JP4762552B2 - 診断用および治療用標的としてのｓｇｋ１ - Google Patents

Description

本発明は、ｓｇｋ１（血清および糖質コルチコイド依存性キナーゼ１）を診断目的で検出するための物質の使用、およびＴＦ（組織因子）の妨げられた活性に関係する疾患の治療的処置のためにｓｇｋ１に影響を与えるための活性化合物の使用、さらに、それに関連する診断用キットに関する。

細胞がその環境の中で受ける数多くの外来性シグナルは、これらのシグナルが原形質膜およびその受容体から細胞質および細胞核内へ迅速かつ可逆的に伝達されることを目的として、細胞内リン酸化／脱リン酸化カスケードを引き起こす。これらのカスケードに関与する個々の蛋白質の調節のみが、細胞の高度な特異性と柔軟性を可能にし、そしてこの特異性と柔軟性は、細胞が細胞外のシグナルに非常に迅速に反応することを可能にしている。特に、これらの調節プロセスに関与するのは、キナーゼ、すなわち、リン酸基を個々の物質に転移させる蛋白質である。血清および糖質コルチコイド依存性キナーゼ（ｓｇｋ）は、当初は、ラット乳癌細胞からクローニングされた（Ｗｅｂｓｔｅｒ ＭＫ、Ｇｏｙａ Ｌ、Ｆｉｒｅｓｔｏｎｅ ＧＬ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（１６）：１１４８２〜１１４８５頁、１９９３年；Ｗｅｂｓｔｅｒ ＭＫ、Ｇｏｙａ Ｌ、Ｇｅ Ｙ、Ｍａｉｙａｒ ＡＣ、Ｆｉｒｅｓｔｏｎｅ ＧＬ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３（４）：２０３１〜２０４０頁、１９９３年）。ヒトのキナーゼｈｓｇｋは、細胞容積によって調節される遺伝子として肝臓細胞からクローニングされた（Ｗａｌｄｅｇｇｅｒ Ｓ、Ｂａｒｔｈ Ｐ、Ｒａｂｅｒ Ｇ、Ｌａｎｇ Ｆ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：４４４０〜４４４５頁、１９９７年）。ラットのキナーゼ（Ｃｈｅｎ ＳＹ、Ｂｈａｒｇａｖａ Ａ、Ｍａｓｔｒｏｂｅｒａｒｄｉｎｏ Ｌ、Ｍｅｉｊｅｒ ＯＣ、Ｗａｎｇ Ｊ、Ｂｕｓｅ Ｐ、Ｆｉｒｅｓｔｏｎｅ ＧＬ、Ｖｅｒｒｅｙ Ｆ、Ｐｅａｒｃｅ Ｄ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：２５１４〜２５１９頁、１９９９年；Ｎａｒａｙ−Ｆｅｊｅｓ−Ｔｏｔｈ Ａ、Ｃａｎｅｓｓａ Ｃ、Ｃｌｅａｖｅｌａｎｄ ＥＳ、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｇ、Ｆｅｊｅｓ−Ｔｏｔｈ Ｇ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１６９７３〜１６９７８頁、１９９９年）は、上皮のＮａ⁺チャンネル（ＥＮａＣ）を刺激することが見出された。さらに、ＥＮａＣの活性の増大に高血圧症がともなうこと（Ｗａｒｎｏｃｋ ＤＧ．、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｄ．５３（１）：１８２４頁、１９９８年）が示された。

ＤＥ１９７ ０８ １７３では、ｈｓｇｋ１は、高ナトリウム血症、低ナトリウム血症、真性糖尿病、腎不全、異化亢進、肝性脳症、および微生物性またはウイルス性の感染症のような、細胞容積の変化によって病態生理学的に影響される多くの疾患に関係したかなりの診断用の可能性を有していることが示された。

ＤＥ１９９ １７ ９９０は、スタウロスポリン、ケレリトリンまたはトランスドミナントに阻害性のキナーゼのような、細胞容積依存性の疾患の治療に用いることができるキナーゼ阻害剤について記述している。

ｈｓｇｋはまた脳でも発現され（Ｗａｌｄｅｇｇｅｒ Ｓ、Ｂａｒｔｈ Ｐ、Ｒａｂｅｒ Ｇ、Ｌａｎｇ Ｆ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：４４４０〜４４４５頁、１９９７年）、脳においてＫｖ１．３電圧依存性のＫ⁺チャンネルを調節する。これらＫｖ１．３型のＫ⁺チャンネルは、ニューロンの興奮性を調節することに関与し（Ｐｏｎｇｓ Ｏ．、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．７２：６９〜８８頁、１９９２年）、細胞増殖を調節することに関与し（Ｃａｈａｌａｎ ＭＤとＣｈａｎｄｙ ＫＧ．、Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．８（６）：７４９〜７５６頁、１９９７年）、さらにアポトーシスの細胞死を調節することに関与する（Ｓｚａｂｏ Ｉ、Ｇｕｌｂｉｎｓ Ｅ、Ａｐｆｅｌ Ｈ、Ｚｈａｎ Ｘ、Ｂａｒｔｈ Ｐ、Ｂｕｓｃｈ ＡＥ、Ｓｃｈｌｏｔｔｍａｎｎ Ｋ、Ｐｏｎｇｓ Ｏ、Ｌａｎｇ Ｆ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２０４６５〜２０４６９頁、１９９９年；Ｌａｎｇ Ｆ、Ｓｚａｂｏ Ｉ、Ｌｅｐｐｌｅ−Ｗｉｅｎｈｕｅｓ Ａ、Ｓｉｅｍｅｎ Ｄ、Ｇｕｌｂｉｎｓ Ｅ．、Ｎｅｗｓ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃｉ．１４：１９４〜２００頁、１９９９年）ことが示された。Ｋｖ１．３はまた、リンパ球の増殖と機能を調節することにおいて重要である（Ｃａｈａｌａｎ ＭＤとＣｈａｎｄｙ ＫＧ、Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．８（６）：７４９〜７５６頁、１９９７年）。ｓｇｋファミリーの他の二つの構成要素、すなわち、ｓｇｋ２とｓｇｋ３がクローニングされている（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｔ、Ｄｅａｋ Ｍ、Ｍｏｒｒｉｃｅ Ｎ、Ｃｏｈｅｎ Ｐ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３４４：１８９〜１９７頁、１９９９年）。さらに、ｓｇｋｓは、転写段階および転写後段階で調節されうるセリン−スレオニン蛋白質キナーゼファミリーを形成することが見出されている。ｓｇｋ１と同様、ｓｇｋ２とｓｇｋ３も、例えば、インシュリンおよびＩＧＦ１によってＰ１３キナーゼ経路を介して活性化される。しかし、これまでのところ、ｓｇｋ蛋白質ファミリーの特性は完全には決定されていない。

それゆえに、本発明は、新規の診断上および治療上の適用のためにｓｇｋ１を利用するという目的に基づいている。

驚くべきことに、無処置のｓｇｋ１の過剰発現は、不活性ｓｇｋ１の発現に比較して、凝固活性の増大を起こすことを示すことが可能となった。この実験系では、凝固は組織因子（Ｔｉｓｓｕｅ Ｆａｃｔｏｒ：ＴＦ）によって誘発された。ＴＦは、血管細胞または単核細胞と止血系との間の主要な連結リンクとして働く４７ｋＤａの膜貫通糖蛋白質である。このように作用する際に、ＴＦは血液凝固カスケードを開始する（Ｄａｖｉｅ ＥＷ、Ｆｕｊｉｋａｗａ Ｋ、Ｋｉｓｉｅｌ Ｗ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１０３６３〜１０３７０頁、１９９１年）。ＴＦは、第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子に高い親和性で結合することによって血液凝固を開始する。結果として得られる複合体は、第ＩＸおよびＸ因子の活性化を開始し、この後にトロンビンの産生が続く。トロンビンは、その役割として、フィブリノーゲンからフィブリンへの変換を触媒し、フィブリンの析出および血液凝固を起こす（Ｎｅｍｅｒｓｏｎ Ｙ．、Ｂｌｏｏｄ ７１：１〜８頁、１９９８年）。

ＴＦの発現の増大は、必ずしもＴＦの生物活性の増大に関連してはいない。機能的に活性なＴＦは、細胞表面での生物学的に活性な形態の発現に依存する。血管平滑筋細胞（ＳＭＣｓ）および単球においては、細胞にあるＴＦの全量の１０〜２０％のみが、上記生物学的に活性な形態を構成するが、これだけが細胞表面で利用可能であり、残りのＴＦは、細胞内部の貯蔵箇所に存在し（約３０％）、また潜在的な表面のＴＦとしても存在する（５０〜６０％）（Ｐｒｅｉｓｓｎｅｒ ＫＴ、Ｎａｗｒｏｔｈ ＰＰ、Ｋａｎｓｅ ＳＭ．、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９０：３６０〜３７２頁、２０００年；Ｓｃｈｅｃｔｅｒ ＡＤ、Ｇｉｅｓｅｎ ＰＬ、Ｔａｂｙ Ｏ、Ｒｏｓｅｎｆｉｅｌｄ ＣＬ、Ｒｏｓｓｉｋｈｉｎａ Ｍ、Ｆｙｆｅ ＢＳ、Ｋｏｈｔｚ ＤＳ、Ｆａｌｌｏｎ ＪＴ、Ｎｅｍｅｒｓｏｎ Ｙ、Ｔａｕｂｍａｎｎ ＭＢ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ：１００：２２７６〜２２８５頁、１９９７年）。その凝固作用（Ｒｕｅｆ Ｊ、Ｈｕ ＺＹ、Ｙｉｎ ＬＹ、Ｗｕ Ｙ、Ｈａｎｓｏｎ ＳＲ、Ｋｅｌｌｙ ＡＢ、Ｈａｒｋｅｒ ＬＡ、Ｒａｏ ＧＮ、Ｒｕｎｇｅ ＭＳ、Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ、Ｃ．Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．：２４〜３３頁、１９９７年）に加えて、ＴＦは腫瘍の転移および血管新生においても重要な役割をはたすことが示されている（Ｌｗａｌｅｅｄ ＢＡとＣｏｏｐｅｒ ＡＪ．、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ．５５：４７０〜４７３頁、２０００年；Ｖｅｒｈｅｕｌ ＨＭＷ、Ｊｏｒｎａ ＡＳ、Ｈｏｅｋｍａｎ Ｋ、Ｂｒｏｘｔｅｒｍａｎ ＨＪ、Ｇｅｂｂｉｎｋ ＭＦＢＧ、Ｐｉｎｅｄｏ ＨＭ．、Ｂｌｏｏｄ：４２１６〜４２２１頁、２０００年）。このように、これまでに見出された機能的なデータは、ｓｇｋ１の作用が、細胞膜でのＴＦの発現および／または機能に影響を与えること、ならびにそれによって血液の凝固性、腫瘍細胞の粘着とその後の転移、血管新生、さらには血管新生がある役割をはたす疾患に対して間接的に影響を与えるのに適していることを示す。ｓｇｋ１の刺激は、組織因子の発現を増大させ、一方で、ｓｇｋ１の阻害は、活性な組織因子の発現を低下させる。したがって、ｓｇｋ１は上述の徴候に対して刺激的または阻害的に間接的な影響を与えることが可能である。

（発明の開示）
したがって、本発明における目的は、独立請求項１、６、７、２２、２６および２８の主題によって達成される。好ましい実施形態が従属請求項で特定されている。これにより、これら請求項全ての内容は、これらを参照することによって明細書中に組み入れられる。

本発明によれば、少なくとも１種の物質を、真核生物細胞内でのｓｇｋ１の発現および／または機能を検出するために用いることができる。したがって、このことは、特に、ＴＦの活性の乱れと関係がある疾患を診断することも可能にする。この物質は、例えば、ｓｇｋ１を対象とし、かつ当業者に既知のＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着剤検定）のような検出方法において採用できる抗体でもよい。そのような免疫検定において、測定すべき抗原（ｓｇｋ１）に対する特定の抗体（あるいは、抗体測定の場合には相同の試験抗原）を、担体物質（例えばセルロースまたはポリスチレン）に結合し、そして、その上に、試料とのインキュベーションを経て免疫複合体が形成される。続くステップで、標識した抗体をこれらの免疫複合体に添加する。この免疫複合体が結合した酵素基質複合体は、反応混合物に発色性基質を添加することによって可視化することができ、また、試料中の抗原濃度は、免疫複合体結合マーカー酵素の光度定量測定により、既知の酵素活性の標準値と比較することによって、測定することができる。

診断用の検出に使用できる他の物質はオリゴヌクレオチドであり、これは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、選択的に決定したＤＮＡセグメントが増幅される分子遺伝学的方法によってｓｇｋ１を定量的に検出するのに適している。

別の好ましい実施形態では、本発明による用途で用いられる物質は、ストリンジェントな条件下でｓｇｋ１とハイブリッド形成することができるポリヌクレオチドである。これらのポリヌクレオチドは、例えば、ｓｇｋ１のＤＮＡまたはＲＮＡの含有量を測定するためにサザンまたはノーザンブロットを実行するために、用いることができる。当業者ならば、適切な方法をよく知っている。ｓｇｋ１の転写速度は、例えば、このようにして解析することができる。

本発明による用途の特に好ましい実施形態では、上記物質、すなわち特に、抗体、オリゴヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチドは、ｓｇｋ１における変異を検出するために適している。興味深いことに、ｓｇｋ１におけるある変異がキナーゼの発現および／または活性の増大に関連していることが見出された。このことは、特に、２個のヌクレオチド多型（ＳＮＰｓ）の場合に観察される。これらのヌクレオチド多型は、ヒトｓｇｋ１においては最初に第６イントロン（Ｔ→Ｃ）そして第８エクソン（Ｃ→Ｔ）に位置している。これについてはは、読者は、ＷＯ０２／０７４９８７を参照していただきたい。該文献には、これらヌクレオチド多型が、高血圧症の遺伝的素因に関係していることが示されている。同様の知見が、他の変異の場合でも得られており、特に、挿入変異の場合に得られる。したがって本発明は、ｓｇｋ１の発現および／または活性の増大に関係する対応変異を検出し、このようにして、ＴＦの活性障害に関係する疾患の診断のために結論を出すことができるように、適当な抗体、オリゴヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチドを使うことを想定している。当業者には、上述の用途に使用される方法論的な手法はなじみのものである。ｓｇｋ１の発現および／または機能を定量的に検出できる他の方法は、当業者には明らかであり、そして、これも同様に本発明に包含される。

本発明は、ＴＦの活性障害に関係する疾患を治療することを目的とした、真核生物細胞におけるｓｇｋ１の発現および／または機能に対して影響を与える、特に阻害または活性化するための活性化合物を請求する。ｓｇｋ１は、ｓｇｋ２やｓｇｋ３と同様にキナーゼであるので、スタウロスポリン、ケレリトリンなどの当業者に知られているキナーゼ阻害剤は、特にトランスドミナントにネガティブなキナーゼ変異体などの他の物質と同様に検討できる。当業者はこれらの物質をよく知っており、それらの物質は、商業的（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍなど）および非商業的な供給元から得ることができる。使用できる活性化剤の例は、例えば、ｓｇｋ１の組換え的に改変した変異体、およびホスファターゼの阻害剤である。当業者はまた、ホスファターゼ阻害剤をよく知っており、それらの幾つかは同様に、商業的（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍなど）および非商業的に入手可能である。ホスファターゼ阻害剤を使用すると、脱リン酸化を阻害し、その結果、ｓｇｋ１に活性化された標的（ＴＦ）が活性化状態にとどまるであろう。医薬品または製薬組成物を生産するために、これらの活性化合物を使用することが好ましい。

本発明の他の好ましい実施形態では、上記活性化合物はｓｇｋ１自体を対象とする。上記活性化合物は、例えば、アンチセンス配列、いわゆるキナーゼ欠損変異体、または、スタウロスポリンおよび／またはケレリトリン、またはそれらの類似体などの他のキナーゼ阻害剤でもよく、これらは既に上述した。さらに活性化合物は、いわゆる低分子化合物や、ｓｇｋ１の発現に対して影響を与える、好ましくは、阻害または活性化するペプチドをコードしているポリヌクレオチドでもよい。

本発明の他の好ましい実施形態では、上記活性化合物は、ｓｇｋ１の活性化剤、阻害剤、調節剤および／または生物学的前駆体を対象とする。これら活性化剤、阻害剤、調節剤および／または生物学的前駆体は、上流および／または下流に位置するｓｇｋ１シグナル伝達カスケードの構成要素、ｓｇｋ１の発現のレベルに関わる転写因子、ｓｇｋ１の活性化剤、阻害剤、調節剤および／または生物学的前駆体の蛋白質分解のためプロテアーゼ、または、活性化合物に影響されかつｓｇｋ１の発現および／または機能に関与する今までに知られていない分子でもよい。

本発明によれば、既知の活性化合物およびまだ知られていない活性化合物を使用することが可能である。特に好ましい実施形態では、ｓｇｋ１の活性化剤、阻害剤、調節剤および／または生物学的前駆体を対象とする活性化合物は、いわゆる小分子化合物であり、特に、１０００未満の分子量（ＭＷ）を持つこの性質の化合物である。低分子化合物は、例えば、イミダゾール誘導体ＳＢ２０３５８０（ＭＷ：３７７．４）またはＳＢ２０２１９０（ＭＷ：３３１．３）のようなキナーゼ阻害剤でもよく、両者とも既知のキナーゼ発現阻害剤であり、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍによって市販されている。

本発明は、ＴＦの活性障害に関係するあらゆる形態の疾患を治療するために使用される。これについては、遺伝性または後天性の凝固障害（ｃｏａｇｕｌｏｐａｔｈｉｅｓ）および／または血管障害（ａｎｇｉｏｐａｔｈｉｅｓ）が、特に考慮される。凝固障害は、一般に凝固の撹乱を意味するものとして理解される。遺伝性の凝固障害（いわゆる欠陥凝固障害）は、異常フィブリノーゲン血症、低プロコンバーチン血症、血友病Ｂ、スチュアート−プロワー欠乏症、などである。後天性の凝固障害の例は、プロトロンビン複合体欠乏、消費性凝固障害、線溶亢進、免疫凝固障害および複合凝固障害である。両方の形態の凝固障害は、多様な原形質性凝固因子の欠乏または機能的な撹乱によって引き起こされる。様々な総体的症状にしたがって、出血傾向を持つ凝固障害（負の凝固障害）と血栓傾向を持つ凝固障害（正の凝固障害）とを区別するとともに、原因の部位に応じて、肝性、心原性および免疫性の凝固障害を区別する。したがって、ｓｇｋ１を活性化または阻害することによって、血液が凝固する性質を、低減または増大することができ、それによって医療適用に適合させることができる。同様の考慮は、血管障害、すなわち糖尿病性血管障害、糖尿病性微小血管障害、肺性高血圧（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）、動脈硬化（ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）などのような、血管性疾患という包括的用語の下にまとめられる疾患にも適用される。この場合も、特に、遺伝性および／または後天性の血管障害の処置のために、上記活性化合物を用いることができる。

特に好ましい実施形態では、肺性高血圧および／または動脈硬化を検出するための物質またはこれらを処置するための活性化合物が使用される。

他の好ましい実施形態では、活性化合物は、血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）を刺激または阻害するために用いられる。血管新生は、例えば、胚発生における、血管壁の発生として理解され、数多くの血管新生依存性疾患（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｉｓｅａｓｅｓ）が当業者には知られており、例えば、真性糖尿病、腫瘍形成および自己免疫疾患がある。他の好ましい実施形態では、活性化合物は、創傷治癒を刺激または阻害するために用いられる。

本発明はまた診断用キットに関する。このキットは、ＴＦの活性障害に関係する疾患を診断することを目的とした、ｓｇｋ１の発現および／または機能を検出するのに適した少なくとも１種の物質を含む。本発明による診断用キットは、特に、ｓｇｋ１の発現および／または機能を検出するための物質が、ｓｇｋ１に対する抗体、ｓｇｋ１のＤＮＡセグメントを増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応のためのオリゴヌクレオチド、および／またはストリンジェントな条件下でｓｇｋ１とハイブリッド形成することができるポリヌクレオチドであることを特徴とする。これについては、これらの物質を、変異の検出、特にｓｇｋ１の発現および／または活性の増大に関連するヌクレオチド多型および／または挿入（変異）の検出のために使用することは、格別好ましい。この点について、読者は上記の明細書を参照していただきたい。

さらに、ｓｇｋ１の過剰発現または過小発現または機能亢進または機能低下に関連した疾患を診断するためのキットを使用することが可能である。これらの診断用薬剤は、とりわけ、上述の凝固障害、血管障害、血管新生依存性疾患、創傷治癒の疾患などのような疾患を検出するために、診断用キットにおいて選択的に使うことができる。これについても、ｓｇｋ１の乱された発現および／または機能を検出することでその疾患を検出することができる。特に、この物質は、ヌクレオチドおよび／またはペプチドレベルまたはポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドレベルについての検出を可能にする物質であってもよい。そのような物質の付加的な特徴については、読者は、本明細書中の先の適切な記載を参照していただきたい。

これに加えて、本発明は、ＴＦの活性障害に関係する疾患を診断するための方法を包含する。これに関しては、ｓｇｋ１の発現および／または機能もしくは活性は、患者から取った生体試料において定量的に検出される。この生体試料は、例えば、血液や尿のような流体でも、例えば、細胞試料のような他のものでもよい。定量的な検出は、例えば、ｓｇｋ１に対する抗体の使用、ｓｇｋ１のＤＮＡセグメントを増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応に適したオリゴヌクレオチドの使用、ならびに／あるいは厳密な条件下でｓｇｋ１のＤＮＡおよび／またはｍＲＮＡとハイブリッド形成できるポリヌクレオチドの使用によって行う。

この方法では、ｓｇｋ１における特定の変異、特にヌクレオチド多型および／または挿入、これら特定の変異はｓｇｋ１の発現および／または機能または活性の増大に関係しているのだが、これらの変異を検出するために前記物質を使用することに、特に好ましさが与えられる。診断すべき疾患は、例えば、血液凝固障害に関係した疾患、または肺性高血圧や動脈硬化のような血管性の疾患である。

本発明はさらに、ｓｇｋ１の発現および／または機能に対して影響を与え、特に阻害または活性化する少なくとも１種の活性化合物を含み、好ましくは、適切な場合には、製薬用の賦形剤をも含む製薬組成物を包含する。これについては、活性化合物は、これまでに既に言及した、阻害剤のスタウロスポリン、ケレリトリン、ＳＢ２０３５８０およびＳＢ２０２１９０、あるいはそれらの類似体のようなキナーゼ阻害剤、またはその他の物質であってもよい。活性化合物はさらに、ｓｇｋ１の発現に対して影響を与え、好ましくは阻害または活性化するペプチド、好ましくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであってもよい。本発明によるポリペプチドの一例は、いわゆるキナーゼ欠損変異体である。標的蛋白質の組換え改変変異体が発現および／または機能に影響し得る他の例は、当業者によく知られており、数多くの教科書／参照文献さらには実験研究用の指示書（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ、Ｆｒｉｔｓｃｈ ＥＦ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ、１９９６年；Ｌｅｏｎａｒｄ Ｇ、Ｄａｖｉｓ ＰｈＤ、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｗ、Ｋｕｅｈｌ Ｍｄ、Ｊａｍｅｓ Ｆ、Ｂａｔｔｅｙ ＭＤ．、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、１９９５年）において見つけられる。本発明による活性化合物はさらに、いわゆる低分子化合物、好ましくは１０００未満の分子量（ＭＷ）を持つ低分子化合物であってもよい。さらに、活性化合物はまた、アンチセンス配列、すなわちｍＲＮＡと二本鎖二重鎖を形成し、それによって標的ポリペプチドの翻訳を阻害することができる配列であってもよい。ｓｇｋ１の配列そのものを、例えば、ベクターまたはプラスミドにその配列を組み込むことによって、過剰発現を達成するために使用することも可能であり、標的配列を前もって、例えばプロモーターなどの「キャリア」分子で修飾することも可能である。そのような化合物の付加的な特徴について、読者は本明細書中の適切な先の記述を参照していただきたい。

最後に、本発明は、ｓｇｋ１の活性化因子、阻害因子、調節因子および／または生物学的前駆体の発現および／または機能に対して影響を与え、特に阻害または活性化する少なくとも１種の活性化合物の有効量を含む製薬組成物を包含する。この製薬組成物は、適切な場合には、好ましくは製薬用の賦形剤をも含む。これらｓｇｋ１の活性化因子、阻害因子、調節因子および／または生物学的な前駆体は、例えば、ｓｇｋ１の活性の調節に関与する他のキナーゼや、ｓｇｋ１が発現されるときのレベルについて役割をはたす転写因子、さらに、伝達カスケードにおけるｓｇｋ１の他の既知の構成要素または今のところ未知の構成要素、さらに、既に上述した分子であってもよい。ｓｇｋ１の活性化因子、阻害因子、調節因子および／または生物学的な前駆体の発現に対して影響を与え、好ましくは阻害または活性化するペプチドをコードするポリヌクレオチドが、そのような組成物中に存在してもよい。また、好ましくは１０００未満の分子量（ＭＷ）を持ち、かつｓｇｋ１の活性化因子、阻害因子、調節因子および／または生物学的な前駆体を対象とし、かつこれについては、このキナーゼの発現および／または機能を阻害または活性化する、低分子化合物を使用することも可能である。そのような活性化合物の付加的な特徴については、読者は本明細書中の適切な先の記述を参照していただきたい。

本発明の現存および付加的な特徴は、従属請求項および図面と組み合わせて、好ましい実施形態に関する下記の記述から発生する。これについては、個々の特徴はそれぞれ個別に実現することができ、または、幾つかの特徴は互いに組み合わせて実現できる。

（実施例）
図１において、最高値の％で表した凝固促進活性を、カルシウム再添加後の時間に対してプロットしてある。図１に関わる実験において、ヒト血管平滑筋細胞（ＨＡＯＳＭＣ）の凝固促進活性は、カルシウム再添加した貧血小板血漿（ＰＰＰ）における凝固プロセス中のトロンビン形成を測定することによって測定した（Ｂｅｇｕｉｎ Ｓ、Ｌｉｄｈｏｕｔ Ｔ、Ｈｅｍｋｅｒ ＨＣ：Ｔｈｒｏｍ．Ｈａｅｍｏｓｔ．６１：２５〜２９頁、１９９８年）。このために、集密状態の血管平滑筋細胞を無血清培地で２４時間保ち、その後ＨＥＰＥＳタイロード溶液で３回洗い、その後にヒトＰＰＰでインキュベートした。トロンビンの形成は、インキュベーション培地に１６．７ｍＭのＣａＣｌ₂を添加することによって誘発した。それぞれの場合において、２０μｌの上清を１分から２分毎に取り除き、取り除いた容積中でのトロンビンの形成を、染料Ｓ−２２３８（Ｈａｅｍｏｃｈｒｏｍ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）を用いて測定した。光学濃度を、分光光度計（Ｕｖｉｋｏｎ、Ｃｏｎｔｒｏｎ−ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）において４０５ｎｍで測定した。平滑筋細胞における、表面凝固推進活性の膜結合組織因子の利用可能性への依存度を、ヒト組織因子に対する中和抗体（Ｍａｂ＃ ４５０８；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ；ＰＰＰへのカルシウム再添加前の２０分間にわたり１０μｇ／ｍｌ）を用いて示した。

図１に示すように、ヒト血管平滑筋細胞の凝固促進活性は、ＣａＣｌ₂を添加した後数分で増大した。この増大は、不活性キナーゼ（ｓｇｋ−ＭＴ）を発現させたときのほうが、正常なキナーゼ（ｓｇｋ−ＷＴ）を発現させたときよりも遅い。トロンビン（Ｔｈｒ）を追加で投与すると、予想通り、凝固促進活性の増大の加速を起こす。これについても、上記の作用は、無処置のキナーゼを発現している細胞におけるほうが、不活性の変異体を発現している細胞におけるよりも明白でかつ急速である。無処置（天然型）ｓｇｋキナーゼ（ｓｇｋ−ＷＴ）を発現している細胞は、不活性ｓｇｋ変異体（ｓｇｋ−ＭＴ）を発現している細胞よりも、各時点で、より高い凝固促進活性を示し、このことは、トロンビンを添加した（それぞれ、ｓｇｋ−ＷＴ／ＴｈｒとＳｇｋ−ＭＴ／Ｔｈｒ）か否かに関わらない。

この結果は、血管平滑筋細胞における無処置ｓｇｋ１の過剰発現が凝固活性の増大を起こすことを明白に示す。多様な細胞プロセスにおけるこの既知の重要な役割の結果として、この結果はまた、細胞膜での組織因子の発現の増大に関連したｓｇｋ１の機能亢進が、血液の凝固性を促進し、転移をその後にともなう腫瘍細胞の接着を可能にし、血管新生を増大することができることも示す。逆に、この機構は、ｓｇｋ１発現を抑制することによって、またはｓｇｋ１を薬理学的に阻害することによって抑制されるであろう。

図２は、対照プラスミドを宿す対照細胞（Ｃ：対照）、トランスフェクトされた活性キナーゼ（Ｗ：ＳＧＫ天然型）を含む細胞、およびトランスフェクトされた不活性キナーゼを含む細胞（Ｍ：ＳＧＫ変異体）からの組織因子ｍＲＮＡ（ＴＦ ｍＲＮＡ）のノーザンブロットを示す。該細胞は、上記の実験で使用された細胞と同等のヒト血管平滑筋細胞である。２８Ｓ ｒＲＮＡを内標準として使用する。ヒトＴＦ ｃＤＮＡをプローブとして用いた。細胞は、それぞれの場合で、トロンビン（３Ｕ／ｍｌ）で４時間処理したものと、しなかったものがある。上記ノーザンブロットから、対照細胞と比較して、活性ＳＧＫ（Ｗ）を含む細胞で、トロンビン処理したものは、組織因子ｍＲＮＡの転写が上方調節され、一方、不活性なＳＧＫ変異体を含む細胞では、転写が低減されることが理解できる。このことは、組織因子の発現がヒト血管平滑筋細胞においてＳＧＫによって調節されることを明らかに示している。

血管平滑筋細胞の凝固促進活性の刺激を示すグラフである。 ヒト血管平滑筋細胞における組織因子ＳＧＫの調節（ノーザンブロット）を示すグラフである。Ｔ：トロンビン（３Ｕ／ｍｌ）４時間、Ｃ：対照、Ｗ：ＳＧＫ天然型、Ｍ：ＳＧＫ変異体。

Claims (11)

1. ＴＦ（組織因子）の活性障害に関係する疾患を診断するための診断用キットを調整することを目的とした、真核生物細胞におけるｓｇｋ１の発現および／または機能を検出するための、ｓｇｋ１に対する少なくとも１種の抗体、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてｓｇｋ１の特定のＤＮＡ断片を増幅するために使用できるオリゴヌクレオチド、またはストリンジェントな条件でｓｇｋ１のヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドの使用であって、
   前記疾患が、凝固障害および／または肺高血圧症であることを特徴とする使用。
2. 前記抗体が、ｓｇｋ１における変異の検出に適していることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
3. 前記抗体が、ヌクレオチド多型（ＳＮＰｓ）および／または挿入の検出に適していることを特徴とする、請求項１または２に記載の使用。
4. ＴＦの活性障害に関係する疾患を治療するための医薬品または製薬組成物を生産することを目的とした、真核生物細胞におけるｓｇｋ１の発現および／または機能を阻害するためのケレリトリン、またはそれらの類似体の１つの使用であって、
   前記疾患が、凝固障害および／または肺高血圧症であることを特徴とする使用。
5. ＴＦの活性障害に関係する疾患を治療するための医薬品または製薬組成物を生産することを目的とした、真核生物細胞におけるｓｇｋ１の発現および／または機能を阻害するためのＳＢ２０３５８０の使用であって、
   前記疾患が、凝固障害、糖尿病性血管症、糖尿病性細小血管症および／または肺高血圧症であることを特徴とする使用。
6. ＴＦの活性障害に関係する疾患を治療するための医薬品または製薬組成物を生産することを目的とした、真核生物細胞におけるｓｇｋ１の発現および／または機能を阻害するためのＳＢ２０２１９０の使用であって、
   前記疾患が、凝固障害、糖尿病性血管症、糖尿病性細小血管症、肺高血圧症および／または動脈硬化症であることを特徴とする使用。
7. 前記凝固障害が遺伝性の凝固障害であることを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の使用。
8. 前記凝固障害が後天性の凝固障害であることを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の使用。
9. 凝固障害および／または肺高血圧症をインビトロで診断を補助する方法であって、
   ｓｇｋ１に対する抗体、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてｓｇｋ１の特定のＤＮＡ断片を増幅することができるオリゴヌクレオチド、またはストリンジェントな条件でｓｇｋ１のヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドを用い、患者から採取した生体試料においてｓｇｋ１の発現および／または機能を定量的に検出する方法。
10. 前記抗体が、ｓｇｋ１における特定の変異を検出するために用いられることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
11. 前記抗体が、ｓｇｋ１におけるヌクレオチド多型および／または挿入を検出するために用いられることを特徴とする、請求項９または１０に記載の方法。

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