ES2825573T3 - Medios y métodos para determinar el riesgo de diabetes tipo 1 mediante biomarcadores de proteínas séricas - Google Patents

Medios y métodos para determinar el riesgo de diabetes tipo 1 mediante biomarcadores de proteínas séricas Download PDF

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Abstract

Un método para predecir, determinar y/o monitorizar un riesgo de y/o una progresión hacia la diabetes tipo 1 (T1D) en un individuo, comprendiendo dicho método: a) determinar un perfil de marcador de proteína en una muestra obtenida del individuo, comprendiendo dicho perfil profilina-1 (PROF1) y filamina-A (FLNA), b) comparar el perfil de marcador de proteína determinado y un perfil de control correspondiente, y c) en respuesta a la comparación, determinar una predicción correspondiente a un riesgo relativo de que el individuo desarrolle T1D o un estadio de progresión hacia T1D.

Description

DESCRIPCIÓN
Medios y métodos para determinar el riesgo de diabetes tipo 1 mediante biomarcadores de proteínas séricas
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo del diagnóstico molecular. Más específicamente, la presente invención se refiere a medios y métodos para predecir el riesgo de un sujeto de padecer diabetes tipo 1 (T1D).
Antecedentes de la invención
La medición de los autoanticuerpos de células de los islotes es actualmente el principal medio para identificar una amenaza emergente en el desarrollo de diabetes tipo 1. Los riesgos asociados a la aparición de anticuerpos en los islotes se han evaluado en profundidad, y en general, la aparición de múltiples autoanticuerpos bioquímicamente definidos se correlaciona con la progresión a la enfermedad independientemente del grupo de riesgo genético o de la combinación de autoanticuerpos. La T1D generalmente se diagnostica en el momento en que la mayoría de las células beta productoras de insulina del páncreas han sido destruidas, etapa en la cual el paciente depende de los suplementos de insulina por el resto de su vida. Por lo tanto, son necesarios métodos para establecer el riesgo y el inicio potencial, a fin de comprender mejor la etiología de la enfermedad y diseñar potenciales estrategias de tratamiento / prevención.
Los análisis proteómicos en el estudio de T1D han abordado previa y fundamentalmente la mayoría de las diferencias en los sueros de pacientes diabéticos y de sujetos no diabéticos. Si bien las comparaciones en profundidad de proteínas de muestras de sujetos sanos y de pacientes con T1D han distinguido el estado de enfermedad, la identificación de los cambios que preceden a esta agresiva enfermedad autoinmune es importante para la predicción y la prevención de la enfermedad. Dichos marcadores podrían ser utilizados en la evaluación de riesgos y en tratamientos preventivos.
Hanifi-Moghaddam et al. (Diabetic Medicine, 2005, 23: 156-163) describe niveles alterados de quimiocinas en pacientes con alto riesgo de desarrollar T1D, es decir, CCL3 y CCL4 sobrerregulados y CCL2 subregulado en individuos con múltiples autoanticuerpos de islotes.
Zhi et al. (J Diabetes Sci Technol, 2010, 4: 993-1002) describe que antes del inicio de los síntomas clínicos, es importante la predicción precisa de los individuos con probabilidad de desarrollar T1D, y sugiere que dicha predicción se realice en base a biomarcadores de proteínas tales como a) la detección de autoanticuerpos de células de los islotes o b) proteínas identificadas por análisis proteómico basado en espectrometría de masas en suero humano. Los biomarcadores de la presente invención no se describen.
El documento EP1840573 describe un diagnóstico precoz de T1D en un mamífero, antes de cualquier signo clínico, midiendo el nivel de al menos un marcador de proteína. Los biomarcadores de la presente invención no se describen.
El documento WO2013/106851 describe biomarcadores que son útiles para determinar si un sujeto tiene T1D o está en riesgo de desarrollar T1D. Específicamente, se sugieren para este propósito la sincolina y la triacilglicerol lipasa pancreática. Se proporcionan biomarcadores adicionales, pero los presentes biomarcadores no están entre ellos.
Breve descripción de la invención
La presente descripción está dirigida a métodos y kits útiles para identificar el riesgo de que un individuo, particularmente un individuo que tenga un riesgo conferido por HLA para la diabetes tipo 1, desarrolle diabetes tipo 1 (T1D). El riesgo puede determinarse en base a las cantidades de uno o más de los marcadores de proteínas descritos en el presente documento.
En un aspecto, la presente descripción está dirigida a un método para predecir, determinar y/o monitorizar un riesgo de y/o una progresión hacia la Diabetes Tipo 1 (T1D) en un individuo. El método comprende las etapas de:
a) determinar un perfil de marcador de proteína en una muestra obtenida del individuo, comprendiendo dicho perfil profilina-1 (PROF1) y filamina-A (Fl Na ),
b) comparar el perfil de marcador de proteína determinado y un perfil de control correspondiente, y
c) en respuesta a la comparación, determinar una predicción correspondiente a un riesgo relativo de que el individuo desarrolle T1D o un estadio de progresión hacia T1D.
En algunas realizaciones, el perfil de marcador establecido anteriormente puede comprender además uno o más marcadores de proteína seleccionados del grupo que consiste en VASP, CFL1, ACTB, TAGL2 y TMSB4X. En algunas realizaciones adicionales, los perfiles de marcador establecidos anteriormente pueden comprender además uno cualquiera o más de marcadores de proteína seleccionados entre los enumerados en la Tabla 4 y/o la Tabla 5.
Según algunas realizaciones, los perfiles definidos anteriormente se usan para predecir el riesgo de T1D antes de la seroconversión.
En algunas realizaciones, el individuo con riesgo de desarrollar T1D tiene un riesgo conferido por HLA para T1D.
En otro aspecto, la presente descripción está dirigida a un uso de un kit de cribado in vitro para predecir, determinar y/o monitorizar un riesgo de y/o una progresión hacia T1D en un individuo, comprendiendo dicho kit uno o más agentes de ensayo para evaluar en una muestra biológica un perfil de marcador de proteína indicativo de un riesgo de desarrollar T1D, donde dicho perfil comprende PROF1 y FLNA.
En algunas realizaciones, el kit comprende uno o más agentes de ensayo que reconocen los marcadores de proteína PROF1 y FLNA, y uno o más agentes de ensayo adicionales que reconocen uno o más marcadores de proteína seleccionados del grupo que consiste en TAGL2, VASP, CFL1, ACTB y TMSB4X.
En algunas realizaciones adicionales, el kit puede comprender, además del uno o más agentes de ensayo establecidos anteriormente, uno o más agentes de ensayo adicionales que reconozcan uno o más de los marcadores de proteína enumerados en la Tabla 4 y/o en la Tabla 5.
Otros objetivos, aspectos, realizaciones, detalles y ventajas de la presente invención se harán evidentes a partir de las siguientes figuras, descripción detallada, ejemplos y reivindicaciones dependientes.
Breve descripción de los dibujos
A continuación, la invención se describirá con mayor detalle a través de realizaciones preferidas con referencia a las figuras adjuntos, en las que:
Figura 1 : es una presentación esquemática del diseño del estudio que muestra la manera en que se realizó el descubrimiento. Usando una toma de muestras de suero longitudinal prospectiva de niños con un riesgo conferido por HLA para la diabetes tipo 1, las muestras se seleccionaron en función del resultado clínico y de los niveles determinados de autoanticuerpos asociados a la diabetes tipo 1. Se prepararon muestras de suero para el análisis proteómico por espectrometría de masas. Se realizaron comparaciones entre los niños que desarrollaron diabetes tipo 1 y sus controles de edad, riesgo y género equivalentes. Se emplearon dos enfoques cuantitativos. En primer lugar, con reactivos cuantitativos relativos y absolutos etiquetados con isótopos (iTRAQ), en segundo lugar, utilizando un enfoque sin etiquetas.
Figura 2 : muestra la evolución con el tiempo de las muestras de suero utilizadas, representadas respecto a la primera detección de autoanticuerpos asociados a T1D en años. Las muestras perfiladas para los niños con desarrollo de T1D están representadas por diamantes negros. Éstas incluyen mediciones iTRAQ (13 pares) y mediciones sin etiqueta en dos lotes (LFQ1 y LFQ2, n = 6 y 9 pares respectivamente). Para la comparación entre niños (sanos frente a aquellos con desarrollo de diabetes tipo 1), los análisis consideraron la abundancia de proteínas en toda la serie (184 muestras comparadas con 184 muestras emparejadas por edad), muestras anteriores (71 muestras comparadas con 71 muestras emparejadas por edad) y después de la detección de seroconversión (113 muestras comparadas con 113 muestras emparejadas por edad).
Figura 3 : es una representación esquemática de la estrategia de etiquetado con iTRAQ 8-plex. Se usaron canales de referencia de grupo para vincular las comparaciones de iTRAQ entre experimentos.
Figura 4A : muestra la clasificación entre los sujetos que desarrollan T1D y los controles emparejados por edad en base a la abundancia de APOC4 y AFAM. Se utilizó el método de pares de puntaje más alto, lo que arrojó una tasa de éxito del 91%. Los triángulos negros representan los controles y los cuadrados huecos representan los niños que desarrollan T1D (es decir, los casos).
Figura 4B : ilustra las medidas de abundancia relativa correspondientes a APOC4 y AFAM para los sujetos de casos y de control.
Figura 5A : ilustra las características del receptor-operador en base a las diferencias entre los niveles de APOC4 y AFAM y el efecto individual de dichas proteínas solas. La combinación de APOC4 y AFAM produjo un área bajo la curva (AUC) de 0,89.
Figura 5B : ilustra los niveles de APOC4 en casos y controles, antes de la seroconversión y en sujetos positivos para anticuerpos frente a controles emparejados por edad.
Figura 6 : ilustra la curva característica de receptor-operador (ROC) de la abundancia de PROF1 y FLNA detectada de tres a seis meses antes de la seroconversión de autoanticuerpos.
Figura 7 : ilustra el resultado del análisis de la ruta de proteínas diferencialmente abundantes tres a seis meses antes de la seroconversión de autoanticuerpos, enfatizando la importancia putativa de dichas proteínas en los eventos que preceden a la seroconversión. Las abreviaturas utilizadas en la figura se refieren a los genes que codifican las proteínas enumeradas.
Figura 8A : ilustra la curva característica de receptor-operador (ROC) de la abundancia de SHBG a lo largo de la serie temporal (AUC 0,74), mientras que la Figura 8B ilustra SHBG frente a CO8G, ZPI, BTD, CO5 y THBG (AUC = 0,80).
Figura 9 : ilustra la curva característica de receptor-operador (ROC) de la abundancia de SHBG frente a IBP2, ADIPO, CO2 y CO8G (AUC = 0,85) después de la serocon versión.
Descripción detallada de la invención
En algunas implementaciones, la presente descripción está dirigida a métodos, perfiles proteómicos y kits útiles para determinar o predecir el riesgo de que un individuo desarrolle diabetes tipo 1 (T1D), o para determinar el estadio de progresión de un individuo hacia T1D, o para monitorizar o predecir la progresión de un individuo hacia la T1D. Como se describe, dicho riesgo puede evaluarse basándose en los perfiles de varios paneles de marcadores de proteínas cuya aplicabilidad, en algunas realizaciones, depende de si se han detectado autoanticuerpos T1D conocidos.
En algunas realizaciones importantes, se puede hacer una predicción del riesgo de un individuo de desarrollar T1D antes de cualquier signo de seroconversión. Tal como se usa en el presente documento, el término "seroconversión" se refiere a la primera detección de uno o varios autoanticuerpos asociados a T1D contra antígenos específicos de células beta en el suero. Estos incluyen autoanticuerpos específicos de células de los islotes (ICA), autoanticuerpos de insulina (IAA), autoanticuerpos de ácido glutámico descarboxilasa 65 (GADA), autoanticuerpos de antígeno 2 del islote (IA-2A) y autoanticuerpos transportadores de zinc 8 (ZnT8A). En algunas realizaciones, se pueden usar los siguientes valores de corte para determinar la presencia o ausencia de los autoanticuerpos: ICA > 4 JDFU (unidades de la Fundación de Diabetes Juvenil), IAA > 3,48 RU (unidades relativas), GADA > 5,36 RU, IA-2A > 0,43 RU, y ZnT8A > 0,61 RU. La seroconversión puede ocurrir años, por ejemplo, 1 a 2 años, antes del diagnóstico clínico.
Normalmente, el individuo cuyo riesgo de T1D debe determinarse es un sujeto humano, preferiblemente un niño o un adolescente. En algunas realizaciones más preferidas, dicho sujeto no muestra ningún signo de seroconversión. Tal como se usan en este documento, los términos "sujeto" e "individuo" son intercambiables.
Los perfiles proteómicos predictivos identificados en el presente documento se aplican en particular a individuos que tienen un riesgo conferido por el antígeno leucocitario humano (HLA) para T1D. Tal como se usa en el presente documento, el término "riesgo conferido por HLA para T1D" se refiere a una predisposición a T1D según se determina sobre la base del genotipo HLA del individuo. En algunas realizaciones, se asigna susceptibilidad conferida por HLA si el individuo porta los alelos HLA-DQB1 *02/*0302 o *0302. En los experimentos realizados, se comparó a los individuos diagnosticados con T1D cuyo riesgo era conferido por HLA con sujetos de control con la misma susceptibilidad. De manera similar, en la implementación de este cribado, se puede emplear el control y la referencia de control agrupada.
Tal como se usa en el presente documento, el término "perfil proteómico" se refiere a un conjunto de proteínas en una muestra biológica en un momento dado. Un perfil proteómico cambia continuamente en respuesta a eventos internos y externos. Por lo tanto, un perfil proteómico se puede usar no solo para predecir el riesgo de un individuo de desarrollar una enfermedad en un momento dado, sino también para monitorizar cualquier cambio en la predicción o el estado de la enfermedad, por ejemplo, en respuesta al tratamiento o cambios en la dieta u otros cambios en el estilo de vida del individuo. El término se puede usar indistintamente con los términos “perfil de expresión de proteínas”, “firma de proteínas”, “perfil de marcadores de proteínas” y similares, como es evidente para un experto en la materia. Los marcadores de proteína predictivos identificados en este documento incluyen los que se enumeran en la Tabla 1.
Tabla 1. Marcadores de proteínas comprendidos en varios perfiles de marcadores de proteínas de la presente descripción.
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Tal como se usa en el presente documento, el término "determinar un perfil de marcador de proteína", y similares, se refiere a detectar, medir, o bien evaluar el nivel, la cantidad o la proporción de uno o más marcadores de proteína que pertenecen a un perfil dado. Dicha determinación puede proporcionar un valor relativo o absoluto que represente la cantidad o el nivel de dicho marcador en una muestra biológica obtenida de un individuo cuyo perfil de marcador y, eventualmente, el riesgo de desarrollar T1D, deben determinarse.
Las muestras biológicas adecuadas para su uso de acuerdo con la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, muestras de tejido (por ejemplo, muestras pancreáticas), muestras de sangre que incluyen sangre entera, suero, plasma, células mononucleares de sangre periférica y cualquier célula sanguínea purificada, y muestras de orina. En esencia, cualquier muestra que contenga proteínas biológicas puede usarse para los presentes fines.
El nivel o la cantidad de un marcador de proteína en una muestra biológica se puede determinar mediante una variedad de técnicas, como es evidente para un experto en la técnica. Los ejemplos no limitativos de métodos adecuados incluyen técnicas de proteómica cuantitativa basadas en espectrometría de masas, tales como etiquetas isobáricas para reactivos de cuantificación relativa y absoluta (iTRAQ) y análisis sin etiquetas, así como espectrometría de masas de monitoreo de reacción seleccionada (SRM). Además, el nivel o la cantidad de un marcador de proteína se puede determinar, por ejemplo, mediante un inmunoensayo, espectrofotometría, un ensayo enzimático, un ensayo ultravioleta, un ensayo cinético, un ensayo electroquímico, un ensayo colorimétrico, un ensayo turbidimétrico, un ensayo de absorción atómica, citometría de flujo, o cualquier combinación de los mismos. Otras técnicas analíticas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, cromatografía líquida tal como cromatografía líquida de alto rendimiento/presión (HPLC), cromatografía de gases, espectrometría de resonancia magnética nuclear, técnicas relacionadas y combinaciones y híbridos de las mismas, por ejemplo, una cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) en tándem.
Tal como se usa en el presente documento, el término "expresión incrementada" se refiere a un aumento en la cantidad de una proteína en una muestra en comparación con una correspondiente muestra de control. Dicho aumento puede determinarse cualitativamente y/o cuantitativamente de acuerdo con los métodos estándar conocidos en la técnica. La expresión aumenta si la cantidad de proteína en la muestra es, por ejemplo, al menos aproximadamente 1,5 veces, 1.75 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 20 veces o 30 veces la cantidad de la misma proteína en la muestra de control.
Tal como se usa en el presente documento, el término "expresión disminuida" se refiere a una disminución en la cantidad de una proteína en una muestra en comparación con una muestra de control correspondiente. Dicha disminución se puede determinar cualitativamente y/o cuantitativamente de acuerdo con los métodos estándar conocidos en la técnica. La expresión disminuye si la cantidad de proteína en la muestra es, por ejemplo, al menos aproximadamente 1,5 veces, 1.75 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 20 veces o 30 veces menor que la cantidad de la misma proteína en la muestra de control.
Para determinar si el nivel de expresión o la cantidad de un marcador de proteína es mayor o menor de lo normal, se debe determinar la cantidad normal del marcador de proteína presente en una muestra biológica de un control relevante. Una vez que se conocen las cantidades de marcadores normales, las cantidades de marcadores determinadas se pueden comparar con ellas y se puede evaluar la importancia de la diferencia utilizando métodos estadísticos estándar. Cuando hay una diferencia estadísticamente significativa entre la cantidad de marcador determinada y la cantidad normal, existe un riesgo significativo de que el individuo evaluado desarrolle T1D.
En algunas realizaciones adicionales, los niveles, cantidades o relaciones relativas de uno o más marcadores de proteínas pueden compararse con un valor umbral predeterminado que es indicativo del riesgo de desarrollar T1D. Los métodos estadísticos para determinar los valores umbrales apropiados serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica. El valor umbral se origina a partir de un control relevante que puede ser un solo individuo no afectado por T1D o un valor agrupado de más de uno de tales individuos.
Tal como se usa en el presente documento, el término "control relevante" se refiere a una muestra de control, un perfil proteómico de control, o un valor de control, preferiblemente un caso equivalente al individuo cuyo riesgo de T1D se debe predecir. La equivalencia de casos se puede realizar, por ejemplo, en base a uno o más de los siguientes criterios: edad, fecha de nacimiento, lugar de nacimiento, sexo, predisposición a T1D, estado de HLA y cualquier parámetro demográfico relevante. En algunas realizaciones, dicha muestra o perfil de control consisten en un conjunto de muestras o perfiles de control relevantes, preferiblemente emparejados por casos. En algunas realizaciones, dicho perfil de control o valor de control se han predeterminado antes de predecir un riesgo de T1D en un individuo de acuerdo con la presente descripción. En algunas otras realizaciones, la determinación de dicho perfil de control o valor de control puede consistir en una etapa del método en cualquiera de los métodos predictivos descritos en el presente documento.
Opcionalmente, antes de compararse con la muestra de control, los niveles de marcadores de proteínas se normalizan utilizando procedimientos estándar.
Las curvas características de operación del receptor (ROC) se pueden utilizar para demostrar el compromiso entre la sensibilidad y la especificidad de un marcador, como es bien conocido por los especialistas en la técnica. La sensibilidad es una medida de la capacidad del marcador para detectar la enfermedad, y la especificidad es una medida de la capacidad del marcador para detectar la ausencia de la enfermedad. El eje horizontal X de la curva ROC representa la especificidad 1, que aumenta con la tasa de falsos positivos. El eje vertical Y de la curva representa la sensibilidad, que aumenta con la tasa de verdaderos positivos. Por lo tanto, para un corte particular seleccionado, se pueden determinar los valores de especificidad y sensibilidad. En otras palabras, los puntos de datos en las curvas ROC representan la proporción de clasificaciones verdaderas positivas y falsas positivas en varios límites de decisión. Los resultados óptimos se obtienen a medida que la proporción de verdadero positivo se acerca a 1,0 y la proporción de falso positivo se acerca a 0,0. Sin embargo, a medida que se cambia el corte para aumentar la especificidad, generalmente se reduce la sensibilidad y viceversa.
Tal como se usa en el presente documento, el término "falso positivo" se refiere a un resultado de prueba que clasifica a un sujeto no afectado incorrectamente como un sujeto afectado, es decir, un sujeto que tiene o se predice que desarrollará una enfermedad. Del mismo modo, "falso negativo" se refiere a los resultados de una prueba que clasifica a un sujeto que tiene o desarrollará una enfermedad incorrectamente como un sujeto no afectado.
Tal como se usa en el presente documento, el término "verdadero positivo" se refiere a un resultado de prueba que clasifica a un sujeto que tiene o desarrollará una enfermedad correctamente como un sujeto que tiene o se predice que desarrollará una enfermedad. Del mismo modo, "verdadero negativo" se refiere a un resultado de prueba que clasifica correctamente a un sujeto no afectado como no afectado.
De acuerdo con lo anterior, el término "tasa de éxito" se refiere a la proporción expresada en porcentaje de individuos afectados con un resultado positivo, mientras que los términos "tasa de falsos positivos" y "tasa de detección falsa" (FDR) se refieren a la proporción expresada en porcentaje de individuos no afectados con un resultado positivo.
El área bajo la curva ROC, a menudo denominada AUC, es una medida de la utilidad de un marcador en la identificación correcta de los sujetos con enfermedad, es decir, los sujetos que desarrollarán T1D. Por lo tanto, los valores de AUC se pueden usar para determinar la efectividad de la prueba. Un área de 1,0 representa una prueba perfecta; un área de 0,5 representa una prueba sin valor. Una guía aproximada tradicional para clasificar la precisión de una prueba diagnóstica o predictiva es la siguiente: los valores AUC de 0,9 a 1,0 representan una prueba con excelente poder diagnóstico o predictivo, los valores AUC de 0,80 a 0,90 representan una prueba con buena potencia diagnóstica o predictiva, los valores de AUC de 0,70 a 0,80 representan una prueba con un poder de diagnóstico o predictivo aceptable, los valores de AUC de 0,60 a 0,70 representan una prueba con un poder diagnóstico o predictivo deficiente, y los valores de AUC de 0,50 a 0,60 representan una prueba con una potencia diagnóstica o predictiva fallida.
Tal como se describe en la parte experimental, la presente descripción se basa en un análisis de una serie única de muestras de suero prospectivas de niños en riesgo recogidas en el estudio finlandés de predicción y prevención de la diabetes tipo 1 (DIPP). Las muestras cubrieron el período de tiempo desde antes del desarrollo de autoanticuerpos (seroconversión) hasta el diagnóstico de diabetes. Se seleccionaron como controles niños sanos, persistentemente negativos con autoanticuerpos equivalentes en términos de fecha y lugar de nacimiento, género y riesgo genético conferido por HLA-DQB1. Los niños que finalmente desarrollaron T1D a veces se denominan "casos" en el presente documento.
Los análisis cuantitativos de los datos dieron como resultado la identificación de proteínas que pueden usarse para predecir el riesgo de T1D y proporcionar indicaciones de la aparición de la enfermedad antes del diagnóstico y, sorprendentemente, incluso antes de la seroconversión. Los paneles de marcadores de proteína predictivos identificados se pueden agrupar en tres categorías diferentes en función de su utilidad temporal para predecir el riesgo de T1D.
Una primera categoría temporal identificada de marcadores proteicos se basa en los cambios en la abundancia de proteínas antes de la seroconversión, particularmente de 3 a 6 meses antes de la seroconversión. La expresión de estas proteínas aumenta o disminuye antes de la seroconversión. Tal como se describe en los ejemplos mostrados a continuación, los análisis de las características del operador receptor de los datos proporcionaron una buena clasificación de los niños propensos a desarrollar T1D con respecto a sus controles. Para ser más específicos, en muestras recolectadas en un período de tiempo de 6 meses previo a la seroconversión, se observaron niveles mayores de PROF1 con una consistencia suficiente para observar un AUC de 0,85 en el análisis de ROC. Un análisis adicional reveló que la combinación de PROF1 y FLNA proporcionó un AUC de 0,88 (Figura 6).
De este modo, en una realización de la presente descripción, la predicción del riesgo de T1D, preferiblemente antes de la seroconversión, se basa en la determinación del perfil del marcador de proteína de PROF1 y FLNA, y en la comparación del perfil del marcador de proteína determinado con el de un control. El aumento de la expresión del perfil del marcador de proteína con respecto al perfil del marcador de control es indicativo de un riesgo de desarrollar T1D.
El análisis de la ruta de proteínas diferencialmente abundantes de tres a seis meses antes de la seroconversión de autoanticuerpos reveló asociaciones bioquímicas entre PROF1, FLNA, TAGL2, VASP, CFL1, ACTB y TMSB4X (Figura 7). Así, la clasificación basada en PROF1 y FLNA de sujetos en riesgo y sujetos no afectados puede mejorarse mediante la inclusión de uno cualquiera de los marcadores de proteínas TAGL2, VASP, CFL1, ACTB y TMSB4X, ya sea solo o en cualquier combinación, en el perfil del marcador de proteína que se va a determinar para predecir el riesgo de T1D.
Una segunda categoría temporal identificada de marcadores de proteínas se basa en los cambios en la abundancia de proteínas, en comparación con los niveles de control, a lo largo de la serie temporal. En otras palabras, estos marcadores pueden usarse para predecir el riesgo de T1D tanto antes como después de la seroconversión. La expresión de estas proteínas bien aumenta o bien disminuye en las series temporales.
Un primer panel marcador de proteínas que pertenece a la segunda categoría temporal comprende SHBG ya sea solo o en cualquier combinación con uno o más de los marcadores de proteínas CO8G, ZPI, BTD, CO5 y THBg . De acuerdo con los resultados de la presente, la expresión de SHBG se redujo mientras que la expresión de CO8G, ZPI, BTD, CO5 y THBG se incrementó en los niños que desarrollaron T1D en comparación con los niveles de expresión en las muestras de control. Por sí sola, la SHBG produjo un AUC de 0,74, pero cuando se usó en combinación con cualquiera de CO8G, ZPI, BTD, CO5 y THBG, el AUC mejoró hasta el orden de 0,8 (Figuras 8A y 8B).
Por lo tanto, en una realización de la presente descripción, la predicción del riesgo de T1D se basa en la determinación del perfil del marcador de proteína de SHBG, ya sea solo o en cualquier combinación con uno o más de los marcadores proteicos seleccionados del grupo que consiste en CO8G, ZPI, BTD, CO5 y THBG, y la comparación del perfil del marcador de proteína determinado con el de un control. Las diferencias en el perfil del marcador de proteína con respecto al perfil del marcador de control son indicativos de un riesgo de desarrollar T1D. Estos perfiles de marcadores son adecuados para ser utilizados en un período de tiempo previo a la seroconversión o desde el estado seroconvertido hasta el diagnóstico.
Un segundo panel marcador de proteínas que pertenece a la segunda categoría temporal comprende APOC4 y AFAM. Como se describe en los ejemplos mostrados a continuación, el análisis estadístico de muestras clínicas reveló que APOC4 y AFAM, preferiblemente en combinación, son marcadores de proteínas notablemente efectivos para determinar el riesgo de T1D con tasas de detección y de falsos positivos clínicamente aceptables. En este documento, APOC4 y AFAM se detectaron sistemáticamente a niveles dispares, más bajos y más altos, respectivamente, en muestras prospectivas de niños que desarrollaron T1D. En conjunto, se determinó una tasa de éxito del 91% con una tasa de falsos positivos del 5% con base en APOC4 junto con los niveles de AFAM (Figura 4A). El análisis ROC de APOC4 en combinación con AFAM produjo un AUC de 0,87 (Figura 5A).
Por lo tanto, en una realización de la presente invención, la predicción del riesgo de T1D se basa en la determinación del perfil del marcador de proteína de APOC4 y AFAM, y en la comparación del perfil del marcador de proteína determinado con el de un control. Las diferencias en el perfil del marcador de proteína con respecto al perfil del marcador de control son indicativos de un riesgo de desarrollar T1D.
Un tercer panel del marcador de proteína temporal identificado comprende proteínas cuyos niveles de expresión reflejan la transición del estado seroconvertido hacia el diagnóstico. Los análisis de los presentes datos revelaron que la progresión a T1D se caracteriza por una disminución de IBP2 y ADIPO, y un aumento de CO2. Por lo tanto, los pacientes seroconvertidos deben ser monitorizados para detectar estos marcadores de proteínas como indicadores de la gravedad antes de la enfermedad y/o para identificar cualquier necesidad de intervención, y más cuando se toman junto con el contraste proporcionado junto con SHBG y CO8G (Figura 9).
Por lo tanto, en una realización de la presente descripción, la predicción del riesgo de T1D se basa en la determinación del perfil del marcador de proteína de IBP2, ADIPO y CO2, y en la comparación del perfil del marcador de proteína determinado con el de un control. Las diferencias en el perfil del marcador de proteína con respecto al perfil del marcador de control son indicativos de un riesgo de desarrollar T1D. En una realización adicional, dicho perfil de marcador incluye, además de IBP2, ADIPO y CO2, uno o ambos de SHBG y CO8G.
En algunas realizaciones, los paneles marcadores de proteínas definidos anteriormente se pueden usar en cualquier combinación deseada. Así, un panel marcador de proteínas que comprende PROF1 y FLNA y, opcionalmente, al menos uno de TAGL2, VASP, CFL1, ACTB y TMSB4X, se puede usar en combinación con un panel marcador de proteínas que comprende SHBG y, opcionalmente, al menos uno de CO8G, ZPI, BTD, CO5 y THBG, o con un panel marcador de proteínas que comprende APOC4 y AFAM, o con un panel marcador de proteínas que comprende IBP2, ADIPO y CO2 y, opcionalmente, uno o ambos de SHBG y CO8G. Del mismo modo, en algunas realizaciones, un panel marcador de proteínas que comprende SHBG y, opcionalmente, al menos uno de CO8G, ZPI, BTD, CO5 y THBG, se puede usar en combinación con un panel marcador de proteínas que comprende APOC4 y AFAM, o con un panel marcador de proteína compuesto por IBP2, ADIPO y CO2, y opcionalmente uno o ambos de SHBG y CO8G. Del mismo modo, un perfil de marcador de proteína que comprende APOC4 y AFAM se puede usar en combinación con un panel marcador de proteína que comprende IBP2, ADIPO y CO2, y opcionalmente uno o ambos de SHBG y CO8G.
En algunas realizaciones, la evaluación o la predicción del riesgo de T1D de un individuo puede basarse en determinar, además de los perfiles de marcadores de proteínas establecidos anteriormente, el nivel o la cantidad de uno o más marcadores de proteínas establecidos en la Tabla 4 y/o Tabla 5. La selección de uno o más de estos marcadores de proteína adicionales que se van a usar puede depender de una variedad de consideraciones prácticas, tales como la disponibilidad de reactivos o equipos para pruebas de marcadores de proteínas.
En resumen, utilizando un análisis basado en espectrometría de masas de sueros inmuno-agotados, los presentes inventores han demostrado por primera vez los perfiles proteómicos séricos de la transición prediabética hasta el diagnóstico, comparando los perfiles entre niños que progresan a la diabetes tipo 1 y niños sanos. Estos resultados demuestran cambios longitudinales compartidos y específicos de grupo frente a un fondo de amplia heterogeneidad de sujeto, lo que sugiere que los componentes de las proteínas séricas moderadamente abundantes pueden ser indicativos de la amenaza emergente de la diabetes tipo 1.
Opcionalmente, los presentes métodos pueden comprender además determinar variaciones en el perfil proteómico del individuo a diferentes tiempos con el fin de monitorizar, preferiblemente antes de la seroconversión, cualquier cambio en el desarrollo del riesgo de T1D.
En algunas implementaciones, los presentes métodos para predecir el riesgo de un individuo de padecer T1D pueden incluir además una intervención terapéutica. Una vez que se identifica que un individuo tiene un mayor riesgo de T1D, puede ser sometido, por ejemplo, a cambios en la dieta u otros cambios en el estilo de vida del individuo.
En algunas implementaciones adicionales, los paneles de marcadores de proteína predictivos identificados en el presente documento se pueden usar para seleccionar nuevos compuestos terapéuticos o fármacos preventivos para la T1D. En otras palabras, los presentes paneles se pueden usar para evaluar si un medicamento candidato es capaz o no de corregir el perfil del marcador de proteína de un individuo en riesgo hacia el de un individuo no afectado. Por ejemplo, los individuos identificados con un mayor riesgo de T1D en función de su perfil de marcador de proteína perteneciente a la primera o segunda categoría temporal de marcadores de proteína predictivos podrían emplearse como objetivos en los ensayos de vacunación preventiva o en los ensayos destinados a identificar agentes preventivos, como los probióticos, para T1D.
En otras realizaciones e implementaciones adicionales, los paneles de marcadores de proteínas identificados en el presente documento se pueden usar para determinar el estadio de progresión de un individuo hacia T1D y/o para monitorizar o predecir la progresión de un individuo hacia T1D. Dicho estadio de progresión puede ser un estadio anterior a la seroconversión, por ejemplo, 3 a 6 meses antes de la seroconversión o 9 a 12 meses antes de la seroconversión, o una etapa posterior a la seroconversión, por ejemplo, diagnóstico previo de 3 a 6 meses, diagnóstico previo de 9 a 12 meses o diagnóstico previo de 15 a 18 meses. De los paneles de marcadores de proteínas divulgados en el presente documento, el panel i), es decir, PROF1 y FLNA, opcionalmente, con uno o más marcadores de proteínas seleccionados del grupo que consiste en TAGL2, VASP, CFL1, ACTB y TMSB4X, es particularmente adecuado para monitorizar dicha progresión de la T1D del individuo en el estadio anterior a la seroconversión y predecir la progresión al estadio posterior a la seroconversión, por ejemplo de tal manera que se predice que dicho individuo afrontará el estadio posterior a la seroconversión, por ejemplo, dentro de 9 a 12 meses o de 3 a 6 meses. El panel marcador de proteínas ii), es decir, SHBG, opcionalmente, con uno o más marcadores de proteínas seleccionados del grupo que consiste en CO8G, ZPI, BTD, CO5 y THBG, y/o el panel marcador de proteínas iii), es decir, AFAM y APOC4, también pueden usarse como se indicó anteriormente para el panel i) pero, alternativa o adicionalmente, también pueden usarse para monitorizar la progresión de T1D de dicho individuo al estadio posterior a la seroconversión o para predecir la progresión hacia el diagnóstico de T1D, por ejemplo de tal manera que se predice que dicho individuo afrontará el diagnóstico de T1D, por ejemplo, dentro de 9 a 12 meses o de 3 a 6 meses. El panel iv), es decir, IBP2, ADIPO y CO2, opcionalmente, con uno o ambos de SHBG y CO8G, es particularmente adecuado para monitorizar la progresión a T1D de dicho individuo en el estadio posterior a la seroconversión o para predecir la progresión hacia el diagnóstico de T1D, por ejemplo, de tal manera que se predice que dicho individuo afrontará el diagnóstico de T1D, por ejemplo dentro de 9 a 12 meses o de 3 a 6 meses
En otras implementaciones adicionales, la presente descripción se refiere a un kit in vitro para predecir, preferiblemente antes de la seroconversión, un riesgo de que un sujeto desarrolle T1D. El kit puede usarse en cualquiera de los métodos de la presente descripción. Típicamente, el kit comprende uno o más agentes de prueba para analizar una muestra obtenida de un individuo cuyo riesgo de T1D se debe determinar para uno cualquiera o más de los paneles de marcadores de proteínas descritos en el presente documento, indicativos de un riesgo de desarrollar T1D. En algunas realizaciones, el kit puede comprender uno o más agentes de prueba que reconocen un perfil de marcador de proteína que comprende:
i) PROF1 y FLNA, y, opcionalmente, también uno o más marcadores de proteínas seleccionados del grupo que consiste en TAGL2, VASP, CFL1, ACTB y TMSB4X;
ii) SHBG y, opcionalmente, también uno o más marcadores de proteínas seleccionados del grupo que consiste en CO8G, ZPI, BTD, CO5 y THBG;
iii) AFAM y APOC4; o
iv) IBP2, ADIPO y CO2 y, opcionalmente, uno o ambos de SHBG y CO8G.
En algunas realizaciones, el kit también puede comprender los agentes de prueba para cualquier marcador de proteína, o una combinación de los mismos, enumerados en la Tabla 4 o 5.
El kit también puede comprender un medio legible por ordenador que comprende instrucciones ejecutables por ordenador para realizar cualquier método de la presente descripción.
Será obvio para una persona experta en la técnica que, a medida que la tecnología avanza, el concepto inventivo se puede implementar de varias maneras. La invención y sus realizaciones no se limitan a los ejemplos descritos a continuación, sino que pueden variar dentro del alcance de las reivindicaciones.
Ejemplos
Ejemplo 1. Diseño y métodos de investigación
En la Figura 1 se ilustra un esquema del diseño experimental utilizado en la identificación de estos marcadores. En el Ejemplo 2 se proporciona una descripción detallada de las mediciones proteómicas, de las muestras y de las comparaciones.
Sujetos y toma de muestras
Todos los niños estudiados fueron participantes del estudio finlandés DIPP, en el que hizo un seguimiento prospectivamente desde el nacimiento a niños identificados con riesgo de diabetes tipo 1 en base a su genotipo de HLA. En cada visita del estudio a los niños se les tomaron muestras de sangre venosa sin estar en ayunas. Los sueros se separaron y almacenaron a -70°C dentro de las tres horas posteriores a la toma de las muestras de sangre. Las mediciones de autoanticuerpos de células de los islotes (ICA) se realizaron como se ha descrito anteriormente. Para los niños positivo para ICA, también se determinó la ácido glutámico descarboxilasa (GADA), los anticuerpos de la proteína relacionada con la tirosina fosfatasa (IA-2A) y los anticuerpos de la insulina (IAA).
Se realizaron mediciones proteómicas en sueros de 28 casos de niños que desarrollaron diabetes tipo 1 durante el seguimiento del estudio DIPP. Se seleccionaron muestras de suero prospectivas (5-11 por niño) para representar diferentes fases de la progresión de la T1D desde el resultado de autoanticuerpo negativo a seroconversión (SC), y hasta enfermedad manifiesta. Se comparó un niño equivalente con control negativo persistente de autoanticuerpos con cada caso (generalmente del orden de siete muestras por niño), según la fecha y el lugar de nacimiento, el género y el genotipo HLA-DQB1. Las muestras de suero de control prospectivo se emparejaron con las muestras de casos por edad al momento del muestreo. En total, se analizaron 409 muestras de suero, de las cuales se procesaron sueros de veintiséis niños (13 pares de casos y controles) para el análisis con iTRAQ, y de treinta niños (15 pares de casos y controles) para análisis mediante una estrategia sin etiqueta (Tabla 2, Figura 2).
Tabla 2. Resumen de los niños que progresan hasta T1D cuyas muestras fueron estudiadas con proteómica.
Véanse también las Tablas 3a, b y c del Ejemplo 2 para más información sobre los casos y sus controles emparejados.
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x * *02, *03:01, *06:02/3
Preparación de la muestra
Se eliminaron de las muestras de suero las proteínas más abundantes usando columnas de inmunoafinidad. En este estudio se usaron las columnas de Beckman-Coulter (IgY-12) y Agilent (Hu14), donde siempre se aplicó el mismo método de eliminación a las muestras de seguimiento de cada par caso-control.
Se compararon muestras de veintiséis niños usando el método iTRAQ, usando veintisiete esquemas de etiquetado ITRAQ de 8-plex pareados / referencia cruzada de las muestras. Para el etiquetado con iTRAQ, las muestras se procesaron a continuación según el protocolo del fabricante para los reactivos 8-plex (ABSciex, Framingham, MA, EE.UU.), a continuación se fraccionaron utilizando cromatografía de intercambio catiónico fuerte. El esquema de etiquetado típico para las mediciones de iTRAQ fue el indicado en la Figura 3, donde se usó una referencia combinada para relacionar los experimentos.
Se compararon las muestras de treinta niños utilizando la cuantificación sin etiqueta (LFQ), con la concentración y la digestión realizadas de manera similar a las muestras de iTRAQ, con las digestiones sin fraccionar antes de la LC-MS /MS. Se realizaron dos lotes de análisis, a saber, LFQ1 (n = 6 pares) y LFQ2 (n = 9 pares).
Análisis de LC-MS/MS
Los análisis de espectros de masas en tándem de HPLC (LC-MS/MS) se realizaron con un instrumento de tiempo de vuelo QSTAR-Elite (TOF) y un instrumento de transformada de Fourier (FT) Orbitrap-Velos. Para el análisis de las muestras marcadas con iTRAQ, se utilizaron los modos de disociación inducida por colisión y de disociación de colisión de mayor energía para registrar los espectros de masas en tándem de iones positivos para QSTAR-Elite y Orbitrap-Velos, respectivamente. Los datos sin etiqueta se adquirieron con Orbitrap-Velos mediante disociación inducida por colisión. Las separaciones cromatográficas se realizaron con columnas cónicas de 150 mm x 75 pm de diámetro interno empacadas con sílice unida a Magic C18 (200 Á), utilizando gradientes binarios de agua y acetonitrilo con ácido fórmico al 0,2%.
Procesamiento de datos de LC-MS/MS
Los datos de iTRAQ se analizaron utilizando el software ProteinPilot™ usando el algoritmo de identificación Paragon™ con una base de datos Swiss-Prot humana (18/08/2011, 20245 entradas). Las búsquedas en la base de datos se realizaron en el modo completo especificando la cuantificación de iTRAQ de 8-plex, la digestión con tripsina y la modificación de cisteína con MMTS. Las relaciones de iTRAQ se calcularon en relación con las muestras de referencia utilizando ProteinPilot™.
Los datos sin etiqueta se analizaron con Proteome Discover versión 1.3 (Thermo Scientific) junto con Mascot (2.1, Matrix Science). Los criterios de búsqueda de la base de datos fueron la digestión con tripsina, la modificación de la cisteína con MMTS, la desamidación de N/Q y la oxidación de metionina, utilizando la misma base de datos. Se utilizaron los ajustes de tolerancia de masa de 5 ppm para los precursores y de 0,5 Da para fragmentos. Para el análisis cuantitativo, se utilizó el software Progenesis (versión 4.0) para la detección y alineación de características de los mapas de iones y el cálculo de las mediciones de abundancia basadas en la intensidad para cada proteína. Para facilitar la comparación de los datos sin etiqueta con los resultados de iTRAQ, se escalaron los valores de intensidad de cada proteína en relación con la intensidad media de cada proteína a lo largo de la serie de muestras de casocontrol pareado.
Análisis de los datos
Diferencias proteómicas en suero entre niños sanos y los que progresan a diabetes tipo 1. Se calcularon los índices de abundancia de caso-control para las muestras pareadas. Las relaciones se transformaron en log2 y se utilizaron en el intervalo de análisis de productos (RP) como es bien conocido en la técnica para identificar diferencias a lo largo de la serie temporal (n = 28), antes de la detección de la seroconversión de autoanticuerpos (n = 23) y antes del diagnóstico (n = 28). Los análisis de RP se realizaron con permutaciones de 10.000 veces y se aplicó una tasa de descubrimiento falsa (FDR) menor o igual al 5% (corrección de Benjamini-Hochberg (BH)). Las diferencias analizadas se hicieron para las relaciones promedio caso-control en los siguientes intervalos de tiempo (seleccionados en función de la similitud de la serie de muestras utilizada): a lo largo de la serie temporal; antes de la seroconversión, es decir, de 3 a 6 meses, de 9 a 12 meses y el período total; antes del diagnóstico, es decir, de 3 a 6 meses, de 9 a 12 meses, en 1,5 años y en la totalidad. Se realizaron pruebas estadísticas adicionales utilizando la prueba de suma de intervalos de Wilcoxon.
Cambios en la proteómica en suero en niños que progresan a diabetes tipo 1. Se realizaron análisis de correlación de intervalo de Spearman para evaluar si alguno de los perfiles de proteínas estaba correlacionado con la aparición de T1D. Los análisis se realizaron para los índices de abundancia de caso-control recopilados de las muestras pareadas. Para esta comparación hubo once pares bien emparejados con muestras antes y después de la seroconversión (sujetos D1, d4, D5, D9, D10, D11, D12, D14, D15, D17, D19). El análisis se repitió por separado para los sujetos de caso y control con índices de referencia. Para unificar este análisis, se escaló el eje de edad / tiempo entre el nacimiento y el diagnóstico (cero a uno). Un coeficiente de correlación de Spearman superior a 0,4 se consideró una correlación débil válida (valor-p basado en 10.000 permutaciones del eje de tiempo. FDR corregida con BH < 0,05).
Clasificación del sujeto y el estado. Se aplicó el método de los pares con mejores puntuaciones (TSP) para identificar si las combinaciones de las proteínas cuantificadas podían clasificar las muestras y los sujetos. Se usó el método de dejar uno fuera para la validación cruzada. El método se probó en términos de abundancia relativa de proteínas a lo largo de la serie temporal, antes o después de la seroconversión, así como para los cambios longitudinales entre individuos asociados supuestamente con el estado seroconvertido. Los valores promediados de abundancia relativa de log2 de proteína en el sujeto se utilizaron para los períodos de tiempo estudiados. En los datos preliminares (ITRAQ y LFQ1), se detectó APOC4 en 16 de los 19 pares de sujetos, los 16 se analizaron por separado con el método TSP. La falta de cuantificación de APOC4 en todos los niños se atribuyó a las diferencias en el rendimiento del instrumento más que en su ausencia.
Ejemplo 2. Información suplementaria sobre muestras
Sujetos y muestras
Los detalles de las muestras de suero obtenidas en niños que progresan a diabetes tipo 1 (D) y sus controles pareados (C) se muestran a continuación en las Tablas 3a, 3b y 3c.
Tabla 3a. Muestras de iTRAQ
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Tabla 3b. Muestras sin etiqueta LFQ1.
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Tabla 3c. Muestras sin etiqueta LFQ2.
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Comparaciones de muestras
Muestras emparejadas
Las comparaciones correspondientes a las muestras se emparejaron principalmente dentro de una ventana de tiempo de 60 días, con unas pocas excepciones en las que se usó una muestra posterior. Las muestras donde no se pudo realizar el emparejamiento solo se utilizaron para obtener una visión general del agrupamiento de los perfiles de expresión. Para el análisis de los tiempos seleccionados, se realizó la siguiente agrupación (basada en el uso de los índices emparejados de caso/control) según las edades y los intervalos de tiempo de la Tabla 3a y la Tabla 3b: Las muestras se agruparon en función del tiempo de recolección
i) 3 a 6 meses antes de la seroconversión;
ii) 9 a 12 meses antes de la seroconversión;
iii) 3 a 6 meses antes del diagnóstico;
iv) 9 a 12 meses antes del diagnóstico;
v) 15 a 18 meses antes del diagnóstico;
vi) a lo largo de los 18 meses previos al diagnóstico.
Ejemplo 3. Resultados
Las mediciones de iTRAQ detallaron en promedio la comparación cuantitativa de 220 proteínas, y en total se identificaron 658 proteínas y se cuantificaron con dos o más péptidos únicos. En comparación con las concentraciones de referencia y después de excluir las dianas de agotamiento, éstas abarcaban un intervalo de concentraciones estimadas de seis órdenes de magnitud. Con los análisis que utilizan un enfoque sin etiqueta, se detectaron y cuantificaron sistemáticamente 261 proteínas con más de un péptido único y que abarcan un intervalo de detección dinámico similar. Había 248 proteínas comunes a las dos técnicas.
Diferencias entre los proteomas en suero de los niños que desarrollaron T1D y sus controles emparejados por edad. Para los sujetos considerados en este estudio, los niños que desarrollaron T1D tenían niveles más bajos de SHBG, APOC4, APOC2 y APOC1 que sus controles sanos de la misma edad (FDR <3%) (Tabla 3).
En muestras previas a la seroconversión, se observaron niveles más bajos de APOC4 y APOC2 y APOA en niños que desarrollaron diabetes tipo 1 que en sus controles. De manera similar, la consideración específica de las muestras de 3 a 6 meses antes de la seroconversión fue consistente con los niveles más bajos de IBP2, TSP4, APOC2 y APOC4, así como con una mayor abundancia relativa de PROF1, FLNA y TAGL2.
Con un análisis similar de los datos posteriores a la seroconversión de la misma edad, se distinguieron varias proteínas con una abundancia relativa más baja, que incluyen SHBG, ADIPO, THBG, APOC4, APOC2, IBP2, APOC1 y APOC3 (FDR < 5%, Tabla 4).
Tabla 4. Proteínas en suero detectadas a diferentes niveles entre los niños que progresan a diabetes tipo 1 y sus controles emparejados.
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Cambios longitudinales en el proteoma del suero de los niños con evolución hacia T1D
Con el análisis de los índices de abundancia de proteínas, no se observaron correlaciones significativas entre los índices de caso-control con el tiempo hacia el diagnóstico. Por el contrario, las correlaciones de referencia de caso y control produjeron un indicio mucho más claro de los cambios longitudinales en el proteoma sérico, tanto en el caso como en el control. A diferencia de las proteínas correlacionadas observadas tanto con los niños de caso como de control (> 0,4, FDR <0,05), hubo cambios en la abundancia de 26 proteínas (14 aumentaron y 12 disminuyeron, FDR <5%, Tabla 5). Esto incluyó las proteínas incluidas en la Tabla 4, destacando su utilidad para evaluar el avance de la enfermedad.
Tabla 5. Cambios longitudinales en proteínas en suero específicas para niños que desarrollan T1D
Se identificó un subconjunto de proteínas en el que el coeficiente de correlación absoluto de Spearman fue mayor que 0,4 (FDR <0,05) y no se observó en, o por encima de, estos umbrales en los sujetos de control. El análisis se basó en los cambios observados en once niños que representan las muestras antes y después de la seroconversión (D1, D4, D5, D9, D10, D11, D12, D14, D15, D17, D19). El enriquecimiento funcional para estas proteínas se muestra en la Tabla 6. Cabe destacar que se incluyen en esta lista las proteínas ADIPO e IBP2, que también se detectaron como diferencialmente abundantes en los análisis de productos de rango. El cambio temporal de estas proteínas podría usarse para evaluar un mayor riesgo, particularmente en sujetos seroconvertidos.
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Tabla 6. Anotaciones GO enriquecidas en proteínas que aumentan en los niños, que progresaron a diabetes tipo 1.
El enriquecimiento se calculó para proteínas con un coeficiente de correlación absoluto de Spearman superior a 0,4 (FDR < 0,05) que no se observaron en, o por encima de, estos umbrales en los sujetos control. Se usó un fondo de las 208 proteínas detectadas para estos análisis en el análisis de enriquecimiento. Los nombres de las proteínas y los detalles de detección se indican en la Tabla 3.
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Clasificación proteómica sérica de los sujetos con evolución a T1D.
Se aplicó el método de los pares de puntaje más alto (TSP) para identificar si las combinaciones de las proteínas cuantificadas podían clasificar las muestras y los sujetos. Se utilizó el método de dejar-uno-fuera para la validación cruzada.
El análisis de TSP para los sujetos de iTRAQ y LFQ1 en el que se cuantificó APOC4 (16 de 19) clasificó a los niños que progresaron a diabetes tipo 1 con una tasa de éxito del 91%; el área bajo la curva fue de 0,89. La clasificación se basó en la combinación de los niveles relativos de APOC4 y AFAM, que fueron más bajos y más altos que en los controles, respectivamente (Figuras 4A y 5A).
El análisis de TSP para los sujetos de LFQ2 demostró que la SHBG en combinación con otras proteínas produjo una buena clasificación de los sujetos a lo largo de las series de tiempo (hasta un 94% de tasa de éxito). El análisis de los datos sin etiqueta solamente (LFQ1 y LFQ2) reveló que la combinación de SHBG y BTD proporcionó un AUC de 0,85 para los datos posteriores a la seroconversión y de 0,77 para antes de la seroconversión.
Para los datos recopilados, la SHBG proporcionó áreas bajo la curva para combinaciones de curvas de operador recibidas de estos marcadores del orden de 0,75 a 0,81. Estas combinaciones incluían niveles más altos de los siguientes: THBG, CO8G, BTD, CO5 y ZPI.
La profilina 1 (PFN1) se ha asociado con inflamación y resistencia a la insulina, y se detectaron diferencias especialmente significativas antes y después de la seroconversión (disminuyendo en este último caso). En particular, se observó un pico en la profilina 1 antes de la seroconversión y el análisis de la ruta de las proteínas diferencialmente abundantes detectadas en este período de tiempo indicó proteínas relacionadas funcionalmente (Figura 7). De hecho, las características ROC de la combinación de PROF1 y FLNA mejoraron el AUC a 0,88. En conjunto, estos hallazgos reflejan diferencias metabólicas y cambios previos al diagnóstico de diabetes tipo 1.

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un método para predecir, determinar y/o monitorizar un riesgo de y/o una progresión hacia la diabetes tipo 1 (T1D) en un individuo, comprendiendo dicho método:
a) determinar un perfil de marcador de proteína en una muestra obtenida del individuo, comprendiendo dicho perfil profilina-1 (PROF1) y filamina-A (FLNA),
b) comparar el perfil de marcador de proteína determinado y un perfil de control correspondiente, y
c) en respuesta a la comparación, determinar una predicción correspondiente a un riesgo relativo de que el individuo desarrolle T1D o un estadio de progresión hacia T1D.
2. El método según la reivindicación 1, en el que el perfil comprende además uno o más marcadores de proteína seleccionados del grupo que consiste en VASP, CFL1, ACTB, TAGL2 y TMSB4X.
3. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el riesgo de T1D se predice antes de la seroconversión.
4. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el individuo tiene un riesgo de T1D conferido por HLA.
5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además:
determinar uno o más marcadores de proteína seleccionados de los que se enumeran en la Tabla 4 y/o la Tabla 5,
comparar los marcadores de proteína determinados y los marcadores de control correspondientes, y en respuesta a la comparación, determinar una predicción correspondiente a un riesgo relativo de que el individuo desarrolle T1D.
6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha comparación y determinación de la predicción son realizadas por un procesador de un dispositivo informático.
7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha muestra es una muestra de sangre entera, una muestra de plasma, una muestra de suero, una muestra que comprende células sanguíneas purificadas, una muestra de tejido o una muestra de orina.
8. El uso de un kit de cribado in vitro para llevar a cabo el método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, comprendiendo dicho kit uno o más agentes de ensayo para evaluar en una muestra biológica un perfil de marcador de proteína indicativo de un riesgo de desarrollar T1D, donde dicho perfil comprende PROF1 y FLNA.
9. El uso según la reivindicación 8, que comprende además uno o más agentes de ensayo que reconocen uno o más marcadores de proteína seleccionados del grupo que consiste en TAGL2, VASP, CFL1, ACTb y TMSB4X.
10. El uso según la reivindicación 8 o 9, que comprende además uno o más agentes de ensayo que reconocen uno o más marcadores de proteína enumerados en la Tabla 4 y/o la Tabla 5.
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