JP4793947B2 - ハロアルカンデハロゲナーゼを使用するイペリットの解毒方法 - Google Patents

Description

（発明の分野）
本発明は、除染組成物の主たる化学的活性成分としてハロアルカンデハロゲナーゼ（酵素番号 ＥＣ３．８．１．５）を使用するイペリット（２，２’−ジクロロジエチルスルフィド）の解毒のための方法に関する。除染組成物は、この高い毒性の水疱形成物質により汚染される軍用武器、輸送機関、工業用および農業用機器、技術装置および建設物（以後、器具）の表面、ヒトまたは動物の皮膚ならびに自然環境要素（水、土壌、堆積物および空気）におけるイペリット（２，２’−ジクロロジエチルスルフィド）の解毒を示す。

（本技術の状況）
現時点で、除染組成物は、軍隊、民間防衛団、消防隊およびレスキュー隊で使用され、高単位の消費および材料に対する所望されない攻撃性を示す。なぜなら、これら化学的活性成分は、イぺリットとの反応の間に徐々に消費される化学量論的な（ｓｔｅｃｈｉｏｍｅｔｒｉｃ）因子であるからである。器具への適用は、除染された材料または表面の腐食による価値の低下を導き、これら組成物が土壌中または水中に入った場合、環境を危険にさらすことになる。

高い毒性の有機リン酸系（神経系）物質に対して活性を示す有機リン酸エステル加水分解酵素、ＯＰＡ脱水酵素、またはＤＦＰａｓｅと呼ばれる酵素が文献中に記載されている。水疱形成イぺリット（２，２’−ジクロロジエチルスルフィド）の生物学的解毒の唯一の例として、バクテリア種Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ ＩＧＴＳ８ （ＡＴＣＣ ５３９６８）の使用がこれまでに当該分野において挙げられ、これはその成長のための唯一の炭素源としてイぺリット２−クロロエチル−エチルスルフィドの化学的アナログを利用する能力を有する（非特許文献１）。バクテリア種Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ ＩＧＴＳ８ （ＡＴＣＣ ５３９６８）の解毒活性は、分子中のＳ−Ｃ結合を切断することに基づいている。加水分解の非毒性生成物チオジグリコールにおいてＣ−Ｓ結合を切断する酵素の適用が、公開されている（非特許文献２、非特許文献３）。

ハロアルカンデハロゲナーゼは、対応するアルコールを形成する加水分解性の置換によりハロゲン化脂肪族化合物からハロゲンを除去することができる酵素である（非特許文献４）。ヒドロキシルイオンによるハロゲン原子の形式的な求核置換により、加水分解性の脱ハロゲン化が進行する。構造上、ハロアルカンデハロゲナーゼは、α／β−ヒドロラーゼフォールドスーパーファミリーに属する（非特許文献５）。ハロアルカンデハロゲナーゼは、α／β−ヒドロラーゼフォールドの最も保存された構造的特性に属する求核エルボ（ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｅ ｅｌｂｏｗ）を含む（非特許文献６）。ハロアルカンデハロゲナーゼの別の高く保存された領域は、中心のβシートであり、この両側に主要ドメインの疎水性コアを形成するα−ヘリックスが、隣接する。主要ドメインは、触媒性の三つ組み：アスパラギン酸−ヒスチジン−アスパラギン酸／グルタミン酸（Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ／Ｇｌｕ）を保持する。第２のドメインは、α−ヘリックスのみからなり、主要ドメインの頂部にキャップのように配置される。この主要ドメインとキャップドメインとの間の界面は、酵素の活性部位を形成する。主要ドメイン間に有意な類似性がある一方で、キャップドメインの配列および構造は、種々のハロアルカンデハロゲナーゼにおいて有意に変化する。キャップドメインの特徴および構造は、本質的に基質特異性を決定することが示唆される（非特許文献７、非特許文献８）。
Ｋｉｌｂａｎｅ，Ｊ．Ｊ．，ａｎｄ Ｊａｃｋｏｗｓｋｉ，Ｋ．Ｊ． Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９６年、第６５巻、３７０〜３７４頁 Ｈａｒｖｅｙ，Ｓ．，ＤｅＦｒａｎｋ，Ｊ．Ｊ．，Ｖａｌｄｅｓ，Ｊ．Ｊ．，Ｋａｍｅｌｙ，Ｄ，ａｎｄ Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｙ，Ａ．Ｍ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｂｙ ＵＳ Ａｒｍｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｆｆｉｃｅ １９９０年、４７〜５８頁 Ｋｉｌｂａｎｅ，Ｊ．Ｊ．， Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｏｎｓｅｒｖ．ａｎｄ Ｒｅｃｙｃｌ．１９９０年、第３巻、６９〜７９頁 Ｊａｎｓｓｅｎ，Ｄ．Ｂ．Ｐｒｉｅｓ，Ｆ．，ａｎｄ Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｌｏｅｇ，Ｊ．Ｒ． Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １９９４年、第４８巻、１６３〜１９１頁 Ｏｌｌｉｓ，Ｄ．Ｌ．，Ｃｈｅａｈ，Ｅ．，Ｃｙｇｌｅｒ，Ｍ．，Ｄｉｊｋｓｔｒａ，Ｂ．，Ｆｒｏｌｏｗ，Ｆ．，Ｆｒａｎｋｅｎ，Ｓ．Ｍ．，Ｈａｒｅｌ，Ｍ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｓ．Ｊ．，Ｓｉｌｍａｎ，Ｉ．，Ｓｃｈｒａｇ，Ｊ．，Ｓｕｓｓｍａｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｖｅｒｓｃｈｕｅｒｅｎ，Ｋ．Ｈ．Ｇ．，ａｎｄ Ｇｏｌｄｍａｎ，Ａ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １９９２年、第５巻、１９７〜２１１頁 Ｄａｍｂｏｒｓｋｙ，Ｊ． Ｐｕｒｅ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９８年、第７０巻、１３７５〜１３８３頁 Ｐｒｉｅｓ，Ｆ．，Ｖａｎ ｄｅｎ Ｗｉｊｎｇａａｒｄ，Ａ．Ｊ．，Ｂｏｓ，Ｒ．，Ｐｅｎｔｅｎｇａ，Ｍ．，ａｎｄ Ｊａｎｓｓｅｎ，Ｄ．Ｂ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９４年、第２６９巻、１７４９０〜１７４９４頁 Ｋｍｕｎｉｃｅｋ，Ｊ．，Ｌｕｅｎｇｏ，Ｓ．，Ｇａｇｏ，Ｆ．，Ｏｒｔｉｚ，Ａ．Ｒ．，Ｗａｄｅ，Ｒ．Ｃ．，ａｎｄ Ｄａｍｂｏｒｓｋｙ，Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００１年、第４０巻、８９０５〜８９１７頁

（発明の詳細）
化学量論的な因子を含有する、上記の既存の除染組成物の不利益は、イペリット２，２’−ジクロロジエチルスルフィドの加水分解性解毒の触媒（酵素または酵素ハロアルカンデハロゲナーゼの混合物）を含む、本発明に従う調製物により、広い範囲で克服される。本組成物の基本成分および活性成分は、少なくとも１つのハロアルカンデハロゲナーゼファミリー（ＥＣ３．８．１．５）の野生型酵素または改変された酵素である。本発明は、イペリットの加水分解性の脱ハロゲン化を含むハロアルカンデハロゲナーゼの使用によるイペリットの解毒方法を提供し、ここでイペリットは、１つ以上の野生型または改変されたハロアルカンデハロゲナーゼを含む解毒組成物で処理され、それにより非毒性産物のチオジグリコールに変換される。

ハロアルカンデハロゲナーゼは、天然の生産者または異種の宿主生物（例えば、バクテリアのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉまたは酵母のＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）において発現される。使用されるこの酵素は、粗製抽出物または精製タンパク質の形態で、非生存細胞または生存細胞に含まれ得る。デハロゲナーゼ組成物の酵素として、酵素ＥＣ３．８．１．５のファミリーから選択される少なくとも１つのハロアルカンデハロゲナーゼが使用される（例えば、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ ＮＣＩＭＢ １３０６４由来のハロアルカンデハロゲナーゼＤｈａＡ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ ５０３３／６６由来のハロアルカンデハロゲナーゼＤｍｂＡまたはＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ ＵＴ２６由来のハロアルカンデハロゲナーゼＬｉｎＢ）。

ハロアルカンデハロゲナーゼは、ハロゲン化脂肪族化合物におけるハロゲン−炭素結合を切断することができる重要な酵素群を構成する。これらは、ハロアルカン、ハロシクロアルカン、ハロアルケン、ハロエーテルおよびハロアルコールを含む広い基質特異性を示す。脱ハロゲン化の機構は、ハロゲンが結合する炭素原子への求核攻撃に基づいており、ハロゲンイオンの切断およびアルキル−酵素中間体の形成を進行する。この中間体は、続いて加水分解され、対応するアルコール、ハロゲンイオンおよびプロトンを与える。この酵素ハロアルカンデハロゲナーゼは、加水分解性の脱ハロゲン化によりイペリットを非毒性ビス（２−ヒドロキシエチル）スルフィドに変換する。

除染組成物において、ハロアルカンデハロゲナーゼは、粗製抽出物中にあっても精製されても、キャリア物質に固定化されても、水溶液、単相性の有機溶液または水溶液、あるいは有機／水性の２相系中に遊離していてもよい。酵素は、無機または有機のキャリア物質（例えば：Ｃｅｌｉｔｅ、活性炭、酸化アルミニウム、セルロース、合成樹脂または合成的に誘導されるポリサッカリド（デキストラン）をベースにしたＳｅｐｈａｄｅｘ）への吸着、あるいは有機物質（例えば：セルロース、デキストラン、デンプン、キチン、アガロース）または無機物質（例えば：多孔性ガラス）、または合成ポリマー性キャリア物質（例えば：ＶＡ−Ｅｐｏｘｙ Ｂｉｏｓｙｎｔ，Ｅｕｐｅｒｇｉｔ）の表面への共有結合により固定化され得る。この酵素はまた、架橋（相互の結合）あるいは酵素を固体マトリックスまたは膜により制限されたコンパートメントに捕捉することにより固定化され得る。

酵素ハロアルカンデハロゲナーゼは、溶解、結晶化、凍結乾燥または沈殿され得る。液体媒体は、有機溶媒、有機溶媒の単相性水溶液または有機溶媒および水からなる二相系である。この酵素は、限定された領域に制限され得、ここで触媒性の活性を残したまま、固体マトリックス中または膜で限定されたコンパートメント中に捕捉される。酵素は、生物学的マトリックス（例えば、寒天ゲル、アルギン酸ゲル、κ−カラゲナン）に捕捉され得る。この酵素はまた、安定な無機マトリックス（例えば、シリカゲル）に捕捉され得る。隔離された酵素を保持することのできる密なネットワークは、酵素存在下において合成モノマー（例えば、ポリアクリルアミド）の重合により得られ得る。固定化技術に依存して、触媒速度、安定性および結合親和性のような酵素の特性は、有意に変えられ得る。酵素により触媒されるイペリットの加水分解性の解毒は、１０〜７０℃の温度範囲（反応至適温度は約４０℃である）で実施され得る。

追加の成分は、水性緩衝液系（例えば、リン酸緩衝液、トリス−硫酸塩緩衝液、グリシン緩衝液、酢酸塩緩衝液またはクエン酸塩緩衝液）であり、これは７．０〜８．５の至適区間付近の中性ｐＨを安定させる。このｐＨ活性プロフィールは、広範であり、妥当な活性を維持している間の４〜１２のｐＨ区間を与える。他の追加の成分は、イペリットの水性溶媒への溶解を促進する界面活性剤または有機溶媒である。水に混和できる有機溶媒（例えば、メタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、アセトン、ジオキサン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、３−メチル−３−ペンタノールおよびピリジン）の添加は、酵素安定性に依存して総容積の７０％までの濃度で使用され得る。

ハロアルカンデハロゲナーゼに基づいた除染組成物は、２つのマクロな相、すなわち溶解された酵素を含む水相および部分的に水に可溶または水に不溶の有機溶媒（例えば、酢酸エチル、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、シクロヘキサノール、ｎ−プロピルアセテート、クロロ酢酸エチル、ビス（２−クロロエチル）エーテル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、ヘキサノール、酢酸イソアミル、酢酸ｎ−アミル、トルエン、オクタノール、イソヘプタン、ｎ−ブチルエーテル、シクロヘキサン、２−メチルペンタン、ｎ−ヘキサン、メチルシクロヘキサン、およびｎ−オクタン）からなる第２の相から構成され得る。有機相は、除染組成物中、イペリットの溶解性を増強し、水相へ浸透する。この反応は水相で生じ、ここで酵素は天然の環境にあり、溶解したイペリットの大半が存在する有機溶媒と直接接触しない。反応物および生成物の２つの相（反応物から酵素へ、酵素から生成物）の間の移動は、２つの相の間の表面を拡大すること（良好な分散を生じさせる）または攪拌することにより増大され得る。大量の水は、水と混じらない有機溶媒の添加により置換され得る。次いで酵素は、単相性の有機溶媒に懸濁される。有機溶媒中の酵素の至適触媒活性は、水の含有量の調整および維持により得られ得る。これは、１組の塩／水和物（例えば、ＣａＣｌ_２・Ｈ_２Ｏ／２Ｈ_２Ｏ、無水ＮａＩ／２Ｈ_２Ｏ、無水Ｎａ_２ＨＰＯ_４／２Ｈ_２Ｏ、無水ＮａＯＡｃ／３Ｈ_２Ｏ、無水ＮａＢｒ／２Ｈ_２Ｏ、無水Ｎａ_４Ｐ_２Ｏ_７／７Ｈ_２Ｏ、Ｎａ_２ＨＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ／７Ｈ_２Ｏ、無水Ｎａ_２ＳＯ_４／１０Ｈ_２Ｏ、Ｎａ_２ＨＰＯ_４・７Ｈ_２Ｏ／１２Ｈ_２Ｏ）により慣習的に得られ得、これは、溶媒に添加され、水含有緩衝液として機能する。親油性有機溶媒中での酵素溶解性は、両親媒性ポリマーポリエチレングリコールの酵素表面への共有結合により改変され得る。酵素表面へのポリマー鎖の結合は、リシン残基のε−アミノ基の「リンカー」（例えば、塩化シアヌル酸）との反応により達成される。多価アルコール（例えば、糖アルコールまたはグリセロール）、不活性化されたタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）あるいはポリマー（水とある構造的類似を示す、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール）のようなタンパク質安定剤は、反応媒体に添加され得、酵素安定性を増強する。

本発明に従って使用されるハロアルカンデハロゲナーゼは、さらに構造的解析（例えば、タンパク質結晶学、核磁気共鳴および円偏光二色性分光法）および生化学的特徴付け（例えば、定常状態の動力学、一過性状態の動力学、安定性および熱安定性アッセイ、分光器的解析など）に基づいた論理的な設計方法、続いてコンピューターモデリング（配列の比較、系統発生的解析、相同性モデリング、分子ドッキング、分子力学、分子動力学、量子力学および多変量統計学）およびＤＮＡ変異誘発（例えば、カセット式変異誘発、特定部位の突然変異誘発、化学的変異誘発、誤りがちのＰＣＲ、部位飽和変異誘発（ｓｉｔｅ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、全体的変異誘発、繰返し全体的変異誘発、飽和変異誘発のスキャニング、突然変異株など）より行われ得る。この手順は、ハロアルカンデハロゲナーゼの少なくとも１つのアミノ酸残基を、別のアミノ酸残基を用いて変える工程、または改善された効果を有する改変された酵素を得るためにハロアルカンデハロゲナーゼの２つ以上のメンバーを組換える工程を包含する。改変された核酸は、細胞に導入され得、その細胞中で、それらが発現され、変更されたハロアルカンデハロゲナーゼを提供し得る。

ハロアルカンデハロゲナーゼを有する除染組成物の利点としては、
ａ）イぺリットに対して所望される解毒活性を有し、４〜１２の範囲のｐＨを有する（中性の至適ｐＨ７．０〜８．５を有する）水溶液に、＋１０〜＋７０℃の温度範囲（反応至適温度は約＋４０℃である）で均一に溶解される。
ｂ）低い初期濃度（１×１０^−６ｍｏｌ．ｌ^−１）は、十分な解毒レベルを意味する所望される反応速度を約１５〜３０分で達成するのに十分であり、この酵素濃度の上限は、１×１０^０ｍｏｌ．ｌ^−１である。
ｃ）触媒活性を示す、すなわち、反応の間使い尽くされないで残っており、ロジスティックの領域において費用削減をもたらす。
ｄ）中性水性の腐食に関して非攻撃的な除染組成物（水性懸濁液、泡、エマルジョンまたはミクロエマルジョン）の影響に耐える技術の一般的な構成物質および構成要素に対して化学的攻撃性を示さない。
ｅ）いかなる毒性も示さず、自然環境において分解可能である。

（代表的な実施形態の詳細）
本酵素は、本来の生産者において相同性の発現により調製されるか、または宿主生物（例えば、バクテリアＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉまたは酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）において異種性の発現により調製される。本発明に従って、生細胞または非生細胞に存在するこの酵素は、粗製抽出物または精製タンパク質の形態で使用される。

（実施例１）
Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ ＵＴ２６由来の野生型酵素ハロアルカンデハロゲナーゼＬｉｎＢ（配列１および２）を過剰生産するために、相当する遺伝子をｐＰＩＣＺαＡ発現ベクターでクローン化した。次いでクローン化されたプラスミドは、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５に移される。次いでＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５を増殖培地中（１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液中、１重量％の酵母抽出物、２重量％のペプトン、４×１０^−５重量％のＢｉｏｔｉｎｅおよび１重量％のカザミノ酸、ｐＨ６．５）２８℃で培養した。この培養物が６００ｎｍで光学密度が２に達したとき、酵素合成の誘導を、０．７容積％メタノールの添加により開始した。誘導後、培養物を２８℃で１０時間インキュベートし、次いで採取した。硫酸アンモニウムを、最終濃度７５％飽和まで上清に添加した。溶液を、添加した硫酸アンモニウムが溶解するまで３０分攪拌した。この上清を１１０００ｇで１５分遠心した。次いでペレットを、０．５Ｍ 塩化ナトリウムおよび１０ｍＭ イミダゾールを含有する２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５に再懸濁した。次いでハロアルカンデハロゲナーゼを、Ｎｉ−ＮＴＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム ＨＲ１６／１０（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で精製した。Ｈｉｓタグしたハロアルカンデハロゲナーゼを、平衡緩衝液（２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５；０．５Ｍ 塩化ナトリウムおよび１０ｍＭ イミダゾールを含む）に配置した樹脂に結合させる。結合していないタンパク質および結合の弱いタンパク質を、６０ｍＭ イミダゾールを含む緩衝液で洗い流した。次いでＨｉｓタグした酵素ＬｉｎＢを、１６０ｍＭ イミダゾールを含む緩衝液により溶出した。活性画分を一晩、５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ＝７．５で透析した。この酵素を、長期にわたる酵素安定性を増強するために１０％ グリセロールおよび１ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含む５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ＝７．５に４℃で保存した。

ハロアルカンデハロゲナーゼ（野生型または改変型）により触媒される加水分解性脱ハロゲン化は、毒性のイペリットを非毒性のビス（２−ヒドロキシエチル）スルフィドに変換する。イペリットの加水分解性脱ハロゲン化は、５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．５；１Ｍ ＮａＯＨ溶液の添加により調整される）中、３７℃でハロアルカンデハロゲナーゼにより触媒された。イペリットを、緩衝液中イペリット最終濃度が９４．３ｍｇ．ｌ^−１になるまで反応緩衝液中に添加した。反応を、酵素ＬｉｎＢの溶液（５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５；１×１０^−５〜１×１０^−４ｍｏｌ．ｌ^−１のハロアルカンデハロゲナーゼＬｉｎＢ、１０ｖｏｌ％のグリセロールおよび１ｍｏｌ．ｌ^−１の２−メルカプトエタノール）の添加により開始した。ハロアルカンデハロゲナーゼの作用は、迅速かつ完全なイペリットの除染を導く。この反応動態を図１に示す。イペリットの除染でハロアルカンデハロゲナーゼＬｉｎＢの触媒活性／触媒能力は、ｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍ＝６．９ｓ^−１．ｍＭ^−１である。

図１−ハロアルカンデハロゲナーゼＬｉｎＢの使用によるイペリットの変換。酵素なしでのイペリットの自然な加水分解ｋ_ｃ＝０．００４６ｓ^−１（白抜きの円）およびハロアルカンデハロゲナーゼＬｉｎＢの存在下でのイペリットの分解ｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍ＝６．９ｓ^−１．ｍＭ^−１（黒塗りの円）。

（配列１および配列２）
バクテリアＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ ＵＴ２６から単離された遺伝子ｌｉｎＢおよびハロアルカンデハロゲナーゼＬｉｎＢの配列。

（実施例２）
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ ＮＣＩＭＢ １３０６４（配列３および４）由来の酵素ハロアルカンデハロゲナーゼＤｈａＡを過剰生産するために、対応する遺伝子を、ｌａｃｌ^ｑの制御下でｔａｃプロモーター（Ｐ_ｔａｃ）を含むｐＡＱＮベクターにクローン化した。ｐＡＱＮプラスミドを含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１を２５０ｍｌ Ｌｕｒｉａ ｂｒｏｔｈ中、３７℃で培養した。酵素合成の誘導は、この培養物が６００ｎｍで０．６の光学密度に達したとき、最終濃度０．５ｍＭまでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを添加することにより開始した。誘導後、この培養物を３０℃で４時間インキュベートし、次いで採取した。この細胞を、Ｓｏｎｉｐｒｅｐ １５０（Ｓａｎｙｏ，ＵＫ）を使用する超音波処理により破砕した。この上清を、１０００００ｇで１時間遠心した後、使用した。ハロアルカンデハロゲナーゼを、Ｎｉ−ＮＴＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム ＨＲ１６／１０（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で精製した。Ｈｉｓタグしたハロアルカンデハロゲナーゼを、平衡緩衝液（２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５；０．５Ｍ 塩化ナトリウムおよび１０ｍＭ イミダゾールを含む）に配置した樹脂に結合させた。結合していないタンパク質および結合の弱いタンパク質を、６０ｍＭ イミダゾールを含む緩衝液で洗い流した。次いでＨｉｓダグしたハロアルカンデハロゲナーゼを、１６０ｍＭ イミダゾールを含む緩衝液により溶出した。活性画分を一晩５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ＝７．５で透析した。この酵素を、１０％ グリセロールおよび１ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含む５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ＝７．５に４℃で保存し、長期にわたる酵素安定性を増強させた。

酵素ハロアルカンデハロゲナーゼＤｈａＡまたはその変異体は、１×１０^−６〜１×１０^−４ｍｏｌ．ｌ^−１の濃度で前記の酵素、さらに１〜５ｖｏｌ％の濃度で一般式Ｃ_ｎＨ_２ｎ＋２の脂肪族炭化水素または一般式Ｃ_ｎＨ_２ｎの環式脂肪族炭化水素（ｎは６〜１２である）、さらに５〜２０ｖｏｌ％の濃度で一般式Ｃ_ｎＨ_２ｎ＋１ＯＨの脂肪族アルコール（ｎは２〜４である）、さらに３〜１５重量％の濃度で一般式Ｃ_ｎＨ_２ｎ＋１ＯＳＯ_３Ｍｅの陰イオン活性界面活性剤（ｔｅｎｓｉｄｅ）（ｎは１０〜１６であり、Ｍｅは対イオン（Ｎａ^＋、Ｋ^＋またはモノエタノールアンモニウム）を表す）、１〜１０重量％の濃度で一般式Ｒ^（３）−（Ａｒ）ＳＯ_３ ⁻．Ｍｅ^＋のアルキルベンゼンスルホン酸塩（ここでＲ^（３）は１１〜１３個の炭素原子を有するアルキルを表し、Ｍｅ^＋はナトリウムイオンを示す）、さらに７〜９の範囲に水溶液のｐＨを調整するためのグリシン緩衝液の成分、もしくは総濃度０．１ｍｏｌ．ｌ^−１のグリシンなどを含有する除染組成物の一部である。必要とされるｐＨ８．２は、１Ｍ ＮａＯＨの添加により達成される。１００％にするための残りは、水である。イペリットの除染でロアルカンデハロゲナーゼＤｈａＡの触媒能力は、ｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍ＝５．７ｓ^−１．ｍＭ^−１である。

（配列３および配列４）
バクテリアＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ ＮＣＩＭＢ１３０６４から単離された遺伝子ｄｈａＡおよびハロアルカンデハロゲナーゼＤｈａＡの配列。

（実施例３）
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ ５０３３／６６由来の酵素ハロアルカンデハロゲナーゼＤｍｂＡ（配列５および６）を過剰生産するために、実施例１と同様な手順に従う。酵素ハロアルカンデハロゲナーゼＤｍｂＡまたはその変異体は、１×１０^−６〜１×１０^−４ｍｏｌ．ｌ^−１の濃度で前記の酵素、さらに１〜２０ｖｏｌ％の一般式Ｃ_ｎＨ_２ｎ＋１ＯＨの脂肪族アルコール（ｎは２〜４である）、さらに３〜１５重量％の一般式Ｃ_ｎＨ_２ｎ＋１ＯＳＯ_３Ｍｅの陰イオン活性界面活性剤（ｎは１０〜１６であり、Ｍｅは対イオン（Ｎａ^＋、Ｋ^＋またはモノエタノールアンモニウム）を表す）、１〜１０重量％の一般式Ｃ_９Ｈ_１９−Ａｒ−Ｏ−（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｎＨのエトキシノニルフェノール（ｎは９〜１０である）、さらに７〜９の範囲に水溶液のｐＨを調整するためのグリシン緩衝液の成分、あるいは総濃度０．１ｍｏｌ．ｌ^−１のグリシンなどを含有する除染組成物の一部である。必要とされるｐＨは、１Ｍ ＮａＯＨの添加により達成される。１００％にするための残りは、水である。イペリットの除染でハロアルカンデハロゲナーゼＤｍｂＡの触媒能力は、ｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍ＝６．０ｓ^−１．ｍＭ^−１である。

（配列５および配列６）
バクテリアＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ ５０３３／６６から単離された遺伝子ｄｍｂＡおよびハロアルカンデハロゲナーゼＤｍｂＡの配列。

（実施例４）
酵素ハロアルカンデハロゲナーゼＬｉｎＢまたはその変異体は、１×１０^−６〜１×１０^−４ｍｏｌ．ｌ^−１の濃度のこの酵素、さらに１〜１５重量％の一般式Ｃ_ｎＨ_２ｎ＋１ＯＳＯ_３Ｍｅの陰イオン活性界面活性剤（ｎは１０〜１６であり、Ｍｅは対イオン（Ｎａ^＋、Ｋ^＋またはモノエタノールアンモニウム）を表す）、１〜１０重量％の一般式Ｃ_９Ｈ_１９−Ａｒ−Ｏ−（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｎＨのエトキシ化ノニルフェノール（ｎは９〜１０である）、さらに７〜８．５の範囲に水溶液のｐＨを調整するためのリン酸緩衝液の成分；すなわち必要とされる比および総濃度５０ｍｍｏｌ．ｌ^−１ｎのＫＨ_２ＰＯ_４およびＫ_２ＨＰＯ_４、などを含有する除染組成物の一部である。１００％にするための残りは、水である。

（産業的実用性）
本発明は、イペリットにより汚染される軍用武器、輸送機関、工業用および農業用機器、技術装置および建設物の表面、ヒトまたは動物の皮膚の表面ならびに自然環境の要素からこの高い毒性の水疱形成物質を除去するために産業上利用できる。本技術は、一般的に水疱形成物質を除染するための解毒組成物の使用が必要である軍隊、また民間防衛団においても利用できる。

Claims (8)

1. イペリットの解毒方法であって、該方法は、該イペリットを、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ ＵＴ２６由来のデハロゲナーゼ ＬｉｎＢ（配列番号２）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｏｄｏｃｈｒｏｕｓ ＮＣＩＭＢ １３０６４由来のデハロゲナーゼ ＤｈａＡ（配列番号４）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ ５０３３／６６由来のデハロゲナーゼ ＤｍｂＡ（配列番号６）からなる群から選択される少なくとも１つのハロアルカンデハロゲナーゼを用いて酵素濃度１×１０^−６〜１×１０^０ｍｏｌ．ｌ^−１、温度＋１０℃〜＋７０℃、およびｐＨ４〜１２の液体媒体中で処理する工程を包含する、方法。
2. 前記液体媒体が、有機溶媒、有機溶媒の単相性水溶液または有機溶媒および水からなる２相系である、請求項１に記載の方法。
3. 前記ハロアルカンデハロゲナーゼ溶液が、緩衝液系を含む、請求項２に記載の方法。
4. ハロアルカンデハロゲナーゼの調製が、多価アルコール、不活性タンパク質、ポリマーからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質安定剤の存在下で実施される、請求項１に記載の方法。
5. 前記酵素ハロアルカンデハロゲナーゼが、可溶性形態または結晶性形態または凍結乾燥された形態または沈殿された形態として使用される、請求項１に記載の方法。
6. 前記酵素ハロアルカンデハロゲナーゼが、有機キャリアまたは無機キャリアの表面への吸着、イオン結合または共有結合により固定化される、請求項１に記載の方法。
7. 前記酵素ハロアルカンデハロゲナーゼが、架橋、あるいは酵素を固体マトリックスまたは膜により制限されたコンパートメントに捕捉することにより固定化される、請求項１に記載の方法。
8. 前記解毒が、界面活性剤の存在下で実施される、請求項１に記載の方法。