CN100529101C - 用作诊断和治疗靶的sgk1 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于sgk1(血清和糖皮质激素依赖性激酶1)的诊断性检测的物质的利用并涉及利用活性剂以影响sgk1来治疗性治疗与组织因子活性紊乱相关的疾病以及涉及与之相关的诊断试剂盒。

Description

用作诊断和治疗靶的sgk1
本发明涉及用于诊断性检测sgk1(血清和糖皮质激素依赖性激酶1)的物质的用途并且涉及用于影响sgk1以治疗性治疗与TF(组织因子)活性紊乱相关的疾病的活性化合物的用途，也涉及与之相关的诊断试剂盒。
细胞在它的环境中受到大量外部信号的作用，这些外部信号引起细胞内部的磷酸化/去磷酸化级联反应以便使得这些信号能快速和可逆地从质膜及其受体向细胞质和细胞核传递。只有对参与这些级联反应的个体蛋白进行调控方可使得细胞的高度特异性和适应性成为可能，这种特异性和适应性接下来使得细胞特别快速的对胞外信号反应。特别是激酶，即转移磷酸基至个体底物的蛋白，它们参与这些调控过程。血清和糖皮质激素依赖性激酶(sgk)最初是从大鼠的乳腺癌细胞中克隆得到(Webster MK，GoyaL，Firestone GL.J.Biol.Chem.268(16)：11482-11485，1993；WebsterMK，Goya L，Ge Y，Maiyar AC，Firestone GL.Mol.Cell.Biol.13(4)：2031-2040，1993)。人的激酶hsgk作为细胞容积(cell volume)调控基因克隆自肝细胞(Waldegger S，Barth P，Raber G，Lang F.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4440-4445，1997)。据发现(Chen SY，Bhargava A，Mastroberardino L，Meijer OC，Wang J，Buse P，Firestone GL，VerreyF，Pearce D.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：2514-2519，1999；Naray-Fejes-Toth A，Canessa C，Cleaveland ES，Aldrich G，Fejes-TothG.J.Biol.Chem.274：16973-16978，1999)大鼠激酶刺激上皮Na+通道(ENaC)。另据显示ENaC的活性升高伴随着高血压(Warnock DG.Kidney Ind.53(1)：1824，1998)。
据DE 19708173中显示，hsgk1具有相当可观的与许多疾病，如高钠血症、低钠血症、糖尿病、肾功能不全症、高分解代谢症、肝性脑病和微生物或病毒感染相关的诊断潜能，这些疾病通过细胞容积的改变而受到病理生理学上的影响。
DE 19917990描述了激酶抑制物，如星形孢菌素(staurosporine)、白屈菜赤碱(chelerythrine)或反式显性抑制性激酶，它们可以用于细胞容积依赖性疾病的治疗。
hsgk也在脑中表达(Waldegger S，Barth P，Raber G，Lang F.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4440-4445，1997)，在脑中它调控Kv1.3电压依赖性K+通道。据显示，这些kv1.3型K+通道参与调控神经兴奋性(PongsO.Physiol.Rev.72：69-88，1992)、调控细胞增殖(Cahalan MD和ChandyKG.Cur.Opin.Biotech.8(6)：749-756，1997)以及参与调控程序性细胞死亡(Szabo I，Gulbins E，Apfel H，Zhan X，Barth P，Busch AE，Schlottmann K，Pongs O，Lang F，J.Biol.Chem.271：20465-20469，LangF.，Szabo I，Lepple-Wienhues A，Siemen D，Gulbins E，News Physiol.Sci.14：194-200，1999)。Kv1.3在调控淋巴细胞增殖和功能中也是重要的(Cahalan MD和Chandy KG.Cur.Opin.Biotech.8(6)：749-756，1997)。sgk家族的另外两个成员，即sgk2和sgk3已经得以克隆(Kobayashi T，Deak M，Morrice N，Cohen P.Biochem.J.344：189-197，1999)。而且，已发现这几种sgk形成了能在转录水平上和转录后水平上受调控的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶家族。和sgk1相似，sgk2和sgk3也可以通过如胰岛素和IGF1经由PI3激酶途径激活。然而，sgk蛋白家族还远没有被完全了解。
因此，本发明是基于利用sgk1作为新颖的诊断性和治疗性应用的目的。
出乎意料地是，已经可表明，作为与表达失活的sgk1比较，过量表达完整的sgk1引起促凝剂活性的升高。在这个试验体系中，凝固作用由组织因子(TF)引发。TF为47kDa的跨膜糖蛋白，它作为血管细胞或单核细胞与止血系统之间的主要连接链环。在该作用方式中，TF启动了血液凝固级联反应(Davie EW，Fujikawa K，Kisiel W.Biochemistry 30：10363-10370，1991)。TF通过以高度亲和性结合至因子VII/VIIa上启动血液的凝固。生成的复合物启动因子IX和X的活化，随之生成了凝血酶。凝血酶，对它来说，催化纤维蛋白原转变为纤维蛋白，引起了纤维蛋白的沉积和血液凝固(Nemerson Y.Blood 71：1-8，1998)。
TF表达的增加不一定和TF生物活性的增加相关。功能活性的TF取决于细胞表面上生物学活性形式的表达。在血管平滑肌细胞(SMCs)和单核细胞中，仅总的细胞TF的10-20％在细胞表面，它们也构成了生物学活性形式，而剩余的TF存在于胞内库中(约30％)以及作为潜在的表面TF(50-60％)(Preissner KT，Nawroth PP，Kanse SM.J.Pathol.190：360-372，2000；Schecter AD，Giesen PL，Taby O，Rosenfield CL，Rossikhina M，Fyfe BS，Kohtz DS，Fallon JT，Nemerson Y，TaubmannMB.J.Clin.Invest：100：2276-2285，1997)。据显示，除了它的凝固效果(Ruef J，Hu ZY，Yin LY，Wu Y，Hanson SR，Kelly AB，Harker LA，Rao GN，Runge MS，Patterson，C.Circ.Res.：24-33，1997)，TF也在肿瘤转移和血管生成中也起重要作用(Lwaleed BA和Cooper AJ.MedicalHypotheses.55：470-473，2000；Verheul HMW，Jorna AS，Hoekman K，Broxterman HJ，Gebbink MFBG，Pinedo HM.Blood：4216-4221，2000)。在该途径中，已经发现的功能性数据说明sgk1的作用适于影响细胞膜上TF的表达和/或功能，并因而适于间接影响血液的凝固能力、肿瘤细胞的粘附性、随后的肿瘤细胞转移以及血管生成和血管生成在其中起作用的疾病。刺激sgk1引起组织因子的表达增加，而抑制sgk1引起活性组织因子的表达降低，因此可能以刺激或抑制的方式间接影响上面描述的适应症。
因此，根据本发明的目的可以通过包含针对sgk1的抗体的诊断试剂盒实现，所述诊断试剂盒能够检测真核细胞中sgk1的表达和/或功能，从而诊断与TF(组织因子)活性紊乱相关的疾病。
根据本发明，至少一种物质可用于检测真核细胞中sgk1的表达和/或功能。因此这也使得，特别是诊断与TF活性紊乱相关的疾病成为可能。该物质可以是如直接针对sgk1的抗体并可用于本领域技术人员众所周知的检测方法，如ELISA(酶联免疫吸附检测法)。在这些免疫测定法中，将针对待测定抗原(Sgk1)的特异性抗体(或在抗体测定情况下为同源测试抗原)结合至支持物上(如纤维素或聚苯乙烯)，在支持物上与样本孵育后形成免疫复合物。在随后步骤中，向这些免疫复合物提供经标记的抗体。通过向反应混合物中添加发光底物，能看见结合免疫复合物的酶/底物复合物，或者通过光度检测结合免疫复合物的标记酶与已知酶活性的标准品比较来确定样本中的抗原浓度。
其它可用于诊断性检测的物质是寡核苷酸，其适于使用聚合酶链反应(PCR)，运用分子遗传学方法，从而提供sgk1的定量检测，在这种方法下，选择性检测的DNA片段得到扩增。
在另一优选的实施方案中，本发明的用途中采用的物质为多核苷酸，其可以在严格条件下和sgk1杂交。这些多核苷酸可被用于如实施Southern印迹或Northern印迹以便以这种方法来检测sgk1的DNA或RNA含量。技术人员熟悉适当的方法。例如sgk1的转录率可以以这种方法分析。
在一特别优选的本发明用途的实施方案中，该物质，即特别是抗体、寡核苷酸和/或多核苷酸，适合用于检测sgk1中的突变。有趣地是，已经发现sgk1中的某些突变与激酶表达和/或活性的升高相关。特别是在二种核苷酸多态性(SNPs)的情况下观察到这种现象。这些核苷酸多态性在人sgk1中首先位于内含子6(T→C)上，以及外显子8(C→T)上。关于这一点，读者请参考WO 02/074987，其中表明这些核苷酸多态性与基因决定的易患高血压相关。其它突变的情况下也有类似的发现，特别是插入突变。本发明因此考虑了使用合适的抗体、寡核苷酸和/或多核苷酸来检测和sgk1的表达和/或功能活性升高相关的相应突变，并通过此方法能够得出与TF活性紊乱相关的疾病的诊断结论。技术人员熟悉在描述的用途中所采用的方法。其它可用于定量检测sgk1的表达和/或功能的方法对技术人员来说是显而易见的并同样包含于本发明中。
本发明要求对一种用于影响特别是抑制或活化真核细胞中sgk1的表达和/或功能，目的在于治疗与被扰乱的TF活性相关的疾病的化合物享有权利。既然sgk1像sgk2和sgk3一样也是激酶，为技术人员所知的激酶抑制物如星形孢菌素、白屈菜赤碱等，以及特别是其它物质如反式显性失活(transdominatly nagtive)激酶突变体，都被考虑在内。技术人员熟悉这些物质并且这些物质能从商业(Sigma、Calbiochem等公司)和非商业来源获得。可使用的活化剂的实例是例如sgk1的重组改变的突变体和磷酸酶抑制物。技术人员也熟悉磷酸酶抑制物并且它们其中一些同样可从商业(Sigma、Calbiochem等公司)和非商业来源获得。使用磷酸酶抑制物将抑制脱磷酸作用并因此，sgk1-激活的靶标(TF)将保持活化状态。优选使用这些活性化合物来生产药物或药物组合物。
在另一优选的本发明实施方案中，活性化合物针对sgk1本身。活性化合物可以是如反义序列、所谓的激酶缺陷型突变体、或激酶抑制物如上面已经提到的星形孢菌素和/或白屈菜赤碱或它们的类似物。活性化合物另外也可以是所谓的小分子化合物或编码影响优选抑制或活化sgk1表达的肽的多核苷酸。
在另一优选的本发明实施方案中，活性化合物为针对sgk1的激活剂、抑制剂、调节剂和/或生物学前体。这些激活剂、抑制剂、调节剂和/或生物学前体可以是sgk1信号转导级联反应的上游或下游成员、负责sgk1表达水平的转录因子、负责蛋白水解掉sgk1的激活剂、抑制剂、调节剂和/或生物学前体的蛋白酶或受活性化合物影响并参与sgk1的表达和/或功能的迄今未知的分子。
根据本发明，可使用已知的活性化合物和仍旧未知的活性化合物。在一特别优选的实施方案中，针对sgk1的激活剂、抑制剂、调节剂和/或生物学前体的活性化合物是那些称为小分子化合物的物质，特别是具有分子量(MW)＜1,000这一特性的化合物。小分子化合物可以是例如激酶抑制物如咪唑衍生物SB 203580(MW 377.4)或SB 202190(MW 331.3)，它们两者均为已知的激酶表达抑制物并由Calbiochem公司商业性出售。
本发明可以用于治疗与TF活性紊乱相关的所有形式的疾病。就此而论，遗传或获得性的凝血病和/或血管病得以特别考虑。凝血病一般理解为血凝固紊乱。遗传的凝血病(其称为缺陷型凝血病)的实例是异常纤维蛋白原血症、低转换蛋白原血症、血友病B型、斯图亚特因子缺陷症(stuart-prower defect)等。获得性血凝固紊乱的实例是凝血酶原复合物缺陷(prothrombin complex deficiency)、消耗性凝血病、纤溶亢进、免疫性凝血病以及复合物凝血病(complex coagulopathy)。两种形式的凝血病均由多种血浆凝血因子的缺失或功能紊乱所致。依照区分症状学(differingsymptomatology)，区分了具有出血趋势的凝血病(负凝血病)和具有形成血栓趋势的凝血病(正凝血病)，以及与引发原因的部位对应，区分了肝源性凝血病、心源性凝血病和免疫性凝血病。因此，通过激活或抑制sgk1，血液凝固的倾向可以被降低或升高，并因而适合于医学适应症。对血管病，即集合了一般称为血管病的疾病，如糖尿病性血管病、糖尿病性微血管病、肺动脉高压、动脉硬化症等也作了类似考虑。在这种情况下，活性化合物同样能用于特别是用于治疗遗传性和/或获得性血管病。
在特别优选的实施方案中，使用一种物质来检测或使用一种活性化合物来治疗肺动脉高压和/或动脉硬化症。
在另一优选的实施方案中，活性化合物用于刺激或抑制血管生成。血管生成可理解为血管壁的发育，例如在胚胎发育期间血管壁的发育，并且许多血管生成依赖的疾病为技术人员所知，例如糖尿病、肿瘤生成和自身免疫性疾病。在另一优选的实施方案中，活性化合物用于刺激或抑制伤口愈合。
本发明也涉及诊断试剂盒。该试剂盒包含至少一种适用于检测sgk1表达和/或功能的物质，目的在于诊断与TF活性紊乱相关的疾病。根据本发明的诊断试剂盒的特征特别是在于用于检测sgk1的表达和/或功能的物质是针对sgk1的抗体、用于扩增sgk1的DNA片段的聚合酶链反应的寡核苷酸和/或能在严格条件下和sgk1杂交的多核苷酸。就此而论，十分特别优选使用这些物质来检测突变，特别是检测核苷酸多态性和/或插入突变，这些突变与sgk1的表达和/或活性的升高相关。在这一点上，读者可以参考上面的描述。
另外可使用这种试剂盒来诊断和sgk1的过度表达或低表达(underexpress)或机能亢进或功能减退相关的疾病。这些诊断试剂可以在诊断试剂盒中选择性使用以便特别是来检测例如上面描述过的凝血病、血管病、血管生成依赖性疾病、伤口愈合疾病等。同样，关于这一点，通过检测sgk1的表达和/或功能紊乱可以检测疾病。特别地，该物质可以是能在核苷酸和/或肽水平上或多核苷酸和/或多肽水平上提供这种检测的物质。关于这种物质的其它特性读者可以参考本说明书部分中恰当的前述原文。
除此之外，本发明包括用于检测和TF活性紊乱相关的疾病的方法。在此上下文中，sgk1的表达和/或功能或活性是在取自患者的身体样品中定量检测的。这种身体样品可以是例如体液，如血液或尿液或其它，如细胞样品。例如，使用针对sgk1的抗体、使用适合用于聚合酶链反应来扩增sgk1的DNA片段的寡核苷酸和/或使用能在严格条件下与sgk1的DNA和/或mRNA杂交的多核苷酸，定量检测得以实现。在这个方法中，特别优选使用上述物质来检测sgk1中特定的突变，特别是核苷酸多态性和/或插入突变，这些特定的突变是和sgk1的表达和/或功能或活性的升高相关的。待诊断的疾病是，例如与血液凝固紊乱或血管病相关的疾病如肺动脉高压和动脉硬化症。
另外，本发明包含含有至少一种影响特别是抑制或活化sgk1的表达和/或功能的活性化合物并且优选地如果需要还含有药物赋形剂的药物组合物。就此而论，活性化合物可以是激酶抑制剂如上文提到的抑制剂星形孢菌素、白屈菜赤碱、SB 203580和SB 202190或其类似物或其它物质。另外，活性化合物可以是编码肽优选多肽的多核苷酸，这些肽影响优选抑制或活化sgk1的表达。根据本发明多肽的实例是称为激酶缺陷突变体的多肽。如何通过靶标蛋白的重组改变变体来影响表达和/或功能的其它实例为技术人员所熟悉并能在许多教科书/参考书以及用于实验室工作的指导说明(例如Maniatis T，Fritsch EF，Sambrook J.冷泉港，纽约：Cold SpringHarbor laborator，1996年；Leonard G，Davis博士，Michael W，KuehlMd，James F，Battey MD.，McGraw-Hill Professional Publishing，1995年)中找到。另外，根据本发明的活性化合物可以是被称为小分子化合物优选具有小于1,000的分子量(MW)的小分子化合物的物质。另外，活性化合物也可以是反义序列，即能和靶标多肽的mRNA形成双链体复合物并因此抑制其翻译的序列。也可能使用sgk1自身的序列来获得过量表达，例如通过整合此序列至载体或质粒中，据此也可能事先用“运载体”分子如启动子来修饰靶标序列。关于这样一种组合物的其它特征，读者可参考该描述部分中合适的先前的原文。
最后，本发明包含含有有效量的至少一种这样的活性化合物的药物组合物，其中所述活性化合物影响特别是抑制或活化sgk1的活化物、抑制物、调节物和/或生物学前体的表达和/或功能。这种药物组合物如果需要也优选包含药物赋形剂。这些sgk1的活化物、抑制物、调节物和/或生物学前体例如可以是其它参与sgk1的活性调控的激酶、在sgk1表达的水平上起作用的转录因子、以及在信号传导级联反应中sgk1的其它已知成员或迄今未知的成员、以及在上面已经描述过的分子。编码影响优选抑制或活化sgk1表达的活化物、抑制物、调节物和/或生物学前体的多核苷酸也可以存在于这样一种组合物中。也可能使用优选具有小于1,000的分子量(MW)并且针对sgk1的活化物、抑制物、调节物和/或生物学前体，并在此方面抑制或活化此激酶的表达和/或功能的小分子化合物。有关这样一种活性化合物的其它特征，读者可参考该描述部分中合适的先前的原文。
本发明现存的特点和其它的特点可由以下的优选实施方案并结合附属权利要求及附图得来。就此而论，独立的特征在每种情况下可以由它们自身实现，或者几种特征可以相互结合得以体现。
附图说明：
图1：刺激血管平滑肌细胞的促凝血活性。
图2：人血管平滑肌细胞中组织因子SGK的调节(Northern印迹)。T：凝血酶(3U/ml)4小时，C：对照，W：SGK野生型，M：SGK突变体。
实验
图1中，表示为最大值百分率形式的促凝血活性相对于复钙化(recalcification)后时间绘图。在与图1相关的实验中，人血管平滑肌细胞(HAOSMC)的促凝血活性通过测定复钙化血液贫血小板血浆(PPP)在凝血过程中凝血酶形成而得以测定(Beguin S，Lidhout T，Hemker HC：Throm.Haemost.61：25-29，1998)。为此，将汇合的血管平滑肌细胞置于无血清培养基中24小时，然后用HEPES-tyrode溶液洗涤三次，并随后和人PPP孵育。通过加入16.7mM CaCl2至孵育培养基中诱导凝血酶的形成。在各个情形下每一到两分钟移出20μl的上清并用染料S-2238(Haemochrom Diagnostica)测定移出体积中凝血酶的形成。在分光光度计(Uvikon，Contron-instruments)中405nm下测定光密度。用针对人组织因子的中和抗体(Mab# 4508；美国Diagnostica；在复钙化PPP 20分钟之前加入至10μg/ml)阐明了平滑肌细胞的表面促凝血活性对可获得的细胞膜结合的组织因子的依赖。
如图1显示，加入CaCl2几分钟以后，人血管平滑肌细胞的促凝血活性升高。当表达失活激酶(sgk-MT)时这种升高比表达正常激酶(sgk-WT)时慢。凝血酶(Thr)的额外施用，正如预期的那样，导致了被加速的促凝血活性的升高。也就此而论，这种效果在表达完整激酶的细胞中比在表达失活突变体的细胞中更显著和更迅速。与是否已经加入凝血酶(分别地，sgk-WT/Thr和Sgk-MT/Thr)无关，表达完整(野生型)sgk激酶(sgk-WT)的细胞在各个时间点上比表达失活sgk突变体(sgk-MT)的细胞表现出更高的促凝血活性。
这些结果明确地表明了血管平滑肌细胞中完整sgk1的过度表达导致凝血活性的升高。作为多种细胞过程中TF已知的重要作用的结果，这些结果也表明与细胞膜上组织因子的表达升高相关的sgk1的高活性可以促进血液的凝固，使得肿瘤细胞的粘附及其随后的癌转移成为可能，并且增加血管生成。可逆地，这种机制能通过抑制sgk1表达或通过药学上抑制sgk1得以抑制。
图2显示来自包含对照质粒的对照细胞(C：对照)、包含转染的活性激酶的细胞(W：SGK野生型)和包含转染的失活激酶的细胞(M：SGK突变体)的组织因子mRNA(TF mRNA)的Northern印迹。细胞是与在上面实验中使用的细胞等同的人血管平滑肌细胞。28S rRNA作为内部标准点样。人TF cDNA作为探针使用。在每种情形下细胞不用和用凝血酶(3U/ml)处理4小时。从Northern印迹可以看出，和对照细胞比较，在包含活性SGK(W)的细胞中用凝血酶处理时组织因子mRNA的转录得以上调，而在包含失活SGK突变体的细胞中转录降低。这清楚地表明组织因子的表达受到人血管平滑肌细胞中的SGK调节。

Claims (5)

1.针对sgk1的抗体的用途，用于生产诊断试剂盒来检测真核细胞中sgk1的表达，从而诊断肺动脉高压。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述抗体适用于检测sgk1中的突变。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于所述抗体适用于检测sgk1中的核苷酸多态性(SNPs)和/或插入突变。
4.如权利要求1到3中任意一项所述的用途，其特征在于对取自患者的身体样品定量检测sgk1的表达。
5.诊断试剂盒，其包含针对sgk1的抗体，用于检测sgk1的表达，以诊断肺动脉高压。
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