JP4801309B2 - 皮膚への塗布物質を塗被した擦過面付きアプリケータ - Google Patents
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Description
【０００１】
〔発明の分野〕
本発明は、特に角質層を崩壊させ、その下の表皮層に物質を投与することによる皮膚内への物質の局所投与に関する。
【０００２】
〔発明の背景〕
皮膚を通して身体に物質を投与することは、一般的には侵襲性であり、皮内（ＩＤ）、筋内（ＩＭ）又は皮下（ＳＣ）注入又は注射を容易にするために針や注射器が必要である。これらの方法は、被検者にとって痛みを伴うものであり、熟練者の技能を必要とし、出血を生じる場合が多い。最近、皮膚の外側バリヤとして働く角質層、即ち、厚さ約１０〜２０μｍの角質化された細胞でできた薄い外側層を崩壊させ又は擦過し、露出した表皮に所望の物質を投与する器具を用いることによりこれらの欠点を解決する試みが行われている。この場合、物質は、表皮を通って血管及びリンパ管のある真皮に拡散することができ、それにより体全体にわたって吸収されて投与されるようになる。ワクチンの局所投与の場合、表皮それ自体は、抗原を提供する細胞が多いので薬剤投与に特に望ましいターゲットである。比較すると、真皮に含まれる抗原提供細胞の数はこれよりも少ない。角質層及び表皮中には神経又は血管が無く、したがってこの方法は、抗原に反応できる皮膚層への接近を与えながら本質的に痛みが無く且つ出血を生じないという利点を有している。
【０００３】
従来技術の報告によれば、物質を身体に投与する目的で角質層を崩壊させる種々の器具及び方法が存在する。例えば、角質層の切断は、カーソン（Carson）氏等に付与された米国特許第５，６７９，６４７号明細書に教示されているような穿刺によって達成できる。この米国特許は、例えばツベルクリン皮膚試験やアレルギー検査に用いられる器具に見受けられる小径の尖叉にポリヌクレオチドを塗被し、かかる尖叉を用いて物質を皮膚内へ投与できることを教示している。かかる方法では、皮膚を尖叉で穿刺する必要があり、その結果、塗被状態の物質の皮内注入が行われることになる。これは、小径の極小突起の表面に塗被された物質が穿刺ではなく皮膚表面全体にわたる横方向の擦過により一層効果的に投与されることが思いがけず発見された本発明とは対照的である。米国特許第５，００３，９８７号明細書、米国特許第５，８７９，３２６号明細書及び米国特許第３，９６４，４８２号明細書は、擦過により角質層を切断することを教示しているが、この手法によって有効且つ効果的な投与を達成するための局所塗布法の最適化の仕方については殆ど知られていない。かかる最適化は、局所核酸投与、特に核酸を主成分とするワクチンの局所投与や遺伝子治療にとって特に関心の高いものである。この点に関し、局所投薬のための最も一般的に提案されている方法は、ワクチンの塗布前に皮膚を擦過することである。しかしながら、予想外のこととして、核酸やペプチド、又はポリペプチド例えばアレルゲンの投与が、物質を擦過すると同時に投与した場合に一層効率的であって効果があるということが判明した。
【０００４】
〔発明の概要〕
本発明は、物質、特に核酸、アミノ酸、アミノ酸誘導体、ペプチド又はポリペプチドを局所投与する最適化された方法を提供する。核酸は、遺伝子発現を促進させ、これらが角質層の擦過と同時に投与されると、発現されたタンパク質に対する免疫反応を促進させるということが発見された。同様に、擦過と同時に投与されたアレルゲンは、従来のアレルゲン検査方法よりも活発な免疫反応を生じさせる。
【０００５】
〔好ましい実施形態の詳細な説明〕
本明細書で用いる「擦過」という用語は、例えば引っ掻くこと又は擦ることによる皮膚の外側層の崩壊を意味し、その結果、崩壊した角質層の領域が生じる。これは、角質層を貫通して別個独立の穴を生じさせ、穴相互間に崩壊しなかった角質層の領域が生じる「穿刺」とは対照的である。本発明の方法によれば、物質、例えば核酸を主成分とするワクチンやペプチド、例えばポリペプチドを予め擦過した皮膚に塗布するのではなく擦過と同時に皮膚に塗布する。すなわち、物質を、予め擦過した皮膚に受動的に塗布するのではなく、皮膚に擦り込む。この方法の結果として、擦過後塗布法と比較して投与結果及び応答性が向上する。物質を任意の薬学的に許容できる形態で皮膚中へ投与するのがよいが、液体又はゲル調合物が好ましい。一実施形態では、物質を皮膚に塗布し、次に、擦過器具を物質の付着した皮膚上で往復して動かし又は擦る。所望の結果を得るための最小限度の擦過を利用することが好ましい。選択された物質にとって擦過の適当な度合いの判定は、当業者により適宜実施される。別の実施形態では、物質を塗布に先立って投与器具の擦過表面に乾燥した形態で塗布してもよい。この実施形態では、元に戻す液体（以下、「戻し液」ともいう）を、投与部位のところで皮膚に塗布し、物質を塗被した擦過器具を戻し液の部位のところで皮膚に適用する。次にこれを皮膚上で往復して動かし、又は擦って物質が皮膚の表面上で戻し液中に溶解するようになり、そして擦過と同時に投与されるようになる。変形例として、戻し液を擦過器具内に収容し、器具を擦過のために皮膚に適用したときに放出されて物質を溶解するようにしてもよい。また、核酸製剤をゲルの形態で擦過器具上に塗被してもよいことが判明している。ただし、遺伝子発現の向上が、本発明の他の幾つかの実施形態の場合と同じほど顕著ではない。
【０００６】
擦過による角質層の崩壊のための当該技術分野で知られている任意の器具を本発明の方法に用いることができる。かかる器具としては、例えば、短い顕微針又は極小突起のアレイを備えた超小型電子機械（ＭＥＭＳ）装置、サンドペーパー状の器具、スクレーパ等が挙げられる。擦過器具が器具からの流体を収容したり放出するリザーバを備えていない場合、物質を含有した液体又は戻し液を擦過に先立って、例えば別個のディスペンサ又はポンプから別々に皮膚に塗布する必要がある。しかしながら、リザーバは、擦過器具の一体部分であるのがよい。代表的には、リザーバは、顕微針又は極小突起を通るチャネルを介して、又はかかる顕微針又は極小突起相互間でリザーバから出るチャネル、或いは多孔質材料を通して器具の擦過表面と流体連通状態にある。この実施形態では、物質又は戻し液は、擦過器具のリザーバ内に収容され、擦過に先だって、又は擦過と同時に皮膚表面に小出しされる。擦過器具は、物質又は戻し液の投与速度を制御し、又は物質又は戻し液の投与量を制御する手段を更に有するのがよい。
【０００７】
本発明の方法に用いられる核酸は、ＲＮＡ又はＤＮＡであるのがよい。これら核酸は、局所投薬及び細胞による摂取及び圧出に適した任意の物理的形態であってよい。これは、ウイルス性ベクター又はリポソーム内に含まれ、又は当該技術分野で知られているように自由ポリヌクレオチド、例えばプラスミドとして投与することができる。核酸は代表的には、核酸と適合性のある薬学的に許容できる調合物、例えば流体又はゲルの状態に調合されることになる。アレルゲン組成の調合を含む本発明で用いられる薬学的に許容できるペプチド及びポリペプチドの調合も又、当該技術分野において周知である。
【０００８】
最小限度の擦過（皮膚上で１回という少ないパス）という皮膚細胞への核酸の投与結果の向上をもたらすのに十分であることが判明している。核酸の投与及び圧出量は、皮膚上の擦過のパスの回数の増大につれて増加し続ける。６回以上の擦過パスにより、本発明者の実験装置では、核酸投与結果において最高の改善が見られた。皮膚上の全ての擦過パスは同一方向であってもよいが、方向を擦過中変えることが好ましい。核酸ワクチンの投与に今日最も普通に用いられているプロトコルは、投与量が少ない場合、通常追加の反応エンハンサを伴うＩＭ注入方式である。本発明の方法を用いて投与されるべき核酸ワクチンの適当な投与量の判定は、当業者が適宜行う選択事項である。しかしながら、核酸ワクチンの投与が遺伝子発現のレベルや免疫反応の刺激で立証されるようにたとえ反応エンハンサを用いなくてもＩＭ投与よりも効率が高いということが本発明の利点である。
【０００９】
また、アミノ酸、アミノ酸誘導体、ペプチド及びポリペプチド、特にアレルゲンを本発明の方法に従って局所投与できる。アレルゲンは従来、ツベルクリン尖叉試験と類似した器具を用いる皮内穿刺によって皮膚中に投与される。しかしながら、予想外のこととして、擦過と投与を同時に行うことによりアレルギー反応の向上を得ることができるということが判明した。これにより、一層感度の高い検査が得られ、本発明の方法を用いて従来のアレルギー検査に対する僅かな又は感じ取れないほど小さな反応を容易に検出できるという利点が得られる。
【００１０】
実験例１
ソリッド顕微針アレイを用いるプラスミドＤＮＡの投与
ホタルのルシフェラーゼを暗号化したプラスミドＤＮＡ（３５μｇ）を、麻酔をかけたＢＡＬＢ／ｃマウスに標準の３０ｇ針及び１ｃｃ注射器をもちいてＩＭ注入又はＩＤ注入法により投与し、又は２００μｍシリコン顕微針アレイを用いて局所投薬した。２つのプロトコルを顕微針アレイを用いてＤＮＡ投与のため用いた。
１）擦過と投与の同時実施（ＡＢＲｄｅｌ）：マウスの尾側背を電気式クリッパを用いて剃毛し、次に１０番の小刀を用いて残りの毛を除去した。次に、ＤＮＡ溶液を皮膚表面上の１ｃｍ2 の部位に塗布し、顕微針アレイをこの溶液と接触状態に配置し、そして皮膚表面全体にわたり交互の方向で横方向に６回動かした（各方向において３回づつ）。ＤＮＡ溶液を自然乾燥させ、皮膚部位を皮膚生検材料が回復するまで露出した状態にした。
２） 予備擦過（ｐｒｅＡＢＲ）：上述のように剃毛を行った後、１ｃｍ2 の部位の予備擦過を、マイクロアレイを皮膚表面全体にわたり交互の方向で６回横方向に動かすことによって行った（２つの方向の各々について３回のパス）。次に、ＤＮＡ溶液を擦過した皮膚表面上に広げ、上述したように空気乾燥させた。毛の小胞又は剃毛手技の結果として得られたニックを通る考えられるＤＮＡ投与の対照例として、動物を上述したように剃毛したが、マイクロアレイの擦過を行わなかった（ｎｏＡＢＲ）。ＤＮＡ溶液を１ｃｍ2 の剃毛皮膚部位に局所的に塗布し、自然乾燥させた。
【００１１】
全てのグループにおいて、組織サンプルをＤＮＡ投与後２４時間で集めた。組織ホモジネートをルミネセンスアッセイを用いてルシフェラーゼ活性について分析した。全てのサンプルを標準ＢＣＡタンパク質アッセイによって定められているように全タンパク質含有量について標準化した。データを全タンパク質の１ｍｇ当たりのＲＬＵ（Relative Light Units：相対光単位）として表し、結果を図１に示した。各記号は、１匹のマウスの応答性を表している。２つの別々の実験から得られた累積データが示されている（各グループについてｎ＝６）。ＡＢＲｄｅｌに続いて達成されたルシフェラーゼ遺伝子発現のレベルは、その程度が針を利用したＩＭ及びＩＤ注入と類似しており、擦過した又は擦過しなかった皮膚への局所投与の場合よりも著しく大きかった（ｐ＝０．０２）。
【００１２】
実験例２
投与結果と擦過パスの回数との相関関係
ルシフェラーゼプラスミドＤＮＡ（３５μｇ）を実験例１に記載しているようにＡＢＲｄｅｌによって投与したが、皮膚表面全体にわたる器具の横方向パスの回数を変えた（１２回、１０回、６回、４回及び２回）。加うるに、ＤＮＡ溶液を剃毛したが、擦過しない皮膚の表面上に付着させた後、顕微針アレイを繰り返し皮膚に押し付けて（６回）穿刺の度合いが中程度の投与をシミュレートした。擦過を行わない場合（ｎｏＡＢＲ）のＤＮＡ溶液の局所塗布が、毛の小胞又はニックを通る考えられるＤＮＡ投与の対照例として行った。皮膚生検材料（１ｃｍ2 ）を塗布後２４時間で集め、そして実験例１に記載しているようにルシフェラーゼ活性について分析した。
【００１３】
結果が図２に示されている。各記号は、１匹のマウスの応答性を表しており、ｎ＝５の“ｘ１２”及び“ｘ６”の場合を除き、全てのグループについてｎ＝３であった。皮膚表面全体にわたる顕微針アレイのパスの回数の増大につれて遺伝子発現のレベルの増大が見られた。皮膚発現の平均レベルは、６回以上の擦過によって処理したグループ中のｎｏＡＢＲ対照例の１，０００倍〜２，８００倍であった。皮膚の表面全体にわたる器具の４回、２回又は１回のパスに続く平均応答性は、それぞれバックグラウンドの約３００倍、２００倍及び３０倍であった。「穿刺」グループの遺伝子発現の平均レベルは、バックグラウンドの２倍に過ぎず、ｎｏＡＢＲ対照例と大差なかった。
【００１４】
これら対照例の示すところによれば、擦過プロセスは、皮膚内へのＤＮＡの局所投与の重要な要素である。遺伝子発現のレベルの増大は、擦過器具の擦過パスの回数の増加によって得られた。ただし、遺伝子発現は、１回のパスの後でも観察された。加うるに、皮膚を横方向に擦り又は擦過すると、顕微針アレイを横方向擦過を行わないで繰り返し皮膚に押し付ける方法と比較して、核酸投与結果及び遺伝子発現が著しく向上した。
【００１５】
実験例３
核酸ワクチンの調合
ルシフェラーゼプラスミド（３５μｇ）をＩＤ注入又は同時擦過及び投与により液体調合物（「ＡＢＲｄｅｌ液体」）として実験例１に記載しているように皮膚表面全体にわたり顕微針器具の６回のパスで投与した。加うるに、ＤＮＡを粉末の状態に凍結乾燥させ、顕微針アレイの表面上に塗被し、そして同時擦過及び投与法により粉末として直接投与し（「ＡＢＲｄｅｌ粉末」）、又は塗布時にＰＢＳ緩衝剤の状態で元に戻したの際に投与した（「ＡＢＲｄｅｌ粉末／戻し」）。元への戻しを達成するのに、粉末を塗被したアレイを直接皮膚の表面上のＰＢＳの液滴と直接接触させ、次に擦過と投与を同時に行った。顕微針アレイも又０．５％アガロースゲル中に溶解させたＤＮＡを塗被し、上述したように同時擦過及び投与によって投薬した（「ＡＢＲｄｅｌゲル」）。擦過を行わない液体調合物（ｎｏＡＢＲ）の局所塗布を対照例として行った。皮膚生検材料（１ｃｍ2 ）を塗布後２４時間で集め、実験例１に記載しているように分析した。
【００１６】
結果は図３に示されている。各記号は、１匹のマウスの応答性を表している。２つの別々の実験から得られた累積データが示されており、各グループについてｎ＝６である。皮膚のルシフェラーゼ発現の類似したレベル（ｎｏＡＢＲの約２０倍〜３０倍）が、ＩＤ注入法、ＡＢＲｄｅｌ液体及びＡＢＲｄｅｌ粉末／戻しグループについて観察された。元への戻しを行わないで、ゲル又は粉末を塗被されたＤＮＡの直接的な投与を行った場合、結果的に遺伝子発現が統計的にｎｏＡＢＲ対照例を上回ったものは無かったが、直接的なゲルを利用した投与に続く応答性は、対照例の平均応答性の約２倍〜１０倍高かった。これらの結果の示すところによれば、同時擦過及び投与時にワクチンの乾燥形態の元への戻しは、液体ワクチン調合物の擦過と投与の同時実施と同等な結果をもたらす。これは、本発明の方法の商業的用途にとって利点がある。というのは、液体で充填したリザーバを備える擦過器具をワクチンを擦過によって塗布しているときにワクチンの元への戻しのためにこれにワクチン粉末を予め塗被できるからである。
【００１７】
実験例４
プラスミドＤＮＡの局所投与に対する抗体反応
Ｂ型肝炎の表面抗原（ＨｂｓＡｇ）を暗号化したプラスミドＤＮＡを、実験例１のＡＢＲｄｅｌプロトコルに従って、麻酔をかけたＢＡＬＢ／ｃマウスに標準の３０ｇ針及び１ｃｃ注射器をもちいてＩＭ注入又はＩＤ注入法により投与し、又は２００μｍシリコンソリッド顕微針アレイを用いて局所投薬した。マウスに、１回の投与量当たり１００μｇの全部で３回の免疫処置を行った。漿液サンプルを各免疫処置後ＨｂｓＡｇ（総Ｉｇ）に２〜３週間まで抗体の有無についてＥＬＩＳＡによって分析した。ＤＮＡを、ニック又は毛の小胞を介する考えられる投与のために対照例として剃毛したが、擦過していない（ｎｏＡＢＲ）に局所塗布した。データは、バックグラウンドの少なくとも３倍の吸収値を生じさせる漿液サンプルの最も高い希釈度として定義される抗ＨｂｓＡｇ滴定量を表している（実験を受けたことのない免疫の無いマウスから得られた漿液）。
【００１８】
１グループ当たり全部で１０匹のマウスを分析した。平均滴定量が、図４中にバーとして示されており、個々のマウスの反応性は、白抜きの記号として示されている。結果の示すところによれば、ＡＢＲｄｅｌプロトコルは、生体内で（in vivo ）強い漿液抗体反応を導いている。かかる反応の大きさは、ＩＭ（ＤＮＡを主成分とするワクチン投与について現在の標準）及びＩＤ注入により得られた大きさよりも著しく大きかった（免疫処置２，３の実施後ｐ＜０．０５）。加うるに、ＡＢＲｄｅｌに続く反応性は、標準の針を利用した注入方式の何れかの実施後に観察された反応性よりもばらつきがかなり小さいものであった。３回の免疫処置後における平均滴定量は、ＩＭ注入に続く８２０及びＩＤ注入による４，８００と比較して、ＡＢＲｄｅｌグループについて１２，１６０であった。注目すべきこととして、ＡＢＲｄｅｌ方式は、２回の免疫処置後の最も効率の高い投与方式であり、即ち、ＩＭ方式による４０％（４／１０）及びＩＤ注入法による５０％（５／１０）と比較して、１００％（１０／１０）の動物を２回の免疫処置後にセロコンバージョンを行ったＡＢＲｄｅｌを介して処理した。擦過を行わないでプラスミドＤＮＡを局所的に投与された動物のうち、検出可能な抗体反応を生じたものはゼロであった。さらに抗体アイソタイプの特性決定を行うと、ＡＢＲｄｅｌが標準の針利用ＩＭ及びＩＤ注入と類似した混合反応（ＩｇＧ１とＩｇＧ２ａの両方から成る）を引き起こすことがあることが分かった。これらの結果は、抗体反応がＩｇＧ２ａが無く、もっぱらＩｇＧ１から成る遺伝子ガンを用いる上述の内皮ワクチン摂取とは対照的である（これについては、例えば、McCluskie, MJ et al., Molecular Medicine 5:287, 1999参照）。
【００１９】
実験例５
アレルゲンの局所投与
ヒスタミンジヒドロクロリド（Histamine dihydrochloride ）（２．５ｍｇ）を、実験例１で説明したように、２００μｍシリコンソリッド顕微針アレイを用いて擦過と投与の同時実施方式により、麻酔をかけた豚の皮膚に投薬した（ＡＢＲｄｅｌ；皮膚表面全体にわたり器具の４回のパス）。ヒスタミンを液体又は凍結乾燥粉末として調合し、これをマイクロアレイの表面に塗被し、そして塗布時に皮膚上に直接水で元に戻した。比較のために、ヒスタミン溶液を皮膚の表面上に液滴として置き、その直後に尖叉器具をこの溶液と接触させて皮膚を穿刺するのに用いた。この尖叉器具は、アレルゲン検査で用いられる市販の器具に類似した長さが１ｍｍの７本の金属製３４ｇ針から成っていた。ヒスタミンの作用効果ではなく、器具に起因した皮膚反応をモニタするため、その隣の皮膚の部位をマイクロアレイ又は尖叉状穿刺器具を用いてヒスタミンが無い状態で処理した。追加の対照例としては、擦過又は穿刺を行わないでヒスタミンを局所的に処理した皮膚部位が挙げられる。皮膚部位を、発赤、腫脹及び膨疹潮紅の症状を含む直後の炎症反応の有無についてモニタした。
【００２０】
活発な炎症反応が、ソリッド顕微針アレイを介してヒスタミンで処理された皮膚部位のところで観察された。重度の紅斑及び腫脹（最高２ｍｍの組織の隆起）が、ヒスタミンで処理された皮膚の領域全体にわたって観察され、ヒスタミンが無い状態で器具によって処理された部位は、腫脹が完全に無い状態で擦過の経路に沿って軽度の発赤を示しているに過ぎなかった。同様な強さの反応が、液体と元に戻された粉末ヒスタミン調合物の両方で観察された。尖叉状穿刺器具を用いてヒスタミン溶液で処理された皮膚部位も又、重度の紅斑及び腫脹を示した。ただし、この反応は、尖叉の接触箇所及びそのすぐ周りの領域に局所化されていた。擦過又は穿刺を行わないでヒスタミン溶液で局所的に処理された皮膚部位は、炎症が無く、通常の処理されていない皮膚とは区別できないように見えた。
【００２１】
ヒスタミンジヒドロクロリドは、当該技術分野においてペプチド及びポリペプチドアレルゲンの評価のためのモデルシステムとして用いられている。これらの結果の示すところによれば、擦過と投与の同時実施の規定のプロトコルを、アミノ酸又はアミノ酸誘導体であるアレルゲンの局所投与のために効果的に用いることができ、又これらの結果により、ペプチド又はポリペプチドアレルゲンの投与について類似した結果が得られることが予想される。皮膚穿刺と比較した微小擦過によるアレルゲン投与の利点としては、物質が皮膚の広い表面領域に分布されることが挙げられ、かくして、尖叉状器具による穿刺を用いて達成される局所分布と比較して、反応遺伝子部位が増加する。分布領域の増大と免疫−刺激性の高い表皮組織の良好な標的化との組合せにより現行の穿刺を利用した皮膚穿刺検査方法と比較してアレルゲン検査の感度を増大させることができる。加うるに、毛細血管床及び末梢神経網の上の浅い表皮組織を標的化することにより、本発明の投与は、現行の検査方法よりも侵襲性が低く且つ安全であることが見込まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 実験例１で試験された種々の核酸投与プロトコルで得られた遺伝子発現のレベルを示す図である。
【図２】 実験例２に記載されているように、擦過の回数を変化させることにより得られた遺伝子発現のレベルを示す図である。
【図３】 実験例３に記載されているように核酸の調合物及び投与プロトコルを変えることにより得られた遺伝子発現のレベルを示す図である。
【図４】 実験例４に記載されているようにプラスミドＤＮＡの局所投与を行った後の抗体反応を示す図である。
〔発明の分野〕
本発明は、特に角質層を崩壊させ、その下の表皮層に物質を投与することによる皮膚内への物質の局所投与に関する。
【０００２】
〔発明の背景〕
皮膚を通して身体に物質を投与することは、一般的には侵襲性であり、皮内（ＩＤ）、筋内（ＩＭ）又は皮下（ＳＣ）注入又は注射を容易にするために針や注射器が必要である。これらの方法は、被検者にとって痛みを伴うものであり、熟練者の技能を必要とし、出血を生じる場合が多い。最近、皮膚の外側バリヤとして働く角質層、即ち、厚さ約１０〜２０μｍの角質化された細胞でできた薄い外側層を崩壊させ又は擦過し、露出した表皮に所望の物質を投与する器具を用いることによりこれらの欠点を解決する試みが行われている。この場合、物質は、表皮を通って血管及びリンパ管のある真皮に拡散することができ、それにより体全体にわたって吸収されて投与されるようになる。ワクチンの局所投与の場合、表皮それ自体は、抗原を提供する細胞が多いので薬剤投与に特に望ましいターゲットである。比較すると、真皮に含まれる抗原提供細胞の数はこれよりも少ない。角質層及び表皮中には神経又は血管が無く、したがってこの方法は、抗原に反応できる皮膚層への接近を与えながら本質的に痛みが無く且つ出血を生じないという利点を有している。
【０００３】
従来技術の報告によれば、物質を身体に投与する目的で角質層を崩壊させる種々の器具及び方法が存在する。例えば、角質層の切断は、カーソン（Carson）氏等に付与された米国特許第５，６７９，６４７号明細書に教示されているような穿刺によって達成できる。この米国特許は、例えばツベルクリン皮膚試験やアレルギー検査に用いられる器具に見受けられる小径の尖叉にポリヌクレオチドを塗被し、かかる尖叉を用いて物質を皮膚内へ投与できることを教示している。かかる方法では、皮膚を尖叉で穿刺する必要があり、その結果、塗被状態の物質の皮内注入が行われることになる。これは、小径の極小突起の表面に塗被された物質が穿刺ではなく皮膚表面全体にわたる横方向の擦過により一層効果的に投与されることが思いがけず発見された本発明とは対照的である。米国特許第５，００３，９８７号明細書、米国特許第５，８７９，３２６号明細書及び米国特許第３，９６４，４８２号明細書は、擦過により角質層を切断することを教示しているが、この手法によって有効且つ効果的な投与を達成するための局所塗布法の最適化の仕方については殆ど知られていない。かかる最適化は、局所核酸投与、特に核酸を主成分とするワクチンの局所投与や遺伝子治療にとって特に関心の高いものである。この点に関し、局所投薬のための最も一般的に提案されている方法は、ワクチンの塗布前に皮膚を擦過することである。しかしながら、予想外のこととして、核酸やペプチド、又はポリペプチド例えばアレルゲンの投与が、物質を擦過すると同時に投与した場合に一層効率的であって効果があるということが判明した。
【０００４】
〔発明の概要〕
本発明は、物質、特に核酸、アミノ酸、アミノ酸誘導体、ペプチド又はポリペプチドを局所投与する最適化された方法を提供する。核酸は、遺伝子発現を促進させ、これらが角質層の擦過と同時に投与されると、発現されたタンパク質に対する免疫反応を促進させるということが発見された。同様に、擦過と同時に投与されたアレルゲンは、従来のアレルゲン検査方法よりも活発な免疫反応を生じさせる。
【０００５】
〔好ましい実施形態の詳細な説明〕
本明細書で用いる「擦過」という用語は、例えば引っ掻くこと又は擦ることによる皮膚の外側層の崩壊を意味し、その結果、崩壊した角質層の領域が生じる。これは、角質層を貫通して別個独立の穴を生じさせ、穴相互間に崩壊しなかった角質層の領域が生じる「穿刺」とは対照的である。本発明の方法によれば、物質、例えば核酸を主成分とするワクチンやペプチド、例えばポリペプチドを予め擦過した皮膚に塗布するのではなく擦過と同時に皮膚に塗布する。すなわち、物質を、予め擦過した皮膚に受動的に塗布するのではなく、皮膚に擦り込む。この方法の結果として、擦過後塗布法と比較して投与結果及び応答性が向上する。物質を任意の薬学的に許容できる形態で皮膚中へ投与するのがよいが、液体又はゲル調合物が好ましい。一実施形態では、物質を皮膚に塗布し、次に、擦過器具を物質の付着した皮膚上で往復して動かし又は擦る。所望の結果を得るための最小限度の擦過を利用することが好ましい。選択された物質にとって擦過の適当な度合いの判定は、当業者により適宜実施される。別の実施形態では、物質を塗布に先立って投与器具の擦過表面に乾燥した形態で塗布してもよい。この実施形態では、元に戻す液体（以下、「戻し液」ともいう）を、投与部位のところで皮膚に塗布し、物質を塗被した擦過器具を戻し液の部位のところで皮膚に適用する。次にこれを皮膚上で往復して動かし、又は擦って物質が皮膚の表面上で戻し液中に溶解するようになり、そして擦過と同時に投与されるようになる。変形例として、戻し液を擦過器具内に収容し、器具を擦過のために皮膚に適用したときに放出されて物質を溶解するようにしてもよい。また、核酸製剤をゲルの形態で擦過器具上に塗被してもよいことが判明している。ただし、遺伝子発現の向上が、本発明の他の幾つかの実施形態の場合と同じほど顕著ではない。
【０００６】
擦過による角質層の崩壊のための当該技術分野で知られている任意の器具を本発明の方法に用いることができる。かかる器具としては、例えば、短い顕微針又は極小突起のアレイを備えた超小型電子機械（ＭＥＭＳ）装置、サンドペーパー状の器具、スクレーパ等が挙げられる。擦過器具が器具からの流体を収容したり放出するリザーバを備えていない場合、物質を含有した液体又は戻し液を擦過に先立って、例えば別個のディスペンサ又はポンプから別々に皮膚に塗布する必要がある。しかしながら、リザーバは、擦過器具の一体部分であるのがよい。代表的には、リザーバは、顕微針又は極小突起を通るチャネルを介して、又はかかる顕微針又は極小突起相互間でリザーバから出るチャネル、或いは多孔質材料を通して器具の擦過表面と流体連通状態にある。この実施形態では、物質又は戻し液は、擦過器具のリザーバ内に収容され、擦過に先だって、又は擦過と同時に皮膚表面に小出しされる。擦過器具は、物質又は戻し液の投与速度を制御し、又は物質又は戻し液の投与量を制御する手段を更に有するのがよい。
【０００７】
本発明の方法に用いられる核酸は、ＲＮＡ又はＤＮＡであるのがよい。これら核酸は、局所投薬及び細胞による摂取及び圧出に適した任意の物理的形態であってよい。これは、ウイルス性ベクター又はリポソーム内に含まれ、又は当該技術分野で知られているように自由ポリヌクレオチド、例えばプラスミドとして投与することができる。核酸は代表的には、核酸と適合性のある薬学的に許容できる調合物、例えば流体又はゲルの状態に調合されることになる。アレルゲン組成の調合を含む本発明で用いられる薬学的に許容できるペプチド及びポリペプチドの調合も又、当該技術分野において周知である。
【０００８】
最小限度の擦過（皮膚上で１回という少ないパス）という皮膚細胞への核酸の投与結果の向上をもたらすのに十分であることが判明している。核酸の投与及び圧出量は、皮膚上の擦過のパスの回数の増大につれて増加し続ける。６回以上の擦過パスにより、本発明者の実験装置では、核酸投与結果において最高の改善が見られた。皮膚上の全ての擦過パスは同一方向であってもよいが、方向を擦過中変えることが好ましい。核酸ワクチンの投与に今日最も普通に用いられているプロトコルは、投与量が少ない場合、通常追加の反応エンハンサを伴うＩＭ注入方式である。本発明の方法を用いて投与されるべき核酸ワクチンの適当な投与量の判定は、当業者が適宜行う選択事項である。しかしながら、核酸ワクチンの投与が遺伝子発現のレベルや免疫反応の刺激で立証されるようにたとえ反応エンハンサを用いなくてもＩＭ投与よりも効率が高いということが本発明の利点である。
【０００９】
また、アミノ酸、アミノ酸誘導体、ペプチド及びポリペプチド、特にアレルゲンを本発明の方法に従って局所投与できる。アレルゲンは従来、ツベルクリン尖叉試験と類似した器具を用いる皮内穿刺によって皮膚中に投与される。しかしながら、予想外のこととして、擦過と投与を同時に行うことによりアレルギー反応の向上を得ることができるということが判明した。これにより、一層感度の高い検査が得られ、本発明の方法を用いて従来のアレルギー検査に対する僅かな又は感じ取れないほど小さな反応を容易に検出できるという利点が得られる。
【００１０】
実験例１
ソリッド顕微針アレイを用いるプラスミドＤＮＡの投与
ホタルのルシフェラーゼを暗号化したプラスミドＤＮＡ（３５μｇ）を、麻酔をかけたＢＡＬＢ／ｃマウスに標準の３０ｇ針及び１ｃｃ注射器をもちいてＩＭ注入又はＩＤ注入法により投与し、又は２００μｍシリコン顕微針アレイを用いて局所投薬した。２つのプロトコルを顕微針アレイを用いてＤＮＡ投与のため用いた。
１）擦過と投与の同時実施（ＡＢＲｄｅｌ）：マウスの尾側背を電気式クリッパを用いて剃毛し、次に１０番の小刀を用いて残りの毛を除去した。次に、ＤＮＡ溶液を皮膚表面上の１ｃｍ2 の部位に塗布し、顕微針アレイをこの溶液と接触状態に配置し、そして皮膚表面全体にわたり交互の方向で横方向に６回動かした（各方向において３回づつ）。ＤＮＡ溶液を自然乾燥させ、皮膚部位を皮膚生検材料が回復するまで露出した状態にした。
２） 予備擦過（ｐｒｅＡＢＲ）：上述のように剃毛を行った後、１ｃｍ2 の部位の予備擦過を、マイクロアレイを皮膚表面全体にわたり交互の方向で６回横方向に動かすことによって行った（２つの方向の各々について３回のパス）。次に、ＤＮＡ溶液を擦過した皮膚表面上に広げ、上述したように空気乾燥させた。毛の小胞又は剃毛手技の結果として得られたニックを通る考えられるＤＮＡ投与の対照例として、動物を上述したように剃毛したが、マイクロアレイの擦過を行わなかった（ｎｏＡＢＲ）。ＤＮＡ溶液を１ｃｍ2 の剃毛皮膚部位に局所的に塗布し、自然乾燥させた。
【００１１】
全てのグループにおいて、組織サンプルをＤＮＡ投与後２４時間で集めた。組織ホモジネートをルミネセンスアッセイを用いてルシフェラーゼ活性について分析した。全てのサンプルを標準ＢＣＡタンパク質アッセイによって定められているように全タンパク質含有量について標準化した。データを全タンパク質の１ｍｇ当たりのＲＬＵ（Relative Light Units：相対光単位）として表し、結果を図１に示した。各記号は、１匹のマウスの応答性を表している。２つの別々の実験から得られた累積データが示されている（各グループについてｎ＝６）。ＡＢＲｄｅｌに続いて達成されたルシフェラーゼ遺伝子発現のレベルは、その程度が針を利用したＩＭ及びＩＤ注入と類似しており、擦過した又は擦過しなかった皮膚への局所投与の場合よりも著しく大きかった（ｐ＝０．０２）。
【００１２】
実験例２
投与結果と擦過パスの回数との相関関係
ルシフェラーゼプラスミドＤＮＡ（３５μｇ）を実験例１に記載しているようにＡＢＲｄｅｌによって投与したが、皮膚表面全体にわたる器具の横方向パスの回数を変えた（１２回、１０回、６回、４回及び２回）。加うるに、ＤＮＡ溶液を剃毛したが、擦過しない皮膚の表面上に付着させた後、顕微針アレイを繰り返し皮膚に押し付けて（６回）穿刺の度合いが中程度の投与をシミュレートした。擦過を行わない場合（ｎｏＡＢＲ）のＤＮＡ溶液の局所塗布が、毛の小胞又はニックを通る考えられるＤＮＡ投与の対照例として行った。皮膚生検材料（１ｃｍ2 ）を塗布後２４時間で集め、そして実験例１に記載しているようにルシフェラーゼ活性について分析した。
【００１３】
結果が図２に示されている。各記号は、１匹のマウスの応答性を表しており、ｎ＝５の“ｘ１２”及び“ｘ６”の場合を除き、全てのグループについてｎ＝３であった。皮膚表面全体にわたる顕微針アレイのパスの回数の増大につれて遺伝子発現のレベルの増大が見られた。皮膚発現の平均レベルは、６回以上の擦過によって処理したグループ中のｎｏＡＢＲ対照例の１，０００倍〜２，８００倍であった。皮膚の表面全体にわたる器具の４回、２回又は１回のパスに続く平均応答性は、それぞれバックグラウンドの約３００倍、２００倍及び３０倍であった。「穿刺」グループの遺伝子発現の平均レベルは、バックグラウンドの２倍に過ぎず、ｎｏＡＢＲ対照例と大差なかった。
【００１４】
これら対照例の示すところによれば、擦過プロセスは、皮膚内へのＤＮＡの局所投与の重要な要素である。遺伝子発現のレベルの増大は、擦過器具の擦過パスの回数の増加によって得られた。ただし、遺伝子発現は、１回のパスの後でも観察された。加うるに、皮膚を横方向に擦り又は擦過すると、顕微針アレイを横方向擦過を行わないで繰り返し皮膚に押し付ける方法と比較して、核酸投与結果及び遺伝子発現が著しく向上した。
【００１５】
実験例３
核酸ワクチンの調合
ルシフェラーゼプラスミド（３５μｇ）をＩＤ注入又は同時擦過及び投与により液体調合物（「ＡＢＲｄｅｌ液体」）として実験例１に記載しているように皮膚表面全体にわたり顕微針器具の６回のパスで投与した。加うるに、ＤＮＡを粉末の状態に凍結乾燥させ、顕微針アレイの表面上に塗被し、そして同時擦過及び投与法により粉末として直接投与し（「ＡＢＲｄｅｌ粉末」）、又は塗布時にＰＢＳ緩衝剤の状態で元に戻したの際に投与した（「ＡＢＲｄｅｌ粉末／戻し」）。元への戻しを達成するのに、粉末を塗被したアレイを直接皮膚の表面上のＰＢＳの液滴と直接接触させ、次に擦過と投与を同時に行った。顕微針アレイも又０．５％アガロースゲル中に溶解させたＤＮＡを塗被し、上述したように同時擦過及び投与によって投薬した（「ＡＢＲｄｅｌゲル」）。擦過を行わない液体調合物（ｎｏＡＢＲ）の局所塗布を対照例として行った。皮膚生検材料（１ｃｍ2 ）を塗布後２４時間で集め、実験例１に記載しているように分析した。
【００１６】
結果は図３に示されている。各記号は、１匹のマウスの応答性を表している。２つの別々の実験から得られた累積データが示されており、各グループについてｎ＝６である。皮膚のルシフェラーゼ発現の類似したレベル（ｎｏＡＢＲの約２０倍〜３０倍）が、ＩＤ注入法、ＡＢＲｄｅｌ液体及びＡＢＲｄｅｌ粉末／戻しグループについて観察された。元への戻しを行わないで、ゲル又は粉末を塗被されたＤＮＡの直接的な投与を行った場合、結果的に遺伝子発現が統計的にｎｏＡＢＲ対照例を上回ったものは無かったが、直接的なゲルを利用した投与に続く応答性は、対照例の平均応答性の約２倍〜１０倍高かった。これらの結果の示すところによれば、同時擦過及び投与時にワクチンの乾燥形態の元への戻しは、液体ワクチン調合物の擦過と投与の同時実施と同等な結果をもたらす。これは、本発明の方法の商業的用途にとって利点がある。というのは、液体で充填したリザーバを備える擦過器具をワクチンを擦過によって塗布しているときにワクチンの元への戻しのためにこれにワクチン粉末を予め塗被できるからである。
【００１７】
実験例４
プラスミドＤＮＡの局所投与に対する抗体反応
Ｂ型肝炎の表面抗原（ＨｂｓＡｇ）を暗号化したプラスミドＤＮＡを、実験例１のＡＢＲｄｅｌプロトコルに従って、麻酔をかけたＢＡＬＢ／ｃマウスに標準の３０ｇ針及び１ｃｃ注射器をもちいてＩＭ注入又はＩＤ注入法により投与し、又は２００μｍシリコンソリッド顕微針アレイを用いて局所投薬した。マウスに、１回の投与量当たり１００μｇの全部で３回の免疫処置を行った。漿液サンプルを各免疫処置後ＨｂｓＡｇ（総Ｉｇ）に２〜３週間まで抗体の有無についてＥＬＩＳＡによって分析した。ＤＮＡを、ニック又は毛の小胞を介する考えられる投与のために対照例として剃毛したが、擦過していない（ｎｏＡＢＲ）に局所塗布した。データは、バックグラウンドの少なくとも３倍の吸収値を生じさせる漿液サンプルの最も高い希釈度として定義される抗ＨｂｓＡｇ滴定量を表している（実験を受けたことのない免疫の無いマウスから得られた漿液）。
【００１８】
１グループ当たり全部で１０匹のマウスを分析した。平均滴定量が、図４中にバーとして示されており、個々のマウスの反応性は、白抜きの記号として示されている。結果の示すところによれば、ＡＢＲｄｅｌプロトコルは、生体内で（in vivo ）強い漿液抗体反応を導いている。かかる反応の大きさは、ＩＭ（ＤＮＡを主成分とするワクチン投与について現在の標準）及びＩＤ注入により得られた大きさよりも著しく大きかった（免疫処置２，３の実施後ｐ＜０．０５）。加うるに、ＡＢＲｄｅｌに続く反応性は、標準の針を利用した注入方式の何れかの実施後に観察された反応性よりもばらつきがかなり小さいものであった。３回の免疫処置後における平均滴定量は、ＩＭ注入に続く８２０及びＩＤ注入による４，８００と比較して、ＡＢＲｄｅｌグループについて１２，１６０であった。注目すべきこととして、ＡＢＲｄｅｌ方式は、２回の免疫処置後の最も効率の高い投与方式であり、即ち、ＩＭ方式による４０％（４／１０）及びＩＤ注入法による５０％（５／１０）と比較して、１００％（１０／１０）の動物を２回の免疫処置後にセロコンバージョンを行ったＡＢＲｄｅｌを介して処理した。擦過を行わないでプラスミドＤＮＡを局所的に投与された動物のうち、検出可能な抗体反応を生じたものはゼロであった。さらに抗体アイソタイプの特性決定を行うと、ＡＢＲｄｅｌが標準の針利用ＩＭ及びＩＤ注入と類似した混合反応（ＩｇＧ１とＩｇＧ２ａの両方から成る）を引き起こすことがあることが分かった。これらの結果は、抗体反応がＩｇＧ２ａが無く、もっぱらＩｇＧ１から成る遺伝子ガンを用いる上述の内皮ワクチン摂取とは対照的である（これについては、例えば、McCluskie, MJ et al., Molecular Medicine 5:287, 1999参照）。
【００１９】
実験例５
アレルゲンの局所投与
ヒスタミンジヒドロクロリド（Histamine dihydrochloride ）（２．５ｍｇ）を、実験例１で説明したように、２００μｍシリコンソリッド顕微針アレイを用いて擦過と投与の同時実施方式により、麻酔をかけた豚の皮膚に投薬した（ＡＢＲｄｅｌ；皮膚表面全体にわたり器具の４回のパス）。ヒスタミンを液体又は凍結乾燥粉末として調合し、これをマイクロアレイの表面に塗被し、そして塗布時に皮膚上に直接水で元に戻した。比較のために、ヒスタミン溶液を皮膚の表面上に液滴として置き、その直後に尖叉器具をこの溶液と接触させて皮膚を穿刺するのに用いた。この尖叉器具は、アレルゲン検査で用いられる市販の器具に類似した長さが１ｍｍの７本の金属製３４ｇ針から成っていた。ヒスタミンの作用効果ではなく、器具に起因した皮膚反応をモニタするため、その隣の皮膚の部位をマイクロアレイ又は尖叉状穿刺器具を用いてヒスタミンが無い状態で処理した。追加の対照例としては、擦過又は穿刺を行わないでヒスタミンを局所的に処理した皮膚部位が挙げられる。皮膚部位を、発赤、腫脹及び膨疹潮紅の症状を含む直後の炎症反応の有無についてモニタした。
【００２０】
活発な炎症反応が、ソリッド顕微針アレイを介してヒスタミンで処理された皮膚部位のところで観察された。重度の紅斑及び腫脹（最高２ｍｍの組織の隆起）が、ヒスタミンで処理された皮膚の領域全体にわたって観察され、ヒスタミンが無い状態で器具によって処理された部位は、腫脹が完全に無い状態で擦過の経路に沿って軽度の発赤を示しているに過ぎなかった。同様な強さの反応が、液体と元に戻された粉末ヒスタミン調合物の両方で観察された。尖叉状穿刺器具を用いてヒスタミン溶液で処理された皮膚部位も又、重度の紅斑及び腫脹を示した。ただし、この反応は、尖叉の接触箇所及びそのすぐ周りの領域に局所化されていた。擦過又は穿刺を行わないでヒスタミン溶液で局所的に処理された皮膚部位は、炎症が無く、通常の処理されていない皮膚とは区別できないように見えた。
【００２１】
ヒスタミンジヒドロクロリドは、当該技術分野においてペプチド及びポリペプチドアレルゲンの評価のためのモデルシステムとして用いられている。これらの結果の示すところによれば、擦過と投与の同時実施の規定のプロトコルを、アミノ酸又はアミノ酸誘導体であるアレルゲンの局所投与のために効果的に用いることができ、又これらの結果により、ペプチド又はポリペプチドアレルゲンの投与について類似した結果が得られることが予想される。皮膚穿刺と比較した微小擦過によるアレルゲン投与の利点としては、物質が皮膚の広い表面領域に分布されることが挙げられ、かくして、尖叉状器具による穿刺を用いて達成される局所分布と比較して、反応遺伝子部位が増加する。分布領域の増大と免疫−刺激性の高い表皮組織の良好な標的化との組合せにより現行の穿刺を利用した皮膚穿刺検査方法と比較してアレルゲン検査の感度を増大させることができる。加うるに、毛細血管床及び末梢神経網の上の浅い表皮組織を標的化することにより、本発明の投与は、現行の検査方法よりも侵襲性が低く且つ安全であることが見込まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 実験例１で試験された種々の核酸投与プロトコルで得られた遺伝子発現のレベルを示す図である。
【図２】 実験例２に記載されているように、擦過の回数を変化させることにより得られた遺伝子発現のレベルを示す図である。
【図３】 実験例３に記載されているように核酸の調合物及び投与プロトコルを変えることにより得られた遺伝子発現のレベルを示す図である。
【図４】 実験例４に記載されているようにプラスミドＤＮＡの局所投与を行った後の抗体反応を示す図である。
Claims (7)
- 乾燥した形態の物質を塗被した擦過面と、擦過面と流体連通状態にある前記乾燥した形態の物質を溶解させる液体を収容したリザーバとを有することを特徴とする皮膚への物質の投与器具。
- 擦過面は、顕微針アレイであることを特徴とする請求項１記載の器具。
- 物質は、顕微針に塗被されていることを特徴とする請求項２記載の器具。
- リザーバは、擦過面に設けられた突起を貫通したチャネルを介して擦過面と連通していることを特徴とする請求項１記載の器具。
- リザーバは、擦過面に設けられた突起相互間のチャネルを介して擦過面と連通していることを特徴とする請求項１記載の器具。
- リザーバは、リザーバと擦過面との間に設けられた多孔質材料により擦過面と連通していることを特徴とする請求項１記載の器具。
- 物質は、アミノ酸、アミノ酸誘導体、ペプチド又はポリペプチドであることを特徴とする請求項１記載の器具。
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