JPH0688823A - リン脂質およびその抗体の測定方法 - Google Patents
リン脂質およびその抗体の測定方法Info
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- JPH0688823A JPH0688823A JP5102397A JP10239793A JPH0688823A JP H0688823 A JPH0688823 A JP H0688823A JP 5102397 A JP5102397 A JP 5102397A JP 10239793 A JP10239793 A JP 10239793A JP H0688823 A JPH0688823 A JP H0688823A
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- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 サンプル中に抗リン脂質抗体、ならびに陰性
に荷電したリン脂質が存在するか否かを測定する方法お
よびキットを提供する。また、サンプル中の抗リン脂質
抗体が自己免疫疾患に関する抗体なのか感染症に関する
抗体なのか、ならびに自己免疫疾患に関する抗リン脂質
抗体および感染症に関する抗リン脂質抗体がサンプル中
に存在するか否かを測定する方法を提供する。 【構成】 サンプルを、陰性に荷電したリン脂質、およ
びβ−２−グリコプロティン−Ｉまたはその同族体もし
くは類縁体と接触させ、リン脂質およびβ−２−グリコ
プロティン−Ｉへの抗リン脂質抗体の結合を検出するこ
とにより、サンプル中に抗リン脂質抗体が存在すること
が示される。
に荷電したリン脂質が存在するか否かを測定する方法お
よびキットを提供する。また、サンプル中の抗リン脂質
抗体が自己免疫疾患に関する抗体なのか感染症に関する
抗体なのか、ならびに自己免疫疾患に関する抗リン脂質
抗体および感染症に関する抗リン脂質抗体がサンプル中
に存在するか否かを測定する方法を提供する。 【構成】 サンプルを、陰性に荷電したリン脂質、およ
びβ−２−グリコプロティン−Ｉまたはその同族体もし
くは類縁体と接触させ、リン脂質およびβ−２−グリコ
プロティン−Ｉへの抗リン脂質抗体の結合を検出するこ
とにより、サンプル中に抗リン脂質抗体が存在すること
が示される。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、サンプル中に抗リン脂
質抗体が存在するか否かを測定する方法およびキット、
ならびにサンプル中に陰性に荷電したリン脂質が存在す
るか否かを測定する方法およびキットに関する。本発明
はまた、サンプル中の抗リン脂質抗体が自己免疫疾患に
関する抗体なのか感染症に関する抗体なのかを測定する
方法、ならびに自己免疫疾患に関する抗リン脂質抗体お
よび感染症に関する抗リン脂質抗体がサンプル中に存在
するか否かを測定する方法に関する。
質抗体が存在するか否かを測定する方法およびキット、
ならびにサンプル中に陰性に荷電したリン脂質が存在す
るか否かを測定する方法およびキットに関する。本発明
はまた、サンプル中の抗リン脂質抗体が自己免疫疾患に
関する抗体なのか感染症に関する抗体なのかを測定する
方法、ならびに自己免疫疾患に関する抗リン脂質抗体お
よび感染症に関する抗リン脂質抗体がサンプル中に存在
するか否かを測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】抗リン脂質（ａＰＬ）抗体は、抗原とし
て陰性に荷電したリン脂質、最も一般的にはカルジオリ
ピン（ＣＬ）を用いる固相免疫測定法で、血漿または血
清中に検出できる自己抗体である。血漿（または血清）
からリン脂質アフィニティーおよび陽イオン交換クロマ
トグラフィーを連続的に用いてａＰＬ抗体を精製し、＞
９５％の純度の特異的免疫グロブリンを得る、簡単な２
工程操作が報告されている。これらの抗体は、ＣＬ−Ｅ
ＬＩＳＡで典型的な結合を示すが、リン脂質依存性凝血
試験においてループス抗凝固(LA)活性は示さない。最
近、イオン交換クロマトグラフィーによって、血漿を抗
カルジオリピン（ａＣＬ）抗体またはＬＡ活性をもつ抗
体のいずれかを含有する分画に分離できることも明らか
にされた。これは、ａＣＬ抗体とＬＡ抗体が別個のａＰ
Ｌ抗体亜群を与え、異なる抗原に対し反応することを強
く示唆するものである。
て陰性に荷電したリン脂質、最も一般的にはカルジオリ
ピン（ＣＬ）を用いる固相免疫測定法で、血漿または血
清中に検出できる自己抗体である。血漿（または血清）
からリン脂質アフィニティーおよび陽イオン交換クロマ
トグラフィーを連続的に用いてａＰＬ抗体を精製し、＞
９５％の純度の特異的免疫グロブリンを得る、簡単な２
工程操作が報告されている。これらの抗体は、ＣＬ−Ｅ
ＬＩＳＡで典型的な結合を示すが、リン脂質依存性凝血
試験においてループス抗凝固(LA)活性は示さない。最
近、イオン交換クロマトグラフィーによって、血漿を抗
カルジオリピン（ａＣＬ）抗体またはＬＡ活性をもつ抗
体のいずれかを含有する分画に分離できることも明らか
にされた。これは、ａＣＬ抗体とＬＡ抗体が別個のａＰ
Ｌ抗体亜群を与え、異なる抗原に対し反応することを強
く示唆するものである。
【０００３】リン脂質抗原〔たとえば、カルジオリピン
（ＣＬ）〕に結合する血漿中または血清中の抗体を検出
するための固相免疫測定法は１９８０年代の半ばに開発
され、現在ではそのまま使用できる市販キットとして多
数のバイオテクノロジー関連会社から入手可能であり、
多くの研究施設ではこれらを使用するか、その代りに独
自の自家検定法を採用している。基本的には、ＣＬをマ
イクロタイターのウエルの底にコーティングし、血漿ま
たは血清のサンプルを添加する。抗カルジオリピン、ａ
ＰＬ抗体が結合し、酵素連結抗−ヒト（二次）抗体を用
いて検出できる。しかしながら、希釈した場合、一部の
サンプルは予想よりも低い結合を示すことがあり、その
理由は明らかでない。しかし、これは希釈効果によって
一部のサンプルでは偽陰性を呈するという問題を生じ
る。
（ＣＬ）〕に結合する血漿中または血清中の抗体を検出
するための固相免疫測定法は１９８０年代の半ばに開発
され、現在ではそのまま使用できる市販キットとして多
数のバイオテクノロジー関連会社から入手可能であり、
多くの研究施設ではこれらを使用するか、その代りに独
自の自家検定法を採用している。基本的には、ＣＬをマ
イクロタイターのウエルの底にコーティングし、血漿ま
たは血清のサンプルを添加する。抗カルジオリピン、ａ
ＰＬ抗体が結合し、酵素連結抗−ヒト（二次）抗体を用
いて検出できる。しかしながら、希釈した場合、一部の
サンプルは予想よりも低い結合を示すことがあり、その
理由は明らかでない。しかし、これは希釈効果によって
一部のサンプルでは偽陰性を呈するという問題を生じ
る。
【０００４】抗原としてカルジオリピン（ＣＬ）を使用
する固相酵素連結免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で検出され
る抗リン脂質抗体（ａＰＬ）は、抗カルジオリピン抗体
（ａＣＬ）と呼ばれる。ａＣＬは、梅毒やその他の感染
症、自己免疫疾患の患者で、薬剤誘発状態として、また
正常個体群にある率で検出される。自己免疫疾患患者に
おけるａＣＬの存在は、動脈または静脈血栓、反復性自
然流産および血小板減少症の危険の増大を付与するとさ
れている。しかしながら、これらの臨床的特徴は梅毒や
その他の感染症で生じたａＣＬの場合には認められな
い。
する固相酵素連結免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で検出され
る抗リン脂質抗体（ａＰＬ）は、抗カルジオリピン抗体
（ａＣＬ）と呼ばれる。ａＣＬは、梅毒やその他の感染
症、自己免疫疾患の患者で、薬剤誘発状態として、また
正常個体群にある率で検出される。自己免疫疾患患者に
おけるａＣＬの存在は、動脈または静脈血栓、反復性自
然流産および血小板減少症の危険の増大を付与するとさ
れている。しかしながら、これらの臨床的特徴は梅毒や
その他の感染症で生じたａＣＬの場合には認められな
い。
【０００５】これは、この２つの群にみられるａＣＬの
間にはある種の質的な差があることを示唆している。し
たがって、サンプル中の抗リン脂質抗体が自己免疫疾患
に関する抗体なのか感染症に関する抗体なのかを決定す
る方法、ならびに自己免疫疾患に関する抗リン脂質抗体
および感染症に関する抗リン脂質抗体がサンプル中に存
在するのかどうかを測定する方法が求められている。
間にはある種の質的な差があることを示唆している。し
たがって、サンプル中の抗リン脂質抗体が自己免疫疾患
に関する抗体なのか感染症に関する抗体なのかを決定す
る方法、ならびに自己免疫疾患に関する抗リン脂質抗体
および感染症に関する抗リン脂質抗体がサンプル中に存
在するのかどうかを測定する方法が求められている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、サン
プル中に抗リン脂質抗体（本明細書における定義によ
る）が存在するか否かを測定する検定法を提供すること
にある。本発明の他の目的は、サンプル中に陰性に荷電
したリン脂質が存在するか否かを測定する検定法を提供
することにある。本発明のさらに他の目的は、本発明の
検定法に用いられるキツトを提供することにある。ま
た、本発明の他の目的は、サンプル中の抗リン脂質抗体
が自己免疫疾患に関する抗体なのか感染症に関する抗体
なのかを決定する方法を提供することにある。またさら
に、本発明の他の目的は、自己免疫疾患に関する抗リン
脂質抗体および感染症に関する抗リン脂質抗体がサンプ
ル中に存在するのかどうかを測定する方法を提供するこ
とにある。
プル中に抗リン脂質抗体（本明細書における定義によ
る）が存在するか否かを測定する検定法を提供すること
にある。本発明の他の目的は、サンプル中に陰性に荷電
したリン脂質が存在するか否かを測定する検定法を提供
することにある。本発明のさらに他の目的は、本発明の
検定法に用いられるキツトを提供することにある。ま
た、本発明の他の目的は、サンプル中の抗リン脂質抗体
が自己免疫疾患に関する抗体なのか感染症に関する抗体
なのかを決定する方法を提供することにある。またさら
に、本発明の他の目的は、自己免疫疾患に関する抗リン
脂質抗体および感染症に関する抗リン脂質抗体がサンプ
ル中に存在するのかどうかを測定する方法を提供するこ
とにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本明細書で用いられる抗
リン脂質抗体の語は、一般的にすべての陰性に荷電した
リン脂質、とくにカルジオリピンに結合する抗リン脂質
抗体を称するが、それらはループス抗凝固活性は示さな
い。カルジオリピン酵素連結免疫測定法（ＣＬ−ＥＬＩ
ＳＡ）で結合性を示す抗リン脂質（ａＰＬ）抗体は、リ
ン脂質アフィニティーおよびイオン交換クロマトグラフ
ィーを連続的に用いて＞９５％の純度に精製することが
できる。
リン脂質抗体の語は、一般的にすべての陰性に荷電した
リン脂質、とくにカルジオリピンに結合する抗リン脂質
抗体を称するが、それらはループス抗凝固活性は示さな
い。カルジオリピン酵素連結免疫測定法（ＣＬ−ＥＬＩ
ＳＡ）で結合性を示す抗リン脂質（ａＰＬ）抗体は、リ
ン脂質アフィニティーおよびイオン交換クロマトグラフ
ィーを連続的に用いて＞９５％の純度に精製することが
できる。
【０００８】本発明者らは、血漿のイオン交換クロマト
グラフィーで得られたａＰＬ抗体含有画分をホスファチ
ジルセリン（ＰＳ）またはＣＬアフィニティーカラムに
アプライした場合、これらの抗体を含む血漿をこれらの
カラムにアプライしてａＰＬ抗体を精製できたにもかか
わらず、抗体の結合が起こらないことを見出したのであ
る。リン脂質抗原への結合は、正常ヒト血漿、血清また
はウシ血清が存在する場合にのみ起こり、これは、ａＰ
Ｌ抗体のＣＬへの結合には血漿／血清中のコファクター
の存在が必要なことを示唆している。正常（ａＰＬ抗体
陰性）血漿をイオン交換画分に添加するとカラムへのａ
ＰＬの結合が起こり、この仮説が支持された。リン脂質
アフィニティー、ゲル濾過およびイオン交換クロマトグ
ラフィーを連続的に用いて、本発明者らはこのコファク
ターを均質に精製し、ａＰＬ抗体のＣＬへの結合にはこ
のコファクターの存在が用量依存性に要求されることを
示した。
グラフィーで得られたａＰＬ抗体含有画分をホスファチ
ジルセリン（ＰＳ）またはＣＬアフィニティーカラムに
アプライした場合、これらの抗体を含む血漿をこれらの
カラムにアプライしてａＰＬ抗体を精製できたにもかか
わらず、抗体の結合が起こらないことを見出したのであ
る。リン脂質抗原への結合は、正常ヒト血漿、血清また
はウシ血清が存在する場合にのみ起こり、これは、ａＰ
Ｌ抗体のＣＬへの結合には血漿／血清中のコファクター
の存在が必要なことを示唆している。正常（ａＰＬ抗体
陰性）血漿をイオン交換画分に添加するとカラムへのａ
ＰＬの結合が起こり、この仮説が支持された。リン脂質
アフィニティー、ゲル濾過およびイオン交換クロマトグ
ラフィーを連続的に用いて、本発明者らはこのコファク
ターを均質に精製し、ａＰＬ抗体のＣＬへの結合にはこ
のコファクターの存在が用量依存性に要求されることを
示した。
【０００９】この分子のＮ−末端領域配列の分析によ
り、このコファクターは、陰イオン性リン脂質に結合す
ることが知られている血漿蛋白質であるβ−２−グリコ
プロティン−Ｉ（β−２ＧＰＩ）（アポリポ蛋白質Ｈ）
と同定された。これらの所見は、β−２ＧＰＩまたはそ
の同族体もしくは類縁体の存在は抗体／リン脂質の相互
作用に絶対的な要件であり、結合したβ−２ＧＰＩがａ
ＰＬ抗体の標的抗原を形成することを示唆している。
り、このコファクターは、陰イオン性リン脂質に結合す
ることが知られている血漿蛋白質であるβ−２−グリコ
プロティン−Ｉ（β−２ＧＰＩ）（アポリポ蛋白質Ｈ）
と同定された。これらの所見は、β−２ＧＰＩまたはそ
の同族体もしくは類縁体の存在は抗体／リン脂質の相互
作用に絶対的な要件であり、結合したβ−２ＧＰＩがａ
ＰＬ抗体の標的抗原を形成することを示唆している。
【００１０】本発明は、陰性に荷電したリン脂質、とく
にＣＬを用いる標準検定法における血漿中でのａＰＬ抗
体の結合を、検定系への精製β−２−グリコプロティン
−Ｉの添加によって有意に増大させうることの発見に基
づくものである。この感度の上昇は大部分の検定におけ
る標準的希釈である１：５０の希釈でとくに顕著であ
る。
にＣＬを用いる標準検定法における血漿中でのａＰＬ抗
体の結合を、検定系への精製β−２−グリコプロティン
−Ｉの添加によって有意に増大させうることの発見に基
づくものである。この感度の上昇は大部分の検定におけ
る標準的希釈である１：５０の希釈でとくに顕著であ
る。
【００１１】本発明の第一の態様においては、サンプル
を、陰性に荷電したリン脂質、およびβ−２−グリコプ
ロティン−Ｉまたはその同族体もしくは類縁体と接触さ
せ、接触したリン脂質およびβ−２−グリコプロティン
−Ｉに抗リン脂質抗体が結合したかどうかを測定するこ
とからなる、サンプル中に抗リン脂質抗体（本明細書に
おける定義による）が存在するか否かを測定する検定法
が提供される。リン脂質およびβ−２ＧＰＩへのａＰＬ
抗体の結合の検出は、サンプル中にａＰＬ抗体が存在す
ることを示す。 サンプルは任意の哺乳動物からの血清
または血漿のような血液画分であってよい。
を、陰性に荷電したリン脂質、およびβ−２−グリコプ
ロティン−Ｉまたはその同族体もしくは類縁体と接触さ
せ、接触したリン脂質およびβ−２−グリコプロティン
−Ｉに抗リン脂質抗体が結合したかどうかを測定するこ
とからなる、サンプル中に抗リン脂質抗体（本明細書に
おける定義による）が存在するか否かを測定する検定法
が提供される。リン脂質およびβ−２ＧＰＩへのａＰＬ
抗体の結合の検出は、サンプル中にａＰＬ抗体が存在す
ることを示す。 サンプルは任意の哺乳動物からの血清
または血漿のような血液画分であってよい。
【００１２】この実施態様の方法においては、任意の陰
性に荷電したリン脂質、たとえば、カルジオリピン、ホ
スファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホ
スファチジルグリセロホスフェート、ホスファチジン
酸、またはそれらの同族体もしくは類縁体が使用でき
る。通常はカルジオリピンが用いられる。本発明の第二
の態様においては、サンプルを、リン脂質に対する抗リ
ン脂質抗体（本明細書における定義による）、およびβ
−２−グリコプロティン−Ｉまたはその同族体もしくは
類縁体と接触させ、接触した抗体およびβ−２−グリコ
プロティン−Ｉに陰性に荷電したリン脂質が結合したか
どうかを測定することからなる、サンプル中に陰性に荷
電したリン脂質が存在するか否かを測定する方法が提供
される。
性に荷電したリン脂質、たとえば、カルジオリピン、ホ
スファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホ
スファチジルグリセロホスフェート、ホスファチジン
酸、またはそれらの同族体もしくは類縁体が使用でき
る。通常はカルジオリピンが用いられる。本発明の第二
の態様においては、サンプルを、リン脂質に対する抗リ
ン脂質抗体（本明細書における定義による）、およびβ
−２−グリコプロティン−Ｉまたはその同族体もしくは
類縁体と接触させ、接触した抗体およびβ−２−グリコ
プロティン−Ｉに陰性に荷電したリン脂質が結合したか
どうかを測定することからなる、サンプル中に陰性に荷
電したリン脂質が存在するか否かを測定する方法が提供
される。
【００１３】陰性に荷電したリン脂質のβ−２ＧＰＩお
よびａＰＬ抗体との結合の検出は、サンプル中に陰性に
荷電したリン脂質が存在することを示す。サンプルは、
任意の哺乳動物からの、全血、または血清もしくは血漿
のような血液画分であってよい。本発明のアッセイはと
くにヒトに適用できる。本発明の方法においては、陰性
に荷電したリン脂質またはａＰＬ抗体は通常、アフィニ
ティーカラム充填材料またはプラスチック表面、たとえ
ばマイクロタイタープレートもしくはディップスティッ
クのような適当な固相上に既知の技術で固定化される。
よびａＰＬ抗体との結合の検出は、サンプル中に陰性に
荷電したリン脂質が存在することを示す。サンプルは、
任意の哺乳動物からの、全血、または血清もしくは血漿
のような血液画分であってよい。本発明のアッセイはと
くにヒトに適用できる。本発明の方法においては、陰性
に荷電したリン脂質またはａＰＬ抗体は通常、アフィニ
ティーカラム充填材料またはプラスチック表面、たとえ
ばマイクロタイタープレートもしくはディップスティッ
クのような適当な固相上に既知の技術で固定化される。
【００１４】適当なアフィニティーカラム充填材料は、
ビーズにしたアガロースマトリックス、ポリアクリルア
ミド、ガラス、セルロースまたは架橋デキストランが包
含される。適当なプラスチック表面には、ポリメチルア
クリレート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリテレフ
タレート、エチレングリコール、ポリエステル、ポリプ
ロピレン等が包含される。一般的には、任意の標準的マ
イクロタイタープレートが使用できる。別法として、固
相はゲルまたはマトリックスの形態でもよく、これにａ
ＰＬ抗体またはリン脂質が所望によりβ−２ＧＰＩとと
もに導入される。第一の実施態様の方法の他の形式で
は、リン脂質が所望によりβ−２ＧＰＩとともにリポソ
ームまたはミセルに導入される。
ビーズにしたアガロースマトリックス、ポリアクリルア
ミド、ガラス、セルロースまたは架橋デキストランが包
含される。適当なプラスチック表面には、ポリメチルア
クリレート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリテレフ
タレート、エチレングリコール、ポリエステル、ポリプ
ロピレン等が包含される。一般的には、任意の標準的マ
イクロタイタープレートが使用できる。別法として、固
相はゲルまたはマトリックスの形態でもよく、これにａ
ＰＬ抗体またはリン脂質が所望によりβ−２ＧＰＩとと
もに導入される。第一の実施態様の方法の他の形式で
は、リン脂質が所望によりβ−２ＧＰＩとともにリポソ
ームまたはミセルに導入される。
【００１５】β−２ＧＰＩは任意の哺乳動物からのもの
でよい。実質的に純粋な形であることが望ましい。β−
２ＧＰＩは、血清または血漿から既知の方法で、たとえ
ばリン脂質クロマトグラフィーにより精製できる。しか
しながら、組換えＤＮＡ技術またはペプチド合成で製造
されたβ−２ＧＰＩも使用できる。β−２ＧＰＩは、第
一または第二の実施態様の方法で使用されるサンプルを
陰性に荷電したリン脂質またはａＰＬ抗体と接触させる
前または後に、そのサンプルと接触させることができ
る。また、第一の実施態様の検定では、β−２ＧＰＩを
固相に抗原とともに固定化しても、またリポゾームもし
くはミセルに導入してもよい。抗リン脂質抗体のリン脂
質およびβ−２−グリコプロティン−Ｉへの結合は本技
術分野でよく知られた任意の適当な方法で測定できる。
たとえば、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩ
Ａ）、免疫蛍光法、化学ルミネッセンス法および比濁法
を使用できるが、これらに限定されるものではない。
でよい。実質的に純粋な形であることが望ましい。β−
２ＧＰＩは、血清または血漿から既知の方法で、たとえ
ばリン脂質クロマトグラフィーにより精製できる。しか
しながら、組換えＤＮＡ技術またはペプチド合成で製造
されたβ−２ＧＰＩも使用できる。β−２ＧＰＩは、第
一または第二の実施態様の方法で使用されるサンプルを
陰性に荷電したリン脂質またはａＰＬ抗体と接触させる
前または後に、そのサンプルと接触させることができ
る。また、第一の実施態様の検定では、β−２ＧＰＩを
固相に抗原とともに固定化しても、またリポゾームもし
くはミセルに導入してもよい。抗リン脂質抗体のリン脂
質およびβ−２−グリコプロティン−Ｉへの結合は本技
術分野でよく知られた任意の適当な方法で測定できる。
たとえば、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩ
Ａ）、免疫蛍光法、化学ルミネッセンス法および比濁法
を使用できるが、これらに限定されるものではない。
【００１６】通常は、標識抗体または抗原を用いる標準
ＥＬＩＳＡ法が採用される。標識は、酵素、蛍光物質、
化学発光物質、放射性同位元素または補酵素とすること
ができる。一般的には、酵素標識、たとえばアルカリホ
スファターゼまたはβ−ガラクトシダーゼがそれらの適
当な基質とともに用いられる。酵素／基質反応は適当な
手段たとえば分光光度法によって検出できる。リン脂質
がリポソームに導入された場合は、Bonerji B, Lyon J
A, Alving CR, Biochim. Biophys. Acta, 1982, 689: 3
19-328; Alving C R, Richards R L,Guirgius A A, J.
Immunology.,1977, 118:342 に記載のリポソーム分解ア
ッセイが使用できる。本発明の第三の態様においては、
a)β−２ＧＰＩまたはその同族体もしくは類縁体、およ
びb)陰性に荷電したリン脂質からなり、抗リン脂質抗体
（本明細書における定義による）がサンプル中に存在す
るか否かを測定する検定法に用いられるキットが提供さ
れる。
ＥＬＩＳＡ法が採用される。標識は、酵素、蛍光物質、
化学発光物質、放射性同位元素または補酵素とすること
ができる。一般的には、酵素標識、たとえばアルカリホ
スファターゼまたはβ−ガラクトシダーゼがそれらの適
当な基質とともに用いられる。酵素／基質反応は適当な
手段たとえば分光光度法によって検出できる。リン脂質
がリポソームに導入された場合は、Bonerji B, Lyon J
A, Alving CR, Biochim. Biophys. Acta, 1982, 689: 3
19-328; Alving C R, Richards R L,Guirgius A A, J.
Immunology.,1977, 118:342 に記載のリポソーム分解ア
ッセイが使用できる。本発明の第三の態様においては、
a)β−２ＧＰＩまたはその同族体もしくは類縁体、およ
びb)陰性に荷電したリン脂質からなり、抗リン脂質抗体
（本明細書における定義による）がサンプル中に存在す
るか否かを測定する検定法に用いられるキットが提供さ
れる。
【００１７】キットはさらに、c)試験サンプル中に存在
する抗リン脂質抗体のβ−２ＧＰＩおよび陰性に荷電し
たリン脂質への結合を検出するための手段を包含しても
よい。抗体の結合を検出するためには、任意の適当な手
段、たとえば標識抗−ヒト抗体を使用することができ
る。この場合標識としては、酵素、蛍光物質、化学発光
物質、放射性同位元素または補酵素が使用できる。一般
に使用される標識は酵素である。本発明の第四の態様に
おいては、a)β−２ＧＰＩまたはその同族体もしくは類
縁体、およびb)抗リン脂質抗体（本明細書における定義
による）からなり、サンプル中に陰性に荷電したリン脂
質が存在するか否かを測定する検定法に用いられるキッ
トが提供される。
する抗リン脂質抗体のβ−２ＧＰＩおよび陰性に荷電し
たリン脂質への結合を検出するための手段を包含しても
よい。抗体の結合を検出するためには、任意の適当な手
段、たとえば標識抗−ヒト抗体を使用することができ
る。この場合標識としては、酵素、蛍光物質、化学発光
物質、放射性同位元素または補酵素が使用できる。一般
に使用される標識は酵素である。本発明の第四の態様に
おいては、a)β−２ＧＰＩまたはその同族体もしくは類
縁体、およびb)抗リン脂質抗体（本明細書における定義
による）からなり、サンプル中に陰性に荷電したリン脂
質が存在するか否かを測定する検定法に用いられるキッ
トが提供される。
【００１８】キットはさらに、c)抗体リン脂質抗体の、
β−２ＧＰＩおよび試験サンプル中に存在する陰性に荷
電したリン脂質への結合を検出するための手段を包含し
てもよい。ａＰＬ抗体の結合を検出するためには、任意
の適当な手段が使用できる。通常、酵素を標識とした標
識ａＰＬ抗体が使用される。使用できる他の適当な標識
には、蛍光物質、化学発光物質、放射性同位元素、また
は補酵素が包含される。本発明の検定法の利点は、過剰
のβ−２ＧＰＩの添加により陰性に荷電したリン脂質へ
のａＰＬ抗体の至適な結合が可能となり、定常的に使用
されている検定法に比較して感度の有意な増大が生じる
ことである。この感度の増大の結果として、定常的なａ
ＰＬ検定では「陰性」のサンプルが本発明の検定では陽
性であることがわかる場合があり、「偽陰性」を最小限
にすることができる。
β−２ＧＰＩおよび試験サンプル中に存在する陰性に荷
電したリン脂質への結合を検出するための手段を包含し
てもよい。ａＰＬ抗体の結合を検出するためには、任意
の適当な手段が使用できる。通常、酵素を標識とした標
識ａＰＬ抗体が使用される。使用できる他の適当な標識
には、蛍光物質、化学発光物質、放射性同位元素、また
は補酵素が包含される。本発明の検定法の利点は、過剰
のβ−２ＧＰＩの添加により陰性に荷電したリン脂質へ
のａＰＬ抗体の至適な結合が可能となり、定常的に使用
されている検定法に比較して感度の有意な増大が生じる
ことである。この感度の増大の結果として、定常的なａ
ＰＬ検定では「陰性」のサンプルが本発明の検定では陽
性であることがわかる場合があり、「偽陰性」を最小限
にすることができる。
【００１９】ａＰＬ抗体の検出は、体内におけるその存
在が血栓症、流産および他の臨床的に重要な症候群に関
連することから、臨床的に極めて重要である。したがっ
て、これらの抗体の検定の感度の上昇は臨床的意義が大
きい。自己免疫疾患患者および感染症患者から精製した
抗リン脂質抗体（ａＣＬ）の、リン脂質結合血漿蛋白
質、β−２−グリコプロティン−Ｉ（β−２ＧＰＩ）へ
の結合特異性の検討により、本発明者らは、自己免疫疾
患患者からのａＣＬの結合特異性が感染症患者からのａ
ＣＬの場合とは異なることを発見した。とくに、本発明
者らは、自己免疫疾患患者１２例中１１例でａＣＬ抗体
はβ−２ＧＰＩの存在下にのみカルジオリピン（ＣＬ）
と結合することを見出した。これに反し、マラリア、感
染性単核症、結核、Ａ型肝炎および梅毒患者からの精製
ａＣＬはβ−２ＧＰＩがなくてもＣＬに結合した。血栓
症の合併は自己免疫疾患で存在するａＣＬに関連し、感
染症に伴うａＣＬには関係がないようである。本発明者
らは、自己免疫疾患群における血栓症の危険の増大は、
抗凝固活性をもつ血漿蛋白質、β−２ＧＰＩに関連して
ＣＬに結合するａＣＬ抗体の存在によるものと想像して
いる。
在が血栓症、流産および他の臨床的に重要な症候群に関
連することから、臨床的に極めて重要である。したがっ
て、これらの抗体の検定の感度の上昇は臨床的意義が大
きい。自己免疫疾患患者および感染症患者から精製した
抗リン脂質抗体（ａＣＬ）の、リン脂質結合血漿蛋白
質、β−２−グリコプロティン−Ｉ（β−２ＧＰＩ）へ
の結合特異性の検討により、本発明者らは、自己免疫疾
患患者からのａＣＬの結合特異性が感染症患者からのａ
ＣＬの場合とは異なることを発見した。とくに、本発明
者らは、自己免疫疾患患者１２例中１１例でａＣＬ抗体
はβ−２ＧＰＩの存在下にのみカルジオリピン（ＣＬ）
と結合することを見出した。これに反し、マラリア、感
染性単核症、結核、Ａ型肝炎および梅毒患者からの精製
ａＣＬはβ−２ＧＰＩがなくてもＣＬに結合した。血栓
症の合併は自己免疫疾患で存在するａＣＬに関連し、感
染症に伴うａＣＬには関係がないようである。本発明者
らは、自己免疫疾患群における血栓症の危険の増大は、
抗凝固活性をもつ血漿蛋白質、β−２ＧＰＩに関連して
ＣＬに結合するａＣＬ抗体の存在によるものと想像して
いる。
【００２０】本発明は第五の態様においては、(i) サン
プルの一部をβ−２−グリコプロティン−Ｉまたはその
同族体もしくは類縁体と接触させることなく、陰性に荷
電したリン脂質と接触させ、サンプル中の抗リン脂質抗
体の第一の量を測定し、(ii)サンプルの別の一部を陰性
に荷電したリン脂質およびβ−２−グリコプロティン−
Ｉまたはその同族体もしくは類縁体と接触させて、サン
プル中の抗リン脂質抗体の第二の量を測定し、(iii) 第
一の量が第二の量よりも実質的に小さい場合は測定され
たサンプル中の抗リン脂質抗体は自己免疫疾患に関する
ものであり、第一の量が第二の量よりも実質的に大きい
場合は測定されたサンプル中の抗リン脂質抗体は感染症
に関するものであることから、第一の量と第二の量を比
較して、測定されたサンプル中の抗リン脂質抗体が自己
免疫疾患に関するものであるか感染症に関するものであ
るかを決定することからなる、サンプル中の抗リン脂質
抗体が自己免疫疾患に関するものであるか感染症に関す
るものであるかを決定する方法が提供される。
プルの一部をβ−２−グリコプロティン−Ｉまたはその
同族体もしくは類縁体と接触させることなく、陰性に荷
電したリン脂質と接触させ、サンプル中の抗リン脂質抗
体の第一の量を測定し、(ii)サンプルの別の一部を陰性
に荷電したリン脂質およびβ−２−グリコプロティン−
Ｉまたはその同族体もしくは類縁体と接触させて、サン
プル中の抗リン脂質抗体の第二の量を測定し、(iii) 第
一の量が第二の量よりも実質的に小さい場合は測定され
たサンプル中の抗リン脂質抗体は自己免疫疾患に関する
ものであり、第一の量が第二の量よりも実質的に大きい
場合は測定されたサンプル中の抗リン脂質抗体は感染症
に関するものであることから、第一の量と第二の量を比
較して、測定されたサンプル中の抗リン脂質抗体が自己
免疫疾患に関するものであるか感染症に関するものであ
るかを決定することからなる、サンプル中の抗リン脂質
抗体が自己免疫疾患に関するものであるか感染症に関す
るものであるかを決定する方法が提供される。
【００２１】本発明は第六の態様においては、(i) サン
プルの一部をβ−２−グリコプロティン−Ｉまたはその
同族体もしくは類縁体と接触させることなく、陰性に荷
電したリン脂質と接触させ、サンプル中の抗リン脂質抗
体の第一の量を測定し、(ii)サンプルの別の一部を陰性
に荷電したリン脂質およびβ−２−グリコプロティン−
Ｉまたはその同族体もしくは類縁体と接触させて、サン
プル中の抗リン脂質抗体の第二の量を測定し、(iii) 第
一の量が第二の量と実質的に等しい場合には測定された
サンプル中の抗リン脂質抗体は自己免疫疾患および感染
症に関するものであることから、第一の量と第二の量を
比較して、測定されたサンプル中の抗リン脂質抗体が自
己免疫疾患および感染症に関するものであるか否かを決
定することからなる、サンプル中の抗リン脂質抗体が自
己免疫疾患および感染症に関するものであるか否かを決
定する方法が提供される。
プルの一部をβ−２−グリコプロティン−Ｉまたはその
同族体もしくは類縁体と接触させることなく、陰性に荷
電したリン脂質と接触させ、サンプル中の抗リン脂質抗
体の第一の量を測定し、(ii)サンプルの別の一部を陰性
に荷電したリン脂質およびβ−２−グリコプロティン−
Ｉまたはその同族体もしくは類縁体と接触させて、サン
プル中の抗リン脂質抗体の第二の量を測定し、(iii) 第
一の量が第二の量と実質的に等しい場合には測定された
サンプル中の抗リン脂質抗体は自己免疫疾患および感染
症に関するものであることから、第一の量と第二の量を
比較して、測定されたサンプル中の抗リン脂質抗体が自
己免疫疾患および感染症に関するものであるか否かを決
定することからなる、サンプル中の抗リン脂質抗体が自
己免疫疾患および感染症に関するものであるか否かを決
定する方法が提供される。
【００２２】以下の注釈は、第五および第六の実施態様
の両者に適用される。第一の量が第二の量よりも実質的
に小さいとは、第二の量が第一の量の少なくとも１．１
倍より大であることを意味する（第二の量が第一の量の
１００，０００倍またはそれ以上になることもある）。
第一の量が第二の量よりも実質的に大きいとは、第一の
量が第二の量の少なくとも１．１倍より大であることを
意味する（第一の量が第二の量の１００，０００倍また
はそれ以上になることもある）。第一の量が第二の量と
実質的に等しいとは、第一の量が第二の量の０．９倍よ
り大きく、第二の量の約１．１倍より小さいことを意味
する。この場合、第一の量は第二の量と実質的に等しい
とする。サンプルは、任意の哺乳動物からの、全血、ま
たは血清もしくは血漿のような血液画分であってよい。
本発明の方法はとくにヒトの体液に適用できる。本発明
の方法においては、陰性に荷電したリン脂質は通常、ア
フィニティーカラム充填材料またはプラスチック表面、
たとえばマイクロタイタープレートもしくはディップス
ティックのような適当な固相上に既知の技術で固定化さ
れる。
の両者に適用される。第一の量が第二の量よりも実質的
に小さいとは、第二の量が第一の量の少なくとも１．１
倍より大であることを意味する（第二の量が第一の量の
１００，０００倍またはそれ以上になることもある）。
第一の量が第二の量よりも実質的に大きいとは、第一の
量が第二の量の少なくとも１．１倍より大であることを
意味する（第一の量が第二の量の１００，０００倍また
はそれ以上になることもある）。第一の量が第二の量と
実質的に等しいとは、第一の量が第二の量の０．９倍よ
り大きく、第二の量の約１．１倍より小さいことを意味
する。この場合、第一の量は第二の量と実質的に等しい
とする。サンプルは、任意の哺乳動物からの、全血、ま
たは血清もしくは血漿のような血液画分であってよい。
本発明の方法はとくにヒトの体液に適用できる。本発明
の方法においては、陰性に荷電したリン脂質は通常、ア
フィニティーカラム充填材料またはプラスチック表面、
たとえばマイクロタイタープレートもしくはディップス
ティックのような適当な固相上に既知の技術で固定化さ
れる。
【００２３】適当なアフィニティーカラム充填材料に
は、ビーズにしたアガロースマトリックス、ポリアクリ
ルアミド、ガラス、セルロースまたは架橋デキストラン
が包含される。適当なプラスチック表面には、ポリメチ
ルアクリレート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリテ
レフタレート、エチレングリコール、ポリエステル、ポ
リプロピレン等が包含される。一般的には、任意の標準
的マイクロタイタープレートが使用できる。別法とし
て、固相はゲルまたはマトリックスの形態でもよく、工
程(ii)の方法ではこれに陰性に荷電したリン脂質がβ−
２ＧＰＩとともに導入される。第五および第六の実施態
様の方法工程(ii)においては、他の形式として、リン脂
質をβ−２ＧＰＩとともにリポソームまたはミセルに導
入できる。
は、ビーズにしたアガロースマトリックス、ポリアクリ
ルアミド、ガラス、セルロースまたは架橋デキストラン
が包含される。適当なプラスチック表面には、ポリメチ
ルアクリレート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリテ
レフタレート、エチレングリコール、ポリエステル、ポ
リプロピレン等が包含される。一般的には、任意の標準
的マイクロタイタープレートが使用できる。別法とし
て、固相はゲルまたはマトリックスの形態でもよく、工
程(ii)の方法ではこれに陰性に荷電したリン脂質がβ−
２ＧＰＩとともに導入される。第五および第六の実施態
様の方法工程(ii)においては、他の形式として、リン脂
質をβ−２ＧＰＩとともにリポソームまたはミセルに導
入できる。
【００２４】β−２ＧＰＩは任意の哺乳動物からのもの
でよい。実質的に純粋な形であることが望ましい。β−
２ＧＰＩは、血清または血漿から既知の方法で、たとえ
ばリン脂質クロマトグラフィーにより精製できる。しか
しながら、組換えＤＮＡ技術またはペプチド合成で製造
されたβ−２ＧＰＩも使用できる。工程(ii)の方法にお
いては、β−２ＧＰＩは、試験されるサンプルを陰性に
荷電したリン脂質と接触させる前または後に、そのサン
プルと接触させることができる。また、工程(ii)の方法
においては、β−２ＧＰＩは、抗原とともに固相に固定
化しても、またリポソームもしくはミセルに導入しても
よい。
でよい。実質的に純粋な形であることが望ましい。β−
２ＧＰＩは、血清または血漿から既知の方法で、たとえ
ばリン脂質クロマトグラフィーにより精製できる。しか
しながら、組換えＤＮＡ技術またはペプチド合成で製造
されたβ−２ＧＰＩも使用できる。工程(ii)の方法にお
いては、β−２ＧＰＩは、試験されるサンプルを陰性に
荷電したリン脂質と接触させる前または後に、そのサン
プルと接触させることができる。また、工程(ii)の方法
においては、β−２ＧＰＩは、抗原とともに固相に固定
化しても、またリポソームもしくはミセルに導入しても
よい。
【００２５】抗リン脂質抗体のリン脂質〔工程(ii)にお
いてはさらにβ−２−グリコプロティン−Ｉ〕への結合
は、本技術分野でよく知られた任意の適当な方法で測定
できる。たとえば、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ
（ＲＩＡ）、免疫蛍光法、化学ルミネッセンス法および
比濁法を使用できるが、これらに限定されるものではな
い。通常、標識抗体または抗原を用いる標準ＥＬＩＳＡ
法が採用される。標識は、酵素、蛍光物質、化学発光物
質、放射性同位元素または補酵素とすることができる。
一般的には、酵素標識、たとえばアルカリホスファター
ゼまたはβ−ガラクトシダーゼがそれらの適当な基質と
ともに用いられる。酵素／基質反応は適当な手段たとえ
ば分光光度法によって検出できる。
いてはさらにβ−２−グリコプロティン−Ｉ〕への結合
は、本技術分野でよく知られた任意の適当な方法で測定
できる。たとえば、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ
（ＲＩＡ）、免疫蛍光法、化学ルミネッセンス法および
比濁法を使用できるが、これらに限定されるものではな
い。通常、標識抗体または抗原を用いる標準ＥＬＩＳＡ
法が採用される。標識は、酵素、蛍光物質、化学発光物
質、放射性同位元素または補酵素とすることができる。
一般的には、酵素標識、たとえばアルカリホスファター
ゼまたはβ−ガラクトシダーゼがそれらの適当な基質と
ともに用いられる。酵素／基質反応は適当な手段たとえ
ば分光光度法によって検出できる。
【００２６】リン脂質がリポソームに導入された場合
は、Bonerji B, Lyon J A, Alving CR, Biochim. Bioph
ys. Acta,1982, 689:319-328; Alving C R, Richards R
L,Guirgius A A, J. Immunology., 1977, 118:342 に
記載のリポソーム分解アッセイーが使用できる。ａＰＬ
抗体の結合を検出するためには、任意の適当な手段、た
とえば標識を酵素、蛍光物質、化学発光物質、放射性同
位元素または補酵素とした標識抗−ヒト抗体が使用でき
る。一般に、使用される標識は酵素である。工程(ii)の
方法においては、サンプルへの過剰のβ−２ＧＰＩの添
加により、陰性に荷電したリン脂質へのａＰＬ抗体の至
適な結合が可能となり、定常的に使用されている検定法
に比較して感度の有意な増大が生じる。
は、Bonerji B, Lyon J A, Alving CR, Biochim. Bioph
ys. Acta,1982, 689:319-328; Alving C R, Richards R
L,Guirgius A A, J. Immunology., 1977, 118:342 に
記載のリポソーム分解アッセイーが使用できる。ａＰＬ
抗体の結合を検出するためには、任意の適当な手段、た
とえば標識を酵素、蛍光物質、化学発光物質、放射性同
位元素または補酵素とした標識抗−ヒト抗体が使用でき
る。一般に、使用される標識は酵素である。工程(ii)の
方法においては、サンプルへの過剰のβ−２ＧＰＩの添
加により、陰性に荷電したリン脂質へのａＰＬ抗体の至
適な結合が可能となり、定常的に使用されている検定法
に比較して感度の有意な増大が生じる。
【００２７】以下に、第一の実施態様の方法を、サンプ
ル中のａＰＬ抗体の検出に関して説明する。β−２−グ
リコプロティン−Ｉは、正常ヒト血漿または血清からリ
ン脂質クロマトグラフィーによって精製する。β−２Ｇ
ＰＩの保存溶液を調製し、血漿または血清サンプルに添
加して希釈サンプル（通常は検定緩衝液１：５０）中５
０μｇ／mlの最終濃度とする。サンプルは、ついで以下
のようにＣＬ−ＥＬＩＳＡ法でａＰＬ抗体を検定する。
ＣＬをエタノール溶液としてマイクロタイタープレート
に添加して、プレートの底にＣＬにコーティングする。
エタノールを蒸発させるとプレートの表面にＣＬのコー
ティングが残る。
ル中のａＰＬ抗体の検出に関して説明する。β−２−グ
リコプロティン−Ｉは、正常ヒト血漿または血清からリ
ン脂質クロマトグラフィーによって精製する。β−２Ｇ
ＰＩの保存溶液を調製し、血漿または血清サンプルに添
加して希釈サンプル（通常は検定緩衝液１：５０）中５
０μｇ／mlの最終濃度とする。サンプルは、ついで以下
のようにＣＬ−ＥＬＩＳＡ法でａＰＬ抗体を検定する。
ＣＬをエタノール溶液としてマイクロタイタープレート
に添加して、プレートの底にＣＬにコーティングする。
エタノールを蒸発させるとプレートの表面にＣＬのコー
ティングが残る。
【００２８】コーティングしたマイクロタイタープレー
トを上述のようにして調製した１：５０希釈血清または
血漿サンプルとインキュベートし、洗浄し、アルカリホ
スファターゼ連結抗−ヒト抗体とインキュベートする。
次にプレートを２度目の洗浄に付し、基質とインキュベ
ートする。酵素反応の生成物を分光光度法によって検出
する。次に、本発明の方法を二抗体サンドイッチアッセ
イによるサンプル中の陰性に荷電したリン脂質の検出に
関して説明する。
トを上述のようにして調製した１：５０希釈血清または
血漿サンプルとインキュベートし、洗浄し、アルカリホ
スファターゼ連結抗−ヒト抗体とインキュベートする。
次にプレートを２度目の洗浄に付し、基質とインキュベ
ートする。酵素反応の生成物を分光光度法によって検出
する。次に、本発明の方法を二抗体サンドイッチアッセ
イによるサンプル中の陰性に荷電したリン脂質の検出に
関して説明する。
【００２９】β−２−グリコプロティン−Ｉは上述のよ
うに調製し、血清または血漿サンプルに添加し、希釈サ
ンプル（通常は検定緩衝液１：５０）中５０μｇ／mlの
最終濃度とする。ａＰＬ抗体をマイクロタイタープレー
ト上に吸着させ、血清または血漿サンプルを１：５０に
希釈して加える。プレートを洗浄し、アルカリホスファ
ターゼ連結ａＰＬ抗体とインキュベートする。ついでプ
レートを洗浄に付し、基質とインキュベートする。酵素
反応の生成物を分光光度法によって検出する。サンプル
中の抗リン脂質抗体が自己免疫疾患に関する抗体および
／または感染症に関する抗体であるか否かを決定する方
法は、以下の方法で実施できる。
うに調製し、血清または血漿サンプルに添加し、希釈サ
ンプル（通常は検定緩衝液１：５０）中５０μｇ／mlの
最終濃度とする。ａＰＬ抗体をマイクロタイタープレー
ト上に吸着させ、血清または血漿サンプルを１：５０に
希釈して加える。プレートを洗浄し、アルカリホスファ
ターゼ連結ａＰＬ抗体とインキュベートする。ついでプ
レートを洗浄に付し、基質とインキュベートする。酵素
反応の生成物を分光光度法によって検出する。サンプル
中の抗リン脂質抗体が自己免疫疾患に関する抗体および
／または感染症に関する抗体であるか否かを決定する方
法は、以下の方法で実施できる。
【００３０】第一には、サンプルの一部をβ−２−グリ
コプロティン−Ｉまたはその同類体もしくは類縁体と接
触させることなく、陰性に荷電したリン脂質と接触さ
せ、サンプル中の抗リン脂質抗体の量（「第一の量」と
いう）を測定することによるサンプルの一部の分析でサ
ンプル中の抗リン脂質抗体を測定する。通常、この測定
はＣＬ固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて行わ
れる。ＣＬをエタノール溶液としてマイクロタイタープ
レートに添加して、プレートの底にＣＬをコーティング
する。エタノールを蒸発させるとプレートの表面にＣＬ
のコーティングが残る。プレートを、ミルク粉末１％／
０．３％ゼラチン含有ＰＢＳでブロックする。コーティ
ングしたマイクロタイタープレートを検定緩衝液１：５
０希釈血清または血漿サンプルとインキュベートし、洗
浄し、アルカリホスファターゼ連結抗−ヒト抗体とイン
キュベートする。次にプレートを２度目の洗浄に付し、
基質とインキュベートする。酵素反応の生成物は分光光
度法によって検出する。
コプロティン−Ｉまたはその同類体もしくは類縁体と接
触させることなく、陰性に荷電したリン脂質と接触さ
せ、サンプル中の抗リン脂質抗体の量（「第一の量」と
いう）を測定することによるサンプルの一部の分析でサ
ンプル中の抗リン脂質抗体を測定する。通常、この測定
はＣＬ固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて行わ
れる。ＣＬをエタノール溶液としてマイクロタイタープ
レートに添加して、プレートの底にＣＬをコーティング
する。エタノールを蒸発させるとプレートの表面にＣＬ
のコーティングが残る。プレートを、ミルク粉末１％／
０．３％ゼラチン含有ＰＢＳでブロックする。コーティ
ングしたマイクロタイタープレートを検定緩衝液１：５
０希釈血清または血漿サンプルとインキュベートし、洗
浄し、アルカリホスファターゼ連結抗−ヒト抗体とイン
キュベートする。次にプレートを２度目の洗浄に付し、
基質とインキュベートする。酵素反応の生成物は分光光
度法によって検出する。
【００３１】第二には、サンプル中の抗リン脂質抗体
を、改良ＣＬ固相酵素免疫測定法（改良ＥＬＩＳＡ）を
用いて測定する。一般的に、これは、サンプルの他の一
部を陰性に荷電したリン脂質およびβ−２−グリコプロ
ティン−Ｉまたはその同類体もしくは類縁体と接触さ
せ、サンプル中の抗リン脂質抗体の量（「第二の量」と
いう）を測定する。さらに詳しくは、β−２−グリコプ
ロティン−Ｉは正常ヒト血漿または血清からリン脂質ク
ロマトグラフィーによって精製する。β−２ＧＰＩの保
存溶液を調製し、血漿または血清サンプルに添加して希
釈サンプル（通常は検定緩衝液１：５０）中５０μｇ／
mlの最終濃度とする。サンプルはついで以下のように、
ＣＬ−ＥＬＩＳＡアッセイでａＰＬ抗体を検定する。Ｃ
Ｌをエタノール溶液としてマイクロタイタープレートに
添加してプレートの底にＣＬをコーティングする。エタ
ノールを蒸発させるとプレートの表面にＣＬのコーティ
ングが残る。プレートを、ミルク粉末１％／０．３％ゼ
ラチン含有ＰＢＳでブロックする。コーティングしたマ
イクロタイタープレートを上述のようにして調製した
１：５０希釈血清または血漿サンプルとインキュベート
し、洗浄し、アルカリホスファターゼ連結抗−ヒト抗体
とインキュベートする。次にプレートを２度目の洗浄に
付し、基質とインキュベートする。酵素反応の生成物は
分光光度法によって検出する。
を、改良ＣＬ固相酵素免疫測定法（改良ＥＬＩＳＡ）を
用いて測定する。一般的に、これは、サンプルの他の一
部を陰性に荷電したリン脂質およびβ−２−グリコプロ
ティン−Ｉまたはその同類体もしくは類縁体と接触さ
せ、サンプル中の抗リン脂質抗体の量（「第二の量」と
いう）を測定する。さらに詳しくは、β−２−グリコプ
ロティン−Ｉは正常ヒト血漿または血清からリン脂質ク
ロマトグラフィーによって精製する。β−２ＧＰＩの保
存溶液を調製し、血漿または血清サンプルに添加して希
釈サンプル（通常は検定緩衝液１：５０）中５０μｇ／
mlの最終濃度とする。サンプルはついで以下のように、
ＣＬ−ＥＬＩＳＡアッセイでａＰＬ抗体を検定する。Ｃ
Ｌをエタノール溶液としてマイクロタイタープレートに
添加してプレートの底にＣＬをコーティングする。エタ
ノールを蒸発させるとプレートの表面にＣＬのコーティ
ングが残る。プレートを、ミルク粉末１％／０．３％ゼ
ラチン含有ＰＢＳでブロックする。コーティングしたマ
イクロタイタープレートを上述のようにして調製した
１：５０希釈血清または血漿サンプルとインキュベート
し、洗浄し、アルカリホスファターゼ連結抗−ヒト抗体
とインキュベートする。次にプレートを２度目の洗浄に
付し、基質とインキュベートする。酵素反応の生成物は
分光光度法によって検出する。
【００３２】次に、第一の量と第二の量と比較すること
により、測定されたサンプル中の抗リン脂質抗体が自己
免疫疾患に関する抗リン脂質抗体であるか感染疾患に関
する抗リン脂質抗体であるかを決定する。第一の量が第
二の量より実質的に小さい場合は、測定されたサンプル
中の抗リン脂質抗体は自己免疫疾患に関する抗体であ
り、第一の量が第二の量より実質的に大きい場合は、測
定されたサンプル中の抗リン脂質抗体は感染疾患に関す
る抗体である。また、第一の量と第二の量と比較するこ
とにより、測定されたサンプル中の抗リン脂質抗体が自
己免疫疾患に関する抗リン脂質抗体および感染疾患に関
する抗リン脂質抗体であるかを決定する。第一の量が第
二の量と実質的に等しい場合は、測定されたサンプル中
の抗リン脂質抗体は自己免疫疾患に関する抗体および感
染疾患に関する抗体である。
により、測定されたサンプル中の抗リン脂質抗体が自己
免疫疾患に関する抗リン脂質抗体であるか感染疾患に関
する抗リン脂質抗体であるかを決定する。第一の量が第
二の量より実質的に小さい場合は、測定されたサンプル
中の抗リン脂質抗体は自己免疫疾患に関する抗体であ
り、第一の量が第二の量より実質的に大きい場合は、測
定されたサンプル中の抗リン脂質抗体は感染疾患に関す
る抗体である。また、第一の量と第二の量と比較するこ
とにより、測定されたサンプル中の抗リン脂質抗体が自
己免疫疾患に関する抗リン脂質抗体および感染疾患に関
する抗リン脂質抗体であるかを決定する。第一の量が第
二の量と実質的に等しい場合は、測定されたサンプル中
の抗リン脂質抗体は自己免疫疾患に関する抗体および感
染疾患に関する抗体である。
【００３３】
【実施例】次に、本発明を以下の実施例によりさらに詳
細に説明するが、これは本発明を限定するものではな
い。例１ ａＰＬ（ａＣＬ）抗体および血漿コファクターの精製 血漿および患者 静脈穿刺により採取した新しい血液を、最終容量の１／
１０の０．１１Ｍクエン酸三ナトリウムを含むチューブ
に取り、直ちに２，５００ｇで１５分間遠心分離し、
０．２２μm Millipore Millexフィルターで濾過して、
クエン酸処理血小板不含血漿を調製した。ａＣＬ抗体
は、血漿が高レベルのａＣＬ抗体を含有し、強いＬＡ活
性を示す抗リン脂質症候群の２例の患者から精製した。
全身性エリテマトーデスであるが血栓症の既往はない、
さらに２例の患者からの血漿をイオン交換クロマトグラ
フィーに付した。血漿コファクターは、ａＣＬ抗体およ
びＬＡ活性陰性の３１歳の男性健常者から精製した。
細に説明するが、これは本発明を限定するものではな
い。例１ ａＰＬ（ａＣＬ）抗体および血漿コファクターの精製 血漿および患者 静脈穿刺により採取した新しい血液を、最終容量の１／
１０の０．１１Ｍクエン酸三ナトリウムを含むチューブ
に取り、直ちに２，５００ｇで１５分間遠心分離し、
０．２２μm Millipore Millexフィルターで濾過して、
クエン酸処理血小板不含血漿を調製した。ａＣＬ抗体
は、血漿が高レベルのａＣＬ抗体を含有し、強いＬＡ活
性を示す抗リン脂質症候群の２例の患者から精製した。
全身性エリテマトーデスであるが血栓症の既往はない、
さらに２例の患者からの血漿をイオン交換クロマトグラ
フィーに付した。血漿コファクターは、ａＣＬ抗体およ
びＬＡ活性陰性の３１歳の男性健常者から精製した。
【００３４】患者血漿のイオン交換クロマトグラフィー 患者血漿を、０．０５Ｍ酢酸塩 ０．０５Ｍ ＮａＣｌ
pH４．８に対して完全に透析し、遠心分離し、ついで
Pharmacia Fast Protein Liquid Chromatography（ＦＰ
ＬＣ）システムを用い、前述のように、５時間にわたり
溶出緩衝液（０．０５Ｍ酢酸塩０．６５Ｍ ＮａＣｌ
pH５．２）１５００mlを０〜１００％の直線勾配でSeph
arose Fast Flow 陽イオン交換カラム（Pharmacia)にか
けた。各画分について標準ＣＬ−ＥＬＩＳＡを用いてａ
ＣＬ抗体を検出し、ａＣＬ抗体陽性画分は、０．０１Ｍ
リン酸緩衝０．１５Ｍ食塩溶液pH７．２（ＰＢＳ）（Du
lbecco A）に対して透析した。
pH４．８に対して完全に透析し、遠心分離し、ついで
Pharmacia Fast Protein Liquid Chromatography（ＦＰ
ＬＣ）システムを用い、前述のように、５時間にわたり
溶出緩衝液（０．０５Ｍ酢酸塩０．６５Ｍ ＮａＣｌ
pH５．２）１５００mlを０〜１００％の直線勾配でSeph
arose Fast Flow 陽イオン交換カラム（Pharmacia)にか
けた。各画分について標準ＣＬ−ＥＬＩＳＡを用いてａ
ＣＬ抗体を検出し、ａＣＬ抗体陽性画分は、０．０１Ｍ
リン酸緩衝０．１５Ｍ食塩溶液pH７．２（ＰＢＳ）（Du
lbecco A）に対して透析した。
【００３５】ＣＬ−アフィニティークロマトグラフィー 前述したＰＳアフィニティークロマトグラフィー法を改
良して使用した。エタノール中５．６mgのＣＬ（Sigma)
をガラスシンチレーションバイアルに取り、窒素気流下
に溶媒を蒸発させた。２．３２mgのコレステロール（Ｂ
ＤＨ CHemicals ）と０．４４mgのリン酸ジセチル（Si
gma ）を加え、脂質をクロロホルムに再溶解させた。溶
媒を再び蒸発させ、エタノール５００μｌを加え、バイ
アルに栓をして沸騰水に浸し、脂質が溶解するまで振盪
した。１５％アクリルアミド、５％ＢＩＳ（Biorad）溶
液５mlをそれぞれ加え、脂質／アクリルアミド混合物を
旋回させて激しく混合し、ついで１００μｌの過硫酸ア
ンモニウム（１４０mg／ml）、２．５μｌのＴＥＭＥＤ
（いずれもBioradより）を加えて急速に重合させ、つい
で室温に一夜放置した。堅いゲルを手操作の緩く嵌合す
るテフロン乳棒を用いてホモジナイズし、空のPharmaci
a FPLC HR １０／１０ガラスカラムに充填し、０．０１
Ｍリン酸塩 ０．０５Ｍ ＮａＣｌ pH７．２で平衡化
した。血漿をこの緩衝液で１：５最終容量に希釈し、
０．５ml／min でカラムに注入し、ついで通過液の２８
０nmにおける吸光度が＜０．０１単位になるまで、カラ
ムを０．８ml／min で洗浄した。溶出緩衝液（０．０１
Ｍリン酸塩 １．０Ｍ ＮａＣｌpH７．２）４０mlを０
〜１００％直線勾配で５０分で適用し、蛋白質を含む溶
出画分を集めた。イオン交換画分は非希釈で適用し、上
述のようにクロマトグラフィーに付した。
良して使用した。エタノール中５．６mgのＣＬ（Sigma)
をガラスシンチレーションバイアルに取り、窒素気流下
に溶媒を蒸発させた。２．３２mgのコレステロール（Ｂ
ＤＨ CHemicals ）と０．４４mgのリン酸ジセチル（Si
gma ）を加え、脂質をクロロホルムに再溶解させた。溶
媒を再び蒸発させ、エタノール５００μｌを加え、バイ
アルに栓をして沸騰水に浸し、脂質が溶解するまで振盪
した。１５％アクリルアミド、５％ＢＩＳ（Biorad）溶
液５mlをそれぞれ加え、脂質／アクリルアミド混合物を
旋回させて激しく混合し、ついで１００μｌの過硫酸ア
ンモニウム（１４０mg／ml）、２．５μｌのＴＥＭＥＤ
（いずれもBioradより）を加えて急速に重合させ、つい
で室温に一夜放置した。堅いゲルを手操作の緩く嵌合す
るテフロン乳棒を用いてホモジナイズし、空のPharmaci
a FPLC HR １０／１０ガラスカラムに充填し、０．０１
Ｍリン酸塩 ０．０５Ｍ ＮａＣｌ pH７．２で平衡化
した。血漿をこの緩衝液で１：５最終容量に希釈し、
０．５ml／min でカラムに注入し、ついで通過液の２８
０nmにおける吸光度が＜０．０１単位になるまで、カラ
ムを０．８ml／min で洗浄した。溶出緩衝液（０．０１
Ｍリン酸塩 １．０Ｍ ＮａＣｌpH７．２）４０mlを０
〜１００％直線勾配で５０分で適用し、蛋白質を含む溶
出画分を集めた。イオン交換画分は非希釈で適用し、上
述のようにクロマトグラフィーに付した。
【００３６】標準ａＣＬ抗体免疫測定法 McNeil et al:Thromb. Res.,５２：６０９−６１９の記
載に従いわずかに改変したａＣＬ抗体のＥＬＩＳＡを使
用した。多価第二抗体を用いる場合は、各プレートに既
知陽性血漿を包含させた。試験サンプルのａＣＬ抗体レ
ベルは、ａＣＬ抗体単位で表した。１００単位は、１：
５０希釈における陽性サンプルの４０５nmの吸光度であ
る。
載に従いわずかに改変したａＣＬ抗体のＥＬＩＳＡを使
用した。多価第二抗体を用いる場合は、各プレートに既
知陽性血漿を包含させた。試験サンプルのａＣＬ抗体レ
ベルは、ａＣＬ抗体単位で表した。１００単位は、１：
５０希釈における陽性サンプルの４０５nmの吸光度であ
る。
【００３７】改良ａＣＬ抗体免疫測定法 上述の標準ＣＬ−ＥＬＩＳＡを次のように改良した。１
％ミルク粉末（Diploma ）／０．３％ゼラチン（Ajax)
／ＰＢＳをブロッキング工程に使用し、サンプルは０．
３％ゼラチン／ＰＢＳに希釈して加え、第二の抗体は標
準アッセイにおいて各上記工程に使用した１０％成熟ウ
シ血清（ＡＢＳ）／ＰＢＳに代えて１％ウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）／ＰＢＳに希釈した。他の細部はすべて
上述の標準ＣＬ−ＥＬＩＳＡと同じにした。
％ミルク粉末（Diploma ）／０．３％ゼラチン（Ajax)
／ＰＢＳをブロッキング工程に使用し、サンプルは０．
３％ゼラチン／ＰＢＳに希釈して加え、第二の抗体は標
準アッセイにおいて各上記工程に使用した１０％成熟ウ
シ血清（ＡＢＳ）／ＰＢＳに代えて１％ウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）／ＰＢＳに希釈した。他の細部はすべて
上述の標準ＣＬ−ＥＬＩＳＡと同じにした。
【００３８】ａＣＬ抗体のアフィニティー精製 ａＣＬ抗体レベルの高い患者からの血漿を上述のように
アフィニティーカラムによるクロマトグラフィーに付し
た。このカラムから溶出した蛋白質は０．０５Ｍ酢酸塩
０．０５Ｍ ＮａＣｌ pH４．８に対して一夜透析
し、ついでＦＰＬＣシステムを用いてMono-S陽イオン交
換カラム（Pharmacia ）にアプライした。溶出緩衝液
（０．０５Ｍ酢酸塩 ０．６５Ｍ ＮａＣｌ pH５．
２）１５mlを０〜１００％直線勾配で３０分で適用した
ところ、３０％溶出緩衝液で高度に精製されたａＣＬ抗
体蛋白質が溶出した。
アフィニティーカラムによるクロマトグラフィーに付し
た。このカラムから溶出した蛋白質は０．０５Ｍ酢酸塩
０．０５Ｍ ＮａＣｌ pH４．８に対して一夜透析
し、ついでＦＰＬＣシステムを用いてMono-S陽イオン交
換カラム（Pharmacia ）にアプライした。溶出緩衝液
（０．０５Ｍ酢酸塩 ０．６５Ｍ ＮａＣｌ pH５．
２）１５mlを０〜１００％直線勾配で３０分で適用した
ところ、３０％溶出緩衝液で高度に精製されたａＣＬ抗
体蛋白質が溶出した。
【００３９】血漿コファクターの精製 上述のように、正常血漿をＣＬアフィニティーカラムを
用いるクロマトグラフィーに付した。溶出した蛋白質を
含む画分を、ＹＭ１０膜を用いるAmicon濃縮装置により
圧２００kPa で濃縮し、０．０１Ｍリン酸塩 １Ｍ Ｎ
ａＣｌ pH７．２に対して透析し、さらにＰＡ−１０膜
を用いるMicro-Pro-DiCon 透析濃縮装置（Bio-Molecula
r Dynamics）により２００μｌに濃縮した。濃縮したＣ
Ｌカラム溶出液をＦＰＬＣシステムで操作したPharmaci
a Superose １２ １０／３０ゲル濾過カラムに０．０
１Ｍリン酸塩 １Ｍ ＮａＣｌ pH７．２中、０．４ml
／min でアプライした。コファクター活性が認められた
このカラムからの画分を集め（結果の項参照）、０．０
５Ｍ酢酸塩 ０．０５Ｍ ＮａＣｌ pH４．８に対して
一夜透析し、ついでPharmacia Mono-S陽イオン交換カラ
ムにアプライし、上述したと同じ様式で０．０５Ｍ酢酸
塩 ０．６５Ｍ ＮａＣｌで溶出し、ａＣＬ抗体を精製
した。コファクター活性が認められた画分を集め、ＰＢ
Ｓに対して透析し、小分けして−７０℃で保存した。
用いるクロマトグラフィーに付した。溶出した蛋白質を
含む画分を、ＹＭ１０膜を用いるAmicon濃縮装置により
圧２００kPa で濃縮し、０．０１Ｍリン酸塩 １Ｍ Ｎ
ａＣｌ pH７．２に対して透析し、さらにＰＡ−１０膜
を用いるMicro-Pro-DiCon 透析濃縮装置（Bio-Molecula
r Dynamics）により２００μｌに濃縮した。濃縮したＣ
Ｌカラム溶出液をＦＰＬＣシステムで操作したPharmaci
a Superose １２ １０／３０ゲル濾過カラムに０．０
１Ｍリン酸塩 １Ｍ ＮａＣｌ pH７．２中、０．４ml
／min でアプライした。コファクター活性が認められた
このカラムからの画分を集め（結果の項参照）、０．０
５Ｍ酢酸塩 ０．０５Ｍ ＮａＣｌ pH４．８に対して
一夜透析し、ついでPharmacia Mono-S陽イオン交換カラ
ムにアプライし、上述したと同じ様式で０．０５Ｍ酢酸
塩 ０．６５Ｍ ＮａＣｌで溶出し、ａＣＬ抗体を精製
した。コファクター活性が認められた画分を集め、ＰＢ
Ｓに対して透析し、小分けして−７０℃で保存した。
【００４０】アミノ酸配列 オンライン・フェニルチオヒダントインアミノ酸分析装
置（１２０Ａ型）に接続したApplied Biosystemsシクエ
ンサー（４７７Ａ型）を用いて精製コファクターの自動
エドマン分解を行った。シクエンサーからの全アミノ酸
誘導体を別に述べる改良サンプル移送装置を用いて液体
クロマトグラフに注入した。担体としてはポリブレンを
使用した。
置（１２０Ａ型）に接続したApplied Biosystemsシクエ
ンサー（４７７Ａ型）を用いて精製コファクターの自動
エドマン分解を行った。シクエンサーからの全アミノ酸
誘導体を別に述べる改良サンプル移送装置を用いて液体
クロマトグラフに注入した。担体としてはポリブレンを
使用した。
【００４１】ヘパリンアフィニティーカラムクロマトグ
ラフィー ａＣＬ抗体陽性血漿、またはアフィニティー精製ａＣＬ
抗体、および／または精製コファクターを、０．０１Ｍ
リン酸塩 ０．０５Ｍ ＮａＣｌ pH７．２緩衝液中he
parin-Sepharose ＣＬ−４Ｂ（Pharmacia ）４０mlを充
填したカラムにアプライし、結合した蛋白質を０．０１
Ｍリン酸塩 １Ｍ ＮａＣｌ pH７．２で溶出した。
ラフィー ａＣＬ抗体陽性血漿、またはアフィニティー精製ａＣＬ
抗体、および／または精製コファクターを、０．０１Ｍ
リン酸塩 ０．０５Ｍ ＮａＣｌ pH７．２緩衝液中he
parin-Sepharose ＣＬ−４Ｂ（Pharmacia ）４０mlを充
填したカラムにアプライし、結合した蛋白質を０．０１
Ｍリン酸塩 １Ｍ ＮａＣｌ pH７．２で溶出した。
【００４２】他の方法 ＳＤＳ−ＰＡＧＥのためのサンプルは３％重積ゲルを含
む５〜１５％直線勾配ゲルにかけた。電気泳動後、ゲル
をクーマシーブルーで染色した。蛋白質の定量にはLowr
y の方法を使用した。５０％水酸化アルミニウム懸濁液
（ＢＤＨ Chemicals ）０．１mlを血漿１mlと混合し、
チューブを１５分間、毎分倒立させたのち沈殿を遠心分
離してビタミンＫ依存性凝固因子枯渇血漿を調製した。
む５〜１５％直線勾配ゲルにかけた。電気泳動後、ゲル
をクーマシーブルーで染色した。蛋白質の定量にはLowr
y の方法を使用した。５０％水酸化アルミニウム懸濁液
（ＢＤＨ Chemicals ）０．１mlを血漿１mlと混合し、
チューブを１５分間、毎分倒立させたのち沈殿を遠心分
離してビタミンＫ依存性凝固因子枯渇血漿を調製した。
【００４３】例２ 血漿からのａＣＬ抗体含有イオン交換分画のＣＬアフィ
ニティークロマトグラフィー 前述のように、ａＣＬ抗体およびＬＡ活性を含む血漿は
陽イオン交換クロマトグラフィーで亜群に分離できる。
ａＣＬ抗体含有画分をＣＬアフィニティーカラムに通し
ても結合は認められず、カラムの通過液は適用画分と同
量のａＣＬ抗体を含んでいた。正常血漿をイオン交換画
分に１：１０ｖ／ｖの割合で加え、この混合物をＣＬア
フィニティーカラムに注入すると、アプライしたａＣＬ
抗体の約３０％がカラムに吸着され、カラムから溶出さ
せることができた（表１）。水酸化アルミニウムと混合
してビタミンＫ依存性凝固因子を除去した正常血漿も類
似の結果を生じた。最後に、正常血漿に由来する画分を
精製し（下記参照）、この「コファクター」画分（蛋白
質濃度２００μｇ／ml）を１：５ｖ／ｖの割合で加える
と、適用したａＣＬ抗体の約７４％の吸着が生じた。
ニティークロマトグラフィー 前述のように、ａＣＬ抗体およびＬＡ活性を含む血漿は
陽イオン交換クロマトグラフィーで亜群に分離できる。
ａＣＬ抗体含有画分をＣＬアフィニティーカラムに通し
ても結合は認められず、カラムの通過液は適用画分と同
量のａＣＬ抗体を含んでいた。正常血漿をイオン交換画
分に１：１０ｖ／ｖの割合で加え、この混合物をＣＬア
フィニティーカラムに注入すると、アプライしたａＣＬ
抗体の約３０％がカラムに吸着され、カラムから溶出さ
せることができた（表１）。水酸化アルミニウムと混合
してビタミンＫ依存性凝固因子を除去した正常血漿も類
似の結果を生じた。最後に、正常血漿に由来する画分を
精製し（下記参照）、この「コファクター」画分（蛋白
質濃度２００μｇ／ml）を１：５ｖ／ｖの割合で加える
と、適用したａＣＬ抗体の約７４％の吸着が生じた。
【００４４】例３ 改良ａＣＬ抗体免疫測定法におけるａＣＬ抗体含有イオ
ン交換画分およびアフィニティー精製ａＣＬ抗体の結合 例２で得られた結果は、アフィニティーカラムのＣＬへ
のａＣＬ抗体の結合が血漿依存性であることを示唆して
いる。しかしながら、これらのａＣＬ抗体含有画分およ
びアフィニティー精製ａＣＬ抗体は、標準固相ＣＬ免疫
測定法において、血漿の非存在下に典型的な結合を示
す。これらのアッセイでは、ブロッキング剤および希釈
剤としてＣＬへの抗体の結合に必要な血漿因子を含んで
いた可能性も考えられるウシ血清を使用した。これを試
験するため、ウシ血清を、希釈剤としてゼラチン、ブロ
ッキング剤としてミルク粉末／ゼラチンに置換した。ａ
ＣＬ抗体含有イオン交換画分またはアフィニティー精製
ａＣＬ抗体をこの改良ＣＬ免疫測定法で試験したとこ
ろ、結合は全く起こらなかった。１：５０希釈ではａＣ
Ｌ抗体陽性血漿は標準ＣＬ−ＥＬＩＳＡの場合と同じ結
合を示し、正常血漿は陰性であった。イオン交換画分ま
たはアフィニティー精製プレパレーションにおける抗体
の結合は、正常血漿を１：５０希釈で添加した場合には
認められた。同じ効果が、これらの画分にウシ血清を添
加した場合にもみられた（図１）。すなわち、コファク
ターがウシ血清によって与えられているので、精製ａＣ
Ｌ画分は標準ＣＬ−ＥＬＩＳＡで結合を示すことにな
る。
ン交換画分およびアフィニティー精製ａＣＬ抗体の結合 例２で得られた結果は、アフィニティーカラムのＣＬへ
のａＣＬ抗体の結合が血漿依存性であることを示唆して
いる。しかしながら、これらのａＣＬ抗体含有画分およ
びアフィニティー精製ａＣＬ抗体は、標準固相ＣＬ免疫
測定法において、血漿の非存在下に典型的な結合を示
す。これらのアッセイでは、ブロッキング剤および希釈
剤としてＣＬへの抗体の結合に必要な血漿因子を含んで
いた可能性も考えられるウシ血清を使用した。これを試
験するため、ウシ血清を、希釈剤としてゼラチン、ブロ
ッキング剤としてミルク粉末／ゼラチンに置換した。ａ
ＣＬ抗体含有イオン交換画分またはアフィニティー精製
ａＣＬ抗体をこの改良ＣＬ免疫測定法で試験したとこ
ろ、結合は全く起こらなかった。１：５０希釈ではａＣ
Ｌ抗体陽性血漿は標準ＣＬ−ＥＬＩＳＡの場合と同じ結
合を示し、正常血漿は陰性であった。イオン交換画分ま
たはアフィニティー精製プレパレーションにおける抗体
の結合は、正常血漿を１：５０希釈で添加した場合には
認められた。同じ効果が、これらの画分にウシ血清を添
加した場合にもみられた（図１）。すなわち、コファク
ターがウシ血清によって与えられているので、精製ａＣ
Ｌ画分は標準ＣＬ−ＥＬＩＳＡで結合を示すことにな
る。
【００４５】この改良ＣＬ−ＥＬＩＳＡは、アフィニテ
ィー精製ａＣＬ抗体と未知量のコファクターを含有する
画分の混合物を含むサンプルを試験することによって、
正常血漿に由来する画分中のコファクター活性を検出す
る便利な方法を提供する。コファクターが存在しない
と、アフィニティー精製ａＣＬ抗体は結合せず、結合が
あれば試験画分中のコファクター活性の証明になった。
以下に記載するように、コファクター活性を正常血漿か
ら精製し、この画分をアフィニティー精製ａＣＬ抗体ま
たはａＣＬ抗体含有イオン交換画分に添加すると改良Ｃ
Ｌ−ＥＬＩＳＡにおいてこれらの抗体の結合を生じた
（図１）。
ィー精製ａＣＬ抗体と未知量のコファクターを含有する
画分の混合物を含むサンプルを試験することによって、
正常血漿に由来する画分中のコファクター活性を検出す
る便利な方法を提供する。コファクターが存在しない
と、アフィニティー精製ａＣＬ抗体は結合せず、結合が
あれば試験画分中のコファクター活性の証明になった。
以下に記載するように、コファクター活性を正常血漿か
ら精製し、この画分をアフィニティー精製ａＣＬ抗体ま
たはａＣＬ抗体含有イオン交換画分に添加すると改良Ｃ
Ｌ−ＥＬＩＳＡにおいてこれらの抗体の結合を生じた
（図１）。
【００４６】アフィニティークロマトグラフィーシステ
ムにおいて、血漿のイオン交換に由来する画分に含まれ
るａＣＬ抗体は、血漿の存在下とは異なり、固定化ＣＬ
に結合しなかったが、イオン交換画分に正常血漿を加え
たところ結合が起こった。これは、血漿コファクターが
ａＣＬ抗体−ＣＬ相互作用に関与することの最初の示唆
であり、これは、このコファクター活性を単一の血漿蛋
白質、β−２ＧＰＩに単離することによって確認された
（表１）。この要求が証明されたことから、これらのイ
オン交換画分が何故、標準ＣＬ−ＥＬＩＳＡでＣＬを結
合したかが問題となった。一つの説明は、免疫測定法に
使用したウシ血清希釈剤におけるコファクターまたは類
似分子の存在である。これは、ＣＬ−ＥＬＩＳＡを、ウ
シ血清を省いて、希釈剤としてゼラチンを用いて改変す
ることによって確認された。このアッセイでは、ａＣＬ
抗体含有イオン交換画分およびアフィニティー精製ａＣ
Ｌ抗体は正常血漿またはウシ血清を加えないとＣＬを結
合しなかった（図１）。この系でも、コファクター活性
はβ−２ＧＰＩに単離された。これは、連続的に検討さ
れた４例の患者からの１１の別個のａＣＬ抗体含有イオ
ン交換画分および３種のアフィニティー精製ａＣＬ抗体
プレパレーション（２つはＩｇＧ，１つはＩｇＭ）にお
ける所見と一致した（データは示していない）。
ムにおいて、血漿のイオン交換に由来する画分に含まれ
るａＣＬ抗体は、血漿の存在下とは異なり、固定化ＣＬ
に結合しなかったが、イオン交換画分に正常血漿を加え
たところ結合が起こった。これは、血漿コファクターが
ａＣＬ抗体−ＣＬ相互作用に関与することの最初の示唆
であり、これは、このコファクター活性を単一の血漿蛋
白質、β−２ＧＰＩに単離することによって確認された
（表１）。この要求が証明されたことから、これらのイ
オン交換画分が何故、標準ＣＬ−ＥＬＩＳＡでＣＬを結
合したかが問題となった。一つの説明は、免疫測定法に
使用したウシ血清希釈剤におけるコファクターまたは類
似分子の存在である。これは、ＣＬ−ＥＬＩＳＡを、ウ
シ血清を省いて、希釈剤としてゼラチンを用いて改変す
ることによって確認された。このアッセイでは、ａＣＬ
抗体含有イオン交換画分およびアフィニティー精製ａＣ
Ｌ抗体は正常血漿またはウシ血清を加えないとＣＬを結
合しなかった（図１）。この系でも、コファクター活性
はβ−２ＧＰＩに単離された。これは、連続的に検討さ
れた４例の患者からの１１の別個のａＣＬ抗体含有イオ
ン交換画分および３種のアフィニティー精製ａＣＬ抗体
プレパレーション（２つはＩｇＧ，１つはＩｇＭ）にお
ける所見と一致した（データは示していない）。
【００４７】例４ 正常血漿におけるコファクターの精製と同定 正常血漿をＣＬアフィニティーカラムを用いてクロマト
グラフィーに付し、各画分について改良ＣＬ−ＥＬＩＳ
Ａを用いて上述のようにコファクター活性を試験した。
コファクター活性は溶出蛋白質中に見出され、これは、
この因子がａＣＬ抗体の非存在下でも陰イオン性リン脂
質に結合することを示している。これらの画分を濃縮
し、１Ｍ ＮａＣｌ緩衝液中Superose １２ゲル濾過カ
ラムによるクロマトグラフィーに付した。コファクター
活性は、このカラムでは見掛けの分子量６７kDa に相当
するKav ０．３５０のピークに認められた（図２）。こ
のピークを含む画分を集め、イオン交換開始緩衝液に対
して透析し、Mono-Sカラムによるクロマトグラフィーに
付した。コファクター活性は、約０．５Ｍ ＮａＣｌで
溶出する遅いピークに見出された（図３）。
グラフィーに付し、各画分について改良ＣＬ−ＥＬＩＳ
Ａを用いて上述のようにコファクター活性を試験した。
コファクター活性は溶出蛋白質中に見出され、これは、
この因子がａＣＬ抗体の非存在下でも陰イオン性リン脂
質に結合することを示している。これらの画分を濃縮
し、１Ｍ ＮａＣｌ緩衝液中Superose １２ゲル濾過カ
ラムによるクロマトグラフィーに付した。コファクター
活性は、このカラムでは見掛けの分子量６７kDa に相当
するKav ０．３５０のピークに認められた（図２）。こ
のピークを含む画分を集め、イオン交換開始緩衝液に対
して透析し、Mono-Sカラムによるクロマトグラフィーに
付した。コファクター活性は、約０．５Ｍ ＮａＣｌで
溶出する遅いピークに見出された（図３）。
【００４８】イオン交換カラムからの最終プレパレーシ
ョンは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上、還元条件下でも非還元条
件下でも見掛けの分子量５０kDa の単一のバンドを示
し、高度に精製されていることがわかった（図４）。こ
のバンドは、血漿含有ａＣＬ抗体をＣＬまたはＰＳ−ア
フィニティーカラムによるクロマトグラフィーに付した
場合に、それらのカラム溶出液中に認められたバンドに
相当した（図４にも示してある）。コファクターのＮ末
端アミノ酸配列を図５に示す。現時点での公開されたデ
ーターベースのコンピューター検索により、この配列は
アポリポ蛋白質Ｈとしても知られている血漿蛋白質、β
−２−グリコプロティン−Ｉのアミノ酸末端配列と一致
することがわかる。この配列にホモロジーを示す蛋白質
は、Canfield & Kisiel(J. Clin. Invest.,７０：１２
６０−１２７２，１９８２）によって精製され、活性化
プロテインＣ結合蛋白質と呼ばれ、その後β−２ＧＰＩ
と同一であることが報告された血漿蛋白質以外になかっ
た。
ョンは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上、還元条件下でも非還元条
件下でも見掛けの分子量５０kDa の単一のバンドを示
し、高度に精製されていることがわかった（図４）。こ
のバンドは、血漿含有ａＣＬ抗体をＣＬまたはＰＳ−ア
フィニティーカラムによるクロマトグラフィーに付した
場合に、それらのカラム溶出液中に認められたバンドに
相当した（図４にも示してある）。コファクターのＮ末
端アミノ酸配列を図５に示す。現時点での公開されたデ
ーターベースのコンピューター検索により、この配列は
アポリポ蛋白質Ｈとしても知られている血漿蛋白質、β
−２−グリコプロティン−Ｉのアミノ酸末端配列と一致
することがわかる。この配列にホモロジーを示す蛋白質
は、Canfield & Kisiel(J. Clin. Invest.,７０：１２
６０−１２７２，１９８２）によって精製され、活性化
プロテインＣ結合蛋白質と呼ばれ、その後β−２ＧＰＩ
と同一であることが報告された血漿蛋白質以外になかっ
た。
【００４９】ＩｇＧ−ａＣＬ抗体含有血漿をＣＬまたは
ＰＳ−アフィニティーカラムによるクロマトグラフィー
に付した場合、２つの大きな蛋白質バンドが溶出する。
これらの一つはＩｇＧで、他はβ−２ＧＰＩである（図
４）。β−２ＧＰＩはＣＬアフィニティーカラムを用い
て正常血漿から精製されたことから、β−２ＧＰＩはａ
ＣＬ抗体の存在下にも非存在下にも陰イオン性リン脂質
カラムに結合することは明らかである。しかしながら、
これらの抗体はβ−２ＧＰＩの非存在下にはＣＬに結合
しない。精製β−２ＧＰＩはヘパリン−Sepharose カラ
ムに結合し、ａＣＬは結合しなかったが、ａＣＬ抗体は
結合β−２ＧＰＩの存在下でもこのカラムに結合しなか
った。すなわち、ａＣＬ抗体は陰イオン性リン脂質に結
合したβ−２ＧＰＩは認識するが、ヘパリンに結合した
β−２ＧＰＩは認識しない。これは、リン脂質およびグ
リコプロティンはいずれもこれらの抗体が標的とするエ
ピトープを構成することを示している。これらの結果
は、ａＣＬ抗体が陰イオン性リン脂質に結合したβ−２
ＧＰＩからなる複合体またはβ−２ＧＰＩのリン脂質と
の相互作用の間に形成された潜在エピトープを標的とす
るが、リン脂質の存在と無関係なβ−２ＧＰＩは標的と
しないことを示唆している。
ＰＳ−アフィニティーカラムによるクロマトグラフィー
に付した場合、２つの大きな蛋白質バンドが溶出する。
これらの一つはＩｇＧで、他はβ−２ＧＰＩである（図
４）。β−２ＧＰＩはＣＬアフィニティーカラムを用い
て正常血漿から精製されたことから、β−２ＧＰＩはａ
ＣＬ抗体の存在下にも非存在下にも陰イオン性リン脂質
カラムに結合することは明らかである。しかしながら、
これらの抗体はβ−２ＧＰＩの非存在下にはＣＬに結合
しない。精製β−２ＧＰＩはヘパリン−Sepharose カラ
ムに結合し、ａＣＬは結合しなかったが、ａＣＬ抗体は
結合β−２ＧＰＩの存在下でもこのカラムに結合しなか
った。すなわち、ａＣＬ抗体は陰イオン性リン脂質に結
合したβ−２ＧＰＩは認識するが、ヘパリンに結合した
β−２ＧＰＩは認識しない。これは、リン脂質およびグ
リコプロティンはいずれもこれらの抗体が標的とするエ
ピトープを構成することを示している。これらの結果
は、ａＣＬ抗体が陰イオン性リン脂質に結合したβ−２
ＧＰＩからなる複合体またはβ−２ＧＰＩのリン脂質と
の相互作用の間に形成された潜在エピトープを標的とす
るが、リン脂質の存在と無関係なβ−２ＧＰＩは標的と
しないことを示唆している。
【００５０】例５ 改良ＣＬ−ＥＬＩＳＡにおける精製β−２ＧＰＩとアフ
ィニティー精製ａＣＬ抗体の相互作用 アフィニティー精製ａＣＬ抗体は、β−２ＧＰＩが存在
しないと改良ＣＬ−ＥＬＩＳＡにおいてＣＬを結合しな
い（図１）ので、上述のように精製した糖蛋白質の希釈
系列の存在下に、この抗体の希釈系列の結合を調べた。
結果は図６ａに示す。８μｇ／mlのβ−２ＧＰＩの存在
下に、ａＣＬ抗体の希釈系列は標準ＣＬ−ＥＬＩＳＡで
みられる典型的な結合曲線を示す。β−２ＧＰＩの希釈
の増大とともに、抗体のすべての希釈で、結合は劇的に
低下して、グリコプロティンが１μｇ／mlに低下すると
実質的に結合は認められなかった。図６ａに示した破線
は両因子の希釈系列を説明するものである。ａＣＬ抗体
陽性血漿の希釈は図６ｂに示す。実線は、ＡＢＳの存在
がすべての抗体希釈で適当なコファクターを保証する場
合の、標準ＣＬ−ＥＬＩＳＡにおいて見慣れた結合曲線
を示している。破線は、ａＣＬ抗体陽性血漿を改良ＣＬ
−ＥＬＩＳＡにおいて希釈した場合の結合曲線を示して
いる。血漿がβ−２ＧＰＩレベル１μｇ／mlに相当する
１：２００に希釈されると、抗体の結合は事実上認めら
れない。
ィニティー精製ａＣＬ抗体の相互作用 アフィニティー精製ａＣＬ抗体は、β−２ＧＰＩが存在
しないと改良ＣＬ−ＥＬＩＳＡにおいてＣＬを結合しな
い（図１）ので、上述のように精製した糖蛋白質の希釈
系列の存在下に、この抗体の希釈系列の結合を調べた。
結果は図６ａに示す。８μｇ／mlのβ−２ＧＰＩの存在
下に、ａＣＬ抗体の希釈系列は標準ＣＬ−ＥＬＩＳＡで
みられる典型的な結合曲線を示す。β−２ＧＰＩの希釈
の増大とともに、抗体のすべての希釈で、結合は劇的に
低下して、グリコプロティンが１μｇ／mlに低下すると
実質的に結合は認められなかった。図６ａに示した破線
は両因子の希釈系列を説明するものである。ａＣＬ抗体
陽性血漿の希釈は図６ｂに示す。実線は、ＡＢＳの存在
がすべての抗体希釈で適当なコファクターを保証する場
合の、標準ＣＬ−ＥＬＩＳＡにおいて見慣れた結合曲線
を示している。破線は、ａＣＬ抗体陽性血漿を改良ＣＬ
−ＥＬＩＳＡにおいて希釈した場合の結合曲線を示して
いる。血漿がβ−２ＧＰＩレベル１μｇ／mlに相当する
１：２００に希釈されると、抗体の結合は事実上認めら
れない。
【００５１】改良ＣＬ−ＥＬＩＳＡは、コファクター効
果をさらに詳細に調べるのに便利な系であることがわか
った。ＣＬへのａＣＬ抗体の結合に対するβ−２ＧＰＩ
の作用は、急峻な希釈効果をもつ用量依存性を示し、β
−２ＧＰＩの存在が１μｇ／mlまたはそれ未満になった
場合、抗体の結合はいずれの希釈でも事実上認められな
いことがわかった（図６ａ）。β−２ＧＰＩの正常血漿
レベルが２００μｇ／mlであるから、この数字は改良Ｃ
Ｌ−ＥＬＩＳＡにおけるａＣＬ抗体陽性血漿の希釈結果
に正確に一致し、この場合、かなりの量のａＣＬ抗体が
存在していても、結合は急速に低下し、１：２００の希
釈では、すなわちβ−２ＧＰＩレベル１μｇ／mlでは認
められなくなった（図６ｂ）。
果をさらに詳細に調べるのに便利な系であることがわか
った。ＣＬへのａＣＬ抗体の結合に対するβ−２ＧＰＩ
の作用は、急峻な希釈効果をもつ用量依存性を示し、β
−２ＧＰＩの存在が１μｇ／mlまたはそれ未満になった
場合、抗体の結合はいずれの希釈でも事実上認められな
いことがわかった（図６ａ）。β−２ＧＰＩの正常血漿
レベルが２００μｇ／mlであるから、この数字は改良Ｃ
Ｌ−ＥＬＩＳＡにおけるａＣＬ抗体陽性血漿の希釈結果
に正確に一致し、この場合、かなりの量のａＣＬ抗体が
存在していても、結合は急速に低下し、１：２００の希
釈では、すなわちβ−２ＧＰＩレベル１μｇ／mlでは認
められなくなった（図６ｂ）。
【００５２】例６ ヘパリン・アフィニティークロマトグラフィー アフィニティー精製ａＣＬ抗体は、ヘパリン−Sepharos
e アフィニティーカラムには結合せず、適用したａＣＬ
抗体の約６０％が通過画分中に回収されたが、抗体は１
Ｍ ＮａＣｌで溶出されなかった。精製β−２ＧＰＩ
は、ヘパリン−Sepharose カラムに適用した場合、それ
に結合した。アフィニティー精製ａＣＬ抗体と精製β−
２ＧＰＩの混合物をヘパリン−Sepharose カラムに注入
すると、通過液はａＣＬを含むがβ−２ＧＰＩは含ま
ず、溶出された蛋白質にはβ−２ＧＰＩを含むが、ａＣ
Ｌは含まれなかった。ａＣＬ抗体含有血漿をヘパリン−
Sepharose カラムに注入すると、通過液は適用血漿に相
当する量のａＣＬ抗体を含み、溶出された蛋白質にはβ
−２ＧＰＩを含むが、ａＣＬ抗体は含まれなかった。
e アフィニティーカラムには結合せず、適用したａＣＬ
抗体の約６０％が通過画分中に回収されたが、抗体は１
Ｍ ＮａＣｌで溶出されなかった。精製β−２ＧＰＩ
は、ヘパリン−Sepharose カラムに適用した場合、それ
に結合した。アフィニティー精製ａＣＬ抗体と精製β−
２ＧＰＩの混合物をヘパリン−Sepharose カラムに注入
すると、通過液はａＣＬを含むがβ−２ＧＰＩは含ま
ず、溶出された蛋白質にはβ−２ＧＰＩを含むが、ａＣ
Ｌは含まれなかった。ａＣＬ抗体含有血漿をヘパリン−
Sepharose カラムに注入すると、通過液は適用血漿に相
当する量のａＣＬ抗体を含み、溶出された蛋白質にはβ
−２ＧＰＩを含むが、ａＣＬ抗体は含まれなかった。
【００５３】
【表１】
【００５４】ａＰＬ抗体がβ−２ＧＰＩを包含する抗原
を標的とするとの所見は、これらの自己抗体の理解に新
しい道を開くものである。それは、構造が様々に変化す
るにもかかわらず、すべての陰イオン性リン脂質に等し
くａＰＬ抗体が結合することの説明を提供する。さら
に、β−２ＧＰＩは、凝固の内的経路およびＡＤＰ依存
性血小板凝集を阻害すると考えられるので、これらの所
見は、ａＰＬ抗体がｉｎｖｉｖｏにおいてβ−２ＧＰＩ
の機能に干渉し、前血栓性素因を与える可能性も考えさ
せる。さらにまた、β−２ＧＰＩが陰イオン性巨大分子
を結合するならば、これには感染微生物に由来する巨大
分子も包含されることが考えられる。β−２ＧＰＩと複
合体を形成した異種抗原であれば、ａＰＬ抗体の産生の
免疫原性刺激となることが考えられ、これは多くの感染
疾患でよく認められていることである。
を標的とするとの所見は、これらの自己抗体の理解に新
しい道を開くものである。それは、構造が様々に変化す
るにもかかわらず、すべての陰イオン性リン脂質に等し
くａＰＬ抗体が結合することの説明を提供する。さら
に、β−２ＧＰＩは、凝固の内的経路およびＡＤＰ依存
性血小板凝集を阻害すると考えられるので、これらの所
見は、ａＰＬ抗体がｉｎｖｉｖｏにおいてβ−２ＧＰＩ
の機能に干渉し、前血栓性素因を与える可能性も考えさ
せる。さらにまた、β−２ＧＰＩが陰イオン性巨大分子
を結合するならば、これには感染微生物に由来する巨大
分子も包含されることが考えられる。β−２ＧＰＩと複
合体を形成した異種抗原であれば、ａＰＬ抗体の産生の
免疫原性刺激となることが考えられ、これは多くの感染
疾患でよく認められていることである。
【００５５】例７ サンプル 血液は静脈穿刺で、最終容量の１／１０の０．１Ｍクエ
ン酸三ナトリウムを含むチューブに採取し、２，３回倒
立させて、２，５００ｇで１５分間遠心分離した。血漿
を吸引し、ついでMillipore Millex GS ２２μＭフィル
ターで濾過して血小板屑を除去し、−２０℃で保存し
た。Ａ型肝炎、結核、感染性単球症、マラリヤおよび梅
毒患者からの血漿または血清は他の研究所から入手し
た。
ン酸三ナトリウムを含むチューブに採取し、２，３回倒
立させて、２，５００ｇで１５分間遠心分離した。血漿
を吸引し、ついでMillipore Millex GS ２２μＭフィル
ターで濾過して血小板屑を除去し、−２０℃で保存し
た。Ａ型肝炎、結核、感染性単球症、マラリヤおよび梅
毒患者からの血漿または血清は他の研究所から入手し
た。
【００５６】標準抗カルジオリピン抗体アッセイ 以前に報告1 され、McNellら2 によって改良された酵素
連結免疫測定法を用い、サンプルのａＣＬ抗体を検定す
る。サンプルは１：５０希釈で検定した。第二の抗体と
しては、ヤギ抗−ヒトＩｇＧ、ＩｇＭもしくはＩｇＡ特
異的および／または多価のアルカリホスファターゼ接合
免疫グロブリン（Sigma)を使用した。多価またはＩｇＡ
第二抗体を使用する場合は、各プレートに既知陽性血漿
の希釈系列を包含させた。試験サンプルのａＣＬレベル
は、ａＣＬ単位で表した。１００単位は、１：５０希釈
における陽性サンプルの４０５nmの吸光度である。Ｉｇ
ＧまたはＩｇＭ特異的第二抗体を使用する場合は、各プ
レートにRayne Institute 標準（St. Thomas病院、Lond
on、より提供される）に対して検量した陽性サンプルの
希釈液を包含させた。ａＣＬレベルは対数−対数プロッ
トを用い対照血清から読取り、それぞれＧＰＬまたはＭ
ＰＬ単位（ＩｇＧリン脂質またはＩｇＭリン脂質単位。
１単位はアフィニティー精製ａＣＬ １μｇの活性に相
当する）で表す3 。記録されたレベルが１６個の対照平
均から３標準偏差以上大きい場合にａＣＬ陽性とみなし
た。
連結免疫測定法を用い、サンプルのａＣＬ抗体を検定す
る。サンプルは１：５０希釈で検定した。第二の抗体と
しては、ヤギ抗−ヒトＩｇＧ、ＩｇＭもしくはＩｇＡ特
異的および／または多価のアルカリホスファターゼ接合
免疫グロブリン（Sigma)を使用した。多価またはＩｇＡ
第二抗体を使用する場合は、各プレートに既知陽性血漿
の希釈系列を包含させた。試験サンプルのａＣＬレベル
は、ａＣＬ単位で表した。１００単位は、１：５０希釈
における陽性サンプルの４０５nmの吸光度である。Ｉｇ
ＧまたはＩｇＭ特異的第二抗体を使用する場合は、各プ
レートにRayne Institute 標準（St. Thomas病院、Lond
on、より提供される）に対して検量した陽性サンプルの
希釈液を包含させた。ａＣＬレベルは対数−対数プロッ
トを用い対照血清から読取り、それぞれＧＰＬまたはＭ
ＰＬ単位（ＩｇＧリン脂質またはＩｇＭリン脂質単位。
１単位はアフィニティー精製ａＣＬ １μｇの活性に相
当する）で表す3 。記録されたレベルが１６個の対照平
均から３標準偏差以上大きい場合にａＣＬ陽性とみなし
た。
【００５７】イオン交換クロマトグラフィー 血漿サンプル（０．５ml）を開始緩衝液（０．０５Ｍ酢
酸塩 ０．０５Ｍ ＮａＣｌ pH４．８）に対して透析
し、５０００ｇで５分間遠心分離し、ついでPharmacia
FPLCシステムを用い、Pharmacia Mono-S ＨＲ５／５陽
イオン交換カラムに０．５ml／min の流速でアプライし
た。緩衝液、流速および勾配条件は、以前に記載された
通りである18 。吸収は２８０nmでモニタリングし、１
mlの画分を集めた。各画分について上述の標準ａＣＬ−
ＥＬＩＳＡを用い、１／５希釈でａＣＬ抗体を検定し
た。
酸塩 ０．０５Ｍ ＮａＣｌ pH４．８）に対して透析
し、５０００ｇで５分間遠心分離し、ついでPharmacia
FPLCシステムを用い、Pharmacia Mono-S ＨＲ５／５陽
イオン交換カラムに０．５ml／min の流速でアプライし
た。緩衝液、流速および勾配条件は、以前に記載された
通りである18 。吸収は２８０nmでモニタリングし、１
mlの画分を集めた。各画分について上述の標準ａＣＬ−
ＥＬＩＳＡを用い、１／５希釈でａＣＬ抗体を検定し
た。
【００５８】改良ＣＬ−ＥＬＩＳＡ 上述の標準ＣＬ−ＥＬＩＳＡをオーストラリア特許出願
ＰＪ９５４９号に記載のように改良した。この記載は参
考として本明細書に導入する。略述すれば、ウエルを１
０％成熟ウシ血清（ＡＢＳ）／ＰＢＳに代えて０．３％
ゼラチン／１％ミルク粉末（Diploma ）／リン酸緩衝食
塩溶液（０．０１Ｍ リン酸塩０．１５Ｍ食塩pH７．
３）（ＰＢＳ）でブロックした。サンプルを０．３％ゼ
ラチン／ＰＢＳに希釈し、第二抗体は、標準ＣＬ−ＥＬ
ＩＳＡの全工程の希釈剤である１０％ＡＢＳ／ＰＢＳに
代えて、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＰＢＳに
希釈した。
ＰＪ９５４９号に記載のように改良した。この記載は参
考として本明細書に導入する。略述すれば、ウエルを１
０％成熟ウシ血清（ＡＢＳ）／ＰＢＳに代えて０．３％
ゼラチン／１％ミルク粉末（Diploma ）／リン酸緩衝食
塩溶液（０．０１Ｍ リン酸塩０．１５Ｍ食塩pH７．
３）（ＰＢＳ）でブロックした。サンプルを０．３％ゼ
ラチン／ＰＢＳに希釈し、第二抗体は、標準ＣＬ−ＥＬ
ＩＳＡの全工程の希釈剤である１０％ＡＢＳ／ＰＢＳに
代えて、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＰＢＳに
希釈した。
【００５９】改良ＣＬ−ＥＬＩＳＡにおける精製β−２
ＧＰＩの ａＣＬ抗体の結合に対する影響 標準ＣＬ−ＥＬＩＳＡにおいて陽性であったイオン交換
画分を精製β−２ＧＰＩ（８μｇ／ml）の存在下および
非存在下に、改良ＣＬ−ＥＬＩＳＡシステムで検定し
た。精製β−２ＧＰＩはＰＪ９５４９号に記述のように
して得た。
ＧＰＩの ａＣＬ抗体の結合に対する影響 標準ＣＬ−ＥＬＩＳＡにおいて陽性であったイオン交換
画分を精製β−２ＧＰＩ（８μｇ／ml）の存在下および
非存在下に、改良ＣＬ−ＥＬＩＳＡシステムで検定し
た。精製β−２ＧＰＩはＰＪ９５４９号に記述のように
して得た。
【００６０】β−２ＧＰＩのラジオイムノアッセイ 本発明者らの２名ほか4 によって開発された 125Ｉ−β
−２ＧＰＩおよびβ−２ＧＰＩに対するポリクローナル
ウサギ抗体を使用する固相ＲＩＡを用いて、イオン交換
カラムからの画分を検定した。各サンプル中のβ−２Ｇ
ＰＩのレベルは、４パラメーター算定曲線適合プログラ
ム5 を用いて読み取った。このＲＩＡの感度は７５ng／
ml4 であった。
−２ＧＰＩおよびβ−２ＧＰＩに対するポリクローナル
ウサギ抗体を使用する固相ＲＩＡを用いて、イオン交換
カラムからの画分を検定した。各サンプル中のβ−２Ｇ
ＰＩのレベルは、４パラメーター算定曲線適合プログラ
ム5 を用いて読み取った。このＲＩＡの感度は７５ng／
ml4 であった。
【００６１】結果 血漿のａＣＬ−ＥＬＩＳＡ 研究対象とした患者中、２３例は感染症（梅毒６例、マ
ラリア９例、Ａ型肝炎２例、結核２例、感染性単球症４
例）、１２例は自己免疫疾患〔原発性抗リン脂質症候群
（ＰＡＰＳ）７例および全身性エリテマトーデス（ＳＬ
Ｅ）５例〕の診断であった。表２および３は対象患者の
臨床特性およびａＣＬ状態の一覧である。数値の範囲お
よびアイソタイプの分布には変動がある。感染症の患者
は、ＩｇＧ（梅毒）、ＩｇＭ（感染性単球症および結
核）ならびにＩｇＧ、ＭおよびＡ（マラリアおよびＡ型
肝炎）に対してとくに強い陽性をしめしたが、一方、Ｐ
ＡＰＳまたはＳＬＥと診断された患者では３種のすべて
のアイソタイプについてより一様な傾向を示した。
ラリア９例、Ａ型肝炎２例、結核２例、感染性単球症４
例）、１２例は自己免疫疾患〔原発性抗リン脂質症候群
（ＰＡＰＳ）７例および全身性エリテマトーデス（ＳＬ
Ｅ）５例〕の診断であった。表２および３は対象患者の
臨床特性およびａＣＬ状態の一覧である。数値の範囲お
よびアイソタイプの分布には変動がある。感染症の患者
は、ＩｇＧ（梅毒）、ＩｇＭ（感染性単球症および結
核）ならびにＩｇＧ、ＭおよびＡ（マラリアおよびＡ型
肝炎）に対してとくに強い陽性をしめしたが、一方、Ｐ
ＡＰＳまたはＳＬＥと診断された患者では３種のすべて
のアイソタイプについてより一様な傾向を示した。
【００６２】血漿のイオン交換クロマトグラフィー 前述のように5 、ａＣＬ抗体を含有する血漿は陽イオン
交換クロマトグラフィーによって亜群に分離することが
できる。患者血漿の典型的なイオン交換像を例示した図
９から明らかなように、β−２ＧＰＩは、早い画分に溶
出したａＣＬ活性とは離れて、単一ピーク（画分１７お
よび１８）として溶出した。同じ操作を用いたイオン交
換クロマトグラフィーでａＣＬ活性の回収は７０％を越
えるとの以前の報告6 がある。
交換クロマトグラフィーによって亜群に分離することが
できる。患者血漿の典型的なイオン交換像を例示した図
９から明らかなように、β−２ＧＰＩは、早い画分に溶
出したａＣＬ活性とは離れて、単一ピーク（画分１７お
よび１８）として溶出した。同じ操作を用いたイオン交
換クロマトグラフィーでａＣＬ活性の回収は７０％を越
えるとの以前の報告6 がある。
【００６３】精製β−２ＧＰＩの存在下および非存在
下、改良ＣＬ−ＥＬＩＳＡにおけるａＣＬ抗体含有イオ
ン交換画分の結合 改良ＣＬ−ＥＬＩＳＡシステムにおけるイオン交換画分
からのａＣＬ抗体の結合の結果を図１０（Ａ〜Ｂ）およ
び図１１（Ａ〜Ｄ）にまとめる。
下、改良ＣＬ−ＥＬＩＳＡにおけるａＣＬ抗体含有イオ
ン交換画分の結合 改良ＣＬ−ＥＬＩＳＡシステムにおけるイオン交換画分
からのａＣＬ抗体の結合の結果を図１０（Ａ〜Ｂ）およ
び図１１（Ａ〜Ｄ）にまとめる。
【００６４】感染に関連したａＣＬを有する患者 ａＣＬ抗体が感染に関連している患者からのイオン交換
画分は、β−２ＧＰＩを添加しない改良ＣＬ−ＥＬＩＳ
Ａシステムにおいて、例外なくＣＬを結合した。β−２
ＧＰＩの添加はａＣＬ結合の中程度の阻害を生じた。ａ
ＣＬのＣＬへの結合は、平均、ＩｇＧで３４％、ＩｇＭ
で３３％、ＩｇＡで４６％低下した。
画分は、β−２ＧＰＩを添加しない改良ＣＬ−ＥＬＩＳ
Ａシステムにおいて、例外なくＣＬを結合した。β−２
ＧＰＩの添加はａＣＬ結合の中程度の阻害を生じた。ａ
ＣＬのＣＬへの結合は、平均、ＩｇＧで３４％、ＩｇＭ
で３３％、ＩｇＡで４６％低下した。
【００６５】自己免疫に関連したａＣＬを有する患者 自己免疫疾患を有する患者からのａＣＬ抗体含有画分を
改良ＩｇＧ ＣＬ−ＥＬＩＳＡで試験したところ、８例
中５例（＃２４，２６，２７，２８および３０）ではβ
−２ＧＰＩを添加しないと結合を生じなかった（図１１
Ａ）。β−２ＧＰＩを添加すると劇的な結合の上昇が起
こった〔β−２ＧＰＩ非添加の場合の４５０nmにおける
平均吸光度±ＳＤ（ｎ＝５）：０．０７２±０．０５
８；β−２ＧＰＩ添加の場合：１．１８６±０．４３
０〕（図１１Ｂ）。残りの３例の患者中２例のサンプル
（＃２９および３１）は、β−２ＧＰＩを添加しないで
も有意な結合を示し、β−２ＧＰＩを添加した場合結合
のわずかな上昇を示した。１例の患者サンプル（＃２
５）のみがβ−２ＧＰＩを添加しないでも有意 な結合
を示し、β−２ＧＰＩを添加した場合には結合の阻害を
生じた（図１１Ａおよび１１Ｃ）。
改良ＩｇＧ ＣＬ−ＥＬＩＳＡで試験したところ、８例
中５例（＃２４，２６，２７，２８および３０）ではβ
−２ＧＰＩを添加しないと結合を生じなかった（図１１
Ａ）。β−２ＧＰＩを添加すると劇的な結合の上昇が起
こった〔β−２ＧＰＩ非添加の場合の４５０nmにおける
平均吸光度±ＳＤ（ｎ＝５）：０．０７２±０．０５
８；β−２ＧＰＩ添加の場合：１．１８６±０．４３
０〕（図１１Ｂ）。残りの３例の患者中２例のサンプル
（＃２９および３１）は、β−２ＧＰＩを添加しないで
も有意な結合を示し、β−２ＧＰＩを添加した場合結合
のわずかな上昇を示した。１例の患者サンプル（＃２
５）のみがβ−２ＧＰＩを添加しないでも有意 な結合
を示し、β−２ＧＰＩを添加した場合には結合の阻害を
生じた（図１１Ａおよび１１Ｃ）。
【００６６】一般的に、自己免疫群はＩｇＭ−ａＣＬに
対しては弱い陽性を示すのみで、わずかに４例のサンプ
ルが改良ａＣＬ−ＥＬＩＳＡで試験できる十分なＩｇＭ
−ａＣＬ活性をもつイオン交換画分を与えたにすぎなか
った。１例の患者サンプル（＃２９）ではβ−２ＧＰＩ
を添加した場合にのみＣＬを結合した。３例の患者サン
プルはβ−２ＧＰＩ非添加である程度のＣＬへの結合を
示したが、β−２ＧＰＩを添加すると２例の患者サンプ
ル（＃２５および２７）では結合のわずかな上昇を、１
例の患者サンプル（＃２４）では緩和な阻害を認めた
（データは示していない）。
対しては弱い陽性を示すのみで、わずかに４例のサンプ
ルが改良ａＣＬ−ＥＬＩＳＡで試験できる十分なＩｇＭ
−ａＣＬ活性をもつイオン交換画分を与えたにすぎなか
った。１例の患者サンプル（＃２９）ではβ−２ＧＰＩ
を添加した場合にのみＣＬを結合した。３例の患者サン
プルはβ−２ＧＰＩ非添加である程度のＣＬへの結合を
示したが、β−２ＧＰＩを添加すると２例の患者サンプ
ル（＃２５および２７）では結合のわずかな上昇を、１
例の患者サンプル（＃２４）では緩和な阻害を認めた
（データは示していない）。
【００６７】ＩｇＡ改良ＣＬ−ＥＬＩＳＡでは、４例の
イオン交換精製ａＣＬ画分（患者＃２４，２５，２６お
よび２７）が、β−２ＧＰＩ非添加では殆どまたは全く
結合を示さず、β−２ＧＰＩ添加で有意な結合の上昇を
示した〔β−２ＧＰＩ非添加の場合の４５０nmにおける
平均吸光度±ＳＤ：０．１０±０．０３；β−２ＧＰＩ
添加の場合：０．５０±０．２５〕。４例の患者ではβ
−２ＧＰＩの非添加で中程度の結合を示した。これらの
患者中、２例（＃２９および３０）はβ−２ＧＰＩを添
加すると結合の上昇を、１例（＃２８）ではわずかな変
化を、１例（＃３１）では結合の中程度の阻害を示した
（図１１ＢおよびＤ）。自己免疫疾患を有する患者４例
からのａＣＬ陽性イオン交換画分が多価二次抗体を用い
るＣＬ−ＥＬＩＳＡで以前に試験されている。４例全例
（＃３２，３３，３４および３５）がβ−２ＧＰＩ非添
加では結合を生じなかったが、β−２ＧＰＩを添加する
と劇的な結合の上昇が起こった〔β−２ＧＰＩ非添加の
場合の平均吸光度±ＳＤ：０．０５±０．０５；β−２
ＧＰＩ添加の場合：０．４０±０．０９〕（図１１Ａお
よび１１Ｃ）。
イオン交換精製ａＣＬ画分（患者＃２４，２５，２６お
よび２７）が、β−２ＧＰＩ非添加では殆どまたは全く
結合を示さず、β−２ＧＰＩ添加で有意な結合の上昇を
示した〔β−２ＧＰＩ非添加の場合の４５０nmにおける
平均吸光度±ＳＤ：０．１０±０．０３；β−２ＧＰＩ
添加の場合：０．５０±０．２５〕。４例の患者ではβ
−２ＧＰＩの非添加で中程度の結合を示した。これらの
患者中、２例（＃２９および３０）はβ−２ＧＰＩを添
加すると結合の上昇を、１例（＃２８）ではわずかな変
化を、１例（＃３１）では結合の中程度の阻害を示した
（図１１ＢおよびＤ）。自己免疫疾患を有する患者４例
からのａＣＬ陽性イオン交換画分が多価二次抗体を用い
るＣＬ−ＥＬＩＳＡで以前に試験されている。４例全例
（＃３２，３３，３４および３５）がβ−２ＧＰＩ非添
加では結合を生じなかったが、β−２ＧＰＩを添加する
と劇的な結合の上昇が起こった〔β−２ＧＰＩ非添加の
場合の平均吸光度±ＳＤ：０．０５±０．０５；β−２
ＧＰＩ添加の場合：０．４０±０．０９〕（図１１Ａお
よび１１Ｃ）。
【００６８】結果の考察 例７では、自己免疫疾患およびさまざまの感染症を有す
る患者からのイオン交換精製ａＣＬ抗体について検討し
た。感染症患者からのａＣＬ抗体は例外なくβ−２ＧＰ
Ｉの添加を必要とせず、改良ＣＬ−ＥＬＩＳＡでＣＬを
結合した。感染症患者からの試験サンプルはすべて、β
−２ＧＰＩの添加により、改良ＣＬ−ＥＬＩＳＡでのａ
ＣＬ結合に中程度の低下を生じた（図１１Ａおよび図１
１Ｂ）。
る患者からのイオン交換精製ａＣＬ抗体について検討し
た。感染症患者からのａＣＬ抗体は例外なくβ−２ＧＰ
Ｉの添加を必要とせず、改良ＣＬ−ＥＬＩＳＡでＣＬを
結合した。感染症患者からの試験サンプルはすべて、β
−２ＧＰＩの添加により、改良ＣＬ−ＥＬＩＳＡでのａ
ＣＬ結合に中程度の低下を生じた（図１１Ａおよび図１
１Ｂ）。
【００６９】これに反して、自己免疫疾患患者１２例中
１１例からのイオン交換精製ａＣＬ抗体は（少なくとも
１種のアイソタイプにおいて）ＣＬの結合にβ−２ＧＰ
Ｉの存在を要求した。１例の自己免疫疾患患者では、Ｉ
ｇＧ−ａＣＬ抗体はＣＬへの結合にβ−２ＧＰＩの存在
を要求しなかったが、同じ患者で、ＩｇＡ−ａＣＬはβ
−２ＧＰＩを必要とした。この、β−２ＧＰＩの非存在
下におけるリン脂質結合特性の明らかな差異は、個々の
患者にａＣＬ抗体の亜型があることを明瞭に示唆してい
る。感染に関連したａＣＬとＳＬＥ／ＰＡＰＳ関連ａＣ
Ｌの間に、ＣＬへの結合に際しての要求に差があるのみ
でなく、後者の群内では異なる結合特異性を有する異な
るアイソタイプをもつ亜集団も存在するものと考えられ
る。改良ＣＬ−ＥＬＩＳＡは、精製ａＣＬ抗体のＣＬへ
の結合のβ−２ＧＰＩ要求性を調べるための便利なシス
テムであることがわかった。改良ＣＬ−ＥＬＩＳＡにお
いては、コーティングしてないウエルに対するａＣＬ抗
体の結合は殆どまたは全く認められなかった（結果は示
していない）。ａＣＬのＣＬへの結合に対するβ−２Ｇ
ＰＩの影響は用量依存性で、β−２ＧＰＩの量が１μｇ
／mlまたはそれ未満の場合には、ａＣＬ抗体の結合はい
ずれの希釈においても認められなかった。β−２ＧＰＩ
のＲＩＡは７５ng／mlまでの感度を示し4 、したがっ
て、イオン交換精製ａＣＬ抗体画分はＣＬへの結合を支
持するだけの濃度のβ−２ＧＰＩを含んでいない。
１１例からのイオン交換精製ａＣＬ抗体は（少なくとも
１種のアイソタイプにおいて）ＣＬの結合にβ−２ＧＰ
Ｉの存在を要求した。１例の自己免疫疾患患者では、Ｉ
ｇＧ−ａＣＬ抗体はＣＬへの結合にβ−２ＧＰＩの存在
を要求しなかったが、同じ患者で、ＩｇＡ−ａＣＬはβ
−２ＧＰＩを必要とした。この、β−２ＧＰＩの非存在
下におけるリン脂質結合特性の明らかな差異は、個々の
患者にａＣＬ抗体の亜型があることを明瞭に示唆してい
る。感染に関連したａＣＬとＳＬＥ／ＰＡＰＳ関連ａＣ
Ｌの間に、ＣＬへの結合に際しての要求に差があるのみ
でなく、後者の群内では異なる結合特異性を有する異な
るアイソタイプをもつ亜集団も存在するものと考えられ
る。改良ＣＬ−ＥＬＩＳＡは、精製ａＣＬ抗体のＣＬへ
の結合のβ−２ＧＰＩ要求性を調べるための便利なシス
テムであることがわかった。改良ＣＬ−ＥＬＩＳＡにお
いては、コーティングしてないウエルに対するａＣＬ抗
体の結合は殆どまたは全く認められなかった（結果は示
していない）。ａＣＬのＣＬへの結合に対するβ−２Ｇ
ＰＩの影響は用量依存性で、β−２ＧＰＩの量が１μｇ
／mlまたはそれ未満の場合には、ａＣＬ抗体の結合はい
ずれの希釈においても認められなかった。β−２ＧＰＩ
のＲＩＡは７５ng／mlまでの感度を示し4 、したがっ
て、イオン交換精製ａＣＬ抗体画分はＣＬへの結合を支
持するだけの濃度のβ−２ＧＰＩを含んでいない。
【００７０】β−２ＧＰＩを結合するａＣＬがＳＬＥ／
ＰＡＰＳ群にしか見出されなかったという事実は、臨床
的に重要な意味がある。血栓塞栓合併症が記録されてい
るのは、この患者群である。大部分の報告は、ａＣＬが
梅毒または他の感染源に関連する患者にはこれらの合併
症がみられないことを示している。7 文献の広範囲な再
調査から8 、本発明者らは、ａＣＬをもつＳＬＥ患者に
おける血栓合併症の発症率は４２％であることを見出し
た。非ＳＬＥのａＣＬ陽性患者が包含されると、発症率
は３１％に低下する。これは、特異的非血栓性サブクラ
ス、すなわち感染型のａＣＬで血栓症の危険の少ない群
の包含によるものである。さらに、本研究で示されたよ
うに、感染型のａＣＬ抗体が自己免疫疾患患者に存在す
ることもある。抗体がβ−２ＧＰＩ／リン脂質複合体ま
たはβ−２ＧＰＩ単独のいずれを標的とするかで凝血障
害の予測が可能となる機構については明らかにされてい
ない。しかしながら、β−２ＧＰＩはＡＤＰ誘発血小板
凝集9 および活性化血小板のプロトロンビナーゼ活性10
の両者を阻害することが以前に報告されている。
ＰＡＰＳ群にしか見出されなかったという事実は、臨床
的に重要な意味がある。血栓塞栓合併症が記録されてい
るのは、この患者群である。大部分の報告は、ａＣＬが
梅毒または他の感染源に関連する患者にはこれらの合併
症がみられないことを示している。7 文献の広範囲な再
調査から8 、本発明者らは、ａＣＬをもつＳＬＥ患者に
おける血栓合併症の発症率は４２％であることを見出し
た。非ＳＬＥのａＣＬ陽性患者が包含されると、発症率
は３１％に低下する。これは、特異的非血栓性サブクラ
ス、すなわち感染型のａＣＬで血栓症の危険の少ない群
の包含によるものである。さらに、本研究で示されたよ
うに、感染型のａＣＬ抗体が自己免疫疾患患者に存在す
ることもある。抗体がβ−２ＧＰＩ／リン脂質複合体ま
たはβ−２ＧＰＩ単独のいずれを標的とするかで凝血障
害の予測が可能となる機構については明らかにされてい
ない。しかしながら、β−２ＧＰＩはＡＤＰ誘発血小板
凝集9 および活性化血小板のプロトロンビナーゼ活性10
の両者を阻害することが以前に報告されている。
【００７１】結論として、本発明の一方法はβ−２ＧＰ
Ｉ（単独もしくはリン脂質複合体として）を結合するａ
ＣＬ抗体が自己免疫疾患群の患者にのみ見出されること
を明らかにした。感染に関連するａＣＬ抗体は固相ＥＬ
ＩＳＡにおけるＣＬの結合にβ−２ＧＰＩを必要としな
かった。これは、凝血障害が自己免疫疾患関連ａＣＬに
おいて共通に報告されていて、感染に関連するａＣＬに
は認められていないことから、臨床的に重要である。
Ｉ（単独もしくはリン脂質複合体として）を結合するａ
ＣＬ抗体が自己免疫疾患群の患者にのみ見出されること
を明らかにした。感染に関連するａＣＬ抗体は固相ＥＬ
ＩＳＡにおけるＣＬの結合にβ−２ＧＰＩを必要としな
かった。これは、凝血障害が自己免疫疾患関連ａＣＬに
おいて共通に報告されていて、感染に関連するａＣＬに
は認められていないことから、臨床的に重要である。
【００７２】自己免疫血清によるβ−２ＧＰＩの増強 図１２に、自己免疫血清によるβ−２ＧＰＩの増強の結
果を示す。血漿は自己免疫疾患の患者から得られ、１：
５０〜１：６４００に希釈された。抗リン脂質抗体は、
カルジオリピンＥＬＩＳＡ法を用い、β−２ＧＰＩは非
添加および濃度を３．１２５μｇ／mlから５０μｇ／ml
まで上昇させて測定された。この場合、ＥＬＩＳＡ法
は、プレートのブロックに１０％成熟ウシ血清を添加
し、サンプルは１０％成熟ウシ血清ＰＢＳに希釈した標
準的なものであった。図１２から、ウシ血清の存在下で
さえも、血漿希釈１：４００までは増強の明白なことが
明らかである。
果を示す。血漿は自己免疫疾患の患者から得られ、１：
５０〜１：６４００に希釈された。抗リン脂質抗体は、
カルジオリピンＥＬＩＳＡ法を用い、β−２ＧＰＩは非
添加および濃度を３．１２５μｇ／mlから５０μｇ／ml
まで上昇させて測定された。この場合、ＥＬＩＳＡ法
は、プレートのブロックに１０％成熟ウシ血清を添加
し、サンプルは１０％成熟ウシ血清ＰＢＳに希釈した標
準的なものであった。図１２から、ウシ血清の存在下で
さえも、血漿希釈１：４００までは増強の明白なことが
明らかである。
【００７３】工業的応用性 本発明の第一および第二の実施態様の方法は、それぞ
れ、サンプル中に抗リン脂質抗体または陰性に荷電した
リン脂質が存在するか否かを検出するのにとくに有用で
ある。本発明の第五および第六の実施態様の方法は、そ
れぞれ、サンプル中に存在する抗リン脂質抗体が、自己
免疫疾患に関する抗体であるかもしくは感染症に関する
抗体であるかを決定するために、またはサンプル中に自
己免疫疾患に関する抗リン脂質抗体および感染症に関す
る抗リン脂質抗体が存在するか否かを決定するために有
用である。
れ、サンプル中に抗リン脂質抗体または陰性に荷電した
リン脂質が存在するか否かを検出するのにとくに有用で
ある。本発明の第五および第六の実施態様の方法は、そ
れぞれ、サンプル中に存在する抗リン脂質抗体が、自己
免疫疾患に関する抗体であるかもしくは感染症に関する
抗体であるかを決定するために、またはサンプル中に自
己免疫疾患に関する抗リン脂質抗体および感染症に関す
る抗リン脂質抗体が存在するか否かを決定するために有
用である。
【００７４】参考文献 1. Gharavi AE, Harris EN, Asherson RA,HughesGRV.
Anticardiolipin antibodies:isotype distribution an
d phospholipid specificity. Ann. Rheu Dis.1987;4
6:1-6. 2. McNeil HP, Chesterman CN, Krilis SA. Binding s
pecificity of lupus anticoagulants and anticardiol
ipin antibodies.Thromb. Res. 1988; 52:609-619. 3. Harris EN, Gharavi AE, Patel SP, Hughes GRV. E
valuation of the anticardiolipin antibody test:rep
ort of an international workshop held 4 April 198
6. Clin Exp Immunol 1987; 68:215-222. 4. McNeil HP,Wei Shi,Chesterman CN, Krilis SA. El
evated plasma β2-GPIlevels in patients with antic
ardiolipin antibodies.(submitted). 5. Rodbard D,Munsa PJ. Nashville: Biomedical Comp
uting Information :1984. 6. McNeil HP,Chesterman CN,Krilis SA. Anticardiol
ipin antibodies and lupus anticoagulants comprise
separate antibody subgroups with differentphospho
lipid binding characteristics. Br J Haematol. 198
9;73:506-51 3. 7. Harris EN,Gharavi AE,Loizou S, et al. Cross re
activity of antiphospholipid antibodies.J. Clin. L
ab. Immunol. 1985;16:1-6. 8. McNeil HP,Chesterman CN, Krilis SA. Immunology
and clinical importance of antiphospholipid antib
odies.Adv. Immunol. 1990;49:(in press). 9. Nimpf J, Wurm H, Kostner GM. Interactions of
β2-Glycoprotein-I with human blood platelets:Infl
uence upon the ADP-induced aggregation. Atheroscle
rosis. 1987;63: 109-114. 10. Nimpf J, Bevers EM, Bomans PHH, et al. Prothro
mbinase activity of human platelets is inhibited b
y β2-Glycoprotein-I. Biochem. Biophys. Acta. 198
6;884: 142-149. 表２および３は、研究対象患者の臨床特性およびａＣＬ
状態の一覧である。
Anticardiolipin antibodies:isotype distribution an
d phospholipid specificity. Ann. Rheu Dis.1987;4
6:1-6. 2. McNeil HP, Chesterman CN, Krilis SA. Binding s
pecificity of lupus anticoagulants and anticardiol
ipin antibodies.Thromb. Res. 1988; 52:609-619. 3. Harris EN, Gharavi AE, Patel SP, Hughes GRV. E
valuation of the anticardiolipin antibody test:rep
ort of an international workshop held 4 April 198
6. Clin Exp Immunol 1987; 68:215-222. 4. McNeil HP,Wei Shi,Chesterman CN, Krilis SA. El
evated plasma β2-GPIlevels in patients with antic
ardiolipin antibodies.(submitted). 5. Rodbard D,Munsa PJ. Nashville: Biomedical Comp
uting Information :1984. 6. McNeil HP,Chesterman CN,Krilis SA. Anticardiol
ipin antibodies and lupus anticoagulants comprise
separate antibody subgroups with differentphospho
lipid binding characteristics. Br J Haematol. 198
9;73:506-51 3. 7. Harris EN,Gharavi AE,Loizou S, et al. Cross re
activity of antiphospholipid antibodies.J. Clin. L
ab. Immunol. 1985;16:1-6. 8. McNeil HP,Chesterman CN, Krilis SA. Immunology
and clinical importance of antiphospholipid antib
odies.Adv. Immunol. 1990;49:(in press). 9. Nimpf J, Wurm H, Kostner GM. Interactions of
β2-Glycoprotein-I with human blood platelets:Infl
uence upon the ADP-induced aggregation. Atheroscle
rosis. 1987;63: 109-114. 10. Nimpf J, Bevers EM, Bomans PHH, et al. Prothro
mbinase activity of human platelets is inhibited b
y β2-Glycoprotein-I. Biochem. Biophys. Acta. 198
6;884: 142-149. 表２および３は、研究対象患者の臨床特性およびａＣＬ
状態の一覧である。
【００７５】
【表２】
【００７６】
【表３】 表３：自己免疫疾患を有する患者からの血漿サンプルの 標準ＣＬ−ＥＬＩＳＡでの吸光度(405nm) ───────────────────────── aCL 患者＃ 診断 血栓症 IgG IgM IgA ──────────────────────── ２４ SLE Y ＋ ＋ ＋ ２５ SLE N ＋ ＋ ＋ ２６ SLE Y ＋ ＋ ＋ ２７ PAPS Y ＋ ＋ ＋ ２８ PAPS Y ＋ ＋ ＋ ２９ PAPS Y ＋ ＋ ＋ ３０ PAPS Y ＋ ＋ ＋ ３１ PAPS Y ＋ ＋ ＋ ──────────────────────── 多価 ３２ PAPS Y ＋ ３３ PAPS Y ＋ ３４ SLE N ＋ ３５ SLE N ＋ 注：PAPS＝原発性抗リン脂質症候群 SLE ＝全身性エリテマトーデス Y ＝あり N ＝なし
【図１】図１には、標準および改良ＣＬ−ＥＬＩＳＡに
おける様々なサンプルの結合を例示する。サンプルは、
ａＣＬ含有イオン交換画分（ＩＥ．Ｆ）；アフィニティ
ー精製ａＣＬ抗体（ＡＰ．ＡＢ）；正常血漿（Ｎ．Ｐ
Ｌ）；成熟ウシ血清（ＡＢＳ）；精製コファクター（Ｃ
ＯＦ）；患者血漿（Ｐ．ＰＬ）である。ＡＢＳおよびＣ
ＯＦは単独で試験した場合、陰性である（データは示し
ていない）。
おける様々なサンプルの結合を例示する。サンプルは、
ａＣＬ含有イオン交換画分（ＩＥ．Ｆ）；アフィニティ
ー精製ａＣＬ抗体（ＡＰ．ＡＢ）；正常血漿（Ｎ．Ｐ
Ｌ）；成熟ウシ血清（ＡＢＳ）；精製コファクター（Ｃ
ＯＦ）；患者血漿（Ｐ．ＰＬ）である。ＡＢＳおよびＣ
ＯＦは単独で試験した場合、陰性である（データは示し
ていない）。
【図２】図２は、正常血漿のＣＬアフィニティーカラム
クロマトグラフィーからの溶出液のPharmacia Superose
１２ＨＲ１０／３０カラムによるゲル濾過を例示す
る。緩衝液：０．０１Ｍリン酸塩 １Ｍ ＮａＣ１。コ
ファクター活性は太い矢印で示した大きなピークに検出
された。
クロマトグラフィーからの溶出液のPharmacia Superose
１２ＨＲ１０／３０カラムによるゲル濾過を例示す
る。緩衝液：０．０１Ｍリン酸塩 １Ｍ ＮａＣ１。コ
ファクター活性は太い矢印で示した大きなピークに検出
された。
【図３】図３は、図２のコファクター含有画分のPharma
cia Mono ＳＨＲ５／５カラムによる陽イオン交換の結
果である。開始緩衝液：０．０５Ｍ酢酸塩０．０５ＭＮ
ａＣ１ pH４．８。溶出緩衝液：０．０５Ｍ 酢酸塩
０．６５Ｍ ＮａＣ１pH５．２。破線：溶出緩衝液の勾
配。コファクター活性は太い矢印で示した遅いピークに
検出された。
cia Mono ＳＨＲ５／５カラムによる陽イオン交換の結
果である。開始緩衝液：０．０５Ｍ酢酸塩０．０５ＭＮ
ａＣ１ pH４．８。溶出緩衝液：０．０５Ｍ 酢酸塩
０．６５Ｍ ＮａＣ１pH５．２。破線：溶出緩衝液の勾
配。コファクター活性は太い矢印で示した遅いピークに
検出された。
【図４】図４は、非還元条件下、５〜１５％の直線勾配
ゲルによるＳＤＳ−ＰＡＧＥのクーマシーブルー染色を
例示する。レーン１：ａＣＬ陽性血漿のＣＬアフィニテ
ィーカラムクロマトグラフィーからの溶出液、ＩｇＧ−
ａＣＬ（１５０kDa ）およびコファクター（５０kDa ）
の広いバンドを含む。レーン２：正常血漿から連続的な
ＣＬアフィニティー、ゲル濾過（図２）および陽イオン
交換クロマトグラフィー（図３）によって得られた精製
コファクター。
ゲルによるＳＤＳ−ＰＡＧＥのクーマシーブルー染色を
例示する。レーン１：ａＣＬ陽性血漿のＣＬアフィニテ
ィーカラムクロマトグラフィーからの溶出液、ＩｇＧ−
ａＣＬ（１５０kDa ）およびコファクター（５０kDa ）
の広いバンドを含む。レーン２：正常血漿から連続的な
ＣＬアフィニティー、ゲル濾過（図２）および陽イオン
交換クロマトグラフィー（図３）によって得られた精製
コファクター。
【図５】図５は、特製コファクターのアミノ末端アミノ
酸配列を示す。Ｘは残基が確定できていない配列中位置
を示す。
酸配列を示す。Ｘは残基が確定できていない配列中位置
を示す。
【図６】図６（ａ）：・──・アフィニティー精製ａＣ
Ｌ抗体の希釈系列の、コファクターの希釈系列の存在下
での改良ＣＬ−ＥＬＩＳＡにおける結合、・----・抗体
およびコファクター両者の希釈に基づく外挿結合曲線。 図６（ｂ）：ａＣＬ抗体陽性血漿の希釈系列の、標準Ｃ
Ｌ−ＥＬＩＳＡ・──・および改良ＣＬ−ＥＬＩＳＡ・
----・における結合
Ｌ抗体の希釈系列の、コファクターの希釈系列の存在下
での改良ＣＬ−ＥＬＩＳＡにおける結合、・----・抗体
およびコファクター両者の希釈に基づく外挿結合曲線。 図６（ｂ）：ａＣＬ抗体陽性血漿の希釈系列の、標準Ｃ
Ｌ−ＥＬＩＳＡ・──・および改良ＣＬ−ＥＬＩＳＡ・
----・における結合
【図７】図７は、緩衝液中、または５０μｇ／mlのコフ
ァクターの存在下における、改良ＣＬ−ＥＬＩＳＡでの
ＩｇＧ、ａＰＬ抗体の希釈系列の結合を示す。
ァクターの存在下における、改良ＣＬ−ＥＬＩＳＡでの
ＩｇＧ、ａＰＬ抗体の希釈系列の結合を示す。
【図８】図８は、緩衝液中、または５０μｇ／mlのコフ
ァクターの存在下における、改良ＣＬ−ＥＬＩＳＡでの
ＩｇＭ、ａＰＬ抗体の希釈系列の結合を示す。
ァクターの存在下における、改良ＣＬ−ＥＬＩＳＡでの
ＩｇＭ、ａＰＬ抗体の希釈系列の結合を示す。
【図９】図９は、抗カルジオリピン抗体を有する患者か
らの透析血漿サンプルの典型的なイオン交換クロマトグ
ラフィー像を示す。実線＝２８０nmにおける吸光度、─
＝ａＣＬ活性（４０５nm）の吸光度）、破線＝β−２Ｇ
ＰＩ（μｇ／ml）。
らの透析血漿サンプルの典型的なイオン交換クロマトグ
ラフィー像を示す。実線＝２８０nmにおける吸光度、─
＝ａＣＬ活性（４０５nm）の吸光度）、破線＝β−２Ｇ
ＰＩ（μｇ／ml）。
【図１０】図１０は、感染に関連したａＣＬを有する患
者について実施した改良ＣＬ−ＥＬＩＳＡ（ＩｇＧ）の
結果を示す。Ａ＝β−２ＧＰＩ非添加、Ｂ＝β−２ＧＰ
Ｉ添加。
者について実施した改良ＣＬ−ＥＬＩＳＡ（ＩｇＧ）の
結果を示す。Ａ＝β−２ＧＰＩ非添加、Ｂ＝β−２ＧＰ
Ｉ添加。
【図１１】図１１Ａ〜Ｄは、自己免責疾患に関連したａ
ＣＬを有する患者について実施した改良ＣＬ−ＥＬＩＳ
Ａ（ＩｇＧ）の結果を示す。ＡおよびＢはβ−２ＧＰＩ
非添加、ＣおよびＤはβ−２ＧＰＩ添加。図１１Ａおよ
び図１１Ｃ：患者番号２４−３１＝ＩｇＧ、３２−３５
＝多価、図１１Ｃおよび図１１Ｄ：患者番号２４−３１
＝ＩｇＡ。
ＣＬを有する患者について実施した改良ＣＬ−ＥＬＩＳ
Ａ（ＩｇＧ）の結果を示す。ＡおよびＢはβ−２ＧＰＩ
非添加、ＣおよびＤはβ−２ＧＰＩ添加。図１１Ａおよ
び図１１Ｃ：患者番号２４−３１＝ＩｇＧ、３２−３５
＝多価、図１１Ｃおよび図１１Ｄ：患者番号２４−３１
＝ＩｇＡ。
【図１２】図１２は、自己免疫血清でのβ−２ＧＰＩの
増強の結果を示す。
増強の結果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 チェスターマン，コリン，ニコルソン オーストラリア国 2023 ニューサウスウ ェールズ，ベレビュー ヒル，カムバラ ロード，62エイ
Claims (18)
- 【請求項１】 サンプルを、陰性に荷電したリン脂質、
およびβ−２−グリコプロティン−Ｉまたはその同族体
もしくは類縁体と接触させ、接触したリン脂質およびβ
−２−グリコプロティン−Ｉに抗リン脂質抗体が結合し
たかどうかを測定することからなり、この場合、リン脂
質およびβ−２−グリコプロティン−Ｉへの抗リン脂質
抗体の結合の検出はサンプル中に抗リン脂質抗体が存在
することを示す、サンプル中に抗リン脂質抗体（本明細
書における定義による）が存在するか否かを測定する方
法。 - 【請求項２】 陰性に荷電したリン脂質は、カルジオリ
ピン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセ
リン、ホスファチジルグリセロホスフェートおよびホス
ファチジン酸からなる群より選ばれる請求項１記載の方
法。 - 【請求項３】 陰性に荷電したリン脂質は、アフィニテ
ィーカラム充填材料、マイクロタイタープレート、ディ
ップスティック、ゲル、マトリックス、リポソームおよ
びミセルからなる群より選ばれる固相によって固定化さ
れる請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 β−２−グリコプロティン−Ｉは実質的
に純粋な形である請求項１記載の方法。 - 【請求項５】 β−２−グリコプロティン−Ｉは、アフ
ィニティーカラム充填材料、マイクロタイタープレー
ト、ディップスティック、ゲル、マトリックス、リポソ
ームおよびミセルからなる群より選ばれる固相によって
固定化される請求項１記載の方法。 - 【請求項６】 a)β−２−グリコプロティン−Ｉまたは
その同族体もしくは類縁体、およびb)陰性に荷電したリ
ン脂質からなり、抗リン脂質抗体（本明細書における定
義による）がサンプル中に存在するか否かを測定する検
定法に用いられるキット。 - 【請求項７】 さらに、c)サンプル中存在する抗リン脂
質抗体のβ−２−グリコプロティン−Ｉおよび陰性に荷
電したリン脂質への結合を検出するための手段を包含す
る請求項６記載のキット。 - 【請求項８】 陰性に荷電したリン脂質は、カルジオリ
ピン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセ
リン、ホスファチジルグリセロホスフェートおよびホス
ファチジン酸からなる群より選ばれる請求項６または７
記載のキット。 - 【請求項９】 陰性に荷電したリン脂質は、アフィニテ
ィーカラム充填材料、マイクロタイタープレート、ディ
ップスティック、ゲル、マトリックス、リポソームおよ
びミセルからなる群より選ばれる固相によって固定化さ
れる請求項６または７記載のキット。 - 【請求項１０】 β−２−グリコプロティン−Ｉは実質
的に純粋な形である請求項６または７記載のキット。 - 【請求項１１】 β−２−グリコプロティン−Ｉは、ア
フィニティーカラム充填材料、マイクロタイタープレー
ト、ディップスティック、ゲル、マトリックス、リポソ
ームおよびミセルからなる群より選ばれる固相によって
固定化される請求項６または７記載のキット。 - 【請求項１２】 (i) サンプルの一部をβ−２−グリコ
プロティン−Ｉまたはその同族体もしくは類縁体と接触
させることなく陰性に荷電したリン脂質と接触させ、サ
ンプル中の抗リン脂質抗体の第一の量を測定し、(ii)サ
ンプルの別の一部を陰性に荷電したリン脂質およびβ−
２−グリコプロティン−Ｉまたはその同族体もしくは類
縁体と接触させて、サンプル中の抗リン脂質抗体の第二
の量を測定し、(iii) 第一の量と第二の量を比較し、第
一の量が第二の量よりも実質的に少ない場合は測定され
たサンプル中の抗リン脂質抗体は自己免疫疾患に関する
ものであり、第一の量が第二の量よりも実質的に多い場
合は測定されたサンプル中の抗リン脂質抗体は感染症に
関するものであることより、測定されたサンプル中の抗
リン脂質抗体が自己免疫疾患に関するものであるか感染
症に関するものであるかを測定する方法。 - 【請求項１３】 (i) サンプルの一部をβ−２−グリコ
プロティン−Ｉまたはその同族体もしくは類縁体と接触
させることなく陰性に荷電したリン脂質と接触させ、サ
ンプル中の抗リン脂質抗体の第一の量を測定し、(ii)サ
ンプルの別の一部を陰性に荷電したリン脂質およびβ−
２−グリコプロティン−Ｉまたはその同族体もしくは類
縁体と接触させて、サンプル中の抗リン脂質抗体の第二
の量を測定し、(iii) 第一の量と第二の量を比較し、第
一の量が第二の量と実質的に等しい場合には測定された
サンプル中の抗リン脂質抗体は自己免疫疾患および感染
症に関するものであることより、測定されたサンプル中
の抗リン脂質抗体が自己免疫疾患および感染症に関する
ものであるか否かを測定する方法。 - 【請求項１４】 陰性に荷電したリン脂質は、カルジオ
リピン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジル
セリン、ホスファチジルグリセロホスフェートおよびホ
スファチジン酸からなる群より選ばれる請求項１２記載
の方法。 - 【請求項１５】 陰性に荷電したリン脂質は、アフィニ
ティーカラム充填材料、マイクロタイタープレート、デ
ィップスティック、ゲル、マトリックス、リポソームお
よびミセルからなる群より選ばれる固相によって固定化
される請求項１２記載の方法。 - 【請求項１６】 β−２−グリコプロティン−Ｉは実質
的に純粋な形である請求項１２または１３記載の方法。 - 【請求項１７】 β−２−グリコプロティン−Ｉは、ア
フィニティーカラム充填材料、マイクロタイイタープレ
ート、ディップスティック、ゲル、マトリックス、リポ
ソームおよびミセルからなる群より選ばれる固相によっ
て固定化される請求項１２または１３記載の方法。 - 【請求項１８】 工程(ii)において、サンプルに過剰の
β−２−グリコプロティン−Ｉを加える請求項１２また
は１３記載の方法。
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