EP1613766A1 - Sgk1 als diagnostisches und therapeutisches target - Google Patents

Sgk1 als diagnostisches und therapeutisches target

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EP1613766A1
EP1613766A1 EP03816137A EP03816137A EP1613766A1 EP 1613766 A1 EP1613766 A1 EP 1613766A1 EP 03816137 A EP03816137 A EP 03816137A EP 03816137 A EP03816137 A EP 03816137A EP 1613766 A1 EP1613766 A1 EP 1613766A1
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EP
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sgkl
use according
expression
active ingredient
diseases
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Withdrawn
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EP03816137A
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Florian Physiologisches Institut I Lang
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Original Assignee
Individual
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Publication date
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C12Q1/485—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving kinase
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    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5302—Apparatus specially adapted for immunological test procedures

Definitions

  • the present invention relates to the use of a substance for the diagnostic detection of sgkl (serum and glucocorticoid dependent kinase 1) and to the use of an active substance for influencing sgkl for the therapeutic treatment of diseases which have an impaired activity of TF (tissue factor) in the Are related, as well as a related diagnostic kit.
  • sgkl serum and glucocorticoid dependent kinase 1
  • an active substance for influencing sgkl for the therapeutic treatment of diseases which have an impaired activity of TF (tissue factor) in the Are related as well as a related diagnostic kit.
  • Kinases, ie proteins which transfer a phosphate group to individual substrates, are particularly involved in these regulatory processes. Serum and glucocorticoid dependent kinase (sgk) was originally cloned from rat breast cancer cells (Webster MK, Goya L, Firestone GL J. Biol. Chem.
  • the human kinase hsgk was cloned from liver cells as a cell volume-regulated gene (Waldegger S, Barth P, Raber G, Lang F. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4440-4445, 1997).
  • the rat kinase Choen SY, Bhargava A, Mastroberardino L, Meijer OC, Wang J, Buse P, Firestone GL, Verrey F, Pearce D. Proc. Natl. Acad.
  • hsgkl has a considerable diagnostic potential in many diseases that are pathophysiologically influenced by cell volume changes, such as hypernatremia, hyponatremia, diabetes mellitus, renal insufficiency, hypercatabolism, hepatic encephalopathy and microbial or viral infections ,
  • kinase inhibitors such as, for example, staurosporine, chelerythrine or transdominant inhibitory kinase, which can be used in the therapy of cell volume-dependent diseases.
  • the hsgk is also expressed in the brain (Waldegger S, Barth P, Raber G, Lang F. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94: 4440-4445, 1997), where it regulates the voltage-dependent K + channels Kv1.3 , It has been shown that these K + channels of the Kv1.3 type are involved in the regulation of neuronal excitability (Pongs O. Physiol. Rev. 72: 69-88, 1992), the
  • Kv1.3 is also important in the regulation of lymphocyte proliferation and function (Cahalan MD and
  • the object of the invention is to make the sgkl usable for new diagnostic and therapeutic applications.
  • TF tissue factor
  • the TF is a 47 kDa transmembrane glycoprotein that serves as the primary link between vascular cells or mononuclear cells and the hemostatic system.
  • TF initiates the blood coagulation cascade (Davie EW, Fujikawa K, Kisiel W. Biochemistry 30: 10363-10370, 1991).
  • TF initiates blood coagulation by binding to factors VII / VIII with high affinity.
  • the resulting complex initiates the activation of factors IX and X with the subsequent thrombin generation.
  • Thrombin in turn catalyzes the conversion of fibrinogen to fibrin, which leads to fibrin storage and blood clotting (Nemerson Y. Blood 71: 1-8, 1998).
  • Increased expression of TF is not necessarily associated with increased biological activity of TF.
  • Functionally active TF depends on the expression of a biologically active form on the
  • TF in addition to its coagulatory effect (Ruef J, Hu ZY, Yin LY, Wu Y, Hanson SR, Kelly AB, Harker LA, Rao GN, Runge MS, Pattersoa C. Circ. Res .: 24- 33, 1997) plays an important role in tumor metastasis and in angiogenesis (Lwaleed BA and Cooper AJ. Medical Hypotheses. 55: 470-473, 2000; Verheul HMW, Jorna AS, Hoekman K, Broxterman HJ, Gebbink MFBG, Pinedo HM. Blood: 4216-4221, 2000).
  • the functional data found show that the effects of the sgkl are suitable for influencing the expression and / or function of TF on the cell membrane and thus indirectly for the blood to clot, the attachment of tumor cells with subsequent metastasis, angiogenesis and diseases, in which angiogenesis plays a role.
  • stimulating the sgkl there is an increased expression of the tissue factor by inhibiting the sgkl there is a reduced expression of active tissue factor, and thus the indications described above can be indirectly stimulated or inhibited.
  • At least one substance can be used to detect the expression and / or the function of sgkl in eukaryotic cells. This also makes it possible, in particular, to diagnose diseases which are associated with a disturbed activity of TF.
  • This substance could e.g. B. is an antibody that is directed against Sgkl, and in a detection method known to those skilled in the art, such as. B. ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) can be used. In such immunoassays, the specific antibody directed against the antigen to be determined (Sgkl) is used. (or at
  • Antibody determinations homologous test antigens bound to a carrier substance (e.g. cellulose, polystyrene), on which immune complexes form after incubation with the sample.
  • a carrier substance e.g. cellulose, polystyrene
  • a labeled antibody is added to these immune complexes.
  • the immunocomplex-bound enzyme-substrate complexes can be made visible or the antigen concentration in the sample can be determined by means of a photometric determination of the immunocomplex-bound marker enzymes by comparison with standards of known enzyme activity.
  • oligonucleotides which are suitable with the help of the so-called polymerase chain reaction (PCR), via a molecular genetic method in which selectively certain DNA sections are amplified, a quantitative detection of sgkl to provide.
  • PCR polymerase chain reaction
  • polynucleotides which can hybridize with sgkl under stringent conditions are used as substances in the use according to the invention.
  • polynucleotides for example, Southern or Northern blots are carried out in order to detect the DNA or RNA content of sgkl.
  • Appropriate methods are familiar to the person skilled in the art. In this way, for example, the transcription rate of sgkl can be analyzed.
  • the substance that is to say in particular antibodies, oligonucleotides and / or polynucleotides, is suitable for detecting mutations in sgkl.
  • certain mutations in sgkl are associated with an increased expression and / or activity of the kinase. This was particularly observed with two nucleotide polymorphisms (SNP). These nucleotide polymorphisms are found on the one hand in intron 6 (T ⁇ C) and in exon 8 (C ⁇ T) in human sgkl.
  • WO 02/074987 in which it is shown that these nucleotide polymorphisms are related to a genetic predisposition to hypertension. The same was also found for other mutations, in particular insertion mutations. According to the invention, it is therefore provided that corresponding mutations which are associated with an increased expression and / or activity of Sgkl can be detected by means of appropriate antibodies, oligonucleotides and / or polynucleotides, and thus be able to draw conclusions for the diagnosis of diseases which are disturbed TF related activity.
  • the person skilled in the art is familiar with the methodological procedure of the uses described. Other methods with which the expression and / or function of sgkl can be quantitatively detected are obvious to the person skilled in the art and are likewise encompassed by the invention.
  • an active ingredient for influencing, in particular inhibiting or activating the expression and / or function of sgkl in eukaryotic cells, for the treatment of diseases associated with impaired activity of TF.
  • sgkl like sgk2 and sgk3, is a kinase, kinase inhibitors known in particular to the person skilled in the art, such as, for. B. staurosporine, chelerythrine etc., but also other substances such as. B. transdominant negative kinase mutants, in question.
  • Such substances are known to the person skilled in the art and can be obtained from commercial (Sigma, Calbiochem, etc.) and non-commercial sources.
  • activators z. B.
  • Phosphatase inhibitors are also known to the person skilled in the art, and some of them are also commercially available (Sigma, Calbiochem, etc.) and not commercially available. If phosphatase inhibitors were used, the dephosphorylation would be inhibited and the target (TF) activated by sgkl would remain in the activated state. These active substances are preferably used for the production of a medicament or a pharmaceutical composition.
  • the active ingredient is directed against sgkl itself. It can z. B. antisense sequences, so-called kinase deficient mutants, but also kinase inhibitors, such as the above-mentioned staurosporine and / or chelerythrine or their analogs. Furthermore, the active ingredient can also be a so-called "small molecular compound" or a polynucleotide which codes for a peptide which influences, preferably inhibits or activates the expression of sgkl.
  • the active ingredient is directed against activators, inhibitors, regulators and / or biological precursors of sgkl.
  • activators, inhibitors, Regulators and / or biological precursors could be upstream and / or downstream members of the sgkl signal transduction cascade, transcription factors which are responsible for the expression level of sgkl, proteases which are responsible for the proteolytic degradation of activators, inhibitors, regulators and / or biological precursors of sgkl, but also so far unknown molecules, which are influenced by the active ingredient and are involved in the expression and / or function of sgkl.
  • the active ingredient which is directed against activators, inhibitors, regulators and / or biological precursors of sgkl is a so-called "small molecular compound", in particular one with a molecular weight (MW) ⁇ 1,000.
  • Small molecular compounds can for example kinase inhibitors, such as the immidazole derivatives SB 203580 (MW 377.4, or also SB 202190 (MG 331, 3), both of which are known inhibitors of kinase expression and are commercially available from Calbiochem to be expelled.
  • the invention can be used to treat all forms of diseases associated with impaired TF activity.
  • coagulopathies and / or angiopathies of the innate or acquired type should be considered.
  • Coagulopathies are generally understood as coagulation disorders.
  • Congenital coagulopathies are e.g. B. dysfibrinogenemia, hypoproconvertinemia, haemophilia B, Stuart-Prower-defect, etc.
  • Acquired coagulation disorders are e.g. B. Prothrombin complex deficiency, consumption coagulopathy, hyperfibrinolysis, immunocoagulopathy and complex coagulopathies. Both forms of coagulopathy are caused by a lack of or dysfunction of different plasma Coagulation factors.
  • coagulopathies with a tendency to bleeding minus coagulopathies
  • coagulopathies with a tendency to thrombosis plus agulopathies
  • the blood's willingness to clot can be reduced or increased, and thus adapted to the medical indication.
  • angiopathies ie diseases that are summarized under the generic term for vascular diseases, such as. B. diabetic angiopathy, diabetic microangiopathy, pulmonary hypertension, arteriosclerosis etc.
  • the active ingredient can be used in particular to treat congenital and / or acquired angiopathies.
  • a substance for detection or an active ingredient for the treatment of pulmonary hypertension and / or arteriosclerosis is used.
  • the active ingredient is used to stimulate or inhibit angiogenesis.
  • Angiogenesis is the development of vessel walls, e.g. understood during embryonic development, and a number of angiogenesis-dependent diseases are known to the person skilled in the art, e.g. B. Diabetes mellitus, tumor formation and autoimmune diseases.
  • the active ingredient is used to stimulate or inhibit wound healing.
  • the invention also relates to a diagnostic kit.
  • This comprises at least one substance which is suitable for the detection of expression and / or function of sgkl, for the diagnosis of diseases which are associated with a disturbed activity of TF.
  • the diagnostic kit according to the invention is particularly characterized by this characterized in that as a substance for detecting the expression and / or function of sgkl antibodies against Sgkl, oligonucleotides for a polymerase chain reaction for amplifying DNA sections of sgkl and / or polynucleotides that can hybridize with sgkl under stringent conditions. It is very particularly preferred that mutations are detected with these substances, in particular
  • Nucleotide polymorphisms and / or insertions (mutations) which are associated with an increased expression and / or activity of sgkl. In this regard, reference is made to the above description.
  • Such a kit can also be used to diagnose diseases that are associated with an overexpression or underexpression or function of sgkl.
  • Such diagnostics can be used in a targeted manner in a diagnosis kit in order to, among other things, diseases such as the coagulopathies described above, angiopathies, angiogenesis-dependent diseases, diseases of the
  • the diseases can be detected by detecting an impaired expression and / or function of sgkl.
  • this substance can be one which provides this detection at the nucleotide and / or peptide level or polynucleotide and / polypeptide.
  • the invention includes a method for diagnosing diseases which are associated with a disturbed activity of TF.
  • the expression and / or function or activity of sgkl is detected quantitatively in a patient's body sample.
  • a body sample can be liquids such as blood or urine, for example for example, a cell sample.
  • the quantitative detection is carried out, for example, with antibodies against Sgkl, with oligonucleotides which are suitable for a polymerase chain reaction for the amplification of DNA segments from sgkl and / or with polynucleotides which can hybridize with DNA and / or mRNA from sgkl under stringent conditions.
  • the diseases to be diagnosed are, for example, diseases that are associated with impaired blood coagulation or vascular diseases such as pulmonary hypertension or arteriosclerosis.
  • the invention further comprises a pharmaceutical composition which contains at least one active substance which influences, in particular inhibits or activates, the expression and / or function of sgkl, and preferably, if appropriate, a pharmaceutical carrier.
  • the active substance can be a kinase inhibitor, such as the inhibitors staurosporin, chelerythrin, SB 203580 and SB 202190 or their analogues, but also other substances, mentioned above.
  • the active ingredient can be a polynucleotide which encodes a peptide, preferably a polypeptide, this peptide influencing, preferably inhibiting or activating the expression of sgkl.
  • An example of a polypeptide according to the invention is a so-called kinase deficient mutant.
  • the active ingredient according to the invention can also be a so-called "small molecular compound", preferably a "small molecular compound” with a molecular weight (MW) ⁇ 1,000.
  • the active ingredient can also be a so-called antisense sequence, ie a sequence which is capable of forming a double-strand duplex with the mRNA and thereby preventing the translation of a target polypeptide.
  • the sequence of sgkl itself can also be used to achieve overexpression, e.g. B. by incorporation into vectors or plasmids, the target sequence also being able to be modified beforehand by “carrier” molecules, for example promoters.
  • the invention comprises a pharmaceutical composition which has an effective amount of at least one active ingredient which influences, in particular inhibits or activates, the expression and / or function of activators, inhibitors, regulators and / or biological precursors of sgkl.
  • this pharmaceutical composition can optionally also contain a pharmaceutical carrier.
  • activators, inhibitors, regulators and / or biological precursors of sgkl can e.g. B.
  • sgkl may be further kinases that are involved in the regulation of the activity of sgkl, transcription factors that play a role in the expression level of sgkl, and other known or as yet unknown members of the sgkl in a transduction cascade, as well as the molecules already described above .
  • Polynucleotides which encode a peptide which influences, preferably inhibits or activates the expression of activators, inhibitors, regulators and / or biological precursors of sgkl can also be used in one Composition may be included.
  • small molecular compounds which preferably have a molecular weight (MW) ⁇ 1,000, and which are directed against activators, inhibitors, regulators and / or biological precursors of sgkl, and thereby inhibit or activate the expression or the function of this kinase
  • MW molecular weight
  • the pictures show:
  • Fig. 1 stimulation of procoagulant activity smoother
  • Fig. 2 Regulation of tissue factor by SGK in human vascular smooth muscle cells (Northern blot).
  • T thrombin (3 U / ml) 4h
  • C control
  • W SGK wild type
  • M M
  • HAOSMC human smooth vascular muscle cells
  • PPP recalcified low-platelet plasma
  • confluent smooth vascular muscle cells were kept in serum-free medium for 24 hours, then washed three times in HEPES-Tyrode solution, and then incubated with human PPP.
  • the formation of thrombin was triggered by adding 16.7 mM CaCl 2 to the incubation medium.
  • sgk-WT sgk kinase
  • sgk-MT inactive sgk mutant
  • TF mRNA tissue factor
  • C control
  • W transfected active kinase
  • M transfected inactive kinase
  • the cells are the corresponding human smooth vascular muscle cells as in the above experiment.
  • the 28S rRNA is plotted as an internal standard.
  • Human TF cDNA served as probe. The cells were treated with and without thrombin (3 U / ml) for 4 hours.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Substanz zum diagnostischen Nachweis von sgk1 (serum and glucocorticoid dependent kinase 1) sowie die Verwendung eines Wirkstoffes zur Beeinflussung von sgk1 für die therapeutische Behandlung von Erkrankungen, die mit einer gestörten Aktivität von TF (Tissue Factor) im Zusammenhang stehen, sowie ein diesbezügliches Diagnosekit.

Description

Beschreibung
sgkl als diagnostisches und therapeutisches target
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Substanz zum diagnostischen Nachweis von sgkl (serum and glucocorticoid dependent kinase 1 ) sowie die Verwendung eines Wirkstoffes zur Beeinflussung von sgkl für die therapeutische - Behandlung von Erkrankungen, die mit einer gestörten Aktivität von TF (Tissue Factor) im Zusammenhang stehen, sowie ein diesbezügliches Diagnosekit.
Eine Vielzahl von externen Signalen, denen eine Zelle in ihrer Umwelt ausgesetzt ist, führen zu intrazellulären Phosphorylierungs-/Dephos- phorylierungskaskaden, um eine schnelle und reversible Übertragung dieser Signale von der Plasmamembran und ihren Rezeptoren in das Zytoplasma und den Zellkern zu ermöglichen. Die Regulation einzelner Proteine, die an diesen Kaskaden beteiligt sind, ermöglicht erst die hohe Spezifität und Flexibilität der Zellen, die es ihnen erlauben, sehr schnell auf extrazelluläre Signale zu reagieren. An diesen Regulationsprozessen sind insbesondere Kinasen, d. h. Proteine, die eine Phosphatgruppe auf individuelle Substrate übertragen, beteiligt. Die Serum- und Glucocorticoid-abhängige Kinase (sgk) wurde ursprünglich aus Rattenmammakarzinomazellen kloniert (Webster MK, Goya L, Firestone GL J. Biol. Chem. 268 (16): 11482-11485, 1993; Webster MK, Goya L, Ge Y, Maiyar AC, Firestone GL. Mol. Cell. Biol. 13 (4): 2031- 2040, 1993). Die humane Kinase hsgk wurde als zellvolumenreguliertes Gen aus Leberzellen kloniert (Waldegger S, Barth P, Raber G, Lang F. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94: 4440-4445, 1997). Es zeigte sich, daß die Rattenkinase (Chen SY, Bhargava A, Mastroberardino L, Meijer OC, Wang J, Buse P, Firestone GL, Verrey F, Pearce D. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 2514-2519, 1999; Naray-Fejes-Toth A, Canessa C, Cleaveland ES, Aldrich G, Fejes-Toth G. J. Biol. Chem. 274: 16973- 16978, 1999) den epithelialen Na+-Kanal (ENaC) stimuliert. Weiter wurde gezeigt, daß eine gesteigerte Aktivität des ENaC mit Hypertonie einhergeht (Warnock DG. Kidney Ind. 53 (1 ): 1824, 1998).
In der DE 197 08 173 konnte gezeigt werden, daß die hsgkl bei vielen Erkrankungen, die durch Zellvolumenänderung pathophysiologisch beeinflußt werden, wie beispielsweise Hypernatriämie, Hyponatriämie, Diabetes mellitus, Niereninsuffizienz, Hyperkatabolismus, hepatische Encephalopathie und mikrobielle oder virale Infektionen, ein beträchtliches diagnostisches Potential besitzt.
In der DE 199 17 990 sind Kinase-Hemmstoffe, wie beispielsweise Staurosporin, Chelerythrin oder transdominant inhibitorische Kinase beschrieben worden, die bei der Therapie zellvolumenabhängiger Erkrankungen eingesetzt werden können.
Die hsgk wird auch im Gehirn exprimiert (Waldegger S, Barth P, Raber G, Lang F. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94: 4440-4445, 1997), wo sie die spannungsabhängigen K+-Kanäle Kv1.3 reguliert. Es wurde gezeigt, daß diese K+-Kanäle des Kv1.3-Typs involviert sind in der Regulation der neuronalen Erregbarkeit (Pongs O. Physiol. Rev. 72: 69-88, 1992), der
Regulation von Zeilproliferation (Cahalan MD und Chandy KG. Cur. Opin. Biotech. 8 (6): 749-756, 1997) sowie der Regulation von apoptotischem Zelltod (Szabo I, Gulbins E, Apfel H, Zhan X, Barth P,
Busch AE, Schlottmann K, Pongs O, Lang F. J. Biol. Chem. 271 : 20465-
20469, 1999; Lang F, Szabo I, Lepple-Wienhues A, Siemen D, Gulbins
E. News Physiol. Sei. 14: 194-200, 1999). Kv1.3 ist ferner wichtig bei der Regulation der Lymphozytenproliferation und -funktion (Cahalan MD und
Chandy KG, Cur. Opin. Biotech. 8 (6): 749-756, 1997). Es wurden zwei weitere Mitglieder der sgk-Familie kloniert, die sgk2 und sgk3 (Kobayashi T, Deak M, Morrice N, Cohen P. Biochem. J. 344: 189-197, 1999). Ferner zeigte sich, daß die sgk eine Serin-Threonin- Proteinkinase-Familie bilden, die transkriptionell und posttranskriptionell reguliert werden können. Wie die sgkl , werden auch die sgk2 und sgk3 durch z. B. Insulin und IGF1 über den Pl 3- Kinase- Weg aktiviert. Eine vollständige Charakterisierung der sgk Proteinfamilie hat aber bis jetzt nicht stattgefunden.
Dementsprechend stellt sich die Erfindung die Aufgabe, die sgkl für neue diagnostische und therapeutische Anwendungen nutzbar zu machen.
Überraschenderweise konnte gezeigt werden, daß die Überexpression von intakter sgkl im Vergleich zur Expression von inaktiver sgkl zu einer gesteigerten koagulatorischen Aktivität führt. Die Koagulation wurde in diesem experimentellen System durch den sogenannten Tissue Factor (TF) ausgelöst. Der TF ist ein 47 kDa- Transmembranglycoprotein, das als primäres Bindeglied zwischen vaskulären Zellen oder mononuklearen Zellen und dem hemostatischen System dient. Dabei initiiert TF die Blutkoagulationskaskade (Davie EW, Fujikawa K, Kisiel W. Biochemistry 30: 10363-10370, 1991 ). TF initiiert die Blutkoagulation durch Bindung an die Faktoren VII / Vlla mit hoher Affinität. Der daraus resultierende Komplex initiiert die Aktivierung der Faktoren IX und X mit der daran anschließenden Thrombingenerierung. Thrombin seinerseits katalysiert die Umwandlung von Fibrinogen zu Fibrin, was zur Fibrineinlagerung und Blutgerinnung führt (Nemerson Y. Blood 71 : 1-8, 1998).
Eine erhöhte Expression von TF ist nicht notwendigerweise mit einer erhöhten biologischen Aktivität von TF assoziiert. Funktioneil aktive TF hängt von der Expression einer biologisch aktiven Form an der
Zelloberfläche ab. In glatten Gefäßmuskelzellen (smooth muscle cells SMC) und Monozyten sind nur 10 - 20 % des totalen zellulären TF an der Zelloberfläche verfügbar, was auch die biologisch aktive Form darstellt, während das restliche TF in intrazellulären Pools (ungefähr 30 %) und als latentes Oberflächen-TF (50 - 60 %) vorliegt (Preissner KT, Nawroth PP, Kanse SM. J. Pathol. 190: 360-372, 2000; Schecter AD, Giesen PL, Taby O, Rosenfield CL, Rossikhina M, Fyfe BS, Kohtz DS, Fallon JT, Nemerson Y, Taubmann MB. J. Clin. Invest: 100: 2276-2285, 1997). Es konnte gezeigt werden, daß TF zusätzlich zu seiner koagulatorischen Wirkung (Ruef J, Hu ZY, Yin LY, Wu Y, Hanson SR, Kelly AB, Harker LA, Rao GN, Runge MS, Pattersoa C. Circ. Res.: 24- 33, 1997) eine wichtige Rolle bei Metastasierung von Tumoren und bei der Angiogenese spielt (Lwaleed BA und Cooper AJ. Medical Hypotheses. 55: 470-473, 2000; Verheul HMW, Jorna AS, Hoekman K, Broxterman HJ, Gebbink MFBG, Pinedo HM. Blood: 4216-4221 , 2000). Dadurch zeigen die gefundenen funktionellen Daten, daß die Wirkungen der sgkl geeignet sind, die Expression und/oder Funktion von TF an der Zellmembran zu beeinflussen und damit mittelbar die Gerinnbarkeit des Blutes, die Anheftung von Tumorzellen mit folgender Metastasierung, die Angiogenese, sowie Erkrankungen, bei welchen Angiogenese eine Rolle spielt, zu beeinflussen. Durch Stimulierung der sgkl kommt es zu einer gesteigerten Expression des Tissue Factors, durch Inhibierung der sgkl zu einer verminderten Expression von aktivem Tissue Factor, und damit kann mittelbar stimulierend bzw. inhibierend auf die oben beschriebenen Indikationen eingewirkt werden.
Demzufolge wird die erfindungsgemäße Aufgabe durch den Gegenstand der unabhängigen Ansprüche 1 , 6, 7, 22, 26 und 28 gelöst. Bevorzugte Ausführungen sind in den abhängigen Ansprüchen genannt. Der Inhalt aller dieser Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt der Beschreibung gemacht. Erfindungsgemäß kann mindestens eine Substanz zum Nachweis der Expression und/oder der Funktion von sgkl in eukaryotischen Zellen verwendet werden. Damit ist insbesondere auch eine Diagnose von Erkrankungen, die mit einer gestörten Aktivität von TF im Zusammenhang stehen, möglich. Bei dieser Substanz könnte es sich z. B. um einen Antikörper handeln, der gegen Sgkl gerichtet ist, und in einem dem Fachmann bekannten Nachweisverfahren, wie z. B. ELISA (enzyme-linked-immuno sorbent assay) eingesetzt werden kann. Bei solchen Immunoassays wird der gegen das zu bestimmende Antigen (Sgkl ) gerichtete spezifische Antikörpe . (bzw. bei
Antikörperbestimmungen homologe Testantigene) an eine Trägersubstanz (z. B. Zellulose, Polystyrol) gebunden, an der sich nach der Inkubation mit der Probe Immunkomplexe bilden. In einem nachfolgenden Schritt wird diesen Immunkomplexen ein markierter Antikörper zugeführt. Durch Zugabe eines chromogenen Substrates zum Reaktionsansatz können die Immunokomplex-gebundenen Enzym- Substratkomplexe sichtbar gemacht bzw. die Antigenkonzentration in der Probe über eine photometrische Bestimmung der Immunkomplex- gebundenen Markerenzyme durch Vergleich mit Standards bekannter Enzymaktivität ermittelt werden.
Weitere Substanzen, die für den diagnostischen Nachweis verwendet werden können, sind sogenannte Oligonukleotide, die mit Hilfe der sogenannten Polymerase-Kettenreaktion (PCR) geeignet sind, über ein molekulargenetisches Verfahren, bei dem selektiv bestimmte DNA- Abschnitte amplifiziert werden, einen quantitativen Nachweis von sgkl zu erbringen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden als Substanzen in der erfindungsgemäßen Verwendung Polynukleotide eingesetzt, die mit sgkl unter stringenten Bedingungen hybridisieren können. Mit derartigen Polynukleotiden können beispielsweise Southern oder Northern Blots durchgeführt werden, um so den DNA- oder RNA-Gehalt an sgkl nachzuweisen. Entsprechende Methoden sind dem Fachmann geläufig. Auf diese Weise kann beispielsweise die Transskriptionsrate von sgkl analysiert werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung ist die Substanz, also insbesondere Antikörper, Oligonukleotide und/oder Polynukleotide, zum Nachweis von Mutationen in sgkl geeignet. Interessanterweise hat sich gezeigt, dass bestimmte Mutationen in sgkl mit einer gesteigerten Expression und/oder Aktivität der Kinase einhergehen. Dies wurde insbesondere bei zwei Nukleotidpolymorphismen (SNP) beobachtet. Diese Nukleotidpolymorphismen befinden sich zum einen im Intron 6 (T→ C) bzw. im Exon 8 (C → T) im humanen sgkl . In diesem Zusammenhang wird auf die WO 02/074987 verwiesen, in der gezeigt ist, dass diese Nukleotidpolymorphismen im Zusammenhang mit einer genetischen Prädisposition zur Hypertonie stehen. Ähnliches wurde auch für andere Mutationen, insbesondere Insertionsmutationen, festgestellt. Erfindungsgemäß ist es daher vorgesehen, entsprechende Mutationen, die mit einer gesteigerten Expression und/oder Aktivität von Sgkl in Zusammenhang stehen, durch entsprechende Antikörper, Oligonukleotide und/oder Polynukleotide nachzuweisen und so Rückschlüsse für die Diagnose von Erkrankungen machen zu können, die mit einer gestörten Aktivität von TF im Zusammenhang stehen. Die methodische Vorgehensweise der beschriebenen Verwendungen sind dem Fachmann geläufig. Weitere Verfahren, mit welchen die Expression und/oder Funktion von sgkl quantitativ nachgewiesen werden können, erschließen sich dem Fachmann und werden gleichfalls von der Erfindung umfasst.
Erfindungsgemäß wird ein Wirkstoff für die Beeinflussung, insbesondere die Inhibierung oder Aktivierung der Expression und/oder Funktion von sgkl in eukaryotischen Zellen, zur Behandlung von Erkrankungen, die mit einer gestörten Aktivität von TF im Zusammenhang stehen, beansprucht. Da sgkl , wie auch sgk2 und sgk3, eine Kinase ist, kommen insbesondere dem Fachmann bekannte Kinase-Inhibitoren, wie z. B. Staurosporin, Chelerythrin etc., aber auch andere Substanzen wie z. B. transdominant negative Kinase Mutanten, in Frage. Dem Fachmann sind solche Substanzen bekannt, und man kann sie aus kommerziellen (Sigma, Calbiochem, etc.) sowie nicht kommerziellen Quellen beziehen. Als Aktivatoren können z. B. gentechnisch veränderte Mutanten von sgkl , aber auch z. B. Inhibitoren von. Phosphatasen, genutzt werden. Auch Phosphatase-Inhibitoren sind dem Fachmann bekannt, und sie sind ebenfalls zum Teil kommerziell (Sigma, Calbiochem, etc.) sowie nicht kommerziell erhältlich. Bei Einsatz von Phosphatase-Inhibitoren würde die Dephosphorylierung inhibiert, und dadurch das von sgkl aktivierte Target (TF) im aktivierten Zustand verbleiben. Bevorzugt werden diese Wirkstoffe zur Herstellung eines Medikamentes oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung genutzt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Wirkstoff gegen sgkl selbst gerichtet. Es kann sich bei den Wirkstoffen z. B. um Antisensesequenzen, sogenannte kinase deficient mutants, aber auch um Kinaseinhibitoren, wie die weiter oben schon erwähnten Staurosporin und/oder Chelerythrin bzw. deren Analoga, handeln. Weiterhin kann der Wirkstoff auch ein sogenanntes „small molecular compound" bzw. ein Polynukleotid sein, welches für ein Peptid kodiert, das die Expression von sgkl beeinflußt, vorzugsweise inhibiert oder aktiviert.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Wirkstoff gegen Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologische Vorläufer von sgkl gerichtet. Diese Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologische Vorläufer könnten up- und/oder downstream liegende Mitglieder der sgkl-Signaltransduktionskaskade, Transkriptionsfaktoren, die für den Expressionslevel von sgkl verantwortlich sind, Proteasen, die für den proteolytischen Abbau von Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologische Vorläufer von sgkl , aber auch bis jetzt unbekannte Moleküle, sein, die durch den Wirkstoff beeinflußt werden und an der Expression und/oder Funktion von sgkl beteiligt sind.
Erfindungsgemäß ist es möglich, bekannte sowie . noch unbekannte Wirkstoffe zu verwenden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Wirkstoff, welcher gegen Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologische Vorläufer von sgkl gerichtet ist, ein sogenanntes „small molecular compound", insbesondere ein solches mit einem Molekulargewicht (MG) < 1.000. Small molecular compounds können z. B. Kinase-Inhibitoren, wie z. B. die Immidazol-Derivate SB 203580 (MG 377,4, oder auch SB 202190 (MG 331 ,3) sein, die beide bekannten Inhibitoren der Kinase-Expression sind und von Calbiochem kommerziell vertrieben werden.
Die Erfindung kann genutzt werden, um alle Formen von Erkrankungen, die mit einer gestörten Aktivität von TF im Zusammenhang stehen, zu behandeln. Insbesondere ist hierbei an Koagulopathien und/oder Angiopathien des angeborenen oder erworbenen Typs zu denken. Unter Koagulopathien werden allgemein Gerinnungsstörungen verstanden. Angeborene Koagulopathien (sogenannte Defektkoagulopathien) sind z. B. Dysfibrinogenämie, Hypoprokonvertinämie, Hämophilie B, Stuart- Prower-defect etc.. Erworbene Gerinnungsstörungen sind z. B. Prothrombin-Komplexmangel, Verbrauchs-Koagulopathie, Hyperfibrinolyse, Immunkoagulopathie sowie komplexe Koagulopathien. Beide Formen der Koagulopathien werden verursacht durch Mangel an oder Funktionsstörung von verschieden plasmatischen Gerinnungsfaktoren. Entsprechend der unterschiedlichen Symptomatik werden Koagulopathien mit Blutungstendenz (Minuskoagulopathien) und Koagulopathien mit Thrombosetendenz (Plusagulopathien) sowie entsprechend dem Ort der Ursache hepatogene, kardiogene und Immunkoagulopathien unterschieden. Somit läßt sich durch Aktivierung bzw. Inhibierung von sgkl die Gerinnungsbereitschaft des Blutes herabsetzen bzw. steigern, und somit der medizinischen Indikation anpassen. Ähnliche Überlegungen gelten auch für Angiopathien, d. h. Erkrankungen, die unter den Oberbegriff für Gefäßkrankheiten zusammengefaßt werden, wie z. B. diabetische Angiopathie, diabetische Mikroangiopathie, pulmonale Hypertonie, Arteriosklerose etc. Auch hierbei kann der Wirkstoff insbesondere dazu verwendet werden, angeborene und/oder erworbene Angiopathien zu behandeln.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen wird eine Substanz zum Nachweis bzw. ein Wirkstoff zur Behandlung von pulmonaler Hypertonie und/oder von Arteriosklerose eingesetzt.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der Wirkstoff zur Stimulierung oder Inhibierung der Angiogenese verwendet. Unter Angiogenese wird die Entwicklung von Gefäßwänden, z.B. während der Embryonalentwicklung verstanden, und eine Reihe von angiogeneseabhängigen Erkrankungen sind dem Fachmann bekannt, so z. B. Diabetes mellitus, Tumorbildung und Autoimmunerkrankungen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der Wirkstoff zur Stimulierung oder Inhibierung der Wundheilung eingesetzt.
Die Erfindung betrifft auch ein Diagnosekit. Dieser umfaßt mindestens eine Substanz, die zum Nachweis von Expression und/oder Funktion von sgkl geeignet ist, zur Diagnose von Erkrankungen, die mit einer gestörten Aktivität von TF im Zusammenhang stehen. Der erfindungsgemäße Diagnosekit ist insbesondere dadurch gekennzeichnet, dass als Substanz zum Nachweis der Expression und/oder Funktion von sgkl Antikörper gegen Sgkl , Oligonukleotide für eine Polymerase-Kettenreaktion zur Amplifizierung von DNA- Abschnitten von sgkl und/oder Polynukleotide eingesetzt werden, die unter stringenten Bedingungen mit sgkl hybridisieren können. Ganz besonders bevorzugt ist es hierbei, dass mit diesen Substanzen Mutationen nachgewiesen werden, insbesondere
Nukleotidpolymorphismen und/oder lnsertions(mutationen), die mit einer gesteigerten Expression und/oder Aktivität von sgkl in Verbindung stehen. Diesbezüglich wird auf die obige Beschreibung verwiesen.
Weiterhin können mit einem solchen Kit Erkrankungen diagnostiziert werden, die mit einer Über- oder Unterexpression bzw. -funktion von sgkl verbunden sind. Gezielt können solche Diagnostika in einem Diagnosekit eingesetzt werden, um unter anderem Erkrankungen, wie die weiter oben beschriebenen Koagulopathien, Angiopathien, angiogeneseabhängige Erkrankungen, Erkrankungen der
Wundheilungen etc., nachzuweisen. Auch hierbei kann der Nachweis der Erkrankungen über den Nachweis einer gestörten Expression und/oder Funktion von sgkl erfolgen. Insbesondere kann es sich bei dieser Substanz um eine solche handeln, die auf Nukleotid und/oder Peptid-Ebene bzw. Polynukleotid und/Polypeptid diesen Nachweis erbringt. Zu den weiteren Merkmalen einer solchen Substanz wird auf den entsprechenden bisherigen Text der Beschreibung Bezug genommen.
Darüber hinaus umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Diagnose von Erkrankungen, die mit einer gestörten Aktivität von TF in Zusammenhang stehen. Hierbei wird die Expression und/oder Funktion bzw. Aktivität von sgkl quantitativ in einer Körperprobe eines Patienten nachgewiesen. Bei einer derartigen Körperprobe kann es sich beispielsweise um Flüssigkeiten wie Blut oder Urin oder auch beispielsweise um eine Zellprobe handeln. Der quantitative Nachweis erfolgt beispielsweise mit Antikörpern gegen Sgkl , mit Oligonukleotiden, die für eine Polymerase-Kettenreaktion zur Amplifizierung von DNA- Abschnitten von sgkl geeignet sind und/oder mit Polynukleotiden, die mit DNA und/oder mRNA von sgkl unter stringenten Bedingungen hybridisieren können. Bei diesem Verfahren ist es besonders bevorzugt, mit den genannten Substanzen bestimmte Mutationen, insbesondere Nukleotidpolymorphismen und/oder Insertionen, in sgkl zu detektieren, wobei diese bestimmten Mutationen mit einer gesteigerten Expression und/oder Funktion bzw. Aktivität von sgkl in Zusammenhang stehen. Bei den zu diagnostizierenden Krankheiten handelt es sich beispielsweise um Krankheiten, die mit einer gestörten Blutgerinnung in Zusammenhang stehen oder um Gefäßerkrankungen wie beispielsweise pulmonale Hypertonie oder Arteriosklerose.
Die Erfindung umfaßt ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung, die mindestens einen Wirkstoff enthält, der die Expression und/oder Funktion von sgkl beeinflußt, insbesondere inhibiert oder aktiviert, und vorzugsweise ggf. einen pharmazeutischen Träger. Dabei kann es sich bei dem Wirkstoff um einen Kinase-Inhibitor, wie die bereits weiter oben erwähnten Inhibitoren Staurosporin, Chelerythrin, SB 203580 und SB 202190 bzw. deren Analoga, aber auch andere Substanzen, handeln. Ferner kann es sich bei dem Wirkstoff um ein Polynukleotid handeln, welches ein Peptid, vorzugsweise ein Polypeptid kodiert, wobei dieses Peptid die Expression von sgkl beeinflußt, vorzugsweise inhibiert oder aktiviert. Ein Beispiel für ein erfindungsgemäßes Polypeptid ist ein sogenannter kinase deficient mutant. Weitere Beispiele, wie die Expression und/oder Funktion über gentechnisch veränderte Varianten des Target-Proteins beeinflußt werden kann, sind dem Fachmann geläufig, und können in einer Reihe von Lehr-/Fachbüchern sowie Anleitungen für die Laborarbeit (z. B. Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laborator, 1996; Leonard G, Davis PhD, Michael W, Kuehl Md, James F, Battey MD. McGraw-Hill Professional Publishing, 1995) nachgelesen werden. Bei dem erfindungsgemäßen Wirkstoff kann es sich ferner um einen sogenannten „small molecular compound" handeln, vorzugsweise um ein „small molecular compound" mit einem Molekulargewicht (MG) < 1.000. Ferner kann es sich bei dem Wirkstoff auch um eine sogenannte Antisensesequenz handeln, d. h. eine Sequenz, die in der Lage ist, mit der mRNA eine Doppelstrangduplex auszubilden, und dadurch die Translation eines Zielpolypeptids zu verhindern. Auch kann die Sequenz von sgkl selbst genutzt werden, um eine Uberexpression zu erzielen, z. B. durch Einbau in Vektoren oder Plasmiden, wobei vorher die Zielsequenz auch noch durch „Carrier"-Moleküle, z. B. Promotoren, modifiziert werden kann. Zu weiteren Merkmalen einer solchen Zusammensetzung wird auf den entsprechenden bisherige Text der Beschreibung Bezug genommen.
Schließlich umfaßt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge mindestens eines Wirkstoffes aufweist, der die Expression und/oder Funktion von Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologischen Vorläufern von sgkl beeinflußt, insbesondere inhibiert oder aktiviert. Vorzugsweise kann diese pharmazeutische Zusammensetzung ggf. auch einen pharmazeutischen Träger enthalten. Diese Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologische Vorläufer von sgkl können z. B. weitere Kinasen sein, die an der Regulation der Aktivität von sgkl beteiligt sind, Transkriptionfaktoren, die eine Rolle spielen für den Expressionslevel von sgkl , sowie weitere bekannte oder bis jetzt unbekannte Mitglieder der sgkl in einer Transduktionskaskade, sowie die weiter oben schon beschriebenen Moleküle. Auch Polynukleotide, die ein Peptid kodieren, welches die Expression von Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologischen Vorläufern von sgkl beeinflußt, vorzugsweise inhibiert oder aktiviert, können in einer solchen Zusammensetzung enthalten sein. Auch sogenannte „small molecular compounds", die vorzugsweise ein Molekulargewicht (MG) < 1.000 haben, und die gegen Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologischen Vorläufern von sgkl gerichtet sind, und dabei die Expression bzw. die Funktion dieser Kinase inhibieren oder aktivieren, sind einsetzbar. Zu weiteren Merkmalen eines solchen Wirkstoffes wird auf den entsprechenden bisherigen Text der Beschreibung Bezug genommen.
Die bestehenden und weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen in Verbindung mit den Unteransprüchen und den Figuren. Hierbei können die einzelnen Merkmale jeweils für sich oder zu mehreren in Kombination miteinander verwirklicht sein.
In den Abbildungen zeigen:
Fig. 1 : Stimulation der prokoagulatorischen Aktivität glatter
Gefäßmuskelzellen.
Fig. 2: Regulierung von Tissue Factor durch SGK in humanen vaskulären glatten Muskelzellen (Northern Blot). T: Thrombin (3 U/ml) 4h, C: Kontrolle, W: SGK Wildtyp, M:
SGK Mutante.
Experiment
In Fig. 1 ist die prokoagulatorische Aktivität in % des Maximalwertes gegen die Zeit nach Rekalzifizierung aufgetragen. Bei dem Experiment zu Fig. 1 wurde die prokoagulatorische Aktivität humaner glatter Gefäßmuskelzellen (HAOSMC) durch die Messung der Thrombinbildung während des Gerinnungsvorganges in rekalzifiziertem Blutplättchenarmen Plasma (PPP) gemessen (Beguin S, Lidhout T, Hemker HC: Throm. Haemost. 61 : 25-29, 1998). Dazu wurden konfluente glatte Gefäßmuskelzellen für 24 Stunden in serum-freiem Medium gehalten, dann dreimal in HEPES-Tyrode-Lösung gewaschen, und dann mit humanem PPP inkubiert. Die Bildung von Thrombin wurde durch Zugabe von 16,7 mM CaCI2 zum Inkubationsmedium ausgelöst. Jeweils 20 μl des Überstandes wurden alle ein bis zwei Minuten entnommen und darin die Thrombin-Bildung mit Hilfe des Farbstoffes S-2238 (Haemochrom Diagnostica) bestimmt. Die optische Dichte wurde in ein Spektrophotometer (Uvikon, Contron-instruments) bei 405 nm bestimmt. Die Abhängigkeit der oberflächenprokoagulatorischen Aktivität von glatten Muskelzellen von der Verfügbarkeit des membran-gebundenen Tissue Factors wurde durch neutralisierende Antikörper gegen den humanen Tissue Factor nachgewiesen (Mab# 4508; American Diagnostica; 10 μg/ml 20 Minuten vor der Rekalzifizierung des PPP).
Wie Fig. 1 zeigt, nimmt die prokoagulatorische Aktivität von humanen glatten Gefäßmuskelzellen wenige Minuten nach Zugabe von CaCI2 zu. Diese Zunahme ist bei Expression der inaktiven Kinase (sgk-MT) langsamer als bei der Expression der normalen Kinase (sgk-WT). Die zusätzliche Verabreichung von Thrombin (Thr) führt erwartungsgemäß zu einer Beschleunigung der Zunahme der prokoagulatorischen Aktivität. Auch dabei ist die Wirkung stärker und schneller in Zellen, welche die intakte Kinase exprimieren, als in Zellen, welche eine inaktive Mutante exprimieren. Zellen, welche intakte (Wildtyp) sgk Kinase exprimieren (sgk-WT) weisen zu jedem Zeitpunkt eine höhere prokoagulatorische Aktivität auf als Zellen, welche eine inaktive sgk Mutante exprimieren (sgk-MT), unabhängig davon, ob Thrombin dazugegeben (sgk-WT/Thr bzw. Sgk-MT/Thr) wurde oder nicht. Dieses Ergebnis zeigt eindeutig, daß eine Überexpression von intakter sgkl in glatten Gefäßmuskelzellen zu einer gesteigerten koagulatorischen Aktivität führt. Durch die bekannt wichtige Rolle des TF bei verschiedenen Zellvorgängen zeigt dieses Ergebnis auch, daß eine Überaktivität der sgkl bei einer gesteigerten Expression des Tissue Factors an der Zellmembran die Gerinnbarkeit des Blutes fördern, die Anheftung von Tumorzellen mit folgender Metastasierung ermöglichen sowie die Angiogenese steigern kann. Umgekehrt würde dieser Mechanismus durch Unterdrückung der sgkl -Expression bzw. durch pharmakologische Hemmung der skgl unterdrückt werden.
Fig. 2 zeigt einen Northern Blot mit mRNA des Tissue Factors (TF mRNA) von Kontrollzellen mit Kontrollplasmid (C: Kontrolle), Zellen mit transfizierter aktiver Kinase (W: SGK Wildtyp) und Zellen mit transfizierter inaktiver Kinase (M: SGK Mutante). Bei den Zellen handelt es sich um die entsprechenden humanen glatten Gefäßmuskelzellen wie in obigem Experiment. Als interner Standard ist die 28S rRNA aufgetragen. Als Sonde diente humane TF cDNA. Die Zellen wurden jeweils ohne und mit Thrombin (3 U/ml) für 4 Stunden behandelt. Aus dem Northern Blot ist abzulesen, das bei den Zellen mit aktiver SGK (W) bei Thrombin-Behandlung im Vergleich mit den Kontrollzellen die Transkription der mRNA des Tissue Factors heraufreguliert wird, wohingegen die Transkription der Zellen mit inaktiver SGK-Mutante herabgesetzt ist. Dies zeigt deutlich, dass die Expression von Tissue Factor durch SGK in humanen vaskulären glatten Muskelzellen reguliert wird.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung mindestens einer Substanz zum Nachweis der Expression und/oder Funktion von sgkl in eukaryotischen Zellen, zur Diagnose von Erkrankungen, die mit einer gestörten Aktivität von TF (Tissue Factor) im Zusammenhang stehen.
2. Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz ein Antikörper ist, der gegen Sgkl gerichtet ist.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz ein Oligonukleotid ist, mit welchem in einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) bestimmte DNA-Abschnitte von sgkl amplifiziert werden können.
4. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz ein Polynukleotid ist, das mit sgkl unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann.
5. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz zum Nachweis von Mutationen, insbesondere Nukleotidpolymorphismen (SNP) und/oder Insertionen, in sgkl geeignet ist.
6. Verwendung mindestens eines Wirkstoffes zur Beeinflussung, insbesondere zur Inhibierung oder Aktivierung der Expression und/oder Funktion von sgkl in eukaryotischen Zellen, zur Behandlung von Erkrankungen, die mit einer gestörten Aktivität von TF im Zusammenhang stehen.
7. Verwendung mindestens eines Wirkstoffes zur Beeinflussung, insbesondere zur Inhibierung oder Aktivierung der Expression und/oder Funktion von sgkl in eukaryotischen Zellen, zur Herstellung eines Medikamentes oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Erkrankungen, die mit einer gestörten Aktivität von TF im Zusammenhang stehen.
8. Verwendung nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff gegen sgkl gerichtet ist.
9. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff gegen Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologische Vorläufer von sgkl gerichtet ist.
10. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein Kinase-Inhibitor, vorzugsweise Staurosporin und/oder Chelerythrin bzw. eines von deren Analoga, ist.
11. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekenn-zeichnet, daß der Wirkstoff ein Polynukleotid ist, welches ein Peptid, vorzugsweise ein Polypeptid, kodiert, wobei dieses Peptid die Expression und/oder Funktion von sgkl beeinflußt, vorzugsweise inhibiert oder aktiviert.
12. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein „small molecular compound", vorzugsweise ein „small molecular compound" mit einem Molekulargewicht (MG) < 1.000, ist.
13. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Erkrankungen, die insbesondere mit einer gestörten Aktivität von TF im Zusammenhang stehen, um Koagulopathien handelt.
14. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Koagulopathien um angeborene Koagulopathien handelt.
15. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Koagulopathien um erworbene Koagulopathien handelt. . , .
16. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Erkrankungen, die insbesondere mit einer gestörten Aktivität von TF im Zusammenhang stehen, um Angiopathien handelt.
17. Verwendung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Angiopathien um angeborene Angiopathien handelt.
18. Verwendung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Angiopathien um erworbene Angiopathien handelt.
19. Verwendung nach einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Erkrankungen um pulmonale Hypertonie und/oder Arteriosklerose handelt.
20. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff zur Stimulierung oder Inhibierung der Angiogenese eingesetzt wird.
21. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff zur Stimulierung oder Inhibierung der Wundheilung eingesetzt wird.
22. Diagnosekit, umfassend mindestens eine Substanz zum Nachweis von Expression und/oder Funktion von sgkl , zur Diagnose von Erkrankungen, die mit einer gestörten Aktivität von TF im Zusammenhang stehen.
23. Diagnosekit nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz ein solche gemäß mindestens einem der Ansprüche 2 bis 5 ist.
24. Diagnosekit nach Anspruch 22 oder 23 zur Diagnose von Erkrankungen, die mit einer Über- und/oder Unterfunktion von sgkl verbunden sind.
25. Diagnosekit nach einem der Ansprüche 22 bis 24 zur Diagnose von Koagulopathien, Angiopathien und/oder Angiogenese- abhängige Erkrankungen.
26. Verfahren zur Diagnose von Erkrankungen, die mit einer gestörten Aktivität von TF im Zusammenhang stehen, wobei die Expression und/oder Funktion von sgkl durch quantitativen Nachweis in einer Körperprobe eines Patienten mit Antikörpern gegen Sgkl , mit
Oligonukleotiden, mit welchen in einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) bestimmte DNA-Abschnitte von sgkl amplifiziert werden können und/oder mit Polynukleotiden, die mit DNA oder mRNA von sgkl unter stringenten Bedingungen hybridisieren können, detektiert wird.
27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass mit den Antikörpern, Oligonukleotiden und/oder Polynukleotiden bestimmte Mutationen, insbesondere Nukleotidpolymorphismen und/oder Insertionen, in sgkl detektiert werden.
28. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine wirksame Menge mindestens eines Wirkstoffes, der die Expression und/oder Funktion von sgkl beeinflußt, insbesondere inhibiert oder aktiviert, und ggf. einen pharmazeutischen Träger.
29. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Wirkstoff um einen Kinase- Inhibitor, vorzugsweise um Staurosporin und/oder Chelerythrin bzw. eines von deren Analoga, handelt.
30. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein Polynukleotid ist, welches ein Peptid, vorzugsweise ein Polypeptid kodiert, wobei dieses Peptid die Expression und/oder Funktion von sgkl beeinflußt, vorzugsweise inhibiert oder aktiviert.
31. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein „small molecular compound", vorzugsweise ein „small molecular compound" mit einem Molekulargewicht (MG) < 1.000, ist.
32. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 28, umfassend eine wirksame Menge mindestens eines Wirkstoffes, der die Expression und/oder Funktion von Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologischen Vorläufern von sgkl beeinflußt, insbesondere inhibiert oder aktiviert, und ggf. einen pharmazeutischen Träger.
33. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein Polynukleotid ist, welches ein Peptid, vorzugsweise ein Polypeptid kodiert, wobei dieses Peptid die Expression und/oder Funktion von Aktivatoren,
Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologischen Vorläufern von sgkl beeinflußt, vorzugsweise inhibiert oder aktiviert.
34. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein . „small molecular compound", vorzugsweise ein „small molecular compound" mit einem Molekulargewicht (MG) < 1.000, ist.
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