JPH04506415A - リン脂質およびその抗体の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 リン脂質およびその抗体の測定方法 技術分野 本発明は、サンプル中に抗リン脂質抗体が存在するかに陰性に荷電したリン脂質 が存在するか否かを測定する方法およびキットに関する。

本発明はまた、サンプル中の抗リン脂質抗体が自己免疫疾患に関する抗体なのか 感染症に関する抗体なのかを測定する方法、ならびに自己免疫疾患に関する抗リ ン脂質抗体および感染症に関する抗リン脂質抗体がサンプル中に存在するか否か を測定する方法に関する。

背景技術 抗リン脂質（ａＰＬ）抗体は、抗原として陰性に荷電きる自己抗体である。

血漿（または血清）からリン脂質アフィニティーおよび陽イオン交換クロマトグ ラフィーを連続的に用いてａＰＬ抗体を精製し、〉９５％の純度の特異的免疫グ ロブリンを得る、簡単な２工程操作が報告されている。これらの抗体は、ＣＬ− ＥＬ　ＩＳＡで典型的な結合を示すが、リン脂質依存性凝血試験においてループ ス抗凝固（ＬＡ）　活性は示さない。最近、イオン交換クロマトグラフィーによ って、血漿を抗カルシオリピン（ａＣＬ）抗体またはＬＡ活性をもつ抗体のいず れかを含有する分画に分離できることも明らかにされた。これは、ａＣＬ抗体と ＬＡ抗体が別個のａＰＬ抗体亜群を与え、異なる抗原に対し反応することを強（ 示唆するものである。

リン脂質抗原〔たとえば、カルシオリピン（ＣＬ））に結合する血漿中または血 清中の抗体を検出するための固相免疫測定法は１９８０年代の半ばに開発され、 現在ではそのまま使用できる市販キットとして多数のバイオテクノロジー関連会 社から入手可能であり、多くの研究施設ではこれらを使用するか、その代りに独 自の自家検定法を採用している。基本的には、ＣＬをマイクロタイターのウェル の底にコーティングし、血漿または血清のサンプルを添加する。抗カルシオリピ ン、ａＰＬ抗体が結合し、酵素連結抗−ヒト（二次）抗体を用いて検出できる。

しかしながら、希釈した場合、一部のサンプルは予想よりも低い結合を示すこと があり、その理由は明らかでない。しかし、これは希釈効果によって一部のサン プルでは偽陰性を呈するという問題を生じる。

抗原としてカルシオリピン（ＣＬ）を使用する固相酵素連結免疫測定法（ＥＬＩ ＳＡ）で検出される抗リン脂質抗体（ａＰＬ）は、抗カルシオリビン抗体（ａＣ Ｌ）と呼ばれる。ａＣＬは、梅毒やその他の感染症、自己免疫疾患の患者で、薬 剤誘発状態として、また正常個体群にある率で検出される。

自己免疫疾患患者におけるａＣＬの存在は、動脈または静脈血栓、反復性自然流 産および血小板減少症の危険の増大を付与するとされている。しかしながら、こ れらの臨床的特徴は梅毒やその他の感染症で生じたａＣＬの場合には認められな い。

これは、この２つの群にみられるａＣＬの間にはある種の質的な差があることを 示唆している。したがって、サンプル中の抗リン脂質抗体が自己免疫疾患に関す る抗体なのか感染症に関する抗体なのかを決定する方法、ならびに自己免疫疾患 に関する抗リン脂質抗体および感染症に関する抗リン脂質抗体がサンプル中に存 在するのかどうかを測定する方法がめられている。

発明の目的 本発明の目的は、サンプル中に抗リン脂質抗体（本明細書における定義による） が存在するか否かを測定する検定法を提供することにある。

本発明の他の目的は、サンプル中に陰性に荷電したリン脂質が存在するか否かを 測定する検定法を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、本発明の検定法に用いられるキットを提供すること にある。

また、本発明の他の目的は、サンプル中の抗リン脂質抗体が自己免疫疾患に関す る抗体なのか感染症に関する抗体なのかを決定する方法を提供することにある。

またさらに、本発明の他の目的は、自己免疫疾患に関する抗リン脂質抗体および 感染症に関する抗リン脂質抗体がサンプル中に存在するのかどうかを測定する方 法を提供することにある。

発明の開示 本明細書で用いられる抗リン脂質抗体の語は、一般的にすべての陰性に荷電した リン脂質、とくにカルシオリピンに結合する抗リン脂質抗体を称するが、それら はループス抗屡固活性は示さない。

カルシオリピン酵素連結免疫測定法（ＣＬ−ＥＬ　Ｉ　ＳＡ）で結合性を示す抗 リン脂質（ａＰＬ）抗体は、リン脂質アフィニティーおよびイオン交換クロマト グラフィーを連続的に用いて〉９５％の純度に精製することができる。

本発明者らは、血漿のイオン交換クロマトグラフィーで得られたａＰＬ抗体含有 画分をホスファチジルセリン（ＰＳ）またはＣＬアフィニティーカラムにアプラ イした場合、これらの抗体を含む血漿をこれらのカラムにアプライしてａＰＬ抗 体を精製できたにもかかわらず、抗体の結合が起こらないことを見出したのであ る。リン脂質抗原への結合は、正常ヒト血漿、血清またはウシ血清が存在する場 合にのみ起こり、これは、ａＰＬ抗体のＣＬへの結合には血漿／血清中のコファ クターの存在が必要なことを示唆している。正常（ａＰＬ抗体陰性）血漿をイオ ン交換画分に添加するとカラムへのａＰＬの結合が起こり、この仮説が支持され た。

リン脂質アフィニティー、ゲル濾過およびイオン交換クロマトグラフィーを連続 的に用いて、本発明者らはこのコファクターを均質に精製し、ａＰＬ抗体のＣＬ への結合にはこのコファクターの存在が用量依存性に要求されることを示した。

この分子のＮ−末端領域配列の分析により、このコファクターは、陰イオン性リ ン脂質に結合することが知られている血漿蛋白質であるβ−２−グリコプロティ ン−１（β−２０ＰＩ）（アポリポ蛋白質Ｈ）と同定された。

これらの所見は、β−２０Ｐｒまたはその同族体もしくは類縁体の存在は抗体／ リン脂質の相互作用に絶対的な要件であり、結合したβ−２ＧＰＩがａＰＬ抗体 の標的抗原を形成することを示唆している。

本発明は、陰性に荷電したリン脂質、とくにＣＬを用いる標準検定法における血 漿中でのａＰＬ抗体の結合を、検定系への精製β−２−グリコプロティン−■の 添加によって有意に増大させうることの発見に基づくものである。この感度の上 昇は大部分の検定における標準的希釈である１：５０の希釈でと（に顕著である 。

本発明の第一の態様においては、サンプルを、陰性に荷電したリン脂質、および β−２−グリコプロテイン−■またはその同族体もしくは類縁体と接触させ、接 触したリン脂質およびβ−２−グリコプロティン−Ｉに抗リン脂質抗体が結合し たかどうかを測定することからなる、サンプル中に抗リン脂質抗体（本明細書に おける定義による）が存在するか否かを測定する検定法が提供される。

リン脂質およびβ−２ＧＰ１へのａＰＬ抗体の結合の検出は、サンプル中にａＰ Ｌ抗体が存在することを示す。

サンプルは任意の哺乳動物からの血清または血漿のような血液画分であってよい 。

この実施態様の方法においては、任意の陰性に荷電したリン脂質、たとえば、カ ルシオリピン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファ チジルグリセロホスフェート、ホスファチジン酸、またはそれらの同族体もしく は類縁体が使用できる。通常はカルシオリピンが用いられる。

本発明の第二の態様においては、サンプルを、リン脂質に対する抗リン脂質抗体 （本明細書における定義による）、およびβ−２−グリコプロティン−■または その同族体もしくは類縁体と接触させ、接触した抗体およびβ−２−グリコプロ ティン−■に陰性に荷電したリン脂質が結合したかどうかを測定することからな る、サンプル中に陰性に荷電したリン脂質が存在するか否かを測定する方法が提 供される。

陰性に荷電したリン脂質のβ−２ＧＰＩおよびａＰＬ抗体との結合の検圧は、サ ンプル中に陰性に荷電したす諸表〒４−５０６４１５　（４） ン脂質か存在することを示す。

サンプルは、任意の哺乳動物からの、全血、または血清もしくは血漿のような血 液画分であってよい。本発明のアッセイはとくにヒトに適用できる。

本発明の方法においては、陰性に荷電したリン脂質またはａＰＬ抗体は通常、ア フィニティーカラム充填材料またはプラスチック表面、たとえばマイクロタイタ ープレートもしくはディツプスティックのような適当な固相上に既知の技術で固 定化される。

適当なアフィニティーカラム充填材料は、ビーズにしたアガロースマトリックス 、ポリアクリルアミド、ガラス、セルロースまたは架橋デキストランが包含され る′。

適当なプラスチック表面には、ポリメチルアクリレート、ポリスチレン、ポリエ チレン、ポリテレフタレート、エチレングリコール、ポリエステル、ポリプロピ レン等が包含される。一般的には、任意の標準的マイクロタイタープレートが使 用できる。

別法として、固相はゲルまたはマトリックスの形態でもよく、これにａＰＬ抗体 またはリン脂質が所望によりβ−２０ＰＩとともに導入される。

第一の実施態様の方法の他の形式では、リン脂質が所望によりβ−２０ＰＩとと もにリポソームまたはミセルに導入される。

β−２０ＰＩは任意の哺乳動物からのものでよい。実質的に純粋な形であること が望ましい。β−２０ＰＩは、血清または血漿から既知の方法で、たとえばリン 脂質クロマトグラフィーにより精製できる。しかしながら、組換えＤＮＡ技術ま たはペプチド合成で製造されたβ−２０ＰＩも使用できる。

β−２ＧＰ　Ｉは、第一または第二の実施態様の方法で使用されるサンプルを陰 性に荷電したリン脂質またはａＰＬ抗体と接触させる前または後に、そのサンプ ルと接触させることができる。また、第一の実施態様の検定では、β−２ＧＰＩ を固相に抗原とともに固定化しても、またリボゾームもしくはミセルに導入して もよい。

抗リン脂質抗体のリン脂質およびβ−２−グリコプロティン−Ｉへの結合は本技 術分野でよく知られた任意の適当な方法で測定できる。たとえば、ＥＬＩＳＡ、 ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫蛍光法、化学ルミネッセンス法および比 濁法を使用できるが、これらに限定されるものではない。

通常は、標識抗体または抗原を用いる標準ＥＬＩＳＡ法が採用される。標識は、 酵素、蛍光物質、化学発光物質、放射性同位元素または補酵素とすることができ る。

一般的には、酵素標識、たとえばアルカリホスファターゼまたはβ−ガラクトシ ダーゼがそれらの適当な基質とともに用いられる。酵素／基質反応は適当な手段 たとえば分光光度法によって検出できる。

リン脂質がリポソームに導入された場合は、ＢｏｎｅｒｊｉＢ、　Ｌｙｏｎ　Ｊ 　Ａ、　Ａｌｖｉｎｇ　ＣＲ，Ｂｉｏｃｈｉｓ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ 。

１９８２．６８９：　３１９−３２８：　Ａｌｖｉｎｇ　ＣＲ，Ｒｉｃｈａｒｄ ｓ　ＲＬ。

Ｇｕｊｒｇｊｕｓ　Ａ　Ａ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、、１９７７、１１ ８：３４２に記載のリポソーム分解アッセイが使用できる。

本発明の第三の態様においては、ａ）β−２ＣＰ　！またはその同族体もしくは 類縁体、およびｂ）陰性に荷電したリン膠質からなり、抗リン脂質抗体（本明細 書における定義による）がサンプル中に存在するか否かを測定する検定法に用い られるキットか提供される。

キットはさらに、Ｃ）試験サンプル中に存在する抗リン脂質抗体のβ−２０ＰＩ および陰性に荷電したリン脂質への結合を検出するための手段を包含してもよい 。

抗体の結合を検出するためには、任意の適当な手段、たとえば標識抗−ヒト抗体 を使用することができる。この場合標識としては、酵素、蛍光物質、化学発光物 質、放射性同位元素または補酵素が使用できる。一般に使用される標識は酵素で ある。

本発明の第四の態様においては、ａ）β−２０ＰＩまたはその同族体もしくは類 縁体、およびｂ）抗リン脂質抗体（本明細書における定義による）からなり、サ ンプル中に陰性に荷電したリン脂質が存在するか否かを測定する検定法に用いら れるキットが提供される。

キットはさらに、Ｃ）抗体リン脂質抗体の、β−２０Ｐｌおよび試験サンプル中 に存在する陰性に荷電したリン脂質への結合を検出するための手段を包含しても よい。

ａＰＬ抗体の結合を検出するためには、任意の適当な手段が使用できる。通常、 酵素を標識とした標識ａＰＬ抗体が使用される。使用できる他の適当な標識には 、蛍光物質、化学発光物質、放射性同位元素、または補酵素が包含される。

本発明の検定法の利点は、過剰のβ−２０ＰＩの添加により陰性に荷電したリン 脂質へのａＰＬ抗体の至適な結合が可能となり、定常的に使用されている検定法 に比較して感度の有意な増大が生じることである。

この感度の増大の結果として、定常的なａＰＬ検定では「陰性」のサンプルが本 発明の検定では陽性であることがわかる場合があり、「偽陰性ノを最小限にする ことができる。

ａＰＬ抗体の検出は、体内におけるその存在が血栓症、流産および他の臨床的に 重要な症候群に関連することから、臨床的に極めて重要である。したがって、こ れらの抗体の検定の感度の上昇は臨床的意義が大きい。

自己免疫疾患患者および感染症患者から精製した抗リン脂質抗体（ａＣＬ）の、 リン脂質結合血漿蛋白質、β−２−グリコプロティン−■（β−２０ＰＩ）への 結合特異性の検討により、本発明者らは、自己免疫疾患患者からのａＣＬの結合 特異性が感染症患者からのａＣＬの場合とは異なることを発見した。とくに、本 発明者らは、自己免疫疾患患者１２例中１１例でａＣＬ抗体はβ−２ＧＰＩの存 在下にのみカルシオリビン（ＣＬ）と結合することを見出した。これに反し、マ ラリア、感染性単核症、結核、Ａ型肝炎および梅毒患者からの精製ａＣＬはβ− ２ＧＰＩがなくてもＣＬに結合した。

血栓症の合併は自己免疫疾患で存在するａＣＬに関連し、感染症に伴うａＣＬに は関係がないようである。本発明者らは、自己免疫疾患群における血栓症の危険 の増大は、抗凝固活性をもつ血漿蛋白質、β−２０Ｐ　Ｉに関連してＣＬに結合 するａＣＬ抗体の存在によるものと想像している。

本発明は第五の態様においては、（ｉ）サンプルの一部をβ−２−グリコプロテ ィン−Ｉまたはその同族体もしくは類縁体と接触させることなく、陰性に荷電し たリン脂質と接触させ、サンプル中の抗リン脂質抗体の第一の量を測定し、（ｉ ｉ）サンプルの別の一部を陰性に荷電したリン脂質およびβ−２−グリコプロテ ィン−■またはその同族体もしくはａａｉ体と接触させて、サンプル中の抗リン 脂質抗体の第二の量を測定し、（ｉｉｉ）第一の量が第二の量よりも実質的に小 さい場合は測定されたサンプル中の抗リン脂質抗体は自己免疫疾患に関するもの であり、第一の量が第二の量よりも実質的に大きい場合は測定されたサンプル中 の抗リン脂質抗体は感染症に関するものであることから、第一の量と第二の量を 比較して、測定されたサンプル中の抗リン脂質抗体が自己免疫疾患に関するもの であるか感染症に関するものであるかを決定することからなる、サンプル中の抗 リン脂質抗体が自己免疫疾患に関するものであるか感染症に関するものであるか を決定する方法が提供される。

本発明は第六の態様においては、（ｉ）サンプルの一部をβ−２−グリコプロテ ィン−１またはその同族体もしくは類縁体と接触させることなく、陰性に荷電し たリン脂質と接触させ、サンプル中の抗リン脂質抗体の第一のリン脂質およびβ −２−グリコプロティン−Ｉまたはその同族体もしくは類縁体と接触させて、サ ンプル中の抗リン脂質抗体の第二の量を測定し、（ｉｉｉ）第一の量が第二の量 と実質的に等しい場合には測定されたサンプル中の抗リン脂質抗体は自己免疫疾 患および感染症に関するものであることから、第一の量と第二の量を比較して、 測定されたサンプル中の抗リン脂質抗体が自己免疫疾患および感染症に関するも のであるか否かを決定することからなる、サンプル中の抗リン脂質抗体が自己免 疫疾患および感染症に関するものであるか否かを決定する方法が提供される。

以下の注釈は、第五および第六の実施態様の両者に適用される。

第一の量か第二の量よりも実質的に小さいとは、第二の量が第一の量の少な（と も１．１倍より大であることを意味する（第二の量が第一の量の１００，０００ 倍またはそれ以上になることもある）。第一の量が第二の量よりも実質的に大き いとは、第一の量が第二の量の少な１　くとも１．１倍より大であることを意味 する（第一の量が第二の量の１００．０００倍またはそれ以上になることもある ）。

第一の量が第二の量と実質的に等しいとは、第一の量が第二の量の０．９倍より 大きく１．第二の量の約１．　１倍より小さいことを意味する。この場合、第一 の量は第二の量と実質的に等しいとする。

サンプルは、任意の哺乳動物からの、全血、または血清もしくは血漿のような血 液画分であってよい。本発明の方法はとくにヒトの体液に適用できる。

本発明の方法においては、陰性に荷電したリン脂質は通常、アフィニティーカラ ム充填材料またはプラスチック表面、たとえばマイクロタイタープレートもしく はディツプスティックのような適当な固相上に既知の技術で固定化される。

適当なアフィニティーカラム充填材料には、ビーズにしたアガロースマトリック ス、ポリアクリルアミド、ガラス、セルロースまたは架橋デキストランが包含さ れる。

適当なプラスチック表面には、ポリメチルアクリレート、ポリスチレン、ポリエ チレン、ポリテレフタレート、エチレングリコール、ポリエステル、ポリプロピ レン等が包含される。一般的には、任意の標準的マイクロタイタープレートが使 用できる。

別法として、固相はゲルまたはマトリックスの形態でもよく、工程（ｉｉ）の方 法ではこれに陰性に荷電したリン脂質がβ−２０Ｐ　Ｉとともに導入される。

第五および第六の実施態様の方法工程（１１）においては、他の形式として、リ ン脂質をβ−２０Ｐ　ｒとともにリポソームまたはミセルに導入できる。

β−２０Ｐ　Ｉは任意の哺乳動物からのものでよい。実質的に純粋な形であるこ とが望ましい。β−２０Ｐ　Ｉは、血清または血漿から既知の方法で、たとえば リン脂質クロマトグラフィーにより精製できる。しかしながら、組換えＤＮＡ技 術またはペプチド合成で製造されたβ−２ＧＰＩも使用できる。

工程（ｉｉ）の方法においては、β−２０ＰＩは、試験されるサンプルを陰性に 荷電したリン脂質と接触させる前または後に、そのサンプルと接触させることが できる。

また、工程（ｉｉ）の方法においては、β−２０Ｐｒは、抗原とともに固相に固 定化しても、またリポソームもしくはミセルに導入してもよい。

抗リン脂質抗体のリン脂質〔工程（ｉｉ）においてはさらにβ−２−グリコプロ ティン−■〕への結合は、本技術分野でよく知られた任意の適当な方法で測定で きる。たとえば、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫蛍光法、 化学ルミネッセンス法および比濁法を使用できるが、これらに限定されるもので はない。

通常、標識抗体または抗原を用いる標準ＥＬＩＳＡ法が採用される。標識は、酵 素、蛍光物質、化学発光物質、放射性同位元素または補酵素とすることができる 。一般的には、酵素標識、たとえばアルカリホスファターゼまたはβ−ガラクト シダーゼがそれらの適当な基質とともに用いられる。酵素／基質反応は適当な手 段たとえば分光光度法によって検出できる。

リン脂質がリポソームに導入された場合は、ＢｏｎｅｒｊｉＢ、　Ｌｙｏｎ　Ｊ 　Ａ、　Ａｌｖｉｎｇ　ＣＲ，Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ 。

１９８２、６８９：３１９’（２８；　Ａｌｖｉｎｇ　ＣＲ，Ｒｉｃｈａｒｄｓ 　ＲＬ。

Ｇｕｊｒｇｉｕｓ　Ａ　Ａ、　Ｊ、　ＩｍＩｌｕｎｏｌｏｇｙ、、　１９７７、 １１８＋３４２に記載のリポソーム分解アッセイ−が使用できる。

ａＰＬ抗体の結合を検出するためには、任意の適当な手段、たとえば標識を酵素 、蛍光物質、化学発光物質、放射性同位元素または補酵素とした標識抗−ヒト抗 体が使用できる。一般に、使用される標識は酵素である。

工程（ｉｉ）の方法においては、サンプルへの過剰のβ−２０ＰＩの添加により 、陰性に荷電したリン脂質へのａＰＬ抗体の至適な結合が可能となり、定常的に 使用されている検定法に比較して感度の有意な増大が生じる。

図面の簡単な説明 図１には、標準および改良ＣＬ−ＥＬ　ＩＳＡにおける様々なサンプルの結合を 例示する。サンプルは、ａＣＬ含有イオン交換画分（ＩＥ、Ｆ）；アフィニティ ー精製ａＣＬ抗体（ＡＰ、ＡＢ）；正常血漿（Ｎ、ＰＬ）；成熟ウシ血清（ＡＢ Ｓ）；精製コファクター（ＣＯＦ）。

患者血漿（Ｐ、ＰＬ）である。ＡＢＳおよびＣＯＦは単独で試験した場合、陰性 である（データは示していない）。

図２は、正常血漿のＣＬアフィニティーカラムクロマトグラフィーからの溶出液 のＰｈａｒｍａｃｉａ　５ｕｐｅｒｏｓｅ　１２ＨＲＩＯ／３０カラムによるゲ ル濾過を例示する。緩衝液：０，０１Ｍリン酸塩　ＩＭ　ＮａＣ１゜コファクタ ー活性は太い矢印で示した大きなピークに検出された。

図３は、図２のコファクター含有画分のＰｈａｒｍａｃｉａＭｏｎｏ　５ＨＲ５ １５カラムによる陽イオン交換の結果である。開始緩衝液：０．０５Ｍ　酢酸塩 ０．０５Ｍ　Ｎａｃｌ　ｐＨ４，８゜溶出緩衝液：０，０５Ｍ　酢酸塩０゜６５ Ｍ　ＮａＣ１ｐＨ５，２゜破線：溶出緩衝液の勾配。

コファクター活性は太い矢印で示した遅いピークに検出された。

図４は、非還元条件下、５〜１５％の直線勾配ゲルによる５ＤＳ−ＰＡＧＥのク ーマシーブルー染色を例示する。レーン１　：　ａＣＬ陽性血漿のＣＬアフィニ ティーカラムクロマトグラフィーからの溶出液、ＩｇＧ−ａＣＬ（１５０ｋＤ＆ ）およびコファクター（５０ｋＤａ）の広いバンドを含む。レーン２：正常血漿 から連続的なＣＬアフィニティー、ゲル濾過（図２）および陽イオン交換クロマ トグラフィー（図３）によって得られた精製コファクター。

図５は、精製コファクターのアミノ末端アミノ酸配列を示す。Ｘは残基が確定で きていない配列中位置を示す。

図６（ａ）：・　・アフィニティー精製ａＣＬ抗体の希釈系列の、コファクター の希釈系列の存在下での改良ＣＬ−ＥＬ　ＩＳＡにおける結合、・　・抗体およ びコファクター両者の希釈に基づく外挿結合曲線。

図６（ｂ）：ａＣＬ抗体陽性血漿の希釈系列の、標準ＣＬ−ＥＬ　ＩＳＡ・　・ および改良ＣＬ−ＥＬ　ＩＳＡ・における結合 図７は、緩衝液中、または５０Ｍｇ／ｍｌのコファクターの存在下における、改 良ＣＬ−ＥＬ　ＩＳＡでのＩｇＧ、ａＰＬ抗体の希釈系列の結合を示す。

図８は、緩衝液中、または５０Ｍｇ／ｍｌのコファクターの存在下における、改 良ＣＬ−ＥＬ　Ｉ　ＳＡでのＩｇＭ。

ａＰＬ抗体の希釈系列の結合を示す。

図９は、抗カルシオリビン抗体を有する患者からの透析血漿サンプルの典型的な イオン交換クロマトグラフィー像を示す。実線＝２８０ｎｍにおける吸光度、点 線＝ａＣＬ活性（４０５ｎ＋ａの吸光度）、破線＝β−２ＧＰＩ（μｇ／ｍｌ） 。

図１０は、感染に関連したａＣＬを有する患者について実施した改良ＣＬ−ＥＬ 　ＩＳＡ　（ＩｇＧ）の結果を示す。Ａ＝β−２０ＰＩ非添加、Ｂ＝β−２ＧＰ 　ｒ添加。

図１１Ａ−Ｄは、自己免疫疾患に関連したａｃＬｔ−育する患者について実施し た改良ＣＬ−ＥＬ　Ｉ　ＳＡ　（Ｉ　ｇＧ）の結果を示す。ＡおよびＢはβ−２ ＧＰＩ非添加、ＣおよびＤはβ−２ＧＰ　Ｉ添加。図１１Ａおよび図１１Ｃ：患 者番号２４２４−３１＝Ｉ、３２−３５＝多価、図１１Ｃおよび図１１Ｄ：患者 番号２４２４−３１＝Ｉ図１２は、自己免疫血清でのβ−２０ＰＩの増強の結果 を示す。

本発明の実施における最良の様式および他の様式以下に、第一の実施態様の方法 を、サンプル中のａＰＬ抗体の検出に関して説明する。

β−２−グリコプロティン−１は、正常ヒト血漿または血清からリン脂質クロマ トグラフィーによって精製する。

β−２０ＰＩの保存溶液を調製し、血漿または血清サンプルに添加して希釈サン プル（通常は検定緩衝液１：５０）中５０μｇ／ｍｌの最終濃度とする。

サンプルは、ついで以下のようにＣＬ−ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法でａＰＬ抗体を検定す る。

ＣＬをエタノール溶液としてマイクロタイタープレートに添加して、プレートの 底にＣＬにコーティングする。

エタノールを蒸発させるとプレートの表面にＣＬのコーティングが残る。

コーティングしたマイクロタイタープレートを上述のようにして調製した１：５ ０希釈血清または血漿サンプルとインキュベートし、洗浄し、アルカリホスファ ターゼ連結抗−ヒト抗体とインキュベートする。次にプレートを２度目の洗浄に 付し、基質とインキュベートする。

酵素反応の生成物を分光光度法によって検出する。

よるサンプル中の陰性に荷電したリン脂質の検出に関して説明する。

β−２−グリコプロティン−Ｉは上述のように調製し、血清または血漿サンプル に添加し、希釈サンプル（通常は検定緩衝液１：５０）中５θμｇ／ｍＩの最終 濃度とする。ａＰＬ抗体をマイクロタイタープレート上に吸着させ、血清または 血漿サンプルを１＝５０に希釈して加える。プレートを洗浄し、アルカリホスフ ァターゼ連結ａＰＬ抗体とインキュベートする。ついでプレートを洗浄に付し、 基質とインキュベートする。酵素反応の生成物を分光光度法によって検出する。

サンプル中の抗リン脂質抗体が自己免疫疾患に関する抗体および／または感染症 に関する抗体であるか否かを決定する方法は、以下の方法で実施できる。

第一には、サンプルの一部をβ−２−グリコプロティン−■またはその同類体も しくは類縁体と接触させることなく、陰性に荷電したリン脂質と接触させ、サン プル中の抗リン膠質抗体の量（ｒ第一の量」という）を測定することによるサン プルの一部の分析でサンプル中の抗リン脂質抗体を測定する。通常、この測定は ＣＬＩ！ｉ１１酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて行われる。ＣＬをエタノ ール溶液としてマイクロタイタープレートに添加しで、プレートの底にＣＬをコ ーティングする。エタノールを蒸発させるとプレートの表面にＣＬのコーチイン チン含有ＰＢＳでブロックする。コーティングしたマイクロタイタープレートを 検定緩衝液１：５０希釈血清または血漿サンプルとインキュベートし、洗浄し、 アルカリホスファターゼ連結抗−ヒト抗体とインキュベートする。次にプレート を２度目の洗浄に付し、基質とインキュベートする。酵素反応の生成物は分光光 度法によって検出する。

第二には、サンプル中の抗リン脂質抗体を、改良ＣＬ固相酵素免疫測定法（改良 ＥＬＩＳＡ）を用いて測定する。一般的に、これは、サンプルの他の一部を陰性 に荷電したリン脂質およびβ−２−グリコプロティン−■またはその同類体もし くは類縁体と接触させ、サンプル中の抗リン脂質抗体の量（「第二の量」という ）を測定する。さらに詳しくは、β−２−グリコプロティン−１は正常ヒト血漿 または血清からリン脂質クロマトグラフィーによって精製する。β−２０ＰＩの 保存溶液を調製し、血漿または血清サンプルに添加して希釈サンプル（通常は検 定緩衝液１：５０）中５０μｇ／ｌａｒの最終濃度とする。サンプルはついで以 下のように、ＣＬ−ＥＬ　Ｉ　ＳＡアッセイでａＰＬ抗体を検定する。ＣＬをエ タノール溶液としてマイクロタイタープレートに添加してプレートの底にＣＬを コーティングする。エタノールを蒸発させるとプレートの表面にＣＬのコーティ ングが残る。プレートを、ミルク粉末１％１０．３％ゼラチン含有ＰＢＳでブロ ックする。コーティングしたマイクロタイタープレートを上述のようにして調製 したｌ：５０希釈血清または血漿サンプルとインキュベートし、洗浄し、アルカ リホスファターゼ連結抗−ヒト抗体とインキュベートする。次にプレートを２度 目の洗浄に付し、基質とインキュベートする。酵素反応の生成物は分光光度法に よって検出する。

次に、第一の量と第二の量と比較することにより、測定されたサンプル中の抗リ ン脂質抗体が自己免疫疾患に関する抗リン脂質抗体であるか感染疾患に関する抗 リン脂質抗体であるかを決定する。第一の量が第二の量より実質的に小さい場合 は、測定されたサンプル中の抗リン脂質抗体は自己免疫疾患に関する抗体であり 、第一の量が第二の量より実質的に大きい場合は、測定されたサンプル中の抗リ ン脂質抗体は感染疾患に関する抗体である。

また、第一の量と第二の量と比較することにより、測定されたサンプル中の抗リ ン脂質抗体が自己免疫疾患に関する抗リン脂質抗体および感染疾患に関する抗リ ン脂質抗体であるかを決定する。第一の量が第二の量と実質的に等しい場合は、 測定されたサンプル中の抗リン雪質抗体は自己免疫疾患に関する抗体および感染 疾患に関する抗体である。

次に、本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明するが、これは本発明を限 定するものではない。

例１ ａＰＬ　（ａＣＬ）抗体および血漿コファクターの精製血漿および患者 静脈穿刺により採取した新しい血液を、最終容量のＩ／１０の０．１１Ｍクエン 酸三ナトリウムを含むチューブに取り、直ちに２，５００ｇで１５分間遠心分離 し、０　、　２２　μｍ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｍｉｌｌｅｘフィルターで濾過 して、クエン酸処理血小板不含血漿を調製した。ａＣＬ抗体は、血漿が高レベル のａＣＬ抗体を含有し、強いＬＡ活性を示す抗リン脂質症候群の２例の患者から 精製した。全身性エリテマトーデスであるが血栓症の既往はない、さらに２例の 患者からの血漿をイオン交換クロマトグラフィーに付した。血漿コファクターは 、ａＣＬ抗体およびＬＡ活性陰性の３１歳の男性健常者から精製した。

患者血漿のイオン交換クロマトグラフィー患者血漿を、０．０５Ｍ酢酸塩　０． ０５ＭＮａＣ１ｐＨ４，８に対して完全に透析し、遠心分離し、ついでＰｈａｒ ｍａｃｉａ　Ｆａｓｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ ａｐｈｙ（Ｆ　Ｐ　Ｌ　Ｃ）システムを用い、前述のように、５時間にわたり溶 出緩衝液（０，０５Ｍ酢酸塩０．６５ＭＮａＣ１ｐＨ５，２）１５００ｍｌを０ 〜１００％の直線勾配で５ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ陽イオン交換 カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にかけた。各両分について標準ＣＬ−ＥＬＩＳＡ を用いてａＣＬ抗体を検出し、ａＣＬ抗体陽性画分は、０．０１Ｍリン酸緩衝０ ．１５Ｍ食塩溶液ｐＨ７゜２　（ＰＢＳ）　（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ　Ａ）に対して 透析した。

ＣＬ−アフィニティークロマトグラフィー諸表平４−５０６４１５　（８） 前述したＰＳアフィニティークロマトグラフィー法を改良して使用した。エタノ ール中５．６ｍｇのＣＬ（Ｓｉｇｍａ）をガラスシンチレーションバイアルに取 り、窒素気流下に溶媒を蒸発させた。２．３２ｍｇのコレステロール（Ｂ　Ｄ　 ＨＣＨｅｍ１ｃａｌｓ　）と０．４４ｍｇのリン酸ジセチル（Ｓｉｇｍａ　）を 加え、脂質をクロロホルムに再溶解させた。溶媒を再び蒸発させ、エタノール５ ００μｍを加え、バイアルに栓をして沸騰水に浸し、脂質が溶解するまで振盪し た。１５％アクリルアミド、５％ＢＩＳ（Ｂｉｏｒａｄ）溶液５ｍｌをそれぞれ 加え、脂質／アクリルアミド混合物を旋回させて激しく混合し、ついで１００μ ｍの過硫酸アンモニウム（１４０■／ａｌｌ）　、　２．　５μｍのＴＥＭＥＤ 　（いずれもＢｉｏｒａｄより）を加えて急速に重合させ、ついで室温に一夜放 置した。堅いゲルを手操作の緩く嵌合するテフロン乳棒を用いてホモジナイズし 、空のＰｈａｒｍａｃｉａ　ＦＰＬＣＨＲ１０／　１０ガラスカラムに充填し、 ０，０１Ｍリン酸塩　０．０５Ｍ　ＮａＣＩ　ＰＨ７゜２で平衡化した。血漿を この緩衝液で１＝５最終容量に希釈し、０．５＠ｌ／ｗｉｎでカラムに注入し、 ついで通過液の２８０ｎａ＋における吸光度が＜０．０１単位になるまで、カラ ムを０．８ｍｌ／ｗｉｎで洗浄した。溶出緩衝液（０，０１Ｍリン酸塩　１．０ Ｍ　ＮａＣ’ｌ　ｐＨ７゜２）４０１１１を０〜１００％直線勾配で５０分で適 用し、蛋白質を含む溶出画分を集めた。イオン交換画分は非希釈で適用し、上述 のようにクロマトグラフィーに付した。

標準ａＣＬ抗体免疫測定法 ＭｃＮｅｉ［ｅｔ　ａｌ：Ｔｈｒｏｍｂ、　ＲｅＳ、、　５２　：　６０９−６ １９の記載に従いわずかに改変したａＣＬ抗体のＥＬ　Ｉ　ＳＡを使用した。多 価第二抗体を用いる場合は、各プレートに既知陽性血漿を包含させた。試験サン プルのａＣＬ抗体レベルは、ａＣＬ抗体単位で表した。１００単位は、１：５０ 希釈における陽性サンプルの４０５ｎｍの吸光度上述の標準ＣＬ−ＥＬ　Ｉ　Ｓ Ａを次のように改良した。

１％ミルク粉末（Ｄｉｐｌｏｍａ　）　／　０　、　３％ゼラチン（Ａｊａｘ） 　／　Ｐ　Ｂ　Ｓをプロツキング工程に使用し、サンプルは０．３％ゼラチン／ ＰＢＳに希釈して加え、第二の抗体は標準アッセイにおいて各上記工程に使用し た１０％成熟ウシ血清（ＡＢＳ）／ＰＢＳに代えて１％ウシ血清アルブミン（Ｂ ＳＡ）／ＰＢＳに希釈した。他の細部はすべて上述の標準ＣＬ−ＥＬＩＳＡと同 じにした。

ａＣＬ抗体のアフィニティー精製 ａＣＬ抗体レベルの高い患者からの血漿を上述のようにアフィニティーカラムに よるクロマトグラフィーに付した。このカラムから溶出した蛋白質は０．０５Ｍ 酢酸塩　０．０５Ｍ　ＮａＣ１ｐＨ４，８に対して一夜透析し、ついでＦＰＬＣ システムを用いてＭｏｎｏ−Ｓ陽イオン交換カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）に アプライした。溶出緩衝液（０，０５Ｍ酢酸塩　０．６５Ｍ’ＮａＣ１ｐＨ５゜ ２）１５ｍｌを０〜１００％直線勾配で３０分で適用したところ、３０％溶出緩 衝液で高度に精製されたａＣＬ抗体蛋白質が溶出した。

血漿コファクターの精製 上述のように、正常血漿をＣＬアフィニティーカラムを用いるクロマトグラフィ ーに付した。溶出した蛋白質を含む画分を、ＹＭＩＯ！ｊを用いるＡｍ１ｃｏｎ 濃總装置により圧２００　ｋＰａで濃縮し、０．０１Ｍリン酸塩　ＩＭＮａＣｌ 　ｐＨ７，２に対して透析し、さらにＰＡ−１０膜を用いるＭｉｃｒｏ−Ｐｒｏ −ＤｉＣｏｎ透析濃縮装置（Ｂｌｏ−Ｍｏ１ｅｃｕｊａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ） により２００μｌに濃縮した。濃縮したＣＬカラム溶出液をＦＰＬＣシステムで 操作したＰｈａｒｍａｃｉａ　５ｕｐｅｒｏｓｅ　１２　１０　／　３０ゲル濾 過カラムに０．０１Ｍリン酸塩　ＩＭ　ＮａＣ１ｐＨ７，２中、０．４ｍｌ／ｗ ｉｎでアプライした。コファクター活性が認められたこのカラムからの両分を集 め（結果の項参照）、０．０５Ｍ酢酸塩　０．０５Ｍ　ＮａＣ１ｐＨ４，８に対 して一夜透析し、ついでＰｈａｒｍａｃ、ｉａ關ｏｎｏ−Ｓ陽イオン交換カラム にアプライし、上述したと同じ様式で０．０５Ｍ酢酸塩　０．６５Ｍ　ＮａＣ１ で溶出し、ａＣＬ抗体を精製した。コファクター活性が認められた両分を集め、 ＰＢＳに対して透析し、小分けして一７０℃で保存した。

アミノ酸配列 オンライン・フェニルチオヒダントインアミノ酸分析装置（１２０Ａ型）に接続 したＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓシクエンサー（４７７Ａ型）を用い て精製コファクターの自動エドマン分解を行った。シクエンサーからの全アミノ 酸誘導体を別に述べる改良サンプル移送装置を用いて液体クロマトグラフに注入 した。担体としてはポリブレンを使用した。

ヘパリンアフィニティーカラムクロマトグラフィーａＣＬ抗体陽性血漿、または アフィニティー精製ａＣＬ抗体、および／または精製コファクターを、０゜０１ Ｍリン酸塩　０．０５Ｍ　ＮａＣ１ｐＨ７，２緩衝液中ｈｅｐａｒｉｎ−５ｅｐ ｈａｒｏｓｅ　ＣＬ　−４Ｂ　’ＣＰｈａｒｍａｃｉａ　）　４０ａ＋１を充填 したカラムにアプライし、結合した蛋白質を０゜０１Ｍリン酸塩　ＩＭ　ＮａＣ ｌ　ｐＨ７，２で溶出した。

他の方法 ５ＤＳ−ＰＡＧＥのためのサンプルは３％重積ゲルを含む５〜１５％直線勾配ゲ ルにかけた。電気泳動後、ゲルをクーマシーブルーで染色した。蛋白質の定量に はり。

ｗｒｙの方法を使用した。５０％水酸化アルミニウム懸濁液（ＢＤＨＣｈｅａ＋ １ｃａｌｓ　）　０．　１ｍｌを血漿１ｍｌと混合し、チューブを１５分間、毎 分倒立させたのち沈殿を遠心分離してビタミンに依存性凝固因子枯渇血漿を調製 した。

！ｌ 血漿からのａＣＬ抗体含有イオン交換分画のＣＬアフィニティークロマトグラフ ィー 前述のように、ａＣＬ抗体およびＬＡ活性を含む血漿は陽イオン交換クロマトグ ラフィーで亜群に分離できる。

ａＣＬ抗体含有画分をＣＬアフィニティーカラムに通しても結合は認められず、 カラムの通過液は適用画分と同量のａＣＬ抗体を含んでいた。正常血漿をイオン 交換画分に１：１０ｖ／ｖの割合で加え、この混合物をＣＬアフィニティーカラ ムに注入すると、アプライしたａＣＬ抗体の約３０％がカラムに吸着され、カラ ムから溶出させることができた（表１）。水酸化アルミニウムと混合してビタミ ンに依存性凝固因子を除去した正常血漿も類似の結果を生じた。最後に、正常血 漿に由来する画分を精製しく下記参照）、この「コファクター」画分（蛋白質濃 度２００　Ｉｔ　ｇ／ｖａｌ＞を１：５ｖ／ｖの割合で加えると、適用したａＣ Ｌ抗体の約７４％の吸着が生じた。

例３ 改良ａＣＬ抗体免疫測定法におけるａＣＬ抗体含有イオン交換画分およびアフィ ニティー精製ａＣＬ抗体の結合 例２で得られた結果は、アフィニティーカラムのＣＬへのａｃＬ抗体の結合が血 漿依存性であることを示唆している。しかしながら、これらのａＣＬ抗体含有画 分およびアフィニティー精製ａＣＬ抗体は、標準固相ＣＬ免疫測定法において、 血漿の非存在下に典型的な結合を示す。これらのアッセイでは、ブロッキング剤 および希釈剤としてＣＬへの抗体の結合に必要な血漿因子を含んでいた可能性も 考えられるウシ血清を使用した。これを試験するため、ウシ血清を、希釈剤とし てゼラチン、ブロッキング剤としてミルク粉末／ゼラチンに置換した。

ａＣＬ抗体含有イオン交換画分またはアフィニティー精製ａＣＬ抗体をこの改良 ＣＬ免疫測定法で試験したところ、結合は全く起こらなかった。ｌ：５０希釈で はａＣＬ抗体陽性血漿は標準ＣＬ−ＥＬ　ＩＳＡの場合と同じ結合を示し、正常 血漿は陰性であった。イオン交換画分またはアフィニティー精製プレバレージョ ンにおける抗体の結合は、正常血漿を１＝５０希釈で添加した場合には認められ た。同じ効果が、これらの画分にウシ血清を添加した場合にもみられた（図１） 。すなわち、コファクターがウシ血清によって与えられているので、精製ａＣＬ 画分は標準ＣＬ−ＥＬ　Ｉ　ＳＡで結合を示すことになる。

この改良ＣＬ−ＥＬ　Ｉ　ＳＡは、アフィニティー精製ａＣＬ抗体と未知量のコ ファクターを含有する両分の混合物を含むサンプルを試験することによって、正 常血漿に由来する百分中のコファクター活性を検出する便利な方法を提供する。

コファクターが存在しないと、アフィニティー精製ａＣＬ抗体は結合せず、結合 があれば試験画分中のコファクター活性の証明になった。以下に記載するように 、コファクター活性を正常血漿から精製し、この両分をアフィニティー精製ａＣ Ｌ抗体またはａＣＬ抗体含有イオン交換画分に添加すると改良ＣＬ−ＥＬ　ｒ　 ＳＡにおいてこれらの抗体の結合を生じた（図１）。

アフィニティークロマトグラフィーシステムにおいて、血漿のイオン交換に由来 する両分に含まれるａＣＬ抗体は、血漿の存在下とは異なり、固定化ＣＬに結合 しなかったが、イオン交換画分に正常血漿を加えたところ結合が起こった。これ は、血漿コファクターがａＣＬ抗体−ＣＬ抗体相互作用に関与することの最初の 示唆であり、これは、このコファクター活性を単一の血漿蛋白質、β−２０ＰＩ に単離することによって確認された（表１）。

この要求が証明されたことから、これらのイオン交換画分が何故、標準ＣＬ−Ｅ Ｌ　ＩＳＡでＣＬを結合したかが問題となった。一つの説明は、免疫測定法に使 用したウシ血清希釈剤におけるコファクターまたは類似分子の存在である。これ は、ＣＬ−ＥＬ　ＩＳＡを、ウシ血清を省いて、希釈剤としてゼラチンを用いて 改変することによって確認された。このアッセイでは、ａＣＬ抗体含有イオン交 換画分およびアフィニティー精製ａＣＬ抗体は正常血漿またはウシ血清を加えな いとＣＬを結合しなかった（図１）。この系でも、コファクター活性はβ−２０ ＰＩに単離された。これは、連続的に検討された４例の患者からの１１の別個の ａＣＬ抗体含有イオン交換画分および３種のアフィニティー精製ａＣＬ抗体プレ バレージョン（２つはＩｇＧ、１つは１ｇＭ）における所見と一致した（データ は示していない）。

例４ 正常血漿におけるコファクターの精製と同定正常血漿をＣＬアフィニティーカラ ムを用いてクロマトグラフィーに付し、各画分について改良ＣＬ−ＥＬ　ｆＳＡ を用いて上述のようにコファクター活性を試験した。

コファクター活性は溶出蛋白質中に見出され、これは、。

この因子がａＣＬ抗体の非存在下でも陰イオン性リン脂質に結合することを示し ている。これらの画分を濃縮し、ＩＭ　ＮａＣ１緩衝液中５ｕｐｅｒｏｓｅ　ｌ 　２ゲル濾過カラムによるクロマトグラフィーに付した。コファクター活性は、 このカラムでは見掛けの分子量６７ｋＤａに相当するＫａｖＯ，３５０のピーク に認められた（図２）。このピークを含む両分を集め、イオン交換開始緩衝液に 対して透析し、Ｍｏｎｏ−Ｓカラムによるクロマトグラフィーに付した。コファ クター活性は、約０．５Ｍ　ＮａＣ１で溶出する遅いピークに見出された（図３ ）。

イオン交換カラムからの最終プレバレージョンは、５ＤＳ−ＰＡＧＥ上、還元条 件下でも非還元条件下でも見掛けの分子量５０ｋＤａの単一のバンドを示し、高 度に精製されていることがわかった（図４）。このバンドは、血漿含有ａＣＬ抗 体をＣＬまたはＰＳ−アフィニティーカラムによるクロマトグラフィーに付した 場合に、それらのカラム溶出液中に認められたバンドに相当した（図４にも示し である）。コファクター〇Ｎ末端アミノ酸配列を図５に示す。現時点での公開さ れたデーターベースのコンピューター検索により、この配列はアポリボ蛋白質Ｈ としても知られている血漿蛋白質、β−２−グリコプロティン−■のアミノ酸末 端配列と一致することがわかる。この配列にホモロジーを示す蛋白質は、Ｃａｎ ｆ　１ｅｌｄ特表平４−５０６４１５　（１ｏ） ＆　Ｋ１５ｉｅｌ（Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、、７　０　：　１　２　６　 ０　−　１　２　７２．１９８２）によって精製され、活性化プロティンＣ結合 蛋白質と呼ばれ、その後β−２０Ｐ　Ｉと同一であることが報告された血漿蛋白 質以外になかった。

ＩｇＧ−ａＣＬ抗体含存血漿をＣＬまたはＰＳ−アフィニティーカラムによるク ロマトグラフィーに付した場合、２つの大きな蛋白質バンドが溶出する。これら の一つはＩｇＧで、他はβ−２０ＰＩである（図４）。β−２０ＰＩはＣＬアフ ィニティーカラムを用いて正常血漿から精製されたことから、β−２ＧＰＩはａ ＣＬ抗体の存在下にも非存在下にも陰イオン性リン脂質カラムに結合することは 明らかである。しかしながら、これらの抗体はβ−２ＧＰＩの非存在下にはＣＬ に結合しない。精製β−２０Ｐ　Ｉはヘパリン−５ｅｐｈａｒｏｓｅカラムに結 合し、ａＣＬは結合しなかったが、ａＣＬ抗体は結合β−２０ＰＩの存在下でも このカラムに結合しなかった。すなわち、ａＣＬ抗体は陰イオン性リン脂質に結 合したβ−２０ＰＩは認識するが、ヘパリンに結合したβ−２ＧＰＩは認識しな い。これは、リン脂質およびグリコプロティンはいずれもこれらの抗体が標的と するエピトープを構成することを示している。これらの結果は、ａＣＬ抗体が陰 イオン性リン脂質に結合したβ−２０ＰＩからなる複合体またはβ−２ＧＰＩの リン脂質との相互作用の間に形成された潜在エピトープを標的とするが、リン脂 質の存在と無関係なβ−２０ＰＩは標的としないことを示唆している。

アフィニティー精製ａＣＬ抗体は、β−２０ＰＩが存在しないと改良ＣＬ−ＥＬ 　ＩＳＡにおいてＣＬを結合しない（図１）ので、上述のように精製した糖蛋白 質の希釈系列の存在下に、この抗体の希釈系列の結合を調べた。

結果は図６ａに示す。８μｇ／ｍｌのβ−２ＧＰＩの存在下に、ａＣＬ抗体の希 釈系列は標準ＣＬ−ＥＬ　ＩＳＡでみられる典型的な結合曲線を示す。β−２０ ＰＩの希釈の増大とともに、抗体のすべての希釈で、結合は劇的に低下して、グ リコプロティンがｌμｇ／ｍｌに低下すると実質的に結合は認められなかった。

図６ａに示した破線は両因子の希釈系列を説明するものである。ａＣＬ抗体陽性 血漿の希釈は図６ｂに示す。実線は、ＡＢＳの存在がすべての抗体希釈で適当な コファクターを保証する場合の、標準ＣＬ−ＥＬ　ＩＳＡにおいて見慣れた結合 曲線を示している。破線は、ａＣＬ抗体陽性血漿を改良ＣＬ−ＥＬ　Ｉ　ＳＡに おいて希釈した場合の結合曲線を示している。血漿がβ−２ＧＰｌレベル１μｇ ／ｍｌに相当する１：２００に希釈されると、抗体の結合は事実上認められない 。

改良ＣＬ−ＥＬ　ＩＳＡは、コファクター効果をさらに詳細に調べるのに便利な 系であることがわかった。ＣＬへのａＣＬ抗体の結合に対するβ−２０Ｐ　Ｉの 作用は、急峻な希釈効果をもつ用量依存性を示し、β−２０Ｐ　１の存在力＜１ Ｍｇ／ｍｌまたはそれ未満になった場合、抗体の結合はいずれの希釈でも事実上 認められないことがわかった（図６ａ）。β−２ＧＰＩの正常血漿レベルが２０ ０μｇ／ｍｌであるから、この数字は改良ＣＬ−ＥＬ　ＩＳＡにおけるａＣＬ抗 体陽性血漿の希釈結果に正確に一致し、この場合、かなりの量のａＣＬ抗体が存 在していても、結合は急速に低下し、１：２００の希釈では、すなわちβ−２０ ＰＩレベルｌμｇ／ａ＋１では認められなくなった（図６ｂ）。

アフィニティー精製ａＣＬ抗体は、ヘパリン−５ｅｐｈａｒｏｓｅアフイニテイ ーカラムには結合せず、適用したａＣＬ抗体の約６０％が通過画分中に回収され たが、抗体はＩＭ　ＮａＣ１で溶出されなかった。精製β−２０ＰＩは、ヘパリ ン−５ｅｐｈａｒｏｓｅカラムに適用した場合、それに結合した。アフィニティ ー精製ａＣＬ抗体と精製β−２０ＰＩの混合物をヘパリン−５ｅｐｈａｒｏｓｅ カラムに注入すると、通過液はａＣＬを含むがβ−２０Ｐ　Ｉは含まず、溶出さ れた蛋白質にはβ−２０ＰＩを含むが、ａＣＬは含まれなかった。ａＣＬ抗体含 有血漿をヘパリン−５ｅｐｈａｒｏｓｅカラムに注入すると、通過液は適用血漿 に相当する量のａＣＬ抗体を含み、溶出された蛋白質にはβ−２０ＰＩを含むが 、ａＣＬ抗体は含まれなかった。

表１：ａｃＬ抗体含有イオン交換画分のＣＬアフィニティーカラムによるクロマ トグラフィー ａＣＬ抗体の量 ［、Ｅ、　＃　１０５単位　１０１単位（９６％）１１、　Ｅ、　Ｉｔ十正常Ｐ １″　１２０単位　８０単位（６６％）ｔ、Ｅ、＃＋吸収Ｐｉ　１２０単位　９ ０単位（７５％）ｔ、Ｅ、＄＋β−２ＧＰ［’　１２２単位　３２単位（２６％ ）［、Ｅ、＃：イオン交換画分、Ｐ１．血漿；吸収、ＡＩＯＨｇ吸収１総適用ａ ＣＬ抗体の通過液中に回収された％”　１０ｍ１の１．　Ｅ、　＃に１ｍｌの血 漿を添加”　１０ｍ１の１．Ｅ、＃に４００ｇｇのβ−２ＧＰ１（血漿２ｍｌに 相当）を添加 ａＰＬ抗体がβ−２ＧＰ　Ｉを包含する抗原を標的とするとの所見は、これらの 自己抗体の理解に新しい道を開くものである。それは、構造が様々に変化するに もかかわらず、すべての陰イオン性リン脂質に等しく　ａＰＬ抗体が結合するこ との説明を提供する。さらに、β−２０ＰＩは、凝固の内的経路およびＡＤＰ依 存性血小板凝集を阻害すると考えられるので、これらの所見は、ａＰＬ抗体がｉ ｎ　ｖｉｖｏにおいてβ−２０ＰＩの機能に干渉し、前血栓性素因を与える可能 性も考えさせる。さらにまた、β−２０Ｐ１が陰イオン性巨大分子を結合するな らば、これには感染微生物に由来する巨大分子も包含されることが考えられる。

β−２０ＰＩと複合体を形成した異種抗原であれば、ａＰＬ抗体の産生の免疫原 性刺激となることが考えられ、これは多くの感染疾患でよく認められていること である。

血液は静脈穿刺で、最終容量の１／１０の０．１Ｍクエン酸三ナトリウムを含む チューブに採取し、２，３回倒立させて、２．５００ｇで１５分間遠心分離した 。血漿を吸引し、ついでＭｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｍｉｌｌｅｘ　ＧＳ　２２　μＭ フィルターで濾過して血小板屑を除去し、−２０℃で保存した。

Ａ型肝炎、結核、感染性単球症、マラリャおよび梅毒患者からの血漿または血清 は他の研究所から入手した。

標準抗カルシオリビン抗体アッセイ 以前に報告１され、ＭｃＮｅｌｌら２によって改良された酵素連結免疫測定法を 用い、サンプルのａＣＬ抗体を検定する。サンプルはｌ：５０希釈で検定した。

第二の抗体としては、ヤギ抗−ヒトＩｇＧ、ＩｇＭもしくはＩｇＡ特異的および ／または多価のアルカリホスファターゼ接合免疫グロブリン（Ｓｉｇｍａ）を使 用した。多価またはＩｇＡ第二抗体を使用する場合は、各プレートに既知陽性血 漿の希釈系列を包含させた。試験サンプルのａＣＬレベルは、ａＣＬ単位で表し た。１００単位は、■＝５０希釈における陽性サンプルの４０５０ｆｆｌの吸光 度である。ｒｇＧまたはＩｇＭ特異的第二抗体を使用する場合は、各プレートｉ ：Ｒａｙｎｅ　［ｎ５ｔｉｔｕｔｅ標準（Ｓｔ、　Ｔｈｏｍａｓ病院、Ｌｏｎｄ ｏｎ、より提供される）に対して検量した陽性サンプルの希釈液を包含させた。

ａＣＬレベルは対数一対数プロットを用い対照血清から読取り、それぞれＧＰＬ またはＭＰＬ単位（ＩｇＧリン脂質またはＩｇＭリン脂質単位。１単位はアフィ ニティー精製ａＣＬ　１μｇの活性に相当する）で表す３゜記録されたレベルが １６個の対照平均から３標準偏差以上大きい場合にａＣＬ陽性とみなした。

イオン交換クロマトグラフィー 血漿サンプル（０、５ｍｌ）を開始緩衝液（０，０５Ｍ酢酸塩　０．０５Ｍ　Ｎ ａＣ１ｐＨ４，８）に対して透析し、５０００ｇで５分間遠心分離し、ついでＰ ｈａｒｍａｃｔａ　ＦＰＬＣシステムを用い、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｍｏｎｏ− Ｓ　ＨＲ５／　５陽イオン交換カラムに０　、　５　ｍｌ／　ｍａｉｎの流速で アプライした。緩衝液、流速および勾配条件は、以前に記載された通りである１ ８　。吸収は２８０ｎｌでモニタリングし、１ｍｌの画分を集めた。

各百分について上述の標準ａＣＬ−ＥＬＩＳＡを用い、１１５希釈でａＣＬ抗体 を検定した。

改良ＣＬ−ＥＬ　ＩＳＡ 上述の標準ＣＬ−ＥＬ　ＩＳＡをオーストラリア特許出願ＰＪ９５４９号に記載 のように改良した。この記載は参考として本明細書に導入する。略述すれば、ウ ェルを１０％成熟ウシ血清（ＡＢＳ）／ＰＢＳに代えて０．３％ゼラチン／１％ ミルク粉末（Ｄｉｐｌｏｍａ　）　／リン酸緩衝食塩１溶液（０，ＯＩＭ　リン 酸塩０．１５Ｍ食塩ｐＨ７゜３）（ＰＢＳ）でブロックした。サンプルを０，３ ％ゼラチン／ＰＢＳに希釈し、第二抗体は、標準ＣＬ−ＥＬＩＳＡの全工程の希 釈剤であるｌＯ％ＡＢＳ／ＰＢＳに、代えて、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ ）／ＰＢＳに希釈した。

改良ＣＬ−ＥＬ　ＩＳＡにおける精製β−２ＧＰＩのａＣＬ抗体の結合に対する 影響 標準ＣＬ−ＥＬ　Ｉ　ＳＡにおいて陽性であったイオン交換画分を精製β−２０ ＰＩ（８μｇ／ｍｌ）の存在下および非存在下に、改良ＣＬ−ＥＬ　ＩＳＡシス テムで検定した。精製β−２ＧＰｒはＰＪ９５４９号に記述のようにして得た。

β−２０Ｐ　Ｉのラジオイムノアッセイ本発明者らの２名ほか４によって開発さ れたｌ！Ｉｌ−β−２ＧＰＩおよびβ−２ＧＰＩに対するポリクローナルウサギ 抗体を使用する固相ＲＩＡを用いて、イオン交換カラムからの画分を検定した。

各サンプル中のβ−２０ＰＩのレベルは、４パラメーター算定曲線適合プログラ ム藝を用いて読み取った。このＲＩＡの感度は７５ｎｇ血漿のａＣＬ−ＥＬ　Ｉ ＳＡ 研究対象とした患者中、２３例は感染症（梅毒６例、マラリア９例、Ａ型肝炎２ 例、結核２例、感染性単球症４例）、１２例は自己免疫疾患〔原発性抗リン脂質 症候群（ＰＡＰＳ）７例および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）５例〕の診断 であった。表２および３は対象患者の臨床特性およびａＣＬ状態の一覧である。

数値の範囲およびアイソタイプの分布には変動がある。感染症の患者は、Ｉ　ｇ 　Ｇ　’（梅毒）、ＩｇＭ（感染性単球症および結核）ならびにＩｇＧ、Ｍおよ びＡ（マラリアおよびＡ型肝炎）に対してとくに強い陽性をしめしたが、一方、 ＰＡＰＳまたはＳＬＥと診断された患者では３種のすべてのアイソタイプについ てより一様な傾向を示した。

血漿のイオン交換クロマトグラフィー 前述のように・、ａＣＬ抗体を含有する血漿は陽イオン交換クロマトグラフィー によって亜群に分離することができる。患者血漿の典型的なイオン交換像を例示 した図９から明らかなように、β−２０ＰＩは、早い画分に溶出したａＣＬ活性 とは離れて、単一ピーク（画分１７および１８）として溶出した。

同じ操作を用いたイオン交換クロマトグラフィーでａＣＬ活性の回収は７０％を 越えるとの以前の報告・がある。

精製β−２０Ｐ　Ｔの存在下および非存在下、改良ＣＬ−ＥＬ　ＩＳＡにおける ａＣＬ抗体含有イオン交換画分の肋 改良ＣＬ−ＥＬ　ＩＳＡシステムにおけるイオン交換画分からのａＣＬ、抗体の 結合の結果を図１０（Ａ−Ｂ）および図１１（Ａ−Ｄ）にまとめる。

感染に関連したａＣＬを有する患者 ａＣＬ抗体が感染に関連している患者からのイオン交換画分は、β−２０Ｐ１を 添加しない改良ＣＬ−ＥＬ　ＩＳＡシステムにおいて、例外なくＣＬを結合した 。β−２０Ｐ　Ｉの添加は’ａＣＬ結合の中程度の阻害を生じた。

ａＣＬのＣＬへの結合は、平均、ｒｇＧで３４％、ＩｇＭで３３％、ＩｇＡで４ ６％低下した。

自己免疫に関連したａＣＬを有する患者自己免疫疾患を有する患者からのａＣＬ 抗体含有画分を改良１ｇＧ　ＣＬ−ＥＬＩＳＡで試験したところ、８例中５例（ ＄２４．２６．２７．２８および３０）ではβ−２０ＰＩを添加しないと結合を 生じなかった（図１ＩＡ）。β−２０ＰＩを添加すると劇的な結合の上昇が起こ った〔β−２０ＰＩ非添加の場合の４５０ｎａ＋における平均吸光度±ＳＤ　（ ｎ＝５）：　０．０７２±０．０５８；β−２ＧＰＩ添加の場合：１．１８６± ０．４３０）（図１１Ｂ）。残りの３例の患者中２例のサンプル（＃２９および ３１）は、β−２０ＰＩを添加しないでも存意な結合を示し、β−２０ＰＩを添 加した場合結合のわずかな上昇を示した。１例の患者サンプルな結合を示し、β −２０Ｐ　Ｉを添加した場合には結合の阻害を生じた（図１１ＡおよびＩＩＣ） 。

一般的に、自己免疫群はＩｇＭ−ａＣＬに対しては弱い陽性を示すのみで、わず かに４例のサンプルが改良ａＣＬ−ＥＬ　Ｉ　ＳＡで試験できる十分なＩｇＭ− ａＣＬ活性をもつイオン交換画分を与えたにすぎなかった。１例の患者サンプル １２９）ではβ−２０Ｐ　Ｉを添加した場合にのみＣＬを結合した。３例の患者 サンプルはβ−２０ＰＩ非添加である程度のＣＬへの結合を示したが、β−２０ ＰＩを添加すると２例の患者サンプル（＃２５および２７）では結合のわずかな 上昇を、１例の患者サンプル（＃２４）では緩和な阻害を認めた（データは示し ていない）。

ＩｇＡ改良ＣＬ−ＥＬＩＳＡでは、４例のイオン交換精製ａＣＬｉｉｆ分（患者 ＃２４，２５，２８および２７）が、β−２０ＰＩ非添加では殆どまたは全く結 合を示さず、β−２０ＰＩ添加で有意な結合の上昇を示した〔β−２（１；ＰＩ 非添加の場合の４５０ｎｍにおける平均吸光度±ＳＤ：０．１０±Ｏ，Ｏａ：β −２ＧＰＩ添加の場合：０．５０±０．２５３゜４例の患者ではβ−２０ＰＩの 非添加で中程度の結合を示した。これらの患者中、２例（＃２９および３０）は β−２０ＰＩを添加すると結合の上昇を、１例（＃２８）ではわずかな変化を、 １例（＃３１）では結合の中程度の阻害を示した（図１１ＢおよびＤ）。

自己免疫疾患を存する患者４例からのａＣＬ陽性イオン交換画分が多価二次抗体 を用いるＣＬ−ＥＬ　ＩＳＡで以前に試験されている。４例全例（＃３２．　３ ３．　３４および３５）がβ−２０ＰＩ非添加では結合を生じなかったが、β− ２０ＰＩを添加すると劇的な結合の上昇が起こった〔β−２０ＰＩ非添加の場合 の平均吸光度±ＳＤ：０．０５＋０．０５；β−２ＧＰ　Ｉ添加の場合：ｏ。

４０＋０．０９）（図１１ＡおよびＩＩＣ）。

結果の考察 例７では、自己免疫疾患およびさまざまの感染症を有する患者からのイオン交換 精製ａＣＬ抗体について検討した。感染症患者からのａＣＬ抗体は例外なくβ− ２０ＰＩ（７）添加を必要とせず、改良ＣＬ−ＥＬ　ＩＳＡでＣＬを結合した。

感染症患者からの試験サンプルはすべて、β−２０Ｐ１（Ｄ添加により、改良Ｃ Ｌ−ＥＬ　ｌ５ＡＩ’（７）ａＣＬ結合に中程度の低下を生じた（図１１Ａおよ び図１１Ｂ）。

これに反して、自己免疫疾患患者１２例中ＩＩ例からのイオン交換精製ａＣＬ抗 体は（少なくとも１種のアイソタイプにおいて）ＣＬの結合にβ−２０ＰＩの存 在を要求した。１例の自己免疫疾患患者では、ＩｇＧ−ａＣＬ抗体はＣＬへの結 合にβ−２０ＰＩの存在を要求しなかったが、同じ患者で、ＩｇＡ−ａＣＬはβ −２ＧＰＩを必要とした。この、β−２０ＰＩの非存在下におけるリン脂質結合 特性の明らかな差異は、個々の患者にａＣＬ抗体の亜型があることを明瞭に示唆 している。感染に関連したａＣＬとＳＬＥ／ＰＡＰＳ関連ａＣＬの間に、ＣＬへ の結合に際しての要求に差があるのみでなく、後者の群内では異なる結合特異性 を有する異なるアイソタイプをもつ亜集団も存在するものと考えられる。

改良ＣＬ−ＥＬ　Ｉ　ＳＡは、精製ａＣＬ抗体のＣＬへの結合のβ−２０Ｐ　Ｉ 要求性を調べるための便利なシステムであることがわかった。改良ＣＬ−ＥＬＩ ＳＡにおいては、コーティングしてないウェルに対するａＣＬ抗体の結合は殆ど または全く認められなかった（結果は示していない）。ａＣＬのＣＬへの結合に 対するβ−２０ＰＩの影響は用量依存性で、β−２ＧＰＩの量力’ｌμｇ／ｍｌ またはそれ未満の場合には、ａＣＬ抗体の結合はいずれの希釈においても認めら れなかった。β−２ＧＰＩのＲＩＡは７５ｎｇ／ｍｌまでの感度を示し４、した がって、イオン交換精製ａＣＬ抗体画分はＣＬへの結合を支持するだけの濃度の β−２０ＰＩを含んでいない。

β−２０Ｐ　Ｉを結合するａＣＬがＳＬＥ／ＰＡＰＳ群にしか見出されなかった という事実は、臨床的に重要な意味がある。血栓塞栓合併症が記録されているの は、この患者群である。大部分の報告は、ａＣＬが梅毒または他の感染源に関連 する患者にはこれらの合併症がみられないことを示している。７文献の広範囲な 再調査から１、本発明者らは、ａＣＬをもっＳＬＥ患者における血栓合併症の発 症率は４２％であることを見出した。非ＳＬＥのａＣＬ陽性患者が包含されると 、発症率は３１％に低下する。これは、特異的非血栓性サブクラス、すなわち感 染型のａＣＬで血栓症の危険の少ない群の包含によるものである。さらに、本研 究で示されたように、感染型のａＣＬ抗体が自己免疫疾患患者に存在することも ある。

抗体がβ−２０Ｐ　Ｉ／リン脂質複合体またはβ−２０ＰＩ単独のいずれを標的 とするかで凝血障害の予測が可能となる機構については明らかにされていない。

しかしながら、β−２ＧＰＩはＡＤＰ誘発血小板凝集１および活性化血小板のプ ロトロンビナーゼ活性ｌ＠の両者を阻害することが以前に報告されている。

結論として、本発明の一方法はβ−２０ＰＩ（単独もしくはリン脂質複合体とし て）を結合するａＣＬ抗体が自己免疫疾患群の患者にのみ見出されることを明ら かにした。感染に関連するａＣＬ抗体は固相ＥＬ　ＩＳＡにおけるＣＬの結合に β−２０Ｐ　Ｉを必要としなかった。これは、凝血障害が自己免疫疾患関連ａＣ Ｌにおいて共通に報告されていて、感染に関連するａＣＬには認められていない ことから、臨床的に重要である。

自己免疫血清によるβ−２ＧＰＩの増強図■２に、自己免疫血清によるβ−２０ Ｐ　Ｉの増強の結果を示す。血漿は自己免疫疾患の患者から得られ、１：５０〜 １：６４００に希釈された。抗リン脂質抗体は、カルシオリピンＥＬＩＳＡ法を 用い、β−２０Ｐ　１は非添加および濃度を３．１２５μｇ／ｍｌから５０μｇ ／ｍｌまで上昇させて測定された。この場合、ＥＬＩＳＡ法は、プレートのブロ ックに１０％成熟ウシ血清を添加し、サンプルはｌＯ％成熟ウシつ清ＰＢＳに希 釈した標準的なものであった。図１２から、ウシ血清の存在下でさえも、血漿希 釈１：４００までは増強の明白なことが明らかである。

工業的応用性 本発明の第一および第二の実施態様の方法は、それぞれ、サンプル中に抗リン脂 質抗体または陰性に荷電したリン脂質が存在するか否かを検出するのにとくに有 用である。本発明の第五および第六の実施態様の方法は、それぞれ、サンプル中 に存在する抗リン膠質抗体が、自己免疫疾患に関する抗体であるかもしくは感染 症に関する抗体であるかを決定するために、またはサンプル中に自己免疫疾患に 関する抗リン脂質抗体および感染症に関する抗リン脂質抗体が存在するか否かを 決定するために有用である。

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Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｌａｂ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９８５；１６：ｌ−６゜８、ＭｃＮ ｅｉｌ　ＨＰ、Ｃｈｅｓｔｅｒｍａｎ　ＣＮ、Ｋｒ１ｌｉｓ　ＳＡ、Ｉｍｍｕｎ ｏｌｏｇｙａｎｄ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ　ｏｆ　ａｎｔｉ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａｄｖ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１ ９９０；４９：（ｉｎ　ｐｒｅｓｓ）−９、Ｎｉｍｐｆ　Ｊ、Ｗｕｒｍ　Ｈ，Ｋ ｏｓｔｎｅｒ　ＧＭ、Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ　ｏｆβ、−Ｇｌｙｃｏｐｒｏ ｔｅｉｎ−１ｗｉｔｈ　ｈｕｍａｎ　ｂｌｏｏｄ　ｐｌａｔｅｌｅｔｓ：Ｉｎｆ ｌｕｅｎｃｅ　ｕｐｏｎ　ｔｈｅ　ＡＤＰ−ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｇｇｒｅｇａｔ ｉｏｎ。

Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、１９８７；６３：　１０９−１１４゜１０、 Ｎｉｍｐｆ　Ｊ、Ｂｅｖｅｒｓ　ＥＭ、Ｂｏｍａｏｓ　ＰＨ１，ｅｔ　ａｌ。

Ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｐｌａ ｔｅｌｅｔｓ　ｉｓ表２および３は、研究対象患者の臨床特性およびａＣＬ状態 の一覧である。

表２：感染症を有する患者からの血漿サンプルの標準ＣＬ−ＥＬ　ＩＳＡでの吸 光度（４０５ｎｍ）患者＃　診断　１ｇＧ　ＩｇＭ　［ｇＡ注：ＮＤ＝測定せず 一＝陰性 ＋＝陽性〔〉１６対照の平均＋３ＳＤ、　ＩｇＧ＝０．２１．１ｇＭ＝０．２９ ．ＩｇＡ＝０．１６　（吸光度４０５ｎｍ）　）表３：自己免疫疾患を有する患 者からの血漿サンプルの標準ＣＬ−ＥＬ　Ｔ　ＳＡでの吸光度（４０５ｎｍ）Ｃ Ｌ 患者＃　診断　血栓症　１ｇＧ　ＩｇＭ　１ｇＡ２４　ＳＬＢ　Ｙ　＋　十　＋ ２５　ＳＬＥ　Ｎ　＋　＋　＋ ２６　ＳＬＢ　Ｙ　＋　＋　＋ ２７　ＰＡＰＳ　Ｙ　＋　＋　＋ ２８　ＰＡＰＳ　Ｙ　＋　＋　＋ ２９　ＰＡＰＳ　Ｙ　＋　＋　＋ ３０　ＰＡＰＳ　Ｙ　十　＋　＋ ３１　ＰＡＰＳ　Ｙ　＋　＋　＋ 多価 ３２　ＰＡＰＳ　Ｙ　＋ ３３　ＰＡＰＳ　Ｙ　＋ ３４　ＳＬＥ　Ｎ　＋ ３５　ＳＬＥ　Ｎ　＋ 注：　ＰＡＰＳ＝原発性抗リン脂質す候群ＳＬＥ　＝全身性エリテマトーデス Ｙ＝あり Ｎ＝なし 吸光度４０５ｎｍ 分画番号 ４　Ｂ　１２　１６　２０　２４　２８分画番号 吸光度２８０ｎｍ ｃＣＬ活性（吸光度４０５ｎｍ） ｃｎｏ　δ Ｂ２−ＧＰＩ濃度（ｕｇ／ｍＤ 患者番号 図１０ ａｃＬ活性（吸光度４０５ｎｍ）　ａｃＬ活性（吸光度４０５ｎｍ）□□□」 添加ＢＥＴＡ２−ＧＰＩ 添加ＢＥＴＡ２−ＧＰＩ濃度　（ｕｇ／ｍｕ図　１２ ！−−見一二側 サンプル中に抗リン脂質抗体が存在するか否かを測定する方法が開示される。サ ンプルを、陰性に荷電したリン脂質、およびβ−２−グリコプロティン−Ｉまた はその同族体もしくは類縁体と接触させ、これらの接触したリン脂質およびβ− ２−グリコプロティン−■に抗リン脂質抗体が結合したか否かを測定することか らなる方法においては、リン脂質およびβ−２−グリコプロティン−■への抗リ ン脂質抗体の結合を検出することにより、サンプル中に抗リン脂質抗体が存在す ることが示される。

また、陰性に荷電したリン脂質がサンプル中に存在するか否かを測定する方法、 サンプル中に抗リン脂質抗体が存在するか否かを測定するアッセイに用いるキッ ト、陰性に荷電したリン脂質がサンプル中に存在するか否かを測定するアッセイ に用いるキット、サンプル中に存在する抗リン脂質抗体は自己免疫疾患に関する 抗体あるいは抗リン脂質抗体がサンプル中に存在するか否かを測定する方法も開 示される。

手続補正書

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．サンプルを、陰性に荷電したリン脂質、およびβ−２−グリコプロティン− Ｉまたはその同族体もしくは類縁体と接触させ、接触したリン脂質およびβ−２ −グリコプロティン−Ｉに抗リン脂質抗体が結合したかどうかを測定することか らなり、この場合、リン脂質およびβ−２−グリコプロティン−Ｉへの抗リン脂 質抗体の結合の検出はサンプル中に抗リン脂質抗体が仔在することを示す、サン プル中に抗リン脂質抗体（本明細書における定義による）が存在するか否かを測 定する方法２．サンプルを、リン脂質に対する抗リン脂質抗体（本明細書におけ る定義による）、およびβ−２−グリコプロティン−Ｉまたはその同族体もしく は類縁体と接触させ、接触した抗体およびβ−２−グリコプロティン−Ｉに陰性 に荷電したリン脂質が結合したかどうかを測定することからなり、この場合、抗 体およびβ−２−グリコプロティン−Ｉへのリン脂質の結合の検出はサンプル中 に陰性に荷電したリン脂質が仔在することを示す、サンプル中に陰性に荷電した リン脂質が存在するか否かを測定する方法 ３．陰性に荷電したリン脂質は、カルジオリピン、ホスファチジルイノシトール 、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロホスフェートおよびホスファ チジン酸からなる群より選ばれる請求項１記載の方法４．陰性に荷電したリン脂 質は、アフィニティーカラム充填材料、マイクロタイタープレート、ディップス ティック、ゲル、マトリックス、リボソームおよびミセルからなる群より選ばれ る固相によって固定化される請求項１または２記載の方法 ５．β−２−グリコプロティン−Ｉは実質的に純粋な形である請求項１または２ 記載の方法 ６．β−２−グリコプロティン−Ｉは、アフィニティーカラム充填材料、マイク ロタイタープレート、ディップスティック、ゲル、マトリックス、リボソームお よびミセルからなる群より選ばれる固相によって固定化される請求項１または２ 記載の方法 ７．ａ）β−２−グリコプロティン−Ｉまたはその同族休もしくは類縁体、およ びｂ）陰性に荷電したリン脂質からなり、抗リン脂質抗体（本明細書における定 義による）がザンプル中に存在するか否かを測定する検定法に用いられるキット ８．さらに、ｃ）サンプル中存在する抗リン脂質抗体のβ−２−グリコプロティ ン−Ｉおよび陰性に荷電したリン脂質への結合を検出するための手段を包含する 請求項７記載のキット ９．ａ）β−２−グリコプロティン−Ｉまたはその同族体もしくは類縁体、およ びｂ）抗リン脂質抗体（本明細書における定義による）からなり、サンプル中に 陰性に荷電したリン脂質が存在するか否かを測定する検定法に用いられるキット １０．さらに、ｃ）サンプル中存在する陰性に荷電したリン脂質への抗リン脂質 抗体およびβ−２−グリコプロティン−Ｉの結合を検出するための手段を包含す る請求項９記載のキット １１．陰性に荷電したリン脂質は、カルジオリピン、ホスファチジルイノシトー ル、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロホスフェートおよびホスフ ァチジン酸からなる群より選ばれる請求項７または８記載のキット １２．陰性に荷電したリン脂質は、アフィニティーカラム充填材料、マイクロタ イタープレート、ディップスティック、ゲル、マトリックス、リボソームおよび ミセルからなる群より選ばれる固相によって固定化される請求項７または８記載 のキット １３．β−２−グリコプロティン−Ｉは実質的に純粋な形である請求項７〜１０ のいずれかに記載のキット１４．β−２−グリコプロティン−Ｉは、アフィニテ ィーカラム充填材料、マイクロタイタープレート、ディップスティック、ゲル、 マトリックス、リボソームおよびミセルからなる群より選ばれる固相によって固 定化される請求項７〜１０のいずれかに記載のキット１５．（ｉ）サンプルの一 部をβ−２−グリコプロティン−Ｉまたはその同族体もしくは類縁体と接触させ ることなく陰性に荷電したリン脂質と接触させ、サンプル中の抗リン脂質抗体の 第一の量を測定し、（ｉｉ）サンプルの別の一部を陰性に荷電したリン脂質およ びβ−２−グリコプロティン−Ｉまたはその同族体もしくは類縁体と接触させて 、サンプル中の抗リン脂質抗体の第二の量を測定し、（ｉｉｉ）第一の量と第二 の量を比較し、第一の量が第二の量よりも実質的に少ない場合は測定されたサン プル中の抗リン脂質抗体は自己免疫疾患に関するものであり、第一の量が第二の 量よりも実質的に多い場合は測定されたサンプル中の抗リン脂質抗体は感染症に 関するものであることより、測定されたサンプル中の抗リン脂質抗体が自己免疫 疾患に関するものであるか感染症に関するものであるかを測定する方法 １６．（ｉ）サンプルの一部をβ−２−グリコプロティン−Ｉまたはその同族体 もしくは類縁体と接触させることなく陰性に荷電したリン脂質と接触させ、サン プル中の抗リン脂質抗体の第一の量を測定し、（ｉｉ）サンプルの別の一部を陰 性に荷電したリン脂質およびβ−２−グリコプロティン−Ｉまたはその同族体も しくは類縁体と接触させて、サンプル中の抗リン脂質抗体の第二の量を測定し、 （ｉｉｉ）第一の量と第二の量を比較し、第一の量が第二の量と実質的に等しい 場合には測定されたサンプル中の抗リン脂質抗体は自己免疫疾患および感染症に 関するものであることより、測定されたサンプル中の抗リン脂質抗体が自己免疫 疾患および感染症に関するものであるか否かを測定する方法 １７．陰性に荷電したリン脂質は、カルジオリピン、ホスファチジルイノシトー ル、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロホスフェートおよびホスフ ァチジン酸からなる群より選ばれる請求項１５記載の方法１８．陰性に荷電した リン脂質は、アフィニティーカラム充填材料、マイクロタイタープレート、ディ ップスティック、ゲル、マトリックス、リボソームおよびミセルからなる群より 選ばれる固相によって固定化される請求項１５記載の方法 １９．β−２−グリコプロティン−Ｉは実質的に純粋な形である請求項１５また は１６記載の方法２０．β−２−グリコプロティン−Ｉは、アフィニティーカラ ム充填材料、マイクロタイイタープレート、ディップスティック、ゲル、マトリ ックス、リボソームおよびミセルからなる群より選ばれる固相によって固定化さ れる請求項１５または１６記載の方法 ２１．工程（ｉｉ）において、サンプルに過剰のβ−２−グリコプロティン−Ｉ を加える請求項１５または１６記載の方法