記酸化低密度リポタンパク質がマロンジアルデヒドＬＤＬ（ＭＤＡ−ＬＤＬ）であることを特徴とする使用。