CN109706139A - 脱卤素酶基因LinB、脱卤素酶、脱卤素酶基因工程菌及其构建方法和应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种脱卤素酶基因LinB、脱卤素酶、脱卤素酶基因工程菌及其构建方法和应用方法。其中，脱卤素酶基因LinB包括(a)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；(b)编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列；或(c)，(a)或(b)的变异体。脱卤素酶包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列编码的多肽；SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；或其变异体。脱卤素酶基因工程菌的构建方法包括将脱卤素酶基因LinB克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得能够表达脱卤素酶的脱卤素酶基因工程菌。

Description

脱卤素酶基因LinB、脱卤素酶、脱卤素酶基因工程菌及其构建 方法和应用方法

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种脱卤素酶基因LinB、脱卤素酶、脱卤素酶基因工程菌及其构建方法和应用方法。

背景技术

以除草剂六六六及芥子气等为代表的有机氯污染物其具有结构稳定、作用持久的特点，是一类持久性有机污染物。上个世纪由于杀虫剂六六六杀虫效果好，一度被广泛使用，但给环境造成难以修复的危害。加之由于六六六的脂溶性大的特点，通过食物链的富积对人类自身的影响正在逐渐地显现，并日益加大。

另外，二战期间，侵华日军在我国遗弃了数以百吨计的化学毒剂和数以百万发计的化学弹药，其中大部分为芥子气，至今仍然威胁着许多地区人民的安全并破坏当地的生态环境。

为了应对未来战争和恐怖事件中化学毒剂的威胁，研究广谱、快速、彻底且环境友好的消毒方法就成为目前军事化学和环境科学共同面对的重要课题。近年来,由光催化技术为代表的化学降解方法取得了一定的效果，但是工艺复杂，成本昂贵，限制了以光催化技术为代表的化学降解方法推广应用。生物降解是一种高效、安全、可靠的技术，有望推广用来去除环境中残存的六六六等含氯有机污染物。氯有机污染物的好氧微生物降解过程主要是在一系列脱卤素酶及氧化还原酶的催化下进行的反应，其中最重要的是负责起始降解的脱氯化氢酶linA和卤代烷脱卤素酶LinB。由LinB基因编码的脱卤素酶催化β-HCH的一步或两步水解脱卤反应。此外，LinB基因编码的脱卤素酶的底物范围比较广，对单氯烷烃、二氯烷烃、溴代烷烃和氯代酯族醇都有活性。

遗传密码有64种，但是绝大多数生物倾向于利用这些密码子中的一部分。根据大肠杆菌表现出的某种程度的密码子利用的差异或偏爱，通过优化LinB序列，构建大肠杆菌表达载体，构建高水平表达的大肠杆菌工程菌，进而增加脱卤素酶LinB产量，同时降低脱卤素酶生产成本，对于推动生物降解含氯有机污染物具有重要意义。

发明内容

为解决至少以上问题之一，本发明提供一种脱卤素酶基因LinB、脱卤素酶、脱卤素酶基因工程菌及其构建方法及其应用。

具体地，本发明一些实施方式提供一种脱卤素酶基因LinB，包括(a),SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；(b),编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列；或(c),(a)或(b)的变异体。

本发明一些实施方式提供所述的脱卤素酶基因LinB，其中所述变异体包括在SEQID NO.1所示的核苷酸序列中进行一个或几个核苷酸取代、缺失或添加，与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列同一性超过 90％的核苷酸序列且编码具有脱卤素酶活性的多肽；在一些实施方式中，与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列同一性超过95％的核苷酸序列且编码具有脱卤素酶活性的多肽；进一步在一些实施方式中，与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列同一性超过99％的核苷酸序列且编码具有脱卤素酶活性的多肽。

另一方面，本发明一些实施方式提供一种脱卤素酶，包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列编码的多肽；SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；或其变异体。

本发明一些实施方式提供的脱卤素酶，其中所述变异体包括在 SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中进行一个或几个氨基酸取代、缺失或添加，与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列序列的同一性超过90％且具有脱卤素酶活性的多肽。在一些实施方式中，所述变异体包括在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中进行一个或几个氨基酸取代、缺失或添加，与SEQ IDNO.2所示氨基酸序列序列的同一性超过95％且具有脱卤素酶活性的多肽。

另一方面，本发明一些实施方式公开一种脱卤素酶基因工程菌，包括所述脱卤素酶基因LinB。

另一方面，本发明一些实施方式还公开一种脱卤素酶基因工程菌的构建方法，包括将本发明所述的脱卤素酶基因LinB克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得能够表达脱卤素酶的脱卤素酶基因工程菌。

进一步，本发明一些实施方式公开的脱卤素酶基因工程菌构建方法，所述重组表达载体包括但不限于：大肠杆菌、酵母、枯草杆菌、乳酸菌、链霉菌、噬菌体、丝状真菌、植物、昆虫、或哺乳动物细胞。

本发明一些实施方式公开的脱卤素酶基因工程菌的构建方法，包括使用T7强启动子表达pET-28a(+)载体质粒，使得脱卤素酶基因 LinB在脱卤素酶基因工程菌中通过T7RNA聚合酶启动转录。

本发明一些实施方式公开的脱卤素酶基因工程菌的构建方法，包括构建脱卤素酶基因LinB的原核表达系统。

另一方面，本发明一些实施方式还公开了一种脱卤素酶基因工程菌的应用方法，包括将本发明所述的脱卤素酶基因工程菌用于含氯有机污染物的降解。

本发明公开涉及的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年10月 22日，编号为CGMCC16601，菌株名称为DH5a-LinB，处于存活状态。

利用本发明实施方式公开的脱卤素酶基因LinB构建出高产的脱卤素酶基因工程菌，制作工艺简单，体系稳定，不采用高温高压反应，不采用有毒化学品，且环境友好。

该脱卤素酶基因工程菌在国防、环境、化工等领域的含氯有机污染物的降解过程中具有潜在的产业化应用价值。例如，可以利用本发明提供的脱卤素酶基因工程菌的缓释作用，发挥其长期有效降解作用，对含氯有机污染物污染的土壤、水体进行修复；制作成含有脱卤素酶基因工程菌的防护膏剂，对含氯污染物污染的物体表面进行降解消毒；也可以将脱卤素酶基因工程菌负载于防护材料上，对吸附在防护材料上的含氯污染物进行降解消毒。

附图说明

图1示出脱卤素酶LinB基因的扩增产物电泳检测图。

图2示出连接脱卤素酶LinB基因的pET-28a(+)单酶切验证电泳图。

图3示出脱卤素酶基因工程菌培养物上清液及破碎菌体对 2-CEES的去除效果图。

图4示出破碎菌体对2-CEES的去除率变化图。

具体实施方式

在本文中的专用词“实施例”或“实施方式”，作为“示例性”说明的任何实施方式不必解释为优于或好于其它实施方式。本发明实施方式中的性能指标测试，除非特别说明，采用本领域技术人员采用的试验方法。应理解，本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明公开的内容。

除非另有说明，否则本文使用的技术和科学术语具有本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义；作为本发明中的其它未特别注明的原材料、试剂、试验方法和技术手段均指本领域内普通技术人员可商购的原材料和试剂，以及本领域技术人员采用的实验方法和技术手段。

如这里所用的，短语“核酸”或“核酸序列”指寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸，或指它们中任一的片段，指基因组或合成来源的DNA 或RNA，它们可以是单链的或双链的，可以表现为有义或反义链，指肽核酸(PNA)或指任何天然或合成来源的DNA样或RNA样物质。在一些实施方式中，本发明的“核酸序列”包括，例如，编码SEQ ID NO.2 氨基酸序列中所列多肽及其变异体的序列。在另一些实施方式中，本发明的“核酸序列，包括，例如，SEQ ID NO.1核酸序列中所列的序列，与其互补的序列，上述序列的片段及其变异体。

特定多肽或蛋白的“编码序列”或“编码特定多肽或蛋白的核苷酸序列”是当置于适当调节序列控制下时，被转录和翻译成多肽或蛋白的核酸序列。

术语“基因”是指涉及产生多肽链的DNA片段；它包括密码区之前和之后的区域(前导区和非转录尾区)，以及在可适用时，包括单个编码片段(外显子)之间的间插序列(内含子)。

如这里所用，“氨基酸”或“氨基酸序列”指寡肽、肽、多肽或蛋白序列，或指它们中任一的片段、部分或亚单位，并指天然存在或合成的分子。在一些实施方式中，本发明的“氨基酸序列”或“多肽序列”包括例如，所示氨基酸序列中所列的序列，上述序列的片段及其变异体。在另一些实施方式中，本发明的“氨基酸序列，包括例如，由具有所示核酸序列中所列序列的多核苷酸编码的序列，与它们互补的序列，前述序列的片段及其变异体。

如这里所用的，术语“多肽”指相互被肽键或修饰的肽键连接起来的氨基酸，即肽等排体，可含有除20个基因编码的氨基酸以外的修饰的氨基酸。这些多肽可以被任意一种自然过程修饰，如翻译后处理，或通过本领域熟知的化学修饰技术。修饰可以发生在多肽的任何地方，包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。应当理解到，同一类型的修饰可以在给定多肽的数个部位表现为相同或不同的程度。而且给定的多肽可有许多类型的修饰。修饰包括乙酰化作用，酰化作用，ADP- 核糖基化作用，酰胺化作用，核黄素共价附着，血红素部分共价附着，核苷酸或核苷酸衍生物共价附着，脂质或脂质衍生物共价附着，磷脂酰肌醇(phosphytidylinositol)共价附着，交联环化作用，二硫键形成，脱甲基作用，形成共价交联，形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸酯，甲酰化作用，Y-羧化作用，糖基化作用，糖基磷脂酰肌醇(GPI)固着物形成，羟基化作用，碘化作用，甲基化作用，肉豆蔻化作用，氧化作用，pergylation，蛋白水解过程，磷酸化作用，异戊二烯化作用，外消旋作用，硒化作用，硫酸化作用，和转运-RNA介导的氨基酸加入蛋白如精氨酰化作用。

在提到两个核酸或多肽时，短语“基本上相同的”指当比较和排列最大对应时，两个或多个序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、 75％、80％、85％，和在某些方面90％、95％、96％、97％、98％、99％的核苷酸或氨基酸残基同一性，正如用已知的序列比较算法之一或通过目测而确定的。典型地，基本上同一性存在于至少大约100个残基区域内，最常见地，序列在至少大约150-200个残基区域内基本上相同。在某些实施例中，序列在编码区的全长区域内基本上相同。

术语“变异体”指在一个或多个碱基对、密码子、内含子、外显子或氨基酸残基上(分别地)被修饰但仍保留本发明脱卤素酶生物活性的本发明的多核苷酸或多肽。本发明的多核苷酸或多肽也可以通过导入修饰的碱基如次黄嘌呤核苷而被修饰。另外，这些修饰可以任选地被重复一或多次。这些变异体可以通过许多方法产生，例如，包括易错聚合酶链式反应(易错PCR)、改组(Shuffling)、寡核苷酸定位诱变(oligonucleotide-directedmutagenesis)、装配PCR、有性PCR诱变、体内诱变、盒式诱变、循环系综诱变、指数系综诱变、位点特异性诱变、基因再装配、基因位点饱和诱变(GSSM)或它们的任何组合、排列或反复步骤。

同源性或同一性经常采用序列分析软件来进行测定(如， GeneticsComputerGroup的序列分析软件包，威斯康星大学生物技术中心，1710University Avenue,Madison,W153705)。该软件可通过指定同源性的程度来对多个删除，替代和其他修饰来匹配相似序列。术语“同源性”和“同一性”在两个或多个核酸或多肽序列的情况下，是指当在对比窗或指定区域被比较和排列时，两个或多个相同的或特定比例氨基酸残基或核苷酸是相同的序列或子序列，其测定可采用任何数量的序列比较算法或通过人工排列和目测。

本公开所用的术语“基本”和“大约”用于描述小的波动。例如，它们可以是指小于或等于±5％，如小于或等于±2％，如小于或等于±1％，如小于或等于±0.5％，如小于或等于±0.2％，如小于或等于±0.1％，如小于或等于±0.05％。浓度、量和其它数值数据在本文中可以以范围格式表示或呈现。这样的范围格式仅为方便和简要起见使用，因此，应灵活解释为不仅包括作为该范围的界限明确列举的数值，还包括该范围内包含的所有独立的数值或子范围。例如，“1％至5％”的数值范围应被解释为不仅包括1％至5％的明确列举的值，还包括在所示范围内的独立值和子范围。因此，在这一数值范围中包括独立值，如2％、3.5％和4％，和子范围，如1％～3％、2％～4％和3％～5％等。这一原理同样适用于仅列举一个数值的范围。此外，无论该范围的宽度或所述特征如何，这样的解释都适用。

在本发明，包括权利要求书中，所有连接词，如“包含”、“包括”、“带有”、“具有”、“含有”、“涉及”、“容纳”等被理解为是开放性的，即是指“包括但不限于”。只有连接词“由...构成”和“由...组成”是封闭连接词。

为了更好的说明本发明内容，在下文的具体实施例中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在实施例中，对于本领域技术人员熟知的一些方法、手段、仪器、设备、原料组成、分子结构等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。

具体地，本发明实施例公开的脱卤素酶基因LinB包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列；或其变异体。

进一步，在一些实施方式中，所述变异体包括在SEQ ID NO.1 所示的核苷酸序列中进行一个或几个核苷酸取代、缺失或添加，与 SEQ ID NO.1所示核苷酸序列同一性超过90％的核苷酸序列且编码具有脱卤素酶活性的多肽；在一些实施方式中，与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列同一性超过95％的核苷酸序列且编码具有脱卤素酶活性的多肽；进一步，在一些实施方式中，与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列同一性超过99％的核苷酸序列且编码具有脱卤素酶活性的多肽。

在一些实施方式中，脱卤素酶包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列编码的多肽；SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；或其变异体。进一步，在一些实施方式中，所述变异体包括在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中进行一个或几个氨基酸取代、缺失或添加，与SEQ IDNO.2所示氨基酸序列序列的同一性超过90％且具有脱卤素酶活性的多肽。在一些实施方式中，所述变异体包括在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中进行一个或几个氨基酸取代、缺失或添加，与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列序列的同一性超过95％且具有脱卤素酶活性的多肽。

在一些实施方式中，脱卤素酶的核苷酸编码序列可以根据预测的脱卤素酶氨基酸序列及其核苷酸编码序列，由人工合成获得。在一些实施方式中，脱卤素酶的核苷酸编码序列是分离的或重组的。

在一些实施方式中，脱卤素酶基因LinB是通过优化密码子得到，转化导入大肠杆菌DH5a表达获得的脱卤素酶，菌体DH5a-LinB对2-CEES(2-氯乙基乙基硫醚)为底物有很高的降解活性。

菌株DH5a-LinB保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2018年10月22日，编号CGMCC16601。

在一些实施方式中，脱卤素酶基因工程菌包括本发明一些实施例公开的脱卤素酶基因LinB。例如，一些实施方式公开了包括将本发明公开的脱卤素酶基因LinB克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得能够表达的脱卤素酶的脱卤素酶基因工程菌的方法。

在一些实施方式中，构建脱卤素酶基因工程菌的方法中，所述重组表达载体，包括但不限于：大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体表达载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体。

在一些实施方式中，用于重组表达脱卤素酶基因LinB的重组菌或转基因细胞系，包括但不限于：大肠杆菌宿主细胞，例如Escherichia coli BL21、Escherichia coliJM109、Escherichiacoli DH5α等；酵母菌宿主细胞，例如Saccharomyces cerevisiae、Pichiapastoris、 Kluyveromyceslactis等；枯草杆菌宿主细胞，例如Bacillus subtilisR25、 Bacillus subtilis 9920等；乳酸菌宿主细胞，例如Lactic acid bacteria COCC101等；放线菌宿主细胞，例如Streptomyces spp等；丝状真菌宿主细胞，例如Trichodermaviride，Trichodermareesei， Aspergillusniger、Aspergillusnidulans等；昆虫细胞，例如Bombyxmori， Antharaeaeucalypti等；哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢细胞CHO、幼小仓鼠肾脏细胞BHK、中国仓鼠肺细胞CHL等。

本发明一些实施方式公开的脱卤素酶基因工程菌的构建方法，包括使用T7强启动子表达pET-28a(+)载体质粒，使得脱卤素酶基因 LinB在脱卤素酶基因工程菌中通过T7RNA聚合酶启动转录。

另一方面，本发明一些实施方式还公开了一种脱卤素酶基因工程菌的应用方法，包括将所述脱卤素酶基因工程菌用于含氯有机污染物的降解过程。在一些实施方式中，包括将本工程菌表达的脱卤素酶与其脱卤素酶混合，用于协同断裂C-Cl键。

例如，可以将本发明实施例公开的脱卤素酶基因工程菌用于被含氯有机污染物污染后的土壤修复、水体修复，或者制作成防护膏剂，作为含氯有机污染物或有机毒剂的防护材料，或者负载于传统防护材料，利用传统防护材料的吸附等能力，将吸附在防护材料上的含氯有机污染物降解。

实施例1

脱卤素酶基因工程菌的构建及验证

1)、脱卤素酶合成基因的获得

脱卤素酶基因工程菌构建方法及其应用，通过密码子优化，并在上游要引入NdeI位点，下游引入Xho I位点，以便下一步与pET-28a(+) 载体连接。以合成的脱卤素酶基因为模板，在引物1 (CATATGTCTCTGGGTGCTAA，见序列表SEQ ID NO.3所示)和引物2(CTCGAGTTAAGCCGGACGCA，见序列表SEQ ID NO.4所示)的作用下进行PCR扩增。

PCR反应体系各组分加入量(总体积50μL):10XPfu DNA Polymerase Buffer5μL,10mMdNTP混合物(dATP、dCTP、dGTP和dTTP 各2.5mM)1μL，浓度为50μM的克隆引物1、引物2各1μL，无核酸水补足至50μL。

采用Biorad的PCR仪，PCR反应条件为：预变性95℃5min，然后进入温度循环95℃40s,56℃30s，72℃2min，共30个循环，最后 72℃延伸7min，终止温度为4℃。

取10μL PCR反应液用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，其电泳检测图如附图1所示，由图1可知获得的脱卤素酶基因LinB基因片段大小约为900个碱基，与预期脱卤素酶基因碱基大小一致。

2)、脱卤素酶LinB基因在大肠杆菌中的重组表达

合成的原核系统表达优化的脱卤素酶序列扩增产物和表达载体 pET-28a(+)(美国Novagen公司)，单酶切后电泳图如图2所示，连接脱卤素酶LinB基因的pET-28a(+)单酶切后，片段大小约为理论值一致，说明脱卤素酶基因成功连接到pET-28a(+)载体。

用XhoI(Thermo fisher scientific)及NdeI(Thermo fisher scientific) 进行双酶切，双酶切产物经电泳分离和凝胶回收后，将经过双酶切的 PCR产物与同样经过双酶切pET-28a(+)载体用T₄DNA连接酶 (Thermo fisher scientific)连接。将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞(Thermo fisher scientific)，在含50ug/mL的卡那霉素(上海生工生物工程有限公司)抗性LB平板上获得转化子，PCR和单酶切验证后委托Thermo fisher公司进行测序。

测序结果表明，在pET-28a(+)的Xho I及NdeI酶切位点之间插入SEQ ID NO.1所示的脱卤素酶LinB基因，且插入方向正确，所以进一步证明构建的重组质粒正确，将该重组质粒命名为 pET-28a(+)-LinB。

转化子接种于固体LB平板活化，挑取单菌落在超净台中接种于 50mL LB，置于摇床37℃振荡培养过夜，检测培养物上清液和破碎菌体对2-CEES的降解效率。

实施例2

2-CEES/二氯甲烷标准曲线的绘制

1)、在10mL试管中分别加入1mg、2mg、3mg、4mg、5mg2-CEES (用微量注射器滴加，实际的质量以天平读数为准)。

2)、将5支试管分别搅均后取1mL左右步骤1)样品进行气相色谱GC分析，得到峰面积与浓度的标准曲线，R2≥99.99％

3)、气相色谱仪为日本岛津GC-2010，气相色谱条件如下：

a)色谱柱：HP-5柱；

b)进样口250℃，便于气化；

c)检测器FID或FPD；

d)程序开温50℃保持2min，15℃/min升温至200℃，保持1min。

4)、工程菌2-CEES去除率的测定：取5支平行5mL培养物上清液，分别加入等量5mg2-CEES，处理10min后分别加入二氯甲烷终止反应，取下层清液用滤头过滤后进行GC分析，用LB培养基和清水做对照组，计算不同时间的去除率，去除率(r)计算公式如下：

式中，C₀和C_t分别为2-CEES初始质量和处理t时间后的质量。

实施例3

脱卤素酶基因工程菌修复2-CEES污染土壤

实施例1所得的脱卤素酶基因工程菌的破碎菌体悬液，可直接喷洒于六六六等氯代烃污染土壤，实现污染土壤的原位修复，还可以将污染土壤与该脱卤素酶基因工程菌悬液混匀，通过定期添加LB 培养基，实现脱卤素酶基因工程菌的生长繁殖，达到污染土壤逐步修复的目的。

实施例4

脱卤素酶基因工程菌及培养物上清液、LB培养基降解2-CEES 效果评价

取5支平行5mL培养物上清液，或1mL破碎菌体，分别加入等量 5mg 2-CEES，处理10min后分别加入二氯甲烷中止反应，取下层清液用滤头过滤后进行GC分析(分析方法同实施例2)，以LB培养基做对照，计算不同时间的去除率，去除率(r)计算公式如下：

式中，C₀和C_t分别为2-CEES初始质量和处理t时间后的质量。

图3示出脱卤素酶基因工程菌培养物上清液、LB培养基和破碎菌体对2-CEES的去除效果图。从图3中可知，脱卤素酶基因工程菌破碎菌体和培养物上清液对2-CEES的去除效果明显高于LB培养基和水对照。

由图4可知，随着处理时间的延长，脱卤素酶基因工程菌破碎菌体对2-CEES去除率增加，处理到60min，达到达72.3％。

实施例5

脱卤素酶基因及氨基酸序列的修饰

进行一个或几个核苷酸取代、缺失或添加的核苷酸序列编码的多肽具有脱卤素酶活性，如第10位碱基由C变成A，则氨基酸则由Leu 突变成ILE，表达得到的蛋白仍具有脱卤素酶活性。

利用本发明实施例公开的脱卤素酶基因LinB密码子、基因构建出高产的脱卤素酶工程菌，制作工艺简单，体系稳定，不采用高温高压反应，不采用有毒化学品，环境友好。该工程菌在国防、环境、化工等领域的含氯有机污染物的降解过程中，具有潜在的产业化应用价值。例如，可以利用本发明提供的工程菌的缓释过程，发挥其长期有效的降解作用，对含氯有机污染物污染的土壤、水体进行修复；制作成含有工程菌的防护膏剂，对含氯污染物污染的物体表面进行降解消毒；也可以将工程菌负载于防护材料上，对吸附在防护材料上的含氯污染物进行降解消毒。

尽管本发明已经关于某些优选的实施方式进行了详细的描述，但应该理解的是任何修饰和变化都是在所描述的和要求的精神和范围内。

Claims (10)

1.一种脱卤素酶基因LinB，其特征在于，包括

(a),SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

(b),编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列；或

(c)，(a)或(b)的变异体。

2.根据权利要求1所述的脱卤素酶基因LinB，其特征在于，所述变异体包括在SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列中进行一个或几个核苷酸取代、缺失或添加，与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列同一性超过90％的核苷酸序列且编码具有脱卤素酶活性的多肽。

3.一种脱卤素酶，其特征在于，包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列编码的多肽；SEQID NO.2所示的氨基酸序列；或其变异体。

4.根据权利要求3所述的脱卤素酶，其特征在于，所述变异体包括在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中进行一个或几个氨基酸取代、缺失或添加，与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列序列的同一性超过90％且具有脱卤素酶活性的多肽。

5.一种脱卤素酶基因工程菌，其特征在于，包括权利要求1所述的脱卤素酶基因LinB。

6.一种脱卤素酶基因工程菌构建方法，其特征在于，包括将权利要求1所述的脱卤素酶基因LinB克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得能够表达脱卤素酶的脱卤素酶基因工程菌。

7.根据权利要求6所述的脱卤素酶基因工程菌构建方法，其特征在于，所述重组表达载体包括：大肠杆菌、酵母、枯草杆菌、乳酸菌、链霉菌、噬菌体、丝状真菌、植物、昆虫、或哺乳动物细胞。

8.根据权利要求6所述的脱卤素酶基因工程菌构建方法，其特征在于，包括使用T7强启动子表达pET-28a(+)载体质粒，使得脱卤素酶基因LinB在脱卤素酶基因工程菌中通过T7RNA聚合酶启动转录。

9.根据权利要求6所述的脱卤素酶基因工程菌构建方法，其特征在于，包括构建脱卤素酶基因LinB的原核表达系统。

10.一种脱卤素酶基因工程菌的应用方法，其特征在于，包括将权利要求5所述的脱卤素酶基因工程菌用于含氯有机污染物的降解。