JP4820574B2 - 花粉症の検査または評価方法 - Google Patents
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Description
一方、外的要因 (薬や食品の摂取、運動、病気など) によって生体内で起こる変化を示す生物指標をバイオマーカーと言われているが、花粉症の明確なバイオマーカーは現状では、特異的IgE抗体量、鼻汁中好酸球数、ヒスタミン濃度などが使用されている。しかしIgE抗体があっても発症しない事例も多く見出されており、鼻汁中好酸球数などは定量性に欠けており、またヒスタミンは花粉症に特異的ではなく、これらをマーカーとして花粉症に対する医薬品や食品の機能性を評価することは困難であり、また現行の抗アレルギー剤
(医薬品、飲食品) では十分満足されていないのが実際である。
さらにアトピー性皮膚炎に関し好酸球において有意に発現が高い遺伝子があることも報告されている(特許文献9−13参照)。
またそれら特異性の高いバイオマーカーを使用することにより、効率よく花粉症の治療または予防が可能な、新規抗花粉症メカニズムを持つ医薬品、医薬部外品、飲食品、香粧品などが求められている。
花粉症に相関した遺伝子発現バイオマーカーとしては前述の特許文献1−8があるが、これらはいずれも、花粉症発症前後で変化するマーカーであって、オフシーズンでも花粉症を判定できるものではない。そこで本発明者らは、健常者とスギ花粉症者との血液をスギ花粉が飛散していない時期に採取し、血中の顆粒球画分につき遺伝子発現解析、さらに血清中の代謝産物解析を行い、2群間に統計学的に有意なバイオマーカーを見出すに至った。
また、スギ花粉症者と健常者との顆粒球において、有意に発現が変動する遺伝子の同定をDNAチップにより見出し、それらをバイオマーカーとしたスギ花粉症の検査・評価方法とし、それに基づいた安全な抗スギ花粉症剤をスクリーニングする方法を提供する。
、および432.310±10mmuの2成分、負イオン測定にて質量電荷比が528.262±10mmu、および995.587±10mmuの質量電荷比の2成分、計4成分の質量電荷比を特定した。また、スギ花粉症者と健常者の抹消血から顆粒球を調整し、発現しているmRNAを取り出し、PCRで増幅させた後、DNAチップ(アフィメトリクス社製ジーンチップ)で発現マーカーを解析した。各群の平均蛍光強度比が2.0以上に変化し、かつANOVA検定で5%未満の危険率で変化がみられ、かつ各群どちらかの平均蛍光強度測定値が10.0以上を満たすものとして、GenBank(NCBIの核酸配列データベース) におけるAccession No.でAF013611、X98263、AF112482、AK022904、AU118614、BC001338、AF156552、BC032338、X98126、Z46632、J03578、AF101044、BC010100、BC000260、AL713733、BC042914、M22538およびAJ512214で表される18の遺伝子発現マーカーを特定した。
本発明では、前記の質量電荷比の4成分を代謝物バイオマーカーおよび/または18の遺伝子発現バイオマーカーを検査項目や評価対象とすることにより、スギ花粉症を低減、改善、あるいは予防する、飲食品、医薬品、医薬部外品、香粧品のスクリーニング法が提供される。
さらに、本発明のバイオマーカーを検査項目や評価対象とすることにより、スギ花粉症を低減、改善、あるいは予防する、飲食品、医薬品、医薬部外品、香粧品のスクリーニング法を提供することができる。
次に、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
(東京理化器械社製CVE-200D) で減圧乾燥させ、さらに100μlのメタノールに再溶解させ、分析用試料とした。
LC及びMSは、高感度/高分解能/高質量精度に微量成分の精密質量測定(ミリマス測定)を行うことができる日本電子社製の高速液体クロマトグラフ接続飛行時間型質量分析計JMS−T100LCを用いた。試薬類はLCMSまたは特級グレードのものを用いた。内部標準試薬として合成アミノ酸(Z−Tyr−Glu,Tos−Arg−OMe:ペプチド研究所社製)を試料と混合し濃度を1ppmとなるように調整した。LC条件およびMS条件は以下に示した。
プレカラム:Opti Guard Fit ODS(TCI社製)
カラム:Cadenza C18 2×150mm(Imtakt社製)
移動相:A=水(0.05%ギ酸)、B=アセトニトリル
流速:0.2ml/分
グラジエントプログラム:5−95%(15分)−100%(5分)
試料導入量:5μl
[TOF MS分析条件]
装置 アジレント社製Agilent 1100series(バイナリーポンプ、カラムヒーター、UV検出器、冷却機能つきオートサンプラー)
オートサンプラー設定温度:4℃
イオン化法:ESI(エレクトロスプレーイオン化、ポジティブモードおよびネガティブモード)
質量範囲:70−1000Da
オリフィス1電圧:10〜50V(掃引Pos、Neg)
イオンガイド電圧:500〜2500V(掃引Pos、Neg)
MCP電圧:2800V
スペクトル記録間隔2.5秒
[データ解析]
LC−TOF MSにて分離された成分のピークをピックアップし、それぞれについて0.2Daの質量幅でマスクロマトグラムを作成し面積計算を行った。分析毎のイオン化効率を補正するために内部標準として導入した2試料の擬分子イオン(M+H)+、(M−H)-のマスクロマトグラムの平均値でそれぞれの面積値を割って相対面積値を計算した。
スギ花粉症群と健常者群に対してt検定(T−test:EXCEL)を行い危険率5%未満で有意差のみられたものを代謝物バイオマーカー候補とした。有意差の見出された4つの成分の平均値と標準誤差範囲を図1に示す。
1.エクセルワークシート上のデータを読み込む。
2.それぞれの成分を規格化する。
3.PCAを行う。
その結果を図2に示す。
その後、洗浄を行いハイブリダイゼーションされているプローブのみにフィコエリスリン−アビジンと結合反応させ、共焦点アルゴンレーザースキャナー(アフィメトリクス社製ジーンチップスキャナー)によりフィコエリスリンを励起させ、その蛍光強度を計測した。
Claims (2)
- LC−TOF MSの正イオン測定にて質量電荷比が448.301±10mmu、および432.310±10mmu、負イオン測定にて質量電荷比が528.262±10mmu、および995.587±10mmu、4つの血中バイオマーカーのいずれか一つ以上の指標を得ることにより、花粉症を試験する方法。
- 請求項1に記載の方法で試験する工程を含む、花粉症低減、改善または予防を目的とした飲食品、医薬品、医薬部外品、または香粧品のスクリーニング方法。
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