EA011311B1 - Способ детоксикации иприта с использованием дегалогеназов галоалкана - Google Patents

Abstract

Способ детоксификации иприта - бис(2-хлороэтил)сульфид - с помощью использования дегалогеназов галоалкана или их составов, способ приготовления дегалогенизирующих ферментов и дегазационных составов, содержащих по крайней мере один дикий тип и/или модифицированный дегалогеназ галоалкана (КФ 3.8.1.5) в качестве химически активного компонента. Предпочтительные дегалогеназы следующие: LinB из Sphingomonas paucimobilis UT26, DhaA из Rhodococcus rodochrous NCIMB 13064, DmbA из Mycobacterium bovis 5033/66. Дегазация используется для детоксификации иприта с поверхности контрольно-измерительной аппаратуры, конструктивных объектов, с кожи человека или животного и элементов окружающей среды с помощью обработки иприта детоксификационным составом в соответствии с изобретением при температуре от +10 до +70°C, предпочтительно при +40°C и рН от 4 до 12.

Description

Это изобретение относится к способу детоксификации иприта-2,2'-дихлордиэтилсульфида - с использованием дегалогеназов галоалкана (Классификационный номер фермента КФ 3.8.1.5), в качестве первичного, химически-активного компонента дегазационного состава. Дегазационный состав предназначен для детоксификации иприта (2,2'-дихлордиэтилсульфид) на поверхности военной техники, транспортных средств, промышленной и сельскохозяйственной техники, технических приборов и конструктивных объектов (в дальнейшем - контрольно-измерительная аппаратура), кожи человека или животных и элементов окружающей среды (воде, грунте, осадках и воздухе), которые загрязнены этим высокотоксичным веществом, вызывающим образование вздутий.

В настоящее время дегазационные составы, использующиеся в вооруженных силах, войсках гражданской обороны, в службе пожарной охраны и аварийно-спасательных силах, характеризуются способностью поглощения и нежелательным агрессивным воздействием на материал, потому что их химически-активные компоненты являются стехиометрическими агентами, которые постепенно поглощаются в течение их реакции с ипритом. Их применение на контрольно-измерительной аппаратуре приводит к ухудшению свойств материала или поверхности, очищенной от загрязнения, коррозией, а также, если эти смеси попадают в грунт или воду, они подвергают опасности окружающую среду.

В литературе описаны ферменты, которые демонстрируют активность против высокотоксичных фосфорорганических (нейтральных) веществ, которые называются фосфорорганическими гидролитическими ферментами, ангидразами смеси изопропиламина с изопропиловым спиртом или диизопропилфторфосфаты. В качестве единственного примера биологической детоксификации иприта, который вызывает образование вздутий (2,2'-дихлородиэтилсульфид), известно использование бактерии вида Кйобососсиз гйобосйтоиб 16Т88 (АТСС 53968), которая имеет свойство утилизировать химический аналог иприта 2-хлороэтилэтилсульфид в качестве единственного источника углерода для ее роста [Кильбейн Дж.Дж., и Яковски К. (1996) Журнал Химической технологии и биотехнологии 65, 370-374 (КйЬаие, 1. 1., апб 1аскоибк1, К. (1996) 1. Сйет. Тесй. Вю1есйпо1. 65, 370-374)]. Деятельность по детоксификации бактерии вида Кйобососсиз гйобосйтоиб 16Т88 (АТСС 53968) основывается на разделении 8-С связей в молекуле. Было опубликовано применение разделения 8-С связей фермента в нетоксических продуктах гидролиза, тиодигликоля [Харви С., ДеФранк Дж. Дж., Вальдес Дж. Дж., Камели Д. и Чакрабарти А.М., (1990) Записки: Симпозиум по вопросам биотехнологии и биодеградации Научного Общества армии США, 47-58 (Натуеу, 8., ИеБтапк, 1. 1., Уа1бе8, И, Кате1у, Ό. апб СйактаЬайу, А. М., (1990) Ргосеебшдз: Вю1есйпо1оду-Вюбедтаба1юп ^откбйор 8утробшт Ьу И8 Агту Кеаеагсй ОШсе, 47-58); Килбейн Дж. Дж. (1990) Исследования, сохранение и утилизация отходов 3, 69-79 (КйЬапе, 1. 1., (1990) Кебоитсеб Сопзету. апб Кесус1. 3, 69-79)].

Дегалогеназы галоалкана являются ферментами, которые могут удалить галоген из гагогенированных алифатических соединений с помощью гидролитической замены, формируя соответствующие этанолы (спирты) [Янссен Д.Б., Прис Ф., и Ван дер Плоег Й. Р. (1994) Годовой обзор микробиологии 48, 163-191 (1ап88еп, Ό. В. Рпез, Р., апб Уап бег Р1оед, 1. К. (1994) Аппиа1 Ке\зе\\· о! М1стоЫо1оду 48, 163191)]. Гидролитическое дегалогенирование проходит путем симметричного нуклеофильного замещения атома галогена ионом гидроксила. По своей структуре, дегалогеназы галоалкана принадлежат к семейству сложного гидролитического фермента α/β [Оллис Д.Л., Чиа Е., Циглер М., Дийкстра Б., Фролов Ф., Франкен С.М., Харель М., Ремингтон С. Дж., Силман И., Щраг Дж., Суссман Дж.Л., Фершуерен К.Х.Г., и Голдман А. (1992) Белковая инженерия 5, 197-211 (О1Й8, Ό. Ь., Сйеай, Е., Суд1ег, М., ИукаЛа, В., Рто1ои, Р., Ргапкеп, 8. М., Наге1, М., Кетшдоп, 8. 1., 8йтап, Ь, 8сйгад, 1., 8и88тап, 1. Ь., Уегбсйиегеп, К. Н. 6., апб 6о1бтап, А. (1992) Рго1еш Епщпееппд 5, 197-211)]. Дегалогеназы галоалкана содержат пару нуклеофильных реагентов [Дамбровский Дж. (1998) Чистая и прикладная химия 70, 1375-1383 (ИатЬотвку, 1. (1998) Риге апб Аррйеб Сйет181ту 70, 1375-1383)], и принадлежит к наиболее стабилизированным структурным свойствам сложного гидролитического фермента α/β. Другой высоко стабилизированный регион в дегалогеназах галоалкана - это центральный β-лист, который располагается на обеих сторонах с помощью α-спиралей, которые формируют гидрофобную сердцевину главного домена. Главный домен служит носителем каталитической триады: аспарагиновая кислота - гистидин - аспарагиновая кислота/глютаминовая кислота (Абр-Н18-Абр/61и). Второй домен полностью состоит из α-спиралей и размещен как колпак на верхушке главного домена. Интерфейс между главным и колпачковым доменом формирует активный центр фермента. Тогда как существует значительное сходство между главными доменами, последовательность и структура колпачкового домена значительно отличается разными дегалогеназами галоалкана. Предполагают, что характер и структура колпачкового домена существенно определяют субстратную специфичность [Прис Ф., Ван ден Вийнгаард А.Й., Вос Р., Пентенга М., и Янссен Д.Б. (1994) Журнал Биологической Химии 269, 17490-17494 (Рйеб, Р., Уаи беп ХУупдаагб. А. 1., Воа, К., Реп1епда, М., апб Запбвеп, Ό. В. (1994) 1оитпа1 о! Вю1одюа1 Сйет181ту 269, 17490-17494); Кмуничек Й., Луенго С., Гаго Ф., Ортиз А.Р., Вейд Р.С., и Дамбровский Й. (2001) Биохимия 40, 8905-8917 (Ктишсек, 1., Ьцепдо, 8., 6адо, Р., Οτίίζ, А. К., ^абе, К. С, апб ИатЬотвку, 1. (2001) Вюсйет181гу 40, 8905-8917)].

- 1 011311

Описание изобретения

Недостатки вышеуказанных существующих дегазационных составов, содержащих стехиометрические агенты, в большей степени преодолеваются с помощью препаратов в соответствии с настоящим изобретением, содержащих катализатор гидролитической детоксификации иприта (2,2'дихлородиэтилсульфид), который является ферментом или смесью ферментов дегалогеназов галоалкана. Основным и активным компонентом составов является по крайней мере один дикий тип или модифицированный фермент семейства дегалогеназа галоалкана (КФ 3.8.1.5). Настоящее изобретение предлагает способ детоксификации иприта с использованием дегалогеназов галоалкана, который включает гидролитическую дегалогенизацию иприта, при которой иприт обрабатывается детоксификационным составом, содержащим один или большее количество диких типов или модифицированных дегалогеназов галоалкана, и посредством этого превращается в нетоксичный продукт тиодигликоль.

Дегалогеназы галоалкана выделяют из естественного производителя или из гетерологического организма-хозяина, например из бактерии ЕзсйепсЫа со11, или из дрожжевых грибков йсЫа ра81оп8. Используемый фермент может содержаться в неживых или живых клетках в форме общего экстракта или очищенного белка. В качестве фермента для состава дегалогеназа используется по крайней мере один дегалогеназ галоалкана, выбранный из семейства ферментов КФ 3.8.1.5, например дегалогеназ галоалкана ЭйаЛ из Кйобососсиб гйобосйтоиб ΝΟΙΜΒ 13064, ЭтЬА из МусоЬас1епит ϋονίδ 5033/66 или ЫпВ из 8рЫпдотопаб раиштоЬШб ИТ26.

Дегалогеназы галоалкана составляют важную группу ферментов, которые могут расщеплять галогено-углеродную связь в галогенизированных алифатических смесях. Они демонстрируют широкую особенность субстрата, включая галоалканы, галоциклоалканы, галоалкены, галоэфиры и галоэтанолы (галоспирты). Механизм дегалогенизации основывается на нуклеофильной атаке атома углерода, к которому прикреплен галоген и приводит к расщеплению иона галогена и формированию промежуточного продукта алифатического одноатомного радикала и фермента. Промежуточный продукт впоследствии гидролизируется, производя соответствующий этанол, ион галогена и протон. Фермент дегалогеназа галоалкана трансформирует иприт в нетоксичный бис(2-гидроксиэтил)сульфид с помощью гидролитической дегалогенизации.

В дегазационных составах дегалогеназ галоалкана может быть в общем экстракте или очищенный, иммобилизированным на веществе-носителе, свободно растворенным в воде, в монофазном органическом или водном растворе или в органической/водной двухфазных системах. Ферменты могут быть иммобилизированы с помощью поглощения на неорганическом или органическом материале-носителе (например: целит, активированный древесный уголь, оксид алюминия, целлюлоза, синтетическая пластмасса или Сефадекс, основанный на синтетически производном полисахариде (декстране)) или ковалентного воздействия на поверхность органического материала (например: целлюлоза, декстран, крахмал, хитин, агароза) или неорганические материалы (например: пористое стекло), или синтетический полимерный материал-носитель (например: биосинтетическая везикулярно-арбускулярная эпоксидная смола, Эупергит): фермент может быть иммобилизирован также с помощью межмолекулярной связи (связи друг с другом) или включением фермента в твердую матрицу или в клетку, ограниченную мембраной.

Дегалогеназ галоалкана фермента может быть растворен, кристаллизирован, лиофилизирован или осажден. Жидкая среда является органическим растворителем, монофазным водным растворителем органического растворителя или двухфазной системой, состоящей из органического растворителя и воды. Фермент может быть помещен в ограниченное пространство, где он остается каталитически активным включением в твердую матрицу или клетку, ограниченную мембраной. Ферменты могут быть включены в биологическую матрицу, например агаровый гель, гель алгината, κ-каррагенин. Фермент может быть включен также в неорганическую устойчивую матрицу, например силикатный гель. Герметичная сетка, которая может переносить выделенный фермент, может быть получена с помощью полимеризации синтетических мономеров, например, полиакриламид, в присутствии фермента. В зависимости от техники иммобилизации, свойства фермента, как, например, уровень катализации, устойчивость и связывающее свойство может значительно изменяться. Гидролитическая детоксификация иприта, катализированного с помощью фермента, может быть выполнена при температурном диапазоне 10-70°С с оптимальной реакцией при 40°С.

Дополнительными компонентами являются водные буферные системы (например, фосфатный буфер, трисульфат буфер, глицин буфер, ацетат буфер или цитрат буфер), которые стабилизируют нейтральную рН среду, близки к оптимальному диапазону 7,0-8,5. Профиль рН активности более широкий и позволяет сделать рН интервал от 4 до 12, при поддержании достаточной активности. Другие дополнительные компоненты являются поверхностно-активными веществами или органическими растворителями, которые упрощают растворение иприта в водных растворах. Добавление водорастворимых органических растворителей, например метанол, трет-бутанол, ацетон, диоксан, ацетонитрил, диметрил формамид, диметрил сульфоксид, тетрагидрофуран, 3-метил-3-пентанол и пиридин, можно использовать при концентрации до 70% всего объема, в зависимости от стабильности фермента.

Дегазационные составы, основанные на дегалогеназах галоалкана могут состоять из двух макроско

- 2 011311 пических фаз, а именно, водная фаза, содержащая растворенный фермент, и второй фазы, состоящей из органических растворителей, которые частично растворяются в воде или не растворяются в воде, например этил ацетат, диэтил эфир, метил трет-бутил эфир, циклогексанол, η-пропилацетат, этил хлороацетат, бис(2-хлороэтил) эфир, изопропил ацетат, бутил ацетат, изобутил ацетат, гексанол, изоамил ацетат, ηамил ацетат, толуол, октанол, изогептан, η-бутил эфир, циклогексан, 2-метилпентан, η-гексан, метилциклогексан и η-октан. Органическая фаза усиливает растворимость иприта в дегазационном составе, который проникает в водную фазу. Реакция происходит в водной фазе, где фермент в природной среде и не в прямом контакте с органическим растворителем, где сосредотачивается большинство растворенного иприта. Переход реагента и продукта между двумя фазами, реагент в фермент, продукт из фермента, можно усилить с помощью увеличения поверхности между двумя фазами (вырабатывая тонкую дисперсию) или с помощью перемешивания. Гравитационная вода может быть заменена путем добавления органического растворителя несмешиваемого в воде, тогда фермент оседает в монофазном органическом растворителе. Оптимальная каталитическая активность фермента в органическом растворителе может быть достигнута с помощью корректировки и поддержания содержания воды. Этого можно условно достичь с помощью пары соди/гидрата, например, СаС1₂ · Н₂О/2 Н₂О, ΝαΙ ангидрит/2 Н₂О, Ыа₂НРО₄ ангидрит/2 Н₂О, ЫаОАс ангидрит/3 Н₂О, ΝπΒγ ангидрит/2 Н₂О, №1₄Р₂О- ангидрит/7 Н₂О, №1₂НРО₄ · 2 Н₂О/7 Н₂О, №₂8О₄ ангидрит/10 Н₂О, №ьНРО₄ · 7 Н₂О/12 Н₂О, который добавляется к растворителю и выполняет функцию водосодержащего буфера. Растворимость фермента в липофильных органических растворителях можно изменить с помощью ковалентного воздействия амфипатического полимера полиэтилен гликоля на поверхность фермента. Связь полимерной цепочки на поверхность фермента достигается с помощью реакции ε-аминогрупп остатков лизина с «соединителем», например цианурхлорид. Стабилизаторы белка, такие как многоатомные спирты, например сахароэтанолы или глицерин, неактивированные белки, например бычий сывороточный альбумин или полимеры, которые демонстрируют некоторое структурное сходство с водой, например полиэтиленгликоль, поливинил спирт можно добавить к реакционной среде, чтобы усилить стойкость фермента.

Дегалогеназы галоалкана, которые используются в соответствии с этим изобретением, могут дальше вырабатываться с помощью конструктивного расчета, основанного на структурном анализе, например кристаллография белка, ядерный магнитный резонанс и спектроскопия циркулярного диохроизма, и биохимическая характеристика, например стационарная кинетика, переходная кинетика, стабильные и термостабильные лабораторные испытания, спектральные анализы и прочее, после компьютерного моделирования, например, сравнение последовательностей, филогенетический анализ, гомологическое моделирование, молекулярная стыковка, молекулярная механика, молекулярная динамика, квантовая механика и многомерная статистика, и мутагенез ДНК, например кассетный мутагенез, сайт-специфический мутагенез, химический мутагенез, ненадежная полимеразная цепная реакция, место насыщенный мутагенез, множественный мутагенез, рекурсивный множественный мутагенез, мутагенез исследования насыщения, деформации ген-мутатора, и пр.

Процедура включает изменение по крайней мере одного остатка аминокислоты дегалогеназа галоалкана с остатком аминокислоты или соединение двух и большего количества членов дегалогеназов галоалканов, чтобы получить модифицированный фермент с улучшенной эффективностью. Модифицированные нуклеиновые кислоты могут быть введены в клетку для того, чтобы обеспечить изменение дегалогеназа галоалкана.

Преимущества дегазационного состава с дегалогеназами галоалкана следующие:

a) Он обладает необходимой активностью детоксификации по отношению к иприту, который однородно растворяется в водных растворах с рН в диапазоне от 4 до 12 (с нейтральным оптимумом рН от 7,0 до 8,5) при температурном диапазоне от + 10 до +70°С с реакционным оптимумом приблизительно +40°С.

b) Низкая начальная концентрация (1 х 10^-6 моль.л^-1) достаточна для получения необходимого уровня реакции, а это означает, что удовлетворительный уровень детоксификации приблизительно от 15 до 30 мин, тогда как верхний лимит концентрации энзима составляет 1 х 10⁰ моль. л^-1.

c) Он демонстрирует каталитическую активность, например, остается неистощенным в течение реакции, что приносит сокращение цены.

ά) Он не демонстрирует химической агрессивности против обычных конструкционных материалов и компонентов технологии, которые противостоят воздействию нейтральной воды, коррозийно неагрессивным дегазационным составом (водные суспензии, пена, эмульсии или микро-эмульсии).

е) Он не токсичен и распадается в окружающей среде.

Описание примера осуществления

Фермент приготовляется с помощью гомологического выделения из естественного производителя или с помощью гетерологичного выделения из организма-хозяина, например из бактерии ЕксйепсШа со11 или дрожжевого грибка РюЫа раЧотк. В соответствии с изобретением, фермент, присутствующий в живых или неживых клетках, используется в форме общего экстракта или очищенного белка.

- 3 011311

Пример 1.

Для того чтобы перепроизводить дикий тип фермента дегалогеназа галоалкана ЫиВ из 8рЫидотопа5 раис1тоЬ1115 ИТ26 (Последовательности 1 и 2), соответствующий ген был клонирован в вектральном выражении ρΡΙΟΖαΛ. Клонированные плазмиды были затем перемещены в йсЫа ра51ог15 68115. Р1сЫа ρ;·ΐ5ΐοιΪ5 68115 затем был культивирован при 28°С в среде для выращивания (1 вес.% дрожжевого экстракта, 2 вес.% пептона, 4 х 10^-5 вес.% биотина и 1 вес.% казаминовой кислоты в 100 мМ фосфат калия буфер, рН 6,5). Индукция синтеза фермента была инициирована с помощью добавления 0,7 % объема метанола, когда культура достигла оптической плотности 2 при 600 нм. После индукции культура была инкубирована при 28°С в течение 10 ч, а после собрали ее урожай. Сульфат аммония добавили к надосадочной жидкости к финальной концентрации 75% насыщенности. Раствор смешивался 30 мин, пока добавленный сульфат аммония не растворился. Надосадочная жидкость центрифугировалась 15 мин при 11000 г. Полипропиленовую гранулу тогда ресуспендировали в 20 мМ буфер фосфат калия, рН 7,5 с содержанием 0,5 М хлорида натрия и 10 мМ имидазола. Дегалозеназ галоалкана затем был очищен на N1ΝΤΑ колонке сефароза НК 16/10 (Компания 61адсп. Германия). Меченный гистидином дегалогеназ галоалкана был прикреплен к смоле, размещенной на уравновешивающем буфере, который содержал 20 мМ буфера фосфата калия рН 7,5; 0,5М хлорида натрия и 10 мМ имидазола. Несвязанные и слабосвязанные белки вымывались с помощью 60 мМ имидазола, содержащимися в буфере. Тогда меченный гистидином фермент ЫиВ был извлечен из адсорбента с помощью содержащихся 160 мМ имидазола. Активные частицы были диализированы накануне вечером по отношению к 50 мМ буфера фосфата калия, рН 7,5. Фермент хранился при 4°С в 50 мМ буфера фосфата калия, рН 7,5, содержащего 10% глицерина и 1 мМ 2-меркаптоэтанола, чтобы усилить длительную стабильность фермента.

Гидролитическая дегалогенизация, катализированная дегалогеназом галоалкана (дикий тип или модифицированный) конвертирует токсичный иприт в нетоксический бис(2-гидроксиэтил)сульфид. Гидролитическая дегалогенизация иприта была катализирована с помощью дегалогеназа галоалкана при 37°С в 50 мМ буфере фосфата (рН 7,5; скорректированная с помощью добавления 1М раствора ΝαΟΗ). Иприт был добавлен в буфер реакции к финальной концентрации 94,3 мг.л^-1 иприта в буфер. Реакция была инициирована с помощью добавления раствора фермента ЫиВ (50 мМ буфера фосфата калия рН 7,5; от 1 х 10^-5 до 1 х 10^-4 моль.л^-1 дегалогеназа галоалкана ЫиВ, 10% объема глицерина и 1 ммоль.л^-1 2меркаптоэтанол). Действие дегалогеназа галоалкана приводит к быстрой и полной дегазации иприта. Кинетика реакции показана на фигуре, которая отображает химическое превращение иприта с помощью дегалогеназа галоалкана ЫиВ. Естественный гидролиз иприта без фермента кс = 0,0046 с^-1 (пустые циклы) и расщепление иприта в присутствии дегалогеназа галоалкана ЫиВ кса1/К_т = 6,9 с^-1 мМ^-1 (черный/заполненные циклы).

Каталитическая активность/производительность дегалогеназа галоалкана ЫиВ при дегазации иприта составляет к_са1/К_т= 6,9 с^-1 мМ^-1.

- 4 011311

Последовательность 1 и 2. Последовательность гена ίίπΒ и дегалогеназ галоалкана ЬтБ выделенный из бактерии 8рЫпдошопаз раишшоЬШз ϋΤ26.

а!д аде с!с ддс дса аад сса !й ддс дад аад ааа йс ай дад а!с аад ддс сдд сдс а!д дсс

1а1 а!с да! даа ддд асе ддс да! ссд а!с с!с йс сад сас ддс аа! ссд асд !сд !сс !а! с!д !дд сдс аа!

а!с а!д ссд са! !дс дсс ддд с!д дда сдд с!д а!с дсс !д! дас с!д а!с ддс а!д ддс да! !сд дас аад с!с да! ссд !сд ддд ссс дад сд! ТаТ дсс !а! дсс дад са! сд! дас !а! с!с дас дед с!д !дд дад дед с!с да! с!с ддд дас адд дй дй с!д д!с д!д са! дас !дд ддд !сс дсс с!с ддс йс дас !дд дсс сдс сдс сас сдс дад сд! д!а сад ддд ай дсс Та! а!д даа дед а!с дсс а!д ссд а!с даа !дд дед да! й! ссс даа сад да! сдс да! с!д й! сад дсс !й сдс Тед сад дед ддс даа даа йд дТд йд сад дас аа! дй й! д!с даа саа дй с!с ссс дда йд а!с с!д сдс ссс йа аде даа дед дад а!д дсс дсс ТаТ сдс дад ссс йс с!с дсс дсс ддс даа дсс сд! еда ссд асе с!д !сТ !дд сс! сдс саа а!с ссд а!с дса ддс асе ссд дсс дас д!д д!с дед а!с дсс сдд дас !а! дсс ддс !дд с!с аде даа аде ссд ай ссд ааа с!с йс а!с аас дсс дад ссд дда дсс с!д асе асд ддс еда а!д сдс дас йс !дс сдс аса !дд сса аас сад асе даа а!с асд д!с дса ддс дсс са! йс а!с сад дад дас ад! ссд дас дад ай ддс дед дед ай дед дед !й д!с сдд еда йд сдс сса дса !аа

ΜδΕ(}ΑΚΡΕΟΕΚΚΕΙΕΙΚΌΚΚΜΑΥΙΠΕ6ΊΌΟΡΙΕΓζ)ΗΕτΝΡΤ88ΥΕ\νΚΝ[ΜΡΗΕΑ

ΟΕΠΚΕΙΑΟΟΕΙΟΜΟΟδΟΚΕΟΡδΟΡΕΚΥΑΥΑΕΗΚΟΥΕΟΑΕλνΕΑΕΟΕΟΟΚννΕννΗΟ

ΨΠδΑΕΟΕΟΨΑΚΚΗΚΕΚνρΠΙΑΥΜΕΑΙΑΜΡΙΕΨΑΟΕΡΕρΟΚΟΕΕί^ΑΓΚδρΑΟΕΕΕνΕ ρΟΝνΕνΕρνΕΡΟΕΙΕΚΡΕδΕΑΕΜΑΑΥΚΕΡΕΕΑΑΟΕΑΚΚΡΤΕδλνΡΚρίΡΙΑΟΤΡΑϋννΑ ΙΑ№ΥΑΠΨΕ8Ε8ΡΙΡΚΕΕΙΝΑΕΡσΑΕΤΤΟΚΜΚΟΕΕΚΤΨΡΝρΤΕΙΤνΑσΑΗΓ^ΕΌ8ΡΟ

ЕЮАА1ААГУККЕКРА

Пример 2.

Для того чтобы перепроизводить дегалогеназ галоалкана фермента ОЬаА из КЕойососсиз гйойосйгоиз ΝΟΙΜΒ 13064 (Последовательность 3 и 4), соответствующий ген был клонирован в векторе р.Ар\, который содержит стимулятор !ас (Р_1ас) под контролем 1ас1^ч ЕзсЕепсЫа сой ΒΕ21, содержащая плазмиду ρΑρΝ была культивирована в 250 мл жидкой среды Лурия (Еипа) при 37°С. Индукция синтеза фермента была инициирована с помощью добавления изопропила-З-И-тиогалактопиранозид к финальной концентрации 0,5 мМ, когда культура достигает оптической плотности 0,6 при 600 нм. После индукции культура была инкубирована при 30°С в течение 4 ч, а тогда собрали ее урожай. Клетки были разрушены ультразвуком с использованием 8ошргер 150 (Компания 8апуо, Великобритания). Надосадочная жидкость использовалась после центрифугирования при 100 000 г в течение 1 ч. Дегалогеназ галоалкана был очищен на Νί-ΝΤΑ колонка Церофароза НК 16/10 (Компания Р1адеп, Германия). Меченный гистидином дегалогеназ галоалкана был прикреплен к смоле, размещенной на уравновешивающем буфере, который содержал 20 мМ буфера фосфата калия рН 7,5, 0,5 Μ хлорида натрия и 10 мМ имидазола. Несвязанные и слабосвязанные белки вымывались с помощью 60 мМ имидазола, содержащимися в буфере. Тогда меченный гистидином дегалогеназ галоалкана был извлечен из адсорбента с помощью содержащихся 160 мМ имидазола. Активные частицы были диализированы накануне вечером по отношению к 50 мМ буфера фосфата калия, рН 7,5. Фермент хранился при 4°С в 50 мМ буфера фосфата калия, рН 7,5, содержащего 10% глицерина и 1 мМ 2-меркаптоэтанола, чтобы усилить длительную стабильность фермента.

Дегалогеназ галоалкана ИЕаА фермента или его разновидность являются частью дегазационного состава, который содержит вышеуказанный фермент при концентрации от 1 х 10^-6 до 1 х 10^-4 моль. л^-1, далее от 1 до 5% объема алифатического гидрокарбоната общей формулы СпН2п+2 или циклический алифатический гидрокарбонат общей формулы СпН2п, где п - это от 6 до 12, далее от 5 до 20% объема алифатического спирта общей формулы СпН2п+1ОН, где п - это от 2 до 4, далее от 3 до 15% веса поверхностноактивного вещества аниона общей формулы СпН2п+1О8О3Ме, где п - это от 10 до 16 и Ме обозначает контрион (Ха', К⁺ или аммоний моноэтанола), от 1 до 10% веса алкилбензолсульфоната общей формулы К⁽³⁾-(Аг)8О3Ме⁺, где К⁽³⁾ обозначает алифатический одноатомный радикал 11-13 атомами углерода, и Ме⁺ обозначает ион натрия, далее компоненты буфера глицина, чтобы корректировать рН водного раствора в диапазоне от 7 до 9, или иначе глицин общей концентрации 0.1 моль.л^-1, и т.д. Необходимый рН 8.2 дос

- 5 011311 тигается с помощью добавления 1М ΝαΟΗ. Остальное до полных 100% необходимо добавить воды. Каталитическая способность дегалогеназа галоалкана 1)ЬаА при дегазации иприта составляет к_са1/К_т= 5.7 з^-1 мМ^-1.

Последовательность 3 и 4. Последовательность гена сПта.А и дегалогеназа галоалкана ОЬа.А, выделенный из бактерии КНобососсиз гНобосНгоиз Ν0ΙΜΒ 13064.

а!д !са даа а!с дд! аса ддс Йс ссс йс дас ссс са! !а! д!д даа д!с с!д ддс дад сд! а!д сас !ас д!с да! дй дда ссд едд да! ддс асд сс! д!д с!д йс с!д сас дд! аас ссд асе !сд !сс 1ас с!д !дд сдс аас а!с а!с ссд са! д!а дса ссд ад! са! едд !дс ай дс! сса дас с!д а!с ддд а!д дда ааа !сд дас ааа сса дас с!с да! !а! йс йс дас дас сас д!с сдс !ас с!с да! дсс йс а!с даа дсс йд дд! йд даа дад д!с д!с с!д д!с а!с сас дас !дд ддс !са дс! с!с дда йс сас !дд дсс аад сдс аа! ссд даа едд д!с ааа дд! ай дса !д! а!д даа йс а!с едд сс! а!с ссд асд !дд дас даа !дд ссд даа йс дсс сд! дад асе йс сад дсс йс едд асе дсс дас д!с ддс еда дад йд а!с а!с да! сад аас дс! йс а!с дад дд! дед с!с ссд ааа !дс д!с д!с сд! ссд ей асд дад д!с дад а!д дас сас !а! сдс дад ссс йс с!с аад сс! дй дас еда дад сса с!д !дд еда йс ссс аас дад с!д ссс а!с дсс дд! дад ссс дед аас а!с д!с дед с!с д!с дад дса !ас а!д аас !дд с!д сас сад !са сс! д!с ссд аад йд йд йс !дд ддс аса ссс ддс д!а с!д а!с ссс ссд дсс даа дсс дед ада ей дсс даа аде с!с ссс аас !дс аад аса д!д дас а!с ддс ссд дда йд сас !ас с!с сад даа дас аас ссд дас ей а!с ддс ад! дад а!с дед сдс !дд с!с ссс дса с!с !ад

Μ8ΕΙ0Τ0ΡΡΡ0ΡΗΥνΕνΕ0ΕΚΜΗΥν0ν0ΡΚ00ΤΡνΕΡΕΗ0ΝΡΤ88ΥΕΨΚΝΙΙΡ

ΗνΑΡδΗΚΟΙΑΡΟΕΙΟΜΟΚδΟΚΡΟΕΟΥΡΡΟΟΗνΚΥΕΟΑΡΙΕΑΕΟΕΕΕννΕνίΗΟΨΟδΑ

ΕΟΡΗλνΑΚΚΝΡΕΚνΚΟΙΑΟΜΕΡΙΚΡΙΡΤλνϋΕλνΡΕΡΑΚΕΤΡΟΑΡΚΤΑΟνΟΚΕΕΙΙΟΟΝΑΡ ΙΕΟΑΕΡΚΟννΚΡΕΤΕνΕΜΟΗΥΚΕΡΡΕΚΡνΟΚΕΡΕλνΚΡΡΝΕΕΡΙΑΟΕΡΑΝίνΑΕνΕΑΥ ΜΝΥΉΗΟδΡνΡΚΕΕΡΥ'ΟΤΡΟνΕΙΡΡΑΕΑΑΚΕΑΕδΡΡΝί'ΚΓνΟΙΟΡΟΕΗΥΕΟΕΠΝΡΟΕΙ О8Е1АКАУЬРАЬ

Пример 3.

Для того чтобы перепроизводить дегалогеназ галоалкана 1)тЬА фермента из МусоЬас!етшт Ьоу1з 5033/66 (Последовательность 5 и 6), нужно повторить процесс, описанный в примере 1. Дегалогеназ галоалкана 1)тЬА фермента или его разновидность является частью дегазационного состава, который содержит вышеуказанный фермент с концентрацией от 1 х 10^-6 до 1 х 10^-4 моль. л^-1, далее от 1 до 20% объема алифатического спирта общей формулы СпН2п+1ОН, где η - это от 2 до 4, далее от 3 до 15 вес.% поверхностно-активного вещества аниона общей формулы СпН2п+1О8О3Ме, где η - это от 10 до 16 и Ме обозначает контрион (Ν'π', К⁺ или моноэтанол аммоний), от 1 до 10% веса этоксинонилфенол общей формулы С9Н19-Ат-О-(С₂Н₄О)_пН, где п - это от 9 до 10, далее компоненты буфера глицина, чтобы откорректировать рН водного раствора в диапазоне от 7 до 9, или глицин общей концентрацией 0,1 моль. л^-1, и т.д. Необходимая рН среда достигается с помощью добавления 1М №ОН. А дальше до 100% необходимо добавить воды. Каталитическая сила дегалогеназа галоалкана 1)тЬА при дегазации иприта составляет к_са1/К_т = 6.0 с^-1 мМ^-1.

- 6 011311

Последовательность 5 и 6. Последовательность гена дшЬЛ и дегалогеназ галоалкана ИтЬА, выделенный из бактерии МусоЬас!егшт Ьоу18 5033/66.

а!д аса дса Не ддс д!с дад ссс !ас ддд сад ссд аад !ас с!а даа а!с дсс ддд аад сдс а!д дед !а! а!с дас даа ддс аад дд! дас дсс а!с д!с !й сад сас ддс аас ссс асд !сд !с! !ас йд Тдд еде аас а!с а!д ссд сас йд даа ддд с!д ддс едд с!д д!д дсс !дс да! с!д а!с ддд а!д ддс дед !сд дас аад с!с аде сса !сд дда ссс дас сдс 1а! аде !а! ддс дад саа еда дас !й йд Не дед с!с !дд да! дед с!с дас с!с ддс дас сас д!д д!а с!д д!д с!д сас дас !дд ддс !сд дед с!с ддс йс дас !дд де! аас сад са! сдс дас еда д!д сад ддд а!с дед йс а!д даа дед а!с д!с асе сед а!д асд !дд дед дас !дд сед сед дсс д!д едд дд! д!д йс сад дд! йс еда !сд сс! саа ддс дад сса а!д дед йд дад сас аас а!с й! д!с даа едд д!д с!д ссс ддд дед а!с с!д еда сад с!с аде дас дад даа а!д аас сас !а! едд едд сса йс д!д аас ддс ддс дад дас ед! сдс ссс асд йд !сд !дд сса еда аас ей сса а!с дас дд! дад ссс дсс дад д!с д!с дед йд д!с аас дад !ас едд аде !дд с!с дад даа асе дас а!д сед ааа с!д йс а!с аас дсс дад ссс ддс дед а!с а!с асе ддс сдс а!с ед! дас !а! д!с адд аде !дд ссс аас сад асе даа а!с аса д!д ссс ддс д!д са! йс дй сад дад дас аде сса дад даа а!с дд! дед дсс а!а дса сад йс д!с едд сад с!с едд !сд дед дсс ддс д!с !да

ΜΤΑΡσνΕΡΥΟρΡΚΥΕΕΙΑΟΚΚΜΑΥΙΟΕΟΚΟϋΑΐνΡρΗΟΝΡΤδδΥΕλνΚΝΙΜΡΗ РЕОЕСКЕУАСОЕ1СМС}А8ОКЕ8Р8СРОЕУ8УСЕ()ЕОНРРАЕ\УОАЕО1.ООНУУЕУЕН 1ЖС8АЕ6РО\УАН9НЕОКУР61АРМЕА1УТРМТ\УАО\¥РРАУК6УР(Х}РК8РРОЕР ΜΑΕΕΗΝΙΡνΕΚνΕΡσΑΙΕΚρΕδϋΕΕΜΝΗΥΚΚΡΡνΝΟσΕϋΚΚΡΤΕδλνΡΚΝΕΡΙϋΟΕΡΑ ΕννΑΕνΝΕΥΚδν/ΕΕΕΤΏΜΡΚΕΡΙΝΑΕΡΟΑΙΙΤΟΚΙΚϋΥνΚδΨΡΝρΤΕΙΤνΡσνΗΡνρΕ О8РЕЕЮАА1АРРУКРЕК.8ААОУ

Пример 4.

Дегалогеназ галоалкана БтВ фермента или его разновидность являются частью дегазационного состава, который содержит фермент при концентрации от 1 х 10^-6 до 1 х 10^-4 моль.л^-1, далее от 1 до 15 вес.% поверхностно-активного вещества аниона общей формулы СпН2п+1О8О3Ме, где η - от 10 до 16 и Ме обозначает контрион (\а', К⁺ или моноэтанол аммоний), от 1 до 10 вес.% этоксилированного нонилфенола общей формулы С9Н₁₉-Аг-О-(С₂Н₄О)_пН, где η - это от 9 до 10, дальнейшие компоненты буфера фосфата для корректировки рН среды водного раствора в диапазоне от 7 до 8.5; т.е. КН₂РО₄ а К₂НРО₄ в необходимой пропорции и при общей концентрации 50 ммоль. л^-1, и т.д. Остальное количество до 100% необходимо добавить воды.

Промышленное применение

Это изобретение применяется в промышленности для устранения иприта с поверхностей военной техники, транспортных средств, промышленной и сельскохозяйственной техники, технических приборов и конструктивных объектов, с кожи человека или животного и элементов окружающей среды, которые загрязнены этим высокотоксичным веществом, которое вызывает образование пузырей. Эта технология применяется в вооруженных силах и в войсках гражданской обороны, всюду, где есть необходимость использования дегазационных составов для дезактивации веществ, которые вызывают образование пузырей.

Claims (11)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ детоксикации иприта с использованием дегалогеназов галоалкана, отличающийся тем, что вышеуказанный иприт обрабатывается по крайней мере одним дегалогеназом галоалкана, избранным из группы ферментов КФ 3.8.1.5, при концентрации фермента от 1х10^-6 до 1х10⁰ моль-л^-1, при температуре от 10 до 70°С и рН от 4 до 12 в жидкой среде.
2. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что дегалогеназ галоалкана является по крайней мере одним ферментом, выбранным из группы, которая включает дегалогеназы Ι,ίιιΒ из ЗрЫпдотопаз раищтоЬШз иТ26 (последовательности 1 и 2), ИйаА из Кйобососсиз гобосйгоиз \С1МВ 13064 (последовательности 3 и 4), ИтЬА из МусоЬас!егшт Ьоущ 5033/66 (последовательности 5 и 6).
3. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что дегалогеназ галоалкана является диким типом дегалогеназа галоалкана или модифицированным полипептидом с активностью дегалогеназа галоалкана, который имеет последовательность аминокислоты, которая по крайней мере на 80% соответствует последовательности 2, 4 или 6 или смеси дегалогеназа галоалкана дикого типа и модифицированного полипептида.

   - 7 011311
4. 4. Способ по п 1 или 2, отличающийся тем, что дегалогеназ галоалкана является диким типом дегалогеназа галоалкана или модифицированным полипептидом с активностью дегалогеназа галоалкана, который имеет последовательность аминокислоты, которая по крайней мере на 90% соответствует последовательности 2, 4 или 6 или смеси дегалогеназа галоалкана дикого типа и модифицированного полипептида.
5. 5. Способ по пп.1-4, отличающийся тем, что жидкая среда является органическим растворителем, моно-фазным водным раствором органического растворителя или двухфазной системой, состоящей из органического раствора и воды.
6. 6. Способ по п.5, отличающийся тем, что раствор дегалогеназа галоалкана включает буферную систему.
7. 7. Способ по пп.1-6, отличающийся тем, что подготовка дегалогеназа галоалкана происходит в присутствии по крайней мере одного белкового стабилизатора, выбранного из группы, состоящей из полиспиртов, неактивных белков, полимеров.
8. 8. Способ по пп.1-7, отличающийся тем, что фермент дегалогеназа галоалкана используется в качестве растворимой формы, или в качестве кристаллизированной формы, или в качестве лиофилизированной формы, или в качестве осажденной формы.
9. 9. Способ по пп.1-8, отличающийся тем, что фермент дегалогеназа галоалкана иммобилизируется с помощью поглощения, с помощью ионной связи или с помощью ковалентного воздействия на поверхности органического или неорганического носителя.
10. 10. Способ по пп.1-8, отличающийся тем, что фермент дегалогеназа галоалкана иммобилизируется с помощью молекулярной связи или включения фермента в твердую матрицу или в клетку, ограниченную мембраной.
11. 11. Способ по пп.1-10, отличающийся тем, что детоксикация происходит в присутствии поверхностно-активных веществ.