CZ298287B6

CZ298287B6 - Způsob detoxikace sulfidického yperitu působením halogenalkandehalogenáz

Info

Publication number: CZ298287B6
Application number: CZ20050352A
Authority: CZ
Inventors: Prokop@Zbyněk; Damborský@Jiří; Opluštil@František; Jesenská@Andrea; Nagata@Yuji
Original assignee: Masarykova univerzita v Brně
Priority date: 2005-06-03
Filing date: 2005-06-03
Publication date: 2007-08-15
Also published as: AU2006254625A1; JP4793947B2; IL186596A; JP2008545483A; WO2006128390A1; CZ2005352A3; EP1899022B1; AU2006254625B2; NZ564218A; EP1899022A1; US7888103B2; EA011311B1; CA2610024A1; EP1899022B8; CA2610024C; EA200702273A1; US20080248557A1; IL186596A0

Abstract

Způsob detoxikace sulfidického yperitu působením halogenalkandehalogenáz nebo jejich směsí, způsob přípravy dehalogenujících enzymů a dekontaminačních směsí, obsahujících jako chemicky aktivní komponentu alespoň jednu divokou a/nebo modifikovanou halogenalkandehalogenázu (EC 3.8.1.5). Vhodnými dehalogenázami jsou DhaA z Rhodococcus rodochrous NCIMB 13064, DmbA z Mycobacterium bovis 5033/66 nebo LinB ze Sphingomonas paucimobilis UT26. Dekontaminace je použitelná k detoxikaci sulfidického yperitu na površích techniky, stavebních objektů, kůže osob či zvířat asložek životního prostředí, kdy se na sulfidický yperit působí dekontaminační směsí s koncentrací enzymu v rozmezí 1x10.sup.-6.n. - 1x10.sup.0.n. mol.l.sup.-1.n. při teplotě +10 až +70 .degree.C, s výhodou při +40 .degree.C a pH =4 až 12.

Description

Způsob detoxikace sulfidického yperitu působením halogen alkandehalogenáz

Oblasttechniky

Vynález se týká způsobu detoxikace sulfidického yperitu působením halogenalkandehalogenáz (kódové číslo enzymu EC 3.8.1.5), jako základní, chemicky aktivní komponenty dekontaminačních směsí. Dekontaminační směsi jsou určeny k detoxikaci sulfidického yperitu (2,2'-dichlordiethylsulfidu) na površích vojenské techniky, přepravní, průmyslové a zemědělské techniky, technických zařízení a stavebních objektů (dále jen techniky), kůže osob či zvířat a složek životního prostředí (voda, půda, sedimenty a vzduch), které jsou kontaminovány touto vysoce toxickou zpuchýřující látkou.

Stav techniky

V současné době se vjednotkách armád, civilní ochrany a hasičských a záchranných sborů využívají dekontaminační směsi, které se zpravidla vyznačují nežádoucí materiálovou agresivitou a vysokou jednotkovou spotřebou, neboť jejich chemicky aktivními komponentami jsou stechiometrická činidla, která se při reakci se sulfidickým yperitem postupně spotřebovávají. Jejich praktické využití na technice způsobuje korozní znehodnocení detoxikovaného materiálu či povrchů a pokud se směsi dostanou do půd či vod, ohrožují i životní prostředí.

V literatuře byly popsány enzymy, které vykazují detoxikační aktivitu vůči vysoce toxickým fosfor organickým (nervovým) látkám, nazývané jako organofosfátové hydrolázy, OPA anhydrázy či DFPázy. Jako jediný příklad biologické detoxikace zpuchýřujícího sulfidického yperitu, 2,2'-dichlordiethylsulfidu, bylo až dosud v literatuře uváděno použití bakteriálního kmenu Rhodococcus rhodochrous IGTS8 (ATCC 53968), který je schopen využívat chemický analog yperitu 2-chlorethyl-ethylsulfid jako jediný zdroj uhlíku pro svůj růst [Kílbane, J. J., and Jackowski, K. (1996) J. Chem. Těch. Biotechnol. 65, 370-374], Detoxikační účinek bakteriálního kmenu Rhodococcus rhodochrous IGTS8 (ATCC 53968) je založen na štěpení vazby C-S v molekule 2-chlorethyl-ethylsulfidu. Byly publikovány i aplikace enzymu štěpícího vazbu C-S vnetoxickém hydrolytickém produktu, thiodiglykolu [Harvey, S., DeFrank, J. J., Valdes, J, J. Kamely, D, and Chakrabarty, A. M., (1990) Proceedings: Biotechnology-Biodegradation Workshop Symposium by US Army Research Office, 47-58; Kilbane, J. J., (1990) Resources Conserv. andRecycl, 3, 69-79].

Halogenalkandehalogenázy jsou enzymy schopné odstranit halogen ž halogenované alifatické sloučeniny hydrolytickou substitucí a vytvoření příslušných alkoholů [Janssen, D. B. Pries, F. EC 3.8.1.5, např. halogenalkandehalogenázy DhaA zRhodococcus rodochrous NCIMB 13064, DmbA z Mycobacterium bovis 5033/66 nebo LinB ze Sphingomonas paucimobilis UT26.

Halogenalkandehalogenázy tvoří důležitou skupinu enzymů, které mají schopnost štěpit vazbu mezi halogenem a uhlíkem alifatických halogenovaných sloučenin. Mají širokou substrátovou specifitu zahrnující halogenované alkany, cykloalkany, alkeny, ethery a alkoholy. Mechanizmus dehalogenace spočívá v nukleofilním napadení uhlíku, nesoucím halogenový substituent, za odštěpení halogenidového iontu a současné tvorbě alkylenzymového intermediátu. Vzniklý intermediát je následně hydrolyzován za vzniku odpovídajícího alkoholu, halogenidového iontu a protonu. Enzymem halogenalkandehatogenázou je sulfidický yperit hydrolyticky dehalogenován na netoxický bis(2-hydroxyethyl)sulfid.

V dekontaminačních směsích se halogenalkandehalogenáza nachází v surovém nebo čištěném extraktu, imobilizovaná na materiálu nosiče, volná ve vodném roztoku, vjednofázovém organickém nebo vodném roztoku nebo v dvojfázovém systému tvořeném organickou a vodnou fází. Enzymy mohou být imobilizovány adsorpcí na anorganickém nebo organickém materiálu nosiče

-1 CZ 298287 B6 (jako je Celíte, aktivované uhlí, oxidy hliníku, celulóza, syntetické pryskyřice, sephadex) nebo kovalentním připojením na povrch organického materiálu (jako je celulóza, dextran škrob, chitin, agaróza), anorganického materiálu (jako je porézní sklo), nebo syntetického polymerního materiálu nosiče (jako je VA-Epoxy Biosynth, Eupergit).

Enzym halogenalkandehalogenáza může být rozpustný, krystalický, lyofilizovaný nebo vysrážený. Enzym může být uzavřen do vymezené oblasti, kde zůstává katalyticky aktivní - uzavřený do pevné matrice nebo do membránou ohraničených oblastí. Enzymy mohou být uzavřeny do biologické matrice, např. agarového gelu, alginátového gelu a k-karagenanu. Enzym může být uzavřen také do anorganických stabilních matric, např, silíkagelu. Těsná síť, která má schopnost nést izolovaný enzym, může být získána polymerací syntetických monomerů, např. polyakrylamidu, v přítomnosti enzymu. V závislosti na způsobu imobilizace mohou být významně ovlivněny vlastnosti enzymu, jako jsou katalytická rychlost, vazebná afinita a stabilita. Enzymaticky katalyzovaná hydrolytická detoxikace sulfídického yperitu se může uskutečňovat v rozmezí teplot od + ] 0 do +70 °C s reakčním optimem při +40 °C.

Doplňkovými komponentami jsou vodné roztoky pufrů (např., fosfátový pufr, tris-síranový pufr, glycinový pufr, acetátový pufr nebo citrátový pufr), které stabilizují neutrální hodnotu pH prostředí v optimálním intervalu 7,0 až 8,5. Profil aktivity v závislosti na hodnotě pH je širší a umožňuje rozmezí pH od 4 do 12 při udržení dostatečné aktivity. Dalšími doplňkovými komponentami jsou povrchově aktivní látky či organická rozpouštědla, které usnadňují rozpouštění sulfídického yperitu ve vodných prostředích. Přídavky organických rozpouštědel mísitelných s vodou, jako jsou methanol, terciální butanol, aceton, dioxan, acetonitril, dimethylformamid, dimethylsulfoxid, tetrahydrofuran, 3-methyD3-pentanol a pyridin, mohou dosahovat až koncentrace 70 % celkového objemu v závislosti na stabilitě enzymu.

DekontaminaČní směsi na bázi halogenalkandehalogenáz mohou sestávat ze dvou makroskopických fází, jmenovitě z vodné fáze obsahující rozpuštěný enzym a z druhé fáze, kterou jsou ve vodě nerozpustná nebo částečně rozpustná organická rozpouštědla, jako jsou ethylacetát, diethylether, methyl terc-butylether, cyklohexanol, n-propylacetát, ethylchloracetát, bis(2—chlorethyl)ether, izopropylacetát, butylacetát, izobutylacetát, hexanol, izoamylacetát, n-amylacetát, toluen, oktanol, izoheptan, n-butylether, cyklohexan, 2-m ethyl pentan, n-hexan, methylcyklohexan a noktan. Organická fáze zvyšuje rozpustnost yperitu v dekontaminační směsi, který přechází do vodné fáze. Reakce probíhá ve vodné fázi, kde je enzym v přirozeném prostředí a není v přímém styku s organickým rozpouštědlem, ve kterém se nachází většina rozpuštěného yperitu. Urychlení přenosu reaktantu a produktu mezi oběma fázemi, reaktantu k enzymu a produktu od enzymu, může být dosaženo zvýšením mezifázového povrchu (vytvořením jemné disperze) nebo mícháním. Velké množství vody může být nahrazeno organickým rozpouštědlem nemísitelným s vodou. Enzym je potom suspendován vjednofážovém organickém rozpouštědle. Optimální katalytická aktivita enzymu v organickém rozpouštědle může být dosažena úpravou a udržováním obsahu vody. Toho lze běžně dosáhnout pomocí páru sůl/hydrát např. CaCI₂ · H₂O/2 H₂O, Nal bezv./2 H₂O, Na₂HPO₄ bezv./2 H₂O, NaOAc bezv./3 H₂O, NaBr, bezv./2 H₂O, Na^O? bezv./7 H₂O, Na₂HPO₄ · 2 H₂O/7 H₂O, Na₂SO₄ bezv./ΙΟ H₂O, Na₂HPO₄ · 7 H₂O/12 H₂O, které se přidají k rozpouštědlu a fungují jako stabilizátor obsahu vody. Rozpustnost enzymu v lipofílních organických rozpouštědlech může být modifikována kovalentním připojením amfipatického polymeru polyethylenglykolu k povrchu enzymu. Vazba polymerního řetězce k povrchu enzymu je dosažena reakcí ε-amino skupin lysinových zbytků se „spojovníkem“, např. chloridem kyseliny kyanurové. Stabilizátory proteinů, jako jsou polyalkoholy, např. cukerné alkoholy nebo glycerol, inaktivní proteiny, jako je bovinní sérový albumin, nebo polymery, které mají určitou strukturní podobnost s vodou, např. pólyethylenglykol, polyvinylalkohol, mohou být přidány do reakčního média, aby zvýšily stabilitu enzymu.

Halogenalkandehalogenázy použité podle tohoto vynálezu mohou být dodatečně vyvíjeny pomocí racionálního designu, který je založen na strukturní analýze, např. proteinové krystalografii, nukleární magnetické rezonanci a spektroskopii cirku lamí ho dichroismu; a biochemické

2CZ Z98287 B6 charakterizaci, např. kinetice rovnovážného stavu, kinetice přechodného stavu, rozborech stability a termostability, spektroskopických rozborech a podobně, pomocí následného počítačového modelování, např. srovnávání sekvencí, fylogenetických analýz, homologního modelování, molekulárního dokování, molekulami mechaniky, molekulární dynamiky, kvantové mechaniky a statistiky s mnoha proměnnými a mutageneze DNA, např. kazetové mutageneze, místně cílené mutageneze, chemické mutageneze, chybující PCR, místně saturační mutageneze, mutageneze souboru, opakovatelné mutageneze souboru, skenovací saturační mutageneze, použití mutátorových kmenů, atd. Postup zahrnuje změnu alespoň jednoho aminokyselinového zbytku v halogenalkandehalogenáze za jiný aminokyselinový zbytek nebo rekombinaci dvou nebo více členů halogenalkandehalogenáz, aby byla získána modifikovaná halogenalkandehalogenáza se zlepšenou účinností. Modifikované nukleové kyseliny mohou být vpraveny do buňky, v níž mohou být exprimovány, aby poskytly modifikovanou halogenalkandehalogenázu.

Výhodou dekontaminační směsi s obsahem halogenalkandehalogenáz je, že:

a) s požadovanou účinností detoxikuje sulfidický yperit, který je homogenně rozpuštěn ve vodných prostředích s hodnotou pH v rozmezí od 4 do 12 (s optimem v neutrální oblasti pH 7,0 až 8,5) v rozmezí teplot od +0 do +70 °C s reakčním optimem při +40 °C,

b) k použití postačuje nízká počáteční koncentrace (řádově od 1 x 10’⁶ mol.F¹) pro dosažení požadované rychlosti reakce, tj. dostatečného stupně detoxikace v průběhu cca 15 až 30 minut, přičemž horní mez koncentrace enzymu se nachází přibližně při 1x10° mol. 1-1,

c) vykazuje katalytický účinek, tj. při detoxikační reakci se nespotřebovává, což přináší úspory v oblasti logistiky,

d) nevykazuje chemickou agresivitu vůči běžným konstrukčním materiálům a komponentám techniky, které odolávají působení neutrálních vodných, korozně, neagresivních, dekontaminačnich směsí (vodných roztoků, pěn, emulzí či mikroemulzí),

e) nevykazuje žádnou toxicitu a je volně rozložitelný v životním prostředí.

Příklady provedení vynálezu

Enzym se připravuje homologní expresí v původním organizmu nebo heterologní expresí v hostitelském organizmu, např. v bakteriích Escherichia coli nebo v kvasince Pichia pastoris. Podle vynálezu se používá enzym obsažený v živých nebo v mrtvých buňkách, ve formě hrubého buněčného extraktu nebo ve formě purifikováného proteinu.

Příklad 1

Pro nadprodukci enzymu halogenalkandehalogenázy LinB ze Sphingoomonas paucimobilis UT26 (Sekvence 1) se nakloňuje odpovídající gen v expresním vektoru pPICZaA. Nakloňované plazmidy jsou transformovány do Pichiapastoris GS115. Pichiapastoris GS115 je kultivována při teplotě 28 °C v růstovém médium (1 % hmotn. kvasničního extraktu, 2 % hmot, peptonu, 4x10 ⁵ % hmot. Biotinu a 1 % hmot, kyseliny kasaminové ve 100 mM draselnofosfátovém pufru, pH 6,5). Indukce enzymové syntézy je iniciována přidáním 0,7 % obj. metanolu, kdy kultura dosáhne optické hustoty 2 při 600 nm. Po indukci je kultura inkubována 10 h při teplotě 28 °C a pak sklizena. Síran amonný je přidán do supematantu tak aby koncentrace dosáhla 75 % saturace. Roztok je míchán 30 minut, až je všechen přidaný síran amonný rozpuštěn. Supematant je centrifugován při 11 000 g po dobu 15 minut. Pelet je následně rozs uspěn dován ve 20 mM draselnofosfátovém pufru, pH 7,5, sobsahem 0,5 M chloridu sodného a lOmM imidazolu. Halogenalkandehalogenáza je následně čištěna na Ni-NTA Sefarózové koloně HR 16/10 (Qiagen, Německo). Halogenalkandehalogenáza s histidinovou kotvou se naváže na pryskyřici umístěnou v pufru udržujícím rovnováhu, který obsahuje 20 mM draselnofosfátového pufru o pH 7,5; 0,5 M chloridu sodného a 10 mM imidazolu. Nevázané a slabě navázané proteiny jsou vymyty pufrem

-3CZ 298287 B6 obsahujícím 60 mM imidazolu. Enzym LinB s histidinovou kotvou je potom vymyt pufrem obsa- j hujícím 160 mM imidazolu. Aktivní frakce jsou dialyzovány přes noc proti 50 mM draselno- 1 fosfátovém pufru, pH = 7,5. Enzym je skladován při teplotě 4 °C v 50 mM draselnofosfátovém pufru, pH = 7,5 s obsahem 10 % glycerolu a lmM 2-merkaptoethanoIu zvyšující dlouhodobou stabilitu enzymu.

Enzymem halogenalkandehalogenázou (divokou nebo modifikovanou) je sulfidický yperit hydrolyticky dehalogenován na netoxický bis(2-hydroxyethyl)sulfid. Hydrolytická dehalogenace sulfidického yperitu je katalyzována halogenalkandehalogenázou při 37 °Č v 50 mM fosfátovém pufru (pH 7,5; upravené přidáním roztoku 1M NaOH). Sulfidický yperit je přidán do reakčního pufru do výsledné koncentrace 94.3 mg yperitu.f¹ pufru. Reakce je spuštěna přídavkem roztoku enzymu LinB (50 mM draselnofosfátový pufr pH = 7,5, lxl0^_s až 1x10^-4 mol.I^-1 halogen- I alkandehalogenázy LinB, 10 % obj. glycerolu a 1 mmol.f¹ 2-merkaptoethanolu). Účinkem halogenalkandehalogenázy dojde krychle a úplné dekontaminaci sulfidického yperitu. Kinetika reakce je graficky znázorněna na Obr. 1. Katalytická účinnost halogenalkandehalogenázy LinB při dekontaminaci sulfidického yperitu je k_cat/K_m = 6.9 s^_1.mM^_l.

Čas (minuty)

Obr. 1 - Konverze sulfidického yperitu s použitím halogenalkandehalogenázy LinB. Spontánní hydrolýza yperitu za nepřítomnosti enzymu k_c - 0.0046 s^_1 (prázdné kroužky) a odbourávání yperitu v přítomnosti halogenalkandehalogenázy LinB k^Km = 6.9 sÚmM'¹ (černé kroužky).

Sekvence 1. Sekvence genu linB a halogenalkandehalogenázy LinB izolované z bakterie Sphingomonas paucimobilis UT26.

atg agc ctc ggc gca aag cca ttt.ggc gag aag aaa ttc att gag atc aag ggc cgg cgc atg gcc tat átc gat gaa ggg acc ggc gat ccg atc ctč ttc cag cac ggc aat ccg acg tcg. tcc tat ctg tgg cgc aat atc atg ccg cat tgc gcc ggg ctg gga cgg ctg atc gcc tgt gac ctg atc ggc atg ggc gat tcg gac aag ctc gat ccg tcg ggg ccc gag cgt tat gcc tat gcc gag cat cgt.gác tát ctč gac gcg ctg tgg gag gcg ctc gat ctč ggg gac agg gtt gtt ctg gtc gtg cat gac tgg ggg tcc gcc ctc ggc ttc gac tgg gcc cgc cgc cac cgc gag cgt gta cag ggg att gcc tat atg gaa gcg atc gcc atg ccg átc gaa tgg: gcg gat ttt ccc gaa cag gat cgc gat ctg ttt cag gcc ttt cgc tcg cag gcg ggc gaa gaá ttg gtg ttg cag gac aat gtt ttt gtc gaa caa gtt ctc ccc gga ttg atc ctg cgc ccc tta agc gaa gcg gag atg gcc gcc tat cgc gag ccc ttc ctc gcc gcc ggc gaa gcc cgt ega ccg acc ctg tet tgg cct cgc caa átc ccg atc gca ggc acc ccg gcc gac gtg gtč gcg átc gcc cgg gac tat gcc ggc tgg čte agč gaa agc ccg att ccg aaa ctc ttc atc aac gcc gag ccg gga gcc ctg acc acg ggc ega atg cgc gac ttc tgc cgc aca tgg cca aac cag acc gaá átc acg gtc gčá ggc gcc cat ttc atc cag .gag gác agt cčg gac gag att ggc gcg gcg att gcg gcg ttt gtc cgg ega ttg čgč cca gca taa

-4CZ 298287 B6

MSIGAKPFGEKKFIEIKGRRMAYIDEGTGDPILFQHGNPTSSYLWRNIMPHCAGLGRLIACDLI

GMGDSDKLDPSGPERYAYAEHRDYLDÁLWEALDLGDRýVLWHDWGSALGFDWARRHRER vqgiaymeaiampiewadfpeqdrdlfqafrsqageelvlqdnvfveqvlpglilrplseaem

AAYREPFLAAGEARRPTLSWPRQIPÍAGTPADWAIARDYAGWLSESPIPKLFINAEPGALTTG rmrdfcrtwpňqtehvagahfíqědspdeigaaíaáfvrrlrpa

Příklad 2

Pro nadprodukci enzymu halogenalkandehalogenázy DhaA z Rhodococcus radochrous NCIMB 13064 (Sekvence 2), se nakloňuje odpovídající gen v pYBjA2 vektoru obsahujícím tac promotor (P_tac) za kontroly lacF. V 250 ml Luria bujónu je při teplotě 37 °C kultivována Escherichia coli BL21 obsahující pAQN plazmid. Indukce enzymové syntézy je iniciována přidáním izopropylβ-D-thiogalaktopyranosidu až na konečnou koncentraci 0,5 mM, kdy kultura dosáhne optické hustoty 0,6 při 600 nm. Po indukci je kultura inkubována 4 h při teplotě 30 °C a pak sklizena. Buňky jsou rozbity sonifikací s použitím Soniprep 150 (Sanyo, UK). Supernatant je použit po centrifugaci která probíhá 1 hodinu při 100,000 x g. Halogenalkandehalogenáza je následně čištěna na Ni-NTA Sefarózové koloně HR 16/10 (Qiagen, Německo). Halogenalkandehalogenáza s histidinovou kotvou se naváže na pryskyřici umístěnou v roztoku udržujícím rovnováhu, který obsahuje 20 nM draselnofosfátového pufru o pH 7,5; 0,5 M chloridu sodného a 10 mM imidazolu. Nevázané a slabě navázané proteiny jsou vymyty pufrem obsahujícím 60 mM imidazolu. Halogenalkandehalogenáza s histidinovou kotvou je potom vymyta pufrem obsahujícím 160 mM imidazolu. Aktivní frakce jsou dialyzovány pres noc proti 50 mM draselnofosfátového pufru, pH = 7,5. Enzym je skladován při teplotě 4°C v 50 mM draselno fosfátovém pufru, pH ~ 7,5 s obsahem 10 % glycerolu a 1 mM 2-merkaptoethanolu zvyšujícím dlouhodobou stabilitu enzymu.

Enzym halogenalkandehalogenáza DhaA, nebo jeho varianta, je součástí dekontaminační směsi, která obsahuje uvedený enzym v koncentraci lxlO^-6 až 1x10*^ mol.!^-1, dále 1 až 5 obj. % alifatického uhlovodíku obecného vzorce CnH2ft+2 či cykloalifatického uhlovodíku obecného vzorce CnH2íl, ve kterém n má hodnotu 6 až 12, dále 5 až 20 obj. % alifatického alkoholu obecného vzorce CnH2n+1OH, ve které n má hodnotu 2 až 4,dále 3 až 15 hm. % anionaktivního tenzidu obecného vzorce C^En-iOSCEMe, ve kterém n má hodnotu 10 až 16 a Me značí protiion (Na⁺, K⁺ či monoethanolamonium), 1 až 10 hm. % alkylbenzensulfonatu obecného vzorce R^í3)-(Ar)SO3~.Me⁺, ve kterém R⁽³⁾ značí alkyl o počtu uhlíkových atomů 11 až 13, a Me⁺ značí sodný ion, dále složky glycinového pufru k nastavení hodnoty pH vodného roztoku v rozmezí 7 až 9, a sice glycin o celkové koncentraci 0.1 mol.1“¹ atd. Žádaná hodnota pH 8,2 je dosažena přídavkem 1M NaOH. Zbytek do 100% činí voda. Katalytická účinnost halogenalkandehalogenázy DhaA při dekontaminaci sulfidického yperitu je k^/Km = 5.7

Sekvence 2. Sekvence genu dhaA a halogenalkandehalogenázy DhaA izolované z bakterie Rhodococcus rodochrous NCIMB 13064.

atg tca gaa atc ggt aca ggc ttc ccc ttc gac ccc cat tatgtg gaa gtc ctg ggc gag cgt atg cac tac gtč gat gtt gga ccg cgg gat ggc ačg cct gtg ctg ttc ctg cac ggt aac ccg acc tcg tcc tac ctg tgg cgc aac atc atc ccg cat gta gca ccg agt cat cgg tgc att gct cca gac ctg atc ggg atg gga aaa tcg gac aaa cca gac ctc gat tat ttc ttc gac gac cac gtc cgc tac ctc gat gcc ttc atc gaa gcc ttg ggt ttg gaa gag gtc gtč čtg gtc atc cac gac tgg ggc tca gct ctc gga ttc cac tgg gcc aag cgc aat ccg gaa cgg gtc aaa ggt att gca tgt atg gaa ttc atc cgg cct atc ccg acg tgg gac gaa tgg ccg gaa ttc gcc cgt gag: acc ttc cag gcc ttc cgg acc gčc gac gtc ggc ega gag ttg atc atc gat cag aac gct ttc atc

-5CZ 298287 B6 gag ggt gcg ctc ccg aaa tgc gtc gtc cgt.ccg ctt ačg gág gťc gag atg gac cac tat cgc gag ccc ttc ctc aag cct gtt gac ega gag cca ctg tgg ega ttc ccc aac gag ctg ccc atc gcc ggt gag ccc gcg aac atc gtc gcg ctc gtc gag gca tac atg aac tgg ctg cac cag tca cct gtc čcg aag ttg ttg ttc tgg ggc aca ccc ggc gta ctg atc ccc ccg gcc gaá gcc gcg aga ctt gcc gaa agc ctc ccc aac ťgc aag aca gtg gac atc ggc čcg gga ttg čač tac ctc cag gaa gac aac ccg gac ctt atc ggc agt gag atc.gcg cgc tgg čte ccc gca ctc tag

MSEIGTGFPFDPHYVEVLGERMHYVDVGPŘDGtPVLFLHGŇPTSSYLWRNilPHVAPSHRClA PDLtGMGKSDKPPLDYFFDĎHVRYLDAFlEALGLEEWLVIHDWGSALGFHWAKRNPERVKGI ACMEFIRPIPTWDEWPEFARETFQAFRTADVGRELIIDQNAFIEGALPKCWRPLTEVÉMÓHYR EPFLKPVDREPLWRFPNELPIAGEPAŇIVALVEAYMNWLHQŠPVPKLLFWGTPGVLIPPAEAA RLAEŠLPNCKTVDIGPGLHYLQEDNPDUGSEIARWLPAL

Příklad 3

Pro nadprodukci enzymu halogenalkandehalogenázy DmbA z Mycobacterium bovis 5033/66 (Sekvence 3), se postupuje podle Příkladu 1. Enzym halogenalkandehalogenáza DmbA, nebo jeho varianta, je součástí detoxikační směsi, která obsahuje uvedený enzym v koncentraci lxl O“⁶až lxlO⁴ moll¹, dále 1 až 20 obj, % alifatického alkoholu obecného vzorce CnH2n+iOH, ve io kterém n má hodnotu 2 až 4, dále 3 až 15 hm. % anionaktivního tenzidu obecné formule Cnb^n+iOSCbMe, ve které n má hodnotu 10 až 16 a Me značí protiion (Na⁺, K⁺ či monoethanolamonium), dále 1 až 10 hm. % ethoxylovaného nonylfenolu obecného vzorce CsHi^-Ar-O(C2H4O)_nH, kde index n je roven 9 až 10, dále složky glycinového pufru k nastavení hodnoty pH vodného roztoku v rozmezí 7 až 9, a sice glycin o celkové koncentraci 0.1 mol.E¹ atd. Žádaná 15 hodnota pH je dosažena přídavkem 1M NaOH. Zbytek do 100 % činí voda. Katalytická účinnost halogenalkan-dehalogenázy DmbA při dekontaminaci sulfidického yperitu je k_c^!K_m = 6.0fW

Sekvence 3. Sekvence genu dmbA a halogenalkandehalogenázy DmbA izolované z bakterie 20 Mycobacterium bovis 5033/66, atg aca gca ttc ggc gtc gag ccc tac ggg: čág ccg aag tac čta gaa atc gcc ggg aag čgc atg gcg tat atc gac gaa ggc aag ggt gac gcc atc gtc ttt cag cac ggc aac ccc acg tcg tet tac ttg tgg cgc aac atc atg ccg cac ttg gaa ggg ctg ggc cgg ctg gtg gčc tgc gat ctg atc ggg atg ggc gcg tcg gac aag ctc agc cca tcg gga ccc gac cgc tat agc tat ggc gag caa ega gac ttt ttg ttc gcg ctc tgg gat gcg ctc gac ctággc gac cac gtg: gta ctg gtg ctg cac. gac tgg ggc tcg gcg ctc ggc ttc gac tgg gčt aac cag cát cgc gac čga gtg čág ggg atc gcg'ttc atg gaa gcg. atc gtč acc ccg atg acg tgg gcg gac tgg ccg ccg gcc gtg cgg.ggt gtg ttc cag ggt ttc ega tcg cct caa ggc gag cca atg gcg ttg gag cac aac atc ttt gtc gaa cgg gtg ctg ccc ggg gcg atc ctg čgá cag ctc agc gac gag gaa atg aac cac tat cgg cgg cca ttc gtg aac ggc ggc gag gac cgt cgc ccc acg ttg tcg tgg cca ega aac ctt cca atc gac ggt gag ccc gčc gág gtc gtc gcg ttg gtc aac gag tác cgg agc tgg ctc gag gaa acc gac atg ččg aaa ctg ttc atc aac gčc gág ccc ggc gcg atc atc acc ggč cgc atc cgt gac tat gtc agg agc tgg ccc aac cag acc gaa atc aca gtg ccc ggc gtg cat ttc gtt cag gag gac agc cca gag gaa atc ggt gcg gcc ata gca· cag ttc gtc cgg cag ctc cgg tcg gčg gcč ggc gtčtga

-6CZ 298287 136

aiitgrirdyvrswpňqtéitvpgvhfvqedspeeigaaiaqfvrqlrsaagv

Příklad 4

Enzym halogenalkandehalogenáza LinB nebo jeho varianta je součástí detoxikační směsi, která obsahuje uvedený enzym v koncentraci 1 xlO^-6 až 1 x 1CT⁴ mol.L¹, dále 1 až 15 hm. % anionaktivního tenzidu obecného vzorce CnH2n+iOSO3Me, ve které n má hodnotu 10 až 16 a Me značí protiion (Na⁺, K⁺ či monoethanolamonium), dále 1 až 10 % hmotn. ethoxy lovaného nonylfenolu 10 obecného vzorce C9Hi9-Ar-O-(C₂H₄0)_nH, kde index n je roven 9 až 10, dále složky fosfátového pufru k nastavení hodnoty pH vodného roztoku v rozmezí 7,0 až 8,5, a sice KH₂PO₄ a K₂HPO₄v potřebném poměru a o celkové koncentraci 50 mmol.1' atd. Zbytek do 100 hmot. % hmot, činí voda.

Průmyslová využitelnost

Vynález je průmyslově využitelný k odstraňování sulfidického yperitu z povrchů vojenské techniky, přepravní, průmyslové a zemědělské techniky, technických zařízení a stavebních objektů, 20 kůže osob či zvířat a složek životního prostředí, které jsou kontaminovány touto vysoce toxickou zpuchýřující látkou. Technologie je využitelná ve vojenství i civilní správě, obecně všude tam, kde je nutno používat detoxikační směsi k dekontaminaci zpuchýřujících látek.

Claims

1. Způsob detoxikace sulfidického yperitu působením halogenalkandehalogenáz, vyzna30 čený tím, že se na sulfidický yperit působí alespoň jednou halogenalkandehalogenázou vybranou ze skupiny enzymů s kódovým číslem EC 3.8.1.5 při koncentraci enzymu v rozmezí lxl 0'⁰ až 1x10° mol.L¹, teplotě +10 až +70 °C a pH 4 až 12 v kapalném prostředí.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že halogenalkandehalogenázou je enzym 35 vybraný ze skupiny zahrnující dehalogenázu DhaA z Rhodococcus rodochrous NCIMB 13064,

DmbA z Mycobacterium bovis 5033/66, LinB ze Sphingomonaspciucimobilis UT26.

3. Způsob podle nároků 1 a 2, vyznačený tím, že jako halogenalkandehalogenáza se použije divoká nebo modifikovaná halogenalkandehalogenáza nebo směs obou.

4. Způsob podle nároků 1 až 3, vyznačený tím, že se příprava halogenalkandehalogenáz provádí v přítomnosti nejméně jednoho stabilizátoru proteinů, vybraného ze skupiny zahrnující polyalkoholy, inaktivní proteiny, nebo polymery.

45

5. Způsob podle nároků laž4, vyznačený tím, že kapalným prostředím je organické rozpouštědlo, jednofázový vodný roztok organického rozpouštědla, dvoj fázový systém tvořený organickou a vodnou fází.

-7CZ Z9XZ87 B6

6. Způsob podle nároků 1 až 5, vyznačený tím, že se použije enzym halogenalkandehalogenáza v rozpustné formě nebo ve formě krystalické nebo ve formě lyofilizované nebo ve vysrážené formě.

7. Způsob detoxikace sul lidického yperitu podle nároků 1 až 6, vyznačený tím, že enzym halogenalkandehalogenáza je imobilizován adsorpcí nebo iontovou vazbou nebo kovalentní vazbou na povrchu nosiče.

8. Způsob detoxikace sulfidického yperitu podle nároků 1 až 6, vyznačený tím, že enzym halogenalkandehalogenáza je imobilizován vytvořením vzájemných příčných vazeb nebo uzavřením enzymu do pevné matrice nebo do prostoru odděleného membránou.

9. Způsob podle nároků laž8, vyznačený tím, že se detoxikace provádí v přítomnosti povrchově aktivních látek.

Konec dokumentu