JP2004516837A - 慢性炎症性気道疾患の炎症性状態に陽性の影響を与える物質を同定するための方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、炎症プロセスに関与するキナーゼ及び炎症性疾患に陽性の影響を与えるように該キナーゼの機能を調節することに関する。
Description
【0001】
序論
本発明は、炎症過程、特に、マクロファージが重要な役割を果たす慢性炎症性気道疾患の調節の分野に関する。炎症過程は、本発明により炎症過程に関与することが確認されているキナーゼの生物活性に影響を及ぼすことにより調節することができる。
マクロファージが重要な役割を果たす慢性炎症性気道疾患の例は、慢性気管支炎(CB)である。CBは、気流が制限されているか否かに関わらずに起こり得、慢性閉塞性肺疾患(COPD)を含む。CBは、以下のいくつかの疾患の症状を含む複雑な疾患である:咳及び粘質過分泌を特徴とする慢性気管支炎、炎症及び気管支周囲線維症を含む末梢気道病変、気腫及び気流制限。CBは、肺機能が加速度的かつ不可逆的に減退することを特徴とする。CB発症の主要危険因子は、連続的にタバコを喫煙することである。全ての喫煙者の約20%だけがCBに苦しめられるので、遺伝的素因もまた疾患の一因となっていると思われる。
【0002】
CBの初期段階において最初に起こるのは炎症であり、小気道及び大気道に影響を与える。タバコを喫煙することに引き起こされる刺激が、マクロファージ及び好中球を誘引する。喫煙者の痰ではこれらの数が増加している。絶え間なく喫煙すると、傷害部位に炎症細胞を補充するマクロファージ、好中球及び上皮細胞から媒介物が放出されることにより、肺における進行性炎症性反応となる。これまで、CBの経過を戻すのに利用できる治療がなかった。禁煙により、肺機能の減退を減らすことができる。
現在までに、患者の症状を幾分軽減する薬剤がわずかに知られている。持続性β2−アゴニスト及び抗コリン作用剤を適用すると、一時的に気管支が拡張する。LTB4−阻害剤のような炎症性現象に用いるための様々なアンタゴニストが研究されている。
慢性炎症性気道疾患を治療するための薬剤を提供することが常に必要とされている。慢性炎症性気道疾患の原因は、活性化された炎症性免疫細胞、例えばマクロファージにあると考えることができる。それ故、炎症過程の原因を除くよう、マクロファージの機能を調節する薬剤が必要である。
【0003】
発明の説明
本発明において、炎症過程に関与するマクロファージ、特に慢性炎症性気道疾患に関与するマクロファージ、更に特に慢性気管支炎またはCOPDに関与するマクロファージが、差別的に発現した核酸配列及びタンパク質発現のパターンを示すことが分かり、これは、健康なドナーまたは炎症を起こしたドナー由来のマクロファージの遺伝子発現のパターンとは異なるものであり、ここで、後者は、活性化状態のマクロファージを含有する。それ故、マクロファージは種々の炎症状態において種々の活性レベルを示す。例えば、本発明において、COPD喫煙者の炎症過程に含まれるマクロファージは、健康な喫煙者由来のマクロファージとは異なる遺伝子発現パターンを示すことが、つまり、COPD喫煙者におけるマクロファージが、以下に「活性化過剰」状態と称した、異なる状態を示すことが分かった。本発明により、活性化過剰を維持するか又は活性化過剰に関与するキナーゼを調節する物質を同定することにより、マクロファージの活性化過剰状態を軽減するか又は活性化過剰を阻害する可能性を提供する。
【0004】
本明細書において、用語「慢性炎症性気道疾患」は、例えば、慢性気管支炎(CB)及び慢性閉塞性肺疾患(COPD)を含む。用語「慢性炎症性気道疾患」がCB及びCOPDを意味するのが好ましく、CBまたはCOPDを意味するのがより好ましい。
本発明は、活性化過剰でないマクロファージと比べて活性化過剰マクロファージにおいて差別的に発現する核酸配列の同定に基づく。そのような核酸配列は、炎症過程、好ましくは慢性炎症性気道疾患に関与するマクロファージの活性化過剰状態を維持するか又は活性化過剰状態に関与するキナーゼをコードする。そのような差別的に発現する核酸配列又は該核酸配列にコードされるタンパク質はまた、以下に、それぞれ本発明の差別的に発現する核酸配列又はタンパク質と命名した。特に、本発明は、差別的に発現する核酸配列及びタンパク質発現パターンに起因する、マクロファージにおける表現型の変化と、炎症過程にマクロファージが関与することとの関連を教示するものであり、従って、種々の用途の根拠(basis)を提供する。例えば、本発明は、本発明のマクロファージタンパク質又は本発明の差別的に発現する核酸配列の発現レベルを測定するための方法及び試験系を提供し、それにより、例えば、哺乳類、好ましくはヒト、特に好ましくは炎症過程に罹っているヒト、特に慢性炎症性気道疾患、特に好ましくは慢性気管支炎又はCOPDに罹っているヒトにおいて活性化過剰マクロファージに関連する炎症過程の診断又は監視方法を提供する。本発明はまた、本発明の差別的に発現する核酸配列又はタンパク質により物質を同定する方法であって、該物質が調節をする前記方法に関する。ここで、該物質が調節をするとは、該物質が、本発明の差別的に発現する核酸配列又はタンパク質に阻害剤又は活性剤として作用し、それによりマクロファージの活性化過剰を阻害するかマクロファージの活性化過剰状態を軽減して慢性炎症過程に陽性の影響を与えることをいう。それにより哺乳類、好ましくは前記疾患に罹っているヒトの治療をすることができる。本発明はまた、マクロファージにおいて本発明の差別的に発現する核酸配列又はタンパク質を選択的に調節する方法であって、該タンパク質又は差別的に発現する核酸配列のモジュレータであると測定された物質を投与することを含む前記方法に関する。本発明は、炎症過程の治療が必要な患者を治療するために前記物質を使用することを含む。
【0005】
本発明の第一段階において、本発明の差別的に発現する核酸配列は、活性化過剰でないマクロファージと比べて活性化過剰マクロファージにおいて異なる発現パターンを有するものと確認された。簡単のため、特にCOPDに関与するマクロファージの調査について説明するが、他の慢性炎症性気道疾患、例えば、他の慢性気管支炎症状に罹っている被験者由来のサンプルから同等の結果を得ることができる。異なる発現パターンを調査することにより、以下の実施例で例証するように、炎症過程に関与すマクロファージの活性化状態に応じて発現する、一連の差別的に発現する核酸配列を同定することになる。
【0006】
簡単に言えば、そのような本発明の差別的に発現する核酸配列は、活性化過剰マクロファージ由来の細胞抽出物又は細胞を使用する、比較発現プロファイリング実験により同定する。すなわち、例えば、COPDにおける炎症部位由来のものと、該疾患に罹っていないが、タバコの煙にさらされているような同様の炎症を起こしている状態にあるコントロールの対応する部位とを比較する。
【0007】
第二段階において、本発明のタンパク質は、差別的に発現する核酸配列によりコードされるものと確認される。すなわち、活性化過剰を媒介する役割を果たすか又は活性化過剰状態を維持する役割を果たすタンパク質である。本発明の差別的に発現する核酸配列のクラスは、活性化過剰されていないマクロファージにおけるコントロールレベルよりも、低いレベルか又は高いレベルにおいて、本発明により活性化過剰されているマクロファージにおいて発現することを特徴とする、キナーゼのクラスをコードするものであると確認することが出来る。そのような本発明のキナーゼを、以下、DHAM−キナーゼ(“活性化過剰マクロファージにおいて調節解除された(deregulated in hyperactive macrophage)”−キナーゼ)と称する。本発明のDHAM−キナーゼの好ましい例としては、配列表に記載した、グアニレートキナーゼ1(GUK1)、セリン−スレオニン−キナーゼPAK2、又はセリン−スレオニン−キナーゼPRK2があげられる。
【0008】
本発明のDHAM−キナーゼの生物学的活性、すなわち、本発明の炎症過程においてマクロファージの関与を媒介することは、例えば、基質リン酸化及び/又は基質認識キナーゼ及び/又は基質結合等の他のDHAM−キナーゼ機能に依存する。
本発明はまた、DHAM−キナーゼ、特に既述の好ましいキナーゼの機能的同等物、誘導体、変異体(variant)、突然変異体(mutant)及びフラグメントに関する。本明細書において、「機能的(functional)」とは、それぞれ対応するDHAM−キナーゼの、生物学的活性に関与する機能、例えば、基質リン酸化、基質認識及び/又は基質結合を有することを意味する。
【0009】
本発明により、コントロールレベルよりも低いレベルにおいて発現するDHAM−キナーゼの生物学的活性を、マクロファージの活性化過剰状態を軽減するか又は活性化過剰を阻害するよう活性化するのが好ましく、コントロールレベルよりも高いレベルで発現するDHAM−キナーゼの生物学的活性を、マクロファージの活性化過剰状態を軽減するか又は活性化過剰を阻害するよう阻害するのが好ましい。
本発明の一態様において、本発明は、物質がDHAM−キナーゼの活性剤であるか又は阻害剤であるかを測定する試験方法に関する。DHAM−キナーゼは慢性炎症性気道疾患に関与しており、炎症を媒介する役割を果たすので、DHAM−キナーゼの生物学的活性を調節する物質は、慢性炎症性気道疾患を治療するのに使用することもできるし、物質の機能を最適化し、最適化された物質が慢性炎症性気道疾患を治療するのに適当であるようにするためのリード化合物として使用することもできる。本発明の方法を行うために、本発明の試験系を使用することができる。
【0010】
本発明はまた、物質がDHAM−キナーゼの活性剤であるか又は阻害剤であるかを測定するための試験系に関する。本発明の方法を行うのに有用な試験系は、細胞系又は無細胞系を含む。例えば、本発明の一態様は、例えば、測定可能な読み出し(readout)として、レポーター遺伝子、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子等の発現を使用する、差別的に発現する核酸配列の発現レベルに作用する物質を試験できるように設計された試験系に関する。本発明の別の態様は、天然の又は人工的なものであるが適当なDHAM−キナーゼ活性剤により、例えば適当なキナーゼ等により、例えばDHAM−キナーゼの酵素活性等の活性化を干渉する物質、又は、例えばDHAM−キナーゼの酵素活性等の機能と直接相互作用する物質を試験できるように設計された試験系に関する。
【0011】
本発明の試験系は、DHAM−キナーゼ又はDHAM−キナーゼの機能的同等物、誘導体、変異体、突然変異体又はフラグメント、該タンパク質をコードする核酸又はDHAM−キナーゼの機能的同等物、誘導体、変異体、突然変異体又はフラグメント及び/又は制御要素をコードする核酸を含み、ここでDHAM−キナーゼの機能的同等物、誘導体、変異体、突然変異体又はフラグメント;DHAM−キナーゼをコードする核酸若しくはDHAM−キナーゼの機能的同等物、誘導体、変異体、突然変異体又はフラグメントをコードする核酸は、試験する物質と相互作用することができ、直接相互作用することにより、測定可能な読み出しがDHAM−キナーゼのそれぞれの生物学的活性の変化を示すか、及び/又はDHAM−キナーゼの発現の変化を示す。
【0012】
本発明の試験系は、例えば、当業界で周知の要素を含む。例えば、無細胞系は、例えば、DHAM−キナーゼ又はDHAM−キナーゼの機能的同等物、誘導体、変異体、突然変異体又はフラグメント、DHAM−キナーゼをコードする核酸又はDHAM−キナーゼの機能的同等物、誘導体、変異体、突然変異体又はフラグメントをコードする核酸を、溶解形態又は結合形態で、又は細胞区画又は小胞内に含むことができる。適当な細胞系としては、例えば、適当な原核細胞又は真核細胞、例えば、DHAM−キナーゼ又はDHAM−キナーゼの機能的同等物、誘導体、変異体、突然変異体又はフラグメント、DHAM−キナーゼをコードする核酸又はDHAM−キナーゼの機能的同等物、誘導体、変異体、突然変異体又はフラグメントをコードする核酸を含む原核細胞又は真核細胞があげられる。本発明の前記試験系に使用するのに適当な細胞は、組換え技術により、例えば、所望のDHAM−キナーゼ又はDHAM−キナーゼの機能的同等物、誘導体、変異体、突然変異体又はフラグメントを発現するのに適当な組換えベクターで形質転換するか又は形質移入した後に得ることができる。或いは、そのような適当な細胞は、所望のDHAM−キナーゼ又はDHAM−キナーゼの機能的同等物、誘導体、変異体、突然変異体又はフラグメントを発現する天然原料から単離される細胞又は細胞系であり得る。本発明の試験系は、対象の物質がDHAM−キナーゼの活性剤であるか又は阻害剤であるかを試験するのが望まれているか又は必要であるとき、DHAM−キナーゼの天然又は人工のリガンドを含むことができる。
【0013】
本発明の試験方法は、例えば、細胞系を細胞系の表現型を監視するのに使用するとき、読み出しを測定すること、例えば試験系における表現型の変化を測定することを含む。そのような変化は、例えば以下の実施例に詳細に説明するように、DHAM−キナーゼ活性又は阻害に対して起こる細胞の、天然の応答又は人工的な応答における変化であり得る。
本発明の試験方法は、一方では物質が本発明の活性剤であるか又は阻害剤であるかを測定するのに適当な高速処理(high throughput)試験に有用であり得る。また、例えば、高速処理試験において確認されたヒット化合物又はリード化合物の二次試験又は確認にも有用であり得る。
【0014】
本発明はまた、本発明の方法において本発明のDHAM−キナーゼの活性剤又は阻害剤であると確認された物質に関する。本発明の物質は、本発明のDHAM−キナーゼの機能を活性化又は阻害することができる、好ましくは阻害することができる、あらゆる化合物である。DHAM−キナーゼの機能を活性化又は阻害する方法の別の例としては、DHAM−キナーゼの発現レベルに影響を与えることである。DHAM−キナーゼの機能を活性化又は阻害する方法の別の例としては、適用した物質の性質に応じて可逆的又は不可逆的に行うことができる物質をDHAM−キナーゼに直接結合させ、それによってDHAM−キナーゼの機能的ドメインを活性化するか又は阻止することである。
従って、DHAM−キナーゼの生物学的活性を活性化するか又は阻害するのに有用な物質としては、差別的に発現する核酸配列の発現に作用する物質、例えば、対応する遺伝子又は調節配列とハイブリダイズし、それにより遺伝子発現に影響する核酸フラグメント、又はDHAM−キナーゼ自体又は他の天然に発生する細胞成分により活性化又は阻害するのに作用する物質、例えば、本発明のタンパク質に酵素学的に作用する他のタンパク質、例えば、タンパク質キナーゼがあげられる。
【0015】
それ故、本発明は、例えば、DHAM−キナーゼの遺伝子をコードする核酸配列、又は該核酸配列のフラグメント、誘導体、突然変異体又は変異体である物質であって、該核酸配列又はそのフラグメント、誘導体、突然変異体又は変異体が、遺伝子発現レベルに影響を与えることができる前記物質、例えば、アンチセンス核酸、リボザイムとして適当な核酸分子、又は三重らせん形成に適当な核酸分子に関する。
本発明はまた、例えば、DHAM−キナーゼに直接結合しているか又はDHAM−キナーゼの活性化と相互作用し、それによりその生物学的活性に影響を与える有機若しくは無機化合物又は抗体である物質に関する。
【0016】
更なる観点において、本発明は、DHAM−キナーゼをコードする核酸、好ましくはメッセンジャーRNA、又は細胞、好ましくはマクロファージ、より好ましくは炎症部位から単離したマクロファージ、さらにより好ましくは慢性炎症性気道疾患に罹っている被験者の炎症部位から単離したマクロファージにおける本発明のタンパク質自身の発現レベルを測定するための方法に関する。そのような方法は、例えば、物質が本発明の活性剤であるか又は阻害剤であるか測定するための上に概要を示した方法において、差別的に発現する核酸配列発現レベルに物質が影響を与えることができるかどうか試験するのに使用することができる。しかしながら、本発明の発現レベルを測定するための方法はまた、マクロファージの活性化状態を試験するのに、例えば、活性化過剰マクロファージにより引き起こされる疾患の治療の結果を調査するか又は診断するために使用することができる。前記マクロファージは、哺乳類であるのが好ましく、ヒト細胞であるのがより好ましい。従って、本発明のマクロファージは、哺乳類の炎症部位、より好ましくはヒトの炎症部位から得るのが好ましい。従って、本発明はまた、慢性炎症性疾患の診断方法、又は該疾患の監視方法、例えば、マクロファージにおいてDHAM−キナーゼをコードする核酸、好ましくはメッセンジャーRNA、又はDHAM−キナーゼ自身の発現レベルを測定することを含む、慢性炎症性疾患の治療が必要な患者の治療結果を監視する方法に関する。
【0017】
本発明のタンパク質をコードする核酸、好ましくはメッセンジャーRNA、又は本発明のタンパク質自身の発現レベルを測定する方法は、発現レベルの測定目的に応じ、ルシフェラーゼアッセイ等のレポーター遺伝子駆動アッセイを介するか又はハイブリダイゼーション技術を介する各RNA転写物の濃度を測定するといった公知の方法により、又はそれぞれの抗体を使用する本発明のタンパク質のタンパク質濃度を測定することにより行うことができる。
本発明はまた、慢性炎症性気道疾患を治療するための本発明の物質の使用に関する。本発明の別の態様は、活性剤又は阻害剤であると測定された本発明の物質の少なくとも1種を含有する医薬組成物に関する。本発明の組成物は、それ自体公知の方法により、例えば、慣用の混合、溶解、粉砕、ドラジェ製造、微粒子化(levigating)、粉末化、乳化、カプセル化、包括化(entrapping)又は凍結乾燥方法により製造することができる。
【0018】
本発明の活性化するか又は阻害する物質を慢性炎症性気道疾患を治療するための薬剤として使用するために、該物質を動物モデルで、例えば、炎症性気道疾患に罹っている動物又は本発明のDHAM−キナーゼを発現するトランスジェニック動物で試験することができる。
本発明の物質の毒性及び治療効果は、細胞培養及び動物実験をしてIC50、LD50及びED50を測定することを含む、標準的な医薬的方法により測定することができる。得られたデータは、動物、より好ましくはヒトの投与量範囲を見積もるのに使用する。投与量範囲はまた投与形態(錠剤、カプセル、エアゾールスプレー、アンプル等)及び投与ルート(例えば、経皮、経口、口内(buccal)、点鼻、非経口、吸入、気管内又は直腸)にもまた依存する。
【0019】
有効成分として本発明の物質の少なくとも1種を含有する医薬組成物は、慣用の方法により処方することができる。そのような組成物の製造方法は、例えば、“Remington Pharmaceutical Science”に記載されている。本発明の物質の少なくとも1種を処方するのに有用な成分の例は、国際公開公報第99/18193号パンフレットに記載されている。この文献は本明細書に含まれるものとする。
更なる観点において、本発明は、本発明の慢性炎症性気道疾患を治療する方法に関する。該方法は、慢性炎症性気道疾患の治療が必要な生物、好ましくはヒトに、DHAM−キナーゼの活性剤であるか又は阻害剤であるかを測定するための本発明の方法により活性剤であるか又は阻害剤であると測定された少なくとも1種の物質を含有する医薬組成物の適当な量を投与することを含む。
【0020】
他の態様において、本発明は、本発明のDHAM−キナーゼの活性剤であるか又は阻害剤であると測定された物質を投与することを含む、マクロファージにおけるDHAM−キナーゼ濃度を選択的に調節する方法に関する。
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、限定的に解釈すべきではない。しかしながら、以下の実施例は本発明の最も好ましい態様を示すものである。
【0021】
実施例
実施例1:比較発現プロファイリング
以下は、本発明のDHAM−キナーゼを同定するために、どのようにしたら比較発現プロファイリングを行うことが出来るかを具体的に示すものである。
1.1. 被験者の選択
3群の被験者について研究した:健康な非喫煙者、健康な喫煙者及びCOPD患者。
肺機能を評価するために、被験者は肺活量を測定しなければならない。年齢及び身長に基づく簡単な計算を使用して結果を特徴付けた。COPD患者については、その予測FEV1%が<70%の者について研究した。健康な喫煙者は、COPD患者と年齢及び喫煙暦を合わせたが正常な肺機能を有する者である。健康な非喫煙者は、正常な肺機能を有し、これまで喫煙したことがない。健康な非喫煙者の群は、喘息を除外するためメタコリン挑戦(challenge)を有する。この方法は、各投与間で肺活量を測定することにより、被験者に投与するメタコリン量を増やすことを必要とする。FEV1が20%低下したとき、試験を中止し、PC20を計算する。これがFEV1を20%低下させるメタコリンの投与量に相当する。喘息が存在しない証拠として、32より大きい値を必要とする。全被験者は通常のアレルゲンに対する皮膚プリックテストをし、陰性の結果を有することを必要とする。これによりアトピー性の個体を除く。被験者の病歴を監視し、付随する(concomitant)疾患を除外した。
【0022】
1.2. BAL (気管支肺胞洗浄 (bronchoalveolar lavage) )方法
BAL前にミダゾラムを投与して被験者を落ち着かせた。局所麻酔スプレーを使用して咽頭の裏に麻酔をした。7mm オリンパス気管支鏡を使用した。洗浄領域は右側中央部の突出部(lobe)である。250mlの滅菌生理食塩水を点滴し(instill)、直ぐに吸引した。得られた吸引液はマクロファージを含有した。
1.3. BAL 処理
滅菌ガーゼを通してBALを濾過し、細片を除去した。該細胞をHBSS中で2回洗浄し、1ml HBSS (Hank’s Balanced Salt Solution)に再懸濁し、計測した。マクロファージを引き出して、15 ml Falcon blue−cap ポリプロピレンを使用してペレットにし、10,000,000細胞当たり1 ml Trizol試薬濃度においてTrizol 試薬(Gibco BRL Life Technologies)に再懸濁し、次いで、−70℃において凍結した。
【0023】
1.4. 差別的( Differential )遺伝子発現分析
全RNAを、実施例1.3により得たマクロファージサンプルから抽出した。ピペットを通してTrizol中細胞懸濁液をホモジナイズし、室温で5分間インキュベートした。Trizol 1mL当たり200μLのクロロホルムを添加し、該混合物を注意深く15秒間混合し、室温で3分以上インキュベートした。サンプルを4℃において、15分間10000gでスピンした。上相を新しい反応チューブに移し、室温で10分間、Trizol 1mL当たり0.5 mlのイソプロパノールを添加することによりRNAを沈殿させた。次いで、4℃において10000gで10分間ミクロ遠心分離器を使用することにより該沈殿物をペレット状にし、該ペレットを75%エタノールで2回洗浄し、風乾し、及びDEPC−H2Oに再懸濁した。
Qiagen RNeasy Total RNA単離キット(Qiagen)によりRNAの洗浄を行い、RNAの純度を上げた。RNAの純度は、アガロースゲル電気泳動により測定し、濃度は260nmにおけるUV吸収により測定した。
【0024】
5μgの各RNAをcDNA合成に使用した。第一及び第二ストランド合成は、SuperScript Choice system (Gibco BRL Life Technologies)により行った。総体積11μLのRNA及び1μLの100μM T7−(dt)24プライマー中で、配列番号1に記載の配列を70℃まで10分間加熱し、氷上で2分間冷却した。最終濃度の1倍(1×)にするための第一ストランド溶液、濃度10 mMにするためのDTT及び最終濃度0.5mMにするためのdNTP混合物を、総体積18μLに添加した。該反応混合物を42℃において2分間インキュベートし、2μLのSuperscript II 逆転写酵素(200 U/μL)を添加した。第二ストランドを合成するため、1.15x第二ストランド溶液、230μM dNTPs、10U E.coli DNA リガーゼ(10U/μL)、E.coli DNA ポリメラーゼ(10 U/μL), RNase H (2U/μL)を含有する130μLの混合物を、第一ストランド合成の反応に加え、ピペットで注意深く混合した。16℃において2時間第二ストランド合成を行い、次いで2μLのT4 DNA ポリメラーゼ(5U/μL)を添加し、16℃で5分間インキュベートし、10μLの0.5 M EDTAを添加することにより、反応を停止した。
【0025】
cRNA合成の前に、二本鎖cDNAを精製した。該cDNAを等量のフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)と混合し、未結合のヌクレオチドからcDNAを分離するために、ミクロ遠心分離中で相ロック(lock)ゲル(Eppendorf)のゲルマトリックスによりスピンした。水相を酢酸アンモニウム及びエタノールで沈殿させた。続いて、cDNAをin vitro転写に使用した。製造業者(ENZO Diagnostics)の手順に従いENZO BioArray High Yield RNA Transcript Labeling Kitを使用してcRNA合成を行った。簡単に説明すると、cDNAを、総体積40μLの1x HY 反応溶液、1×ビオチンラベルしたリボヌクレオチド、1x DTT、1x Rnase阻害剤混合物及び1x T7 RNAポリメラーゼと共に37℃で5時間インキュベートした。次いで、該反応混合物をRneasyカラム(Qiagen)を通して精製し、酢酸アンモニウム及びエタノールでcRNAを沈殿させ、最後にDEPC処理水に再懸濁した。260nmにおいてUV分光器により濃度を測定した。残りのcDNAを1x 断片化緩衝液(5x断片化緩衝液:200mM 酢酸トリス、pH 8.1、 500 mM KOAc、150 mM MgOAc)と共に94℃において35分間インキュベートした。
【0026】
DNAチップをハイブリダイズするために、15μgのcRNAを使用し、総体積300μLの50pMビオチンラベルしたコントロールB2 オリゴヌクレオチド、配列番号2に示した配列、1x cRNAカクテル、0.1mg/ml herring 精子DNA、0.5mg/mlアセチル化BSA、1x MES (2−[N−モルホリノ]−エタンスルホン酸)ハイブリダイゼーション溶液と混合した。該ハイブリダイゼーション混合物を99℃まで5分間混合し、45℃に10分間で冷却し、200μLの混合物を使用してプローブ配列に満たした。45℃において60rpmで16時間ハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーション後、チップ上のハイブリダイゼーション混合物を、300μLの非ストリンジェント洗浄液(100 mM MES, 100 mM NaCl, 0.01% Tween 20)と置換した。このチップをAffymetrix Fluidicsステーションに挿入し、EukGE−WS2手順により洗浄及び染色した。チップ当たりの染色溶液は、600μLの1x 染色液(100 mM MES, 1 M NaCl, 0.05% Tween 20)、2mg/ml BSA、10μg/ml SAPE (ストレプトアビジンフィコエリトリン) (Dianova)を含有し、抗体溶液は、1x染色液、2 mg/ml BSA、0.1 mg/ml ヤギIgG, 3μg/ml ビオチニル化抗体を含有した。洗浄及び染色処理後、チップをHP Gene Array Scanner (Hewlett Packard)でスキャンした。
【0027】
データ分析は、COPD喫煙者から単離したRNAでハイブリダイズしたチップと、健康な喫煙者から単離したRNAでハイブリダイズしたチップとの比較により行った。
以下に、差別的に発現した遺伝子及び本発明の方法により確認したその機能を具体的に示す。
【0028】
実施例2 : PAK2
COPD患者において下方制御していると一貫して確認されている遺伝子は、PAK2 (配列番号3, 4)をコードする。PAK2は、活性化Cdc42及びRacと優先的に相互作用するが、Rhoとは相互作用しないセリン/スレオニンキナーゼである。この組合せ(association)により、PAK2の自己リン酸化及びそのキナーゼ活性の活性化を引き起こす。PAK2は、ミオシンII、MLCK (ミオシン軽鎖キナーゼ)、p47phox (NADPHオキシダーゼ)、及びRaf−1をリン酸化することができる。PAK2は、アクチン再編成(reorganization)及び細胞運動に関与する(Knaus et al. 1995, Frost et al. 1996, Goeckeler et al. 2000, Zeng et al. 2000)。
PAK2は、健康な喫煙者と比較してCOPD喫煙者では、一貫して下方制御であることが分かった(47%)。これを、“avg diff”値(表1)及び“倍(fold)変化”値(表2)に示した。COPD喫煙者と健康な喫煙者を含む2つの別々の群のp値は0.001及び0.004であった。
【0029】
【表1】
【0030】
【表2】
2.1. PAK2 のクローニング
健康なボランティアから単離したヒトPMNs (多形核好中球)から抽出した全RNAから、PAK2をクローン化した。5μg RNAを、オリゴ(dt)18プライマー、1x第一ストランド緩衝液、10 mM DTT、0.5 mM dNTPs及び2U Superscript II (Gibco BRL)により42℃において50分間cDNAに逆転写した。次いで、70℃、15分間で該反応を終了し、cDNA濃度をUV分光光度計で測定した。PAK2を増幅させるために、PAK2用の配列特異性プライマー(配列番号5の前(forward)プライマー及び配列番号6の逆(reverse)プライマー)10pmoles及びcDNA100ngをPCRに使用した。反応条件は以下の通りである:94℃で2分間、94℃で30秒間を35サイクル、53℃で30秒、72℃で90秒、次いでTaq DNA−ポリメラーゼにより72℃で7分間。反応混合物を2%アガロースゲルで分離し、約1000bpのバンドを切断し、QIAEX II 抽出キット(Qiagen)を使用して精製した。精製したバンドの濃度を測定し、約120ngを、300ngのpDONR201、Gateway system (Life Technologies)のドナーベクター、1x BPクローナーゼ(clonase)反応緩衝液、Bpクローナーゼ酵素混合物(総体積20μL)と共に、25℃で60分間インキュベートした。次いで、反応物を2μLのプロテイナーゼKと共にインキュベートし、37℃で10分間インキュベートした。次いで、該反応混合物をコンピテントDB3.1細胞に電気穿孔し、カナマイシン含有プレートで培養した。配列決定によりクローンを確認した。データベースに入れた配列と同じ配列(acc. U24153)を有する、pDONR−PAK2と命名したクローンを次の実験に使用した。
【0031】
2.2 PAK2 発現ベクター
上述したPAK2含有ベクターを使用して、CMVプロモータの制御下でPAK2が発現する、Gateway cloning system (Life Technologies)の“attR1”及び“attR2”組換え部位を含む発現ベクターpcDNA3.1(+)/attRにPAK2用cDNAを移した。150ngの“エントリーベクター”pDONR−PAK2を、TE(Tris/EDTA)で20μLにした、150ngの“目的(destination)ベクター”pcDNA3.1(+)/attR、4μLのLR クローナーゼ酵素混合物及び4μLのLR クローナーゼ反応緩衝液と共に混合し、25℃で60分間インキュベートした。次いで、2μLのプロテイナーゼK溶液を添加し、37℃で10分間インキュベートした。氷上で30分間、DNAと共に細胞をインキュベートした後、42℃で30秒間熱ショックを与えることにより、1μLの反応混合物を50μLのDH5αに形質転換した。細胞に熱ショックを与えた後、450μLのS.O.C.を添加し、37℃で60分間細胞をインキュベートした。細胞(100μL)を、100μg/mlアンピシリンを含有するLBプレートに塗抹し、一晩インキュベートした。
【0032】
挿入物としてPAK2と共にpcDNA3.1(+)/attRを含有するコロニーをpcDNA/PAK2と命名し、形質移入研究に使用した。
PAK2の恒常的に活性な突然変異体で同様のクローニング反応を行った。この突然変異体は、ヌクレオチドACC(コード領域の位置1420−1422)とGAAとを置換することにより生成した。それにより、461位におけるアミノ酸スレオニンを、グルタミン酸と置換した。該クローンをpcDNA/PAK2T461Eと呼ぶ。
【0033】
2.3. PAK2 用の Myc で標識した( tagged )発現ベクター
PAK2のC末端をMycで標識したものを生成するために、停止コドンを欠くPAK2のコード配列を、配列番号7の前プライマー及び配列番号8の逆プライマーで、上述した反応条件によりPCRで増幅した。PCR生成物をEcoRI及びXbaIで消化し、1%アガロースゲルで分離し、切断し、及びQIAEX II抽出キット(Qiagen)で精製した。次いで、該生成物をフレーム内でpcDNA3.1/myc−His (Clontech)にクローン化し、EcoRI及びXbaIで消化した。同様に、PAK2の恒常的に活性な突然変異体のクローニング配列を、pcDNA3.1/myc−Hisにクローン化した。
【0034】
2.4.Myc で標識化した PAK2 の精製
Mycで標識化したPAK2を免疫沈降するために、Dynabeads M−280 (Dynal)に結合している抗mycマウスモノクローナル抗体(9E10) (Santa Cruz Biotechnology)を使用した。緩衝液A (20 mM Tris/HCl、pH 8、0.2 mM EDTA、10%グリセロール、5 mM MgCl2、100 mM KCl)中、1mg/ml BSAの存在下、10分間、ダイナビーズ(dynabeads)を予備インキュベートした。ビーズを2回洗浄し、インキュベート前と同体積の緩衝液A中に再懸濁した。5μgの抗myc抗体及び50μLのダイナビーズM−280と共に室温で2時間クローニングを行った。次いで、500μLのRIPA緩衝液(10 mM Tris/HCl、pH 8、140 mM NaCl、1 mM EDTA、1% NP40、0.1%SDS、1%デオキシコーレート)で3回洗浄し、次いで緩衝液Aで2回洗浄した。更に、4℃で2時間、Mycで標識化したPAK2を含有する300μLの細胞内可溶質(cytosolic)抽出物と共にビーズをインキュベートした。磁気装置でビーズを集め、氷冷したキナーゼ緩衝液(50 mM Tris/HCl、pH 7.5、5 mM MgCl2、1 mM EDTA、1 mM EGTA、10 mM β−メルカプトエタノール、脱リン酸酵素阻害剤(50 mM NaF、5 mM Na4P2O7、2 mM Na3VO4、10 nM オカダ酸)及びタンパク質分解酵素阻害剤(40μg/ml ロイペプチン、40μg/mlペプスタイン、40μg/ml アプロチニン、500μM PMSF (フェニルメチルスルホニルフルオライド)で4回洗浄した。
【0035】
2.5. PAK2 構築物による THP−1 細胞の形質移入
5% CO2で加湿した雰囲気中、37℃において、100μg/mlストレプトマイシン、2 mM グルタミン及び1x 非必須アミノ酸、100U/ml ペニシリンを入れた10% FCSを含有するRPMI 1640培地(Bio Whittaker)中でTHP−1細胞を増殖させた。THP−1細胞を新しく継代培養した2−5x105細胞を35mmペトリ皿に培養体積2mLで接種した。
6μL FuGene6 (Roche Biochemicals)を100μLの血清無含有培地に添加し、室温で5分間平衡させた。次いで、2μgの精製したpcDNA/PAK2又はpcDNA/PAK2T461Eを、予め希釈したFuGene6溶液に添加し、穏やかに混合し、さらに室温で15分間インキュベートした。次いで、FuGene6/DNA溶液を細胞に滴下し、培地を撹拌することにより均等に分配した。24時間後、該培地を200μg/ml G418を含有する培地と交換した。
【0036】
PAK2又はPAK2T461Eを発現する安定なクローンを生成するために、48時間後、室温で5分間500×gで細胞をスピンした。該培地を吸引し、RPMI 1640、10% FCS、2 mM グルタミン、100 U/ml ペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン及び200μg/ml G418と交換した。その後5日間毎日交換し、死細胞及び細片を洗浄した。394ウェルプレートに有限的に希釈することにより単一コロニーを単離した。単一クローンを拡大させ、幾つかのクローンにおいてPAK2特異性抗体(クローンV−19, Santa Cruz Biotechnology)によりPAK2の発現を試験した。
【0037】
2.6. PAK2 の自己リン酸化
活性化Cdc42によりPAK2の自己リン酸化を誘発した。それ故、500ngのCdc42を180μM GTPγS (Roche Biochemicals)で10分間30℃で予備的に負荷をかけた(preload)。自己リン酸化のため、500ngのmycで標識化したPAK2又はPAK2T461Eを、反応容積20μLで、50mM Tris/HCl、pH 7.4、10mM MgCl2、30mM β−メルカプトエタノール、0.2mM [γ−32P]ATP (1000 cpm/pmol) (Amersham)中でインキュベートした。濃度範囲0.5〜300nMの本発明の物質及び500ngのGTPγS−負荷Cdc42を添加し、30℃で30分間インキュベートした。10mlのトリクロロ酢酸(30%)を添加することにより該反応を停止し、Packard細胞ハーベスター上、GF/Bガラス繊維フィルター(Whatman)で濾過した。50mM Tris/HCl、pH 7.4、10mM MgCl2、30mMβ−メルカプトエタノールで2回洗浄した。30μLのMicroscintカクテル(Packard)を添加した後、フィルター結合放射能を、マイクロプレートシンチレーションカウンターで計測した。
【0038】
2.7. ヒストン h4 のリン酸化
PAK2を活性化するために、PAK2を活性化Cdc42で誘発した。それ故、500ngのCdc42を、180μM GTPγS (Roche Biochemicals)により30℃において10分間予備的に負荷をかけた。自己リン酸化のため、500ngのmycで標識化したPAK2又はPAK2T461Eを、50mM Tris/HCl、pH 7.4、10mM MgCl2、30mM β−メルカプトエタノール、0.2mM [γ−32P]ATP (1000cpm/pmol) (Amersham)中、反応容積20μLでインキュベートした。500ngのGTPγSで負荷をかけたCdc42、20mgヒストンh4(Sigma)及び本発明の物質を0.5〜300nMの範囲の濃度で添加し、30℃で30分間インキュベートした。2x Laemmli緩衝液を添加することにより反応を停止し、該反応混合物を12% SDS ポリアクリルアミドゲル (Biorad)上で分離した。ヒストンh4に導入した放射能を、蛍光物質イメージング(Storm 860, Molecular Dynamics)により測定した。
【0039】
2.8. キナーゼ活性についての SPA アッセイ ( シンチレーション近接アッセイ( scintillation proximity assay ) )
384ウェルプレート(Packard Optiplate, 白色, 平底, 製造番号. 6005214)でSPAアッセイを行った。N末端にビオチンを有するヒストンを組換えPAK2の基質として使用した。50mM Tris/ 0.1 mM EGTA / 0.1% 2−メルカプトエタノール/ 10mM ステアリン酸マグネシウム/0.1mM ATP/pH 7.5中で酵素ストックを、−80℃においてアリコートで保存した。
方法:
384ウェルプレートにおいて、脱塩水中10μLの試験化合物(5% DMSO含有、最終濃度1%)を、15μLのPAK2(1 U/ml μM; f.c. 0.3 U/ml)と酵素希釈緩衝液(1 mg/ml BSA/ 50 mM Tris/ 0.1 mM EGTA/ 0.1% 2−メルカプトエタノール/ pH 7.5)中で混合し、室温で15分間インキュベートした。“陰性”コントロール(100% CTL、酵素活性を阻害していないもの)として、試験化合物を上述の混合物から除いた。“陽性”コントロール(0% CTL、完全に酵素活性を阻害したもの)として、試験化合物をスタウロスポリン(100μM, f.c. 20 μM)と置換した。ビオチニル化ヒストン(1.5μM, f.c. 0.75μM)及びγ33PでラベルしたATP (0.17μCi/ウェル)を25μLの2×キナーゼアッセイ緩衝液(50mM Tris/ 10mM β−グリセロホスフェート/4mM ジチオスレイトール/200μMバナジン酸ナトリウム/20mM MgCl2/pH7.5)に添加した。次いで、該プレートを室温で2時間インキュベートした。インキュベート時間終了後、0.1mg/ウェルのLEADシーカーストレプトアビジンで被覆したポリスチレンビーズを、100mM Tris/10 mM EDTA/100μM 冷ATPを含有する30μLの溶液に添加した。室温で1時間インキュベーション後、該プレートを500gで1分間遠心分離にかけた。各アッセイミクロ滴定プレートは、上述した“陰性”及び“陽性”コントロールを含むウェルを含有した。データ分析は、“陽性”コントロールを減じた後、“陰性”コントロールのシンチレーションと比較した、試験化合物中に存在するシンチレーションのパーセンテージを計算することにより行った:
%CTL=(シンチレーション(サンプル)−シンチレーション(“陽性”コントロール))×100/(シンチレーション(“陰性”コントロール)−シンチレーション(“陽性”コントロール)
PAK2酵素の阻害剤では、100 %CTL (阻害せず)と0 %CTL (完全に阻害)の間の値が得られると思われる。100 %CTLより大きい値は通常、アロステリック制御等の化合物特異性物理化学的性質又は間接的生化学的性質と関連する。
【0040】
2.9. PAK2 による表現型効果 / 細胞効果
以下のアッセイは、PAK2又はPAK2/T461Eで過渡的に又は安定的に形質移入されている細胞系THP−1 (Tsuchiya et al., 1980)又はMonoMac 6 (Ziegler−Heitbrock et al., 1988)で行い、読出した情報を、形質移入したようにみせかけた細胞と比較した。また、PAK2の活性を刺激する本発明の物質を添加した。
サイトカインの製造及び放出
単球/マクロファージ細胞系を、2.5〜5x105細胞/mlの細胞密度で、10nM PMA、20ng/ml M−CSF、20ng/ml GM−CSF、20μg/ml LPS (サルモネラミネソタ(Salmonella minnessota)Re595由来)等、種々の刺激で刺激した。0、1、3、6、12、24、48及び72時間後に細胞を捕集し、更に研究するために上澄みを凍結し、細胞をPBSで洗浄し、143mMβ−メルカプトエタノールを含む400μLのRLT緩衝液(Qiagen RNeasy Total RNA Isolation Kit)中に再懸濁し、DNAを20gの針で少なくとも5回切断し、−70℃で保存した。
【0041】
煙リッチ培地により、タバコの煙による細胞刺激を行った。サプリメント無含有100mL RPMI培地を、2本のタバコの煙で灌流した。タバコの煙を50mLシリンジ中に引き(タバコ1本当たり50mL体積の約20体積)、次いで培地中に灌流した。その後、培地のpHを7.4に調整し、0.2μmフィルタを通して培地を濾過滅菌(filtersterilize)した。細胞を煙リッチ培地に再懸濁し、1x106細胞/mlの細胞密度で、37℃で10分間インキュベートした。次いで細胞をRPMI 1640で2回洗浄し、上述した時間でフラスコ又は24ウェルプレート(MonoMac6)に播種した。
全RNAを、Qiagen RNeasy Total RNA Isolation Kit (Qiagen)により、製造業者の手順に従い単離した。精製したRNAをTaqMan分析に使用した。サイトカインTNFα、IL−1β、IL−8及びIL−6の発現レベルを測定した。
【0042】
分泌したサイトカインの検出
培養及び刺激した細胞の上澄み中のタンパク質を、最終濃度が10%になるまで三塩素酸(TCA)を添加することにより沈殿させた。沈殿物を80%エタノールで2回洗浄し、ペレットを50mM Tris/HCl、pH 7.4、10 mM MgCl2、1mM EDTA中に再懸濁した。ブラッドフォード法によりタンパク質濃度を測定し、各サンプル50μgを12% SDSポリアクリルアミドゲルにかけた。ゲルをPVDF膜上にブロットし、TBST中5%BSA中で1時間ブロックし、商業的に入手可能な、ヒトTNFα、IL−1β、IL−8及びIL−6に対する抗体と共に1時間インキュベートした。TBSTで洗浄後、セイヨウワサビパーオキシダーゼに結合している抗ヒトIgGと共にブロットをインキュベートし、再度洗浄し、ECL化学ルミネッセンスキット(Amersham)で展開した。バンドの強度をBioMax X線フィルム(コダック)で可視化し、濃度計で定量した。
【0043】
分泌したマトリックス金属プロテアーゼ及び他のプロテアーゼの検出
サイトカインについて使用した方法と同じ方法を使用した。ウエスタンブロットに使用した抗体は、ヒトMMP−1、MMP−7、MMP−9及びMMP−12にあわない。
分泌したマトリックス金属プロテアーゼの活性
蛍光物質を使用してプロテアーゼ活性を測定した。刺激した細胞と未刺激の細胞とから単離した上澄み(既述のもの)を、総体積50μLで、1μMの基質(Dabcyl−Gaba−Pro−Gln−Gly−Leu−Glu (EDANS)−Ala−Lys−NH2 (Novabiochem))と共に5分間室温でインキュベートした。反応当たり125ngの精製したMMP−12で陽性コントロールを行った。励起320nm及び発光405nmにおいて蛍光光度分析によりプロテアーゼ活性を測定した。
【0044】
タンパク質分解活性及び細胞遊走を測定するための別のアッセイにおいて、走化性(Boyden)チャンバを使用した。チャンバの上方部分のウェルにおいて、細胞(ウェル当たり105細胞)を、Matrigel (Becton Dickinson)の8μm層で被覆したフィルター上に置いた。区画の下方部分で、MCP−1 (10ng/ml)、ロイコトリエンB4 (10ng/ml)等の化学遊走物質を培地に添加した。5日後フィルターを除き、Matrigelを通り抜けてきた、下面の細胞を、メタノールで固定し、Diff−Quik染色キット(Dade Behring)で染色し、光学顕微鏡により高性能視野(400x)で3回(in three)カウントした。
【0045】
走化性アッセイ
走化性を測定するために、48ウェルの走化性(Boyden)チャンバ(Neuroprobe)を使用した。細胞を、24時間、FCS無含有RPMI培地中で飢えさせた。化学遊走物質(50ng/ml IL−8、10ng/ml MCP−1、10nM lipoxin A4)及び本発明の物質を、FCS無含有RPMI培地中で希釈し、30μLを下方区画のウェルと置換した。ポリカーボネートフィルター(孔径8μm)で上方区画を下方区画から離した。50μLの細胞懸濁液(5 x104)を上方区画のウェルに置いた。該チャンバを、5%CO2で加湿した雰囲気中、37℃で5時間インキュベートした。次いで、フィルターを除き、上面の細胞をこすり落とし、下面の細胞をメタノール中で5分間固定し、Diff−Quik染色セット(Dade Behring)で染色した。遊走した細胞を光学顕微鏡により高性能視野(400x)で3回カウントした。
【0046】
粘着アッセイ
細胞を捕集し、PBSで洗浄し、PBS及び1μM BCECF((2’−7’−ビス−(カルボキシエチル)−5(6’)−カルボキシフルオレセインアセトキシメチル)エステル、Calbiochem)中に再懸濁し(4x106/ml)、37℃で20分間インキュベートした。PBS中で細胞を洗浄し、0.1% BSAを含有するPBS中に再懸濁した(3.3x 106/ml)。3x105 細胞(90μL)を、ラミニン(Becton Dickinson)で被覆した96ウェルの平底プレートの各ウェルに添加し、10分間放置した。本発明の物質を添加し、37℃で20分間インキュベートした。0.1%BSAを含有するPBSで細胞を洗浄し、37℃で20分間プレートをインキュベートした。0.1%BSAを含有するPBSで細胞を洗浄し、粘着細胞を100μLの0.025M NaOH及び0.1% SDSで可溶化した。蛍光測定により定量した。
【0047】
食作用
細胞懸濁液(2.5x104 細胞/ml)を、5mlのU937又はTHP−1と共に6ウェルプレートに播種するか、又は2mlのMonoMac6と共に24ウェルプレートに播種し、本発明の物質の存在下、5%CO2で加湿した雰囲気中、37℃で1時間インキュベートした。熱により不活性化したSaccharomyces boulardii (20酵母/細胞)の分散懸濁溶液40μLを各ウェルに添加した。細胞を3時間より長くインキュベートし、PBSで2回洗浄し、細胞遠心分離した(cytocentrifuge)。サイトスピン調製物をMay−Grunwald−Giemsaで染色し、食菌した粒子を光学顕微鏡によりカウントした。
【0048】
実施例3: PAK2
同定した別の遺伝子によりPAK2(配列番号9,10)をコードした。PAK2は、プロテインキナーゼのPKCクラスに関連するセリン/スレオニンキナーゼである。PAK2は小さいGTPases Rac及びRhoAの下流エフェクターであり、細胞運動の過程に関与すると思われる(Vincent and Settleman 1997)。
PAK2は、健康な喫煙者と比較してCOPD喫煙者において一貫して下方制御(54.8%)であることが分かった。これは、“avg diff”値(表3)に示した。COPD喫煙者と健康な喫煙者との間で比較したp値は0.02である。
【0049】
【表3】
【0050】
実施例2.9と類似の方法で、PAK2の代わりにPRK2でアッセイした。
実施例4: GUK1
同定した別の遺伝子は、グアニレートキナーゼ1(GUK1;配列番号11,12)である。グアニレートキナーゼ1は、アデノシン三リン酸(ATP)からグアノシン一リン酸(GMP)又はdGMPへリン酸塩が移行するのを触媒する。この酵素はcGMPの回収において機能し、それ故、シグナル伝達経路へのグアニンヌクレオチドの供給を制御すると考えられる(Brady et al. 1996)。
GUK1は、健康な喫煙者と比較してCOPD喫煙者において一貫して上方制御(52%)であることが分かった。これは、“倍変化”(FC)値(表4)に示した。COPD喫煙者と健康な喫煙者とを比較した2つの別々の群のp値は0.02と0.17であった。
【0051】
【表4】
実施例2.9と類似の方法で、PAK2の代わりにGUK1でアッセイした。
Literature:
PAK2
Knaus, U.G., Morris, S., Dong, H.−J., Chernoff, J., and Bokoch, G.M. (1995). Science 269, 221−223.
Frost, J.A., Xu, S., Hutchison, M.R., Marcus, S., and Cobb, M.H. (1996). Mol. Cell. Biol. 16, 3707−3713.
Goeckeler, Z.M., Masaracchia, R.A., Zeng, Q., Chew, T.−L., Gallagher, P., and Wysolmerski, R.B. (2000), J. Biol. Chem. 275, 18366−18374.
Zeng, Q., Lagunoff, D., Masaracchia, R., Goeckeler, Z., Cote, G., and Wysolmerski, R. (2000). J. Cell Sci. 113, 471−482.
PRK2
Vincent, S., and Settleman, J. (1997). Mol. Cell. Biol. 17, 2247−2256.
GUK1
Brady, W.A., Kokoris, M.S., Fitzgibbon, M., and Black, M.E. (1996). J. Biol. Chem. 271, 16734−16740.
Cell lines
Tsuchiya, S., Yamabe, M., Kobayashi, Y., Konno, T., and Tada, K. (1980) Int.J. Cancer 26, 171−176.
Ziegler−Heitbrock, H.W., Thiel, E., Futterer, A., Herzog, V., Wirtz, A., and Riethmuller, G. (1988) Int.J.Cancer 41, 456−461
序論
本発明は、炎症過程、特に、マクロファージが重要な役割を果たす慢性炎症性気道疾患の調節の分野に関する。炎症過程は、本発明により炎症過程に関与することが確認されているキナーゼの生物活性に影響を及ぼすことにより調節することができる。
マクロファージが重要な役割を果たす慢性炎症性気道疾患の例は、慢性気管支炎(CB)である。CBは、気流が制限されているか否かに関わらずに起こり得、慢性閉塞性肺疾患(COPD)を含む。CBは、以下のいくつかの疾患の症状を含む複雑な疾患である:咳及び粘質過分泌を特徴とする慢性気管支炎、炎症及び気管支周囲線維症を含む末梢気道病変、気腫及び気流制限。CBは、肺機能が加速度的かつ不可逆的に減退することを特徴とする。CB発症の主要危険因子は、連続的にタバコを喫煙することである。全ての喫煙者の約20%だけがCBに苦しめられるので、遺伝的素因もまた疾患の一因となっていると思われる。
【0002】
CBの初期段階において最初に起こるのは炎症であり、小気道及び大気道に影響を与える。タバコを喫煙することに引き起こされる刺激が、マクロファージ及び好中球を誘引する。喫煙者の痰ではこれらの数が増加している。絶え間なく喫煙すると、傷害部位に炎症細胞を補充するマクロファージ、好中球及び上皮細胞から媒介物が放出されることにより、肺における進行性炎症性反応となる。これまで、CBの経過を戻すのに利用できる治療がなかった。禁煙により、肺機能の減退を減らすことができる。
現在までに、患者の症状を幾分軽減する薬剤がわずかに知られている。持続性β2−アゴニスト及び抗コリン作用剤を適用すると、一時的に気管支が拡張する。LTB4−阻害剤のような炎症性現象に用いるための様々なアンタゴニストが研究されている。
慢性炎症性気道疾患を治療するための薬剤を提供することが常に必要とされている。慢性炎症性気道疾患の原因は、活性化された炎症性免疫細胞、例えばマクロファージにあると考えることができる。それ故、炎症過程の原因を除くよう、マクロファージの機能を調節する薬剤が必要である。
【0003】
発明の説明
本発明において、炎症過程に関与するマクロファージ、特に慢性炎症性気道疾患に関与するマクロファージ、更に特に慢性気管支炎またはCOPDに関与するマクロファージが、差別的に発現した核酸配列及びタンパク質発現のパターンを示すことが分かり、これは、健康なドナーまたは炎症を起こしたドナー由来のマクロファージの遺伝子発現のパターンとは異なるものであり、ここで、後者は、活性化状態のマクロファージを含有する。それ故、マクロファージは種々の炎症状態において種々の活性レベルを示す。例えば、本発明において、COPD喫煙者の炎症過程に含まれるマクロファージは、健康な喫煙者由来のマクロファージとは異なる遺伝子発現パターンを示すことが、つまり、COPD喫煙者におけるマクロファージが、以下に「活性化過剰」状態と称した、異なる状態を示すことが分かった。本発明により、活性化過剰を維持するか又は活性化過剰に関与するキナーゼを調節する物質を同定することにより、マクロファージの活性化過剰状態を軽減するか又は活性化過剰を阻害する可能性を提供する。
【0004】
本明細書において、用語「慢性炎症性気道疾患」は、例えば、慢性気管支炎(CB)及び慢性閉塞性肺疾患(COPD)を含む。用語「慢性炎症性気道疾患」がCB及びCOPDを意味するのが好ましく、CBまたはCOPDを意味するのがより好ましい。
本発明は、活性化過剰でないマクロファージと比べて活性化過剰マクロファージにおいて差別的に発現する核酸配列の同定に基づく。そのような核酸配列は、炎症過程、好ましくは慢性炎症性気道疾患に関与するマクロファージの活性化過剰状態を維持するか又は活性化過剰状態に関与するキナーゼをコードする。そのような差別的に発現する核酸配列又は該核酸配列にコードされるタンパク質はまた、以下に、それぞれ本発明の差別的に発現する核酸配列又はタンパク質と命名した。特に、本発明は、差別的に発現する核酸配列及びタンパク質発現パターンに起因する、マクロファージにおける表現型の変化と、炎症過程にマクロファージが関与することとの関連を教示するものであり、従って、種々の用途の根拠(basis)を提供する。例えば、本発明は、本発明のマクロファージタンパク質又は本発明の差別的に発現する核酸配列の発現レベルを測定するための方法及び試験系を提供し、それにより、例えば、哺乳類、好ましくはヒト、特に好ましくは炎症過程に罹っているヒト、特に慢性炎症性気道疾患、特に好ましくは慢性気管支炎又はCOPDに罹っているヒトにおいて活性化過剰マクロファージに関連する炎症過程の診断又は監視方法を提供する。本発明はまた、本発明の差別的に発現する核酸配列又はタンパク質により物質を同定する方法であって、該物質が調節をする前記方法に関する。ここで、該物質が調節をするとは、該物質が、本発明の差別的に発現する核酸配列又はタンパク質に阻害剤又は活性剤として作用し、それによりマクロファージの活性化過剰を阻害するかマクロファージの活性化過剰状態を軽減して慢性炎症過程に陽性の影響を与えることをいう。それにより哺乳類、好ましくは前記疾患に罹っているヒトの治療をすることができる。本発明はまた、マクロファージにおいて本発明の差別的に発現する核酸配列又はタンパク質を選択的に調節する方法であって、該タンパク質又は差別的に発現する核酸配列のモジュレータであると測定された物質を投与することを含む前記方法に関する。本発明は、炎症過程の治療が必要な患者を治療するために前記物質を使用することを含む。
【0005】
本発明の第一段階において、本発明の差別的に発現する核酸配列は、活性化過剰でないマクロファージと比べて活性化過剰マクロファージにおいて異なる発現パターンを有するものと確認された。簡単のため、特にCOPDに関与するマクロファージの調査について説明するが、他の慢性炎症性気道疾患、例えば、他の慢性気管支炎症状に罹っている被験者由来のサンプルから同等の結果を得ることができる。異なる発現パターンを調査することにより、以下の実施例で例証するように、炎症過程に関与すマクロファージの活性化状態に応じて発現する、一連の差別的に発現する核酸配列を同定することになる。
【0006】
簡単に言えば、そのような本発明の差別的に発現する核酸配列は、活性化過剰マクロファージ由来の細胞抽出物又は細胞を使用する、比較発現プロファイリング実験により同定する。すなわち、例えば、COPDにおける炎症部位由来のものと、該疾患に罹っていないが、タバコの煙にさらされているような同様の炎症を起こしている状態にあるコントロールの対応する部位とを比較する。
【0007】
第二段階において、本発明のタンパク質は、差別的に発現する核酸配列によりコードされるものと確認される。すなわち、活性化過剰を媒介する役割を果たすか又は活性化過剰状態を維持する役割を果たすタンパク質である。本発明の差別的に発現する核酸配列のクラスは、活性化過剰されていないマクロファージにおけるコントロールレベルよりも、低いレベルか又は高いレベルにおいて、本発明により活性化過剰されているマクロファージにおいて発現することを特徴とする、キナーゼのクラスをコードするものであると確認することが出来る。そのような本発明のキナーゼを、以下、DHAM−キナーゼ(“活性化過剰マクロファージにおいて調節解除された(deregulated in hyperactive macrophage)”−キナーゼ)と称する。本発明のDHAM−キナーゼの好ましい例としては、配列表に記載した、グアニレートキナーゼ1(GUK1)、セリン−スレオニン−キナーゼPAK2、又はセリン−スレオニン−キナーゼPRK2があげられる。
【0008】
本発明のDHAM−キナーゼの生物学的活性、すなわち、本発明の炎症過程においてマクロファージの関与を媒介することは、例えば、基質リン酸化及び/又は基質認識キナーゼ及び/又は基質結合等の他のDHAM−キナーゼ機能に依存する。
本発明はまた、DHAM−キナーゼ、特に既述の好ましいキナーゼの機能的同等物、誘導体、変異体(variant)、突然変異体(mutant)及びフラグメントに関する。本明細書において、「機能的(functional)」とは、それぞれ対応するDHAM−キナーゼの、生物学的活性に関与する機能、例えば、基質リン酸化、基質認識及び/又は基質結合を有することを意味する。
【0009】
本発明により、コントロールレベルよりも低いレベルにおいて発現するDHAM−キナーゼの生物学的活性を、マクロファージの活性化過剰状態を軽減するか又は活性化過剰を阻害するよう活性化するのが好ましく、コントロールレベルよりも高いレベルで発現するDHAM−キナーゼの生物学的活性を、マクロファージの活性化過剰状態を軽減するか又は活性化過剰を阻害するよう阻害するのが好ましい。
本発明の一態様において、本発明は、物質がDHAM−キナーゼの活性剤であるか又は阻害剤であるかを測定する試験方法に関する。DHAM−キナーゼは慢性炎症性気道疾患に関与しており、炎症を媒介する役割を果たすので、DHAM−キナーゼの生物学的活性を調節する物質は、慢性炎症性気道疾患を治療するのに使用することもできるし、物質の機能を最適化し、最適化された物質が慢性炎症性気道疾患を治療するのに適当であるようにするためのリード化合物として使用することもできる。本発明の方法を行うために、本発明の試験系を使用することができる。
【0010】
本発明はまた、物質がDHAM−キナーゼの活性剤であるか又は阻害剤であるかを測定するための試験系に関する。本発明の方法を行うのに有用な試験系は、細胞系又は無細胞系を含む。例えば、本発明の一態様は、例えば、測定可能な読み出し(readout)として、レポーター遺伝子、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子等の発現を使用する、差別的に発現する核酸配列の発現レベルに作用する物質を試験できるように設計された試験系に関する。本発明の別の態様は、天然の又は人工的なものであるが適当なDHAM−キナーゼ活性剤により、例えば適当なキナーゼ等により、例えばDHAM−キナーゼの酵素活性等の活性化を干渉する物質、又は、例えばDHAM−キナーゼの酵素活性等の機能と直接相互作用する物質を試験できるように設計された試験系に関する。
【0011】
本発明の試験系は、DHAM−キナーゼ又はDHAM−キナーゼの機能的同等物、誘導体、変異体、突然変異体又はフラグメント、該タンパク質をコードする核酸又はDHAM−キナーゼの機能的同等物、誘導体、変異体、突然変異体又はフラグメント及び/又は制御要素をコードする核酸を含み、ここでDHAM−キナーゼの機能的同等物、誘導体、変異体、突然変異体又はフラグメント;DHAM−キナーゼをコードする核酸若しくはDHAM−キナーゼの機能的同等物、誘導体、変異体、突然変異体又はフラグメントをコードする核酸は、試験する物質と相互作用することができ、直接相互作用することにより、測定可能な読み出しがDHAM−キナーゼのそれぞれの生物学的活性の変化を示すか、及び/又はDHAM−キナーゼの発現の変化を示す。
【0012】
本発明の試験系は、例えば、当業界で周知の要素を含む。例えば、無細胞系は、例えば、DHAM−キナーゼ又はDHAM−キナーゼの機能的同等物、誘導体、変異体、突然変異体又はフラグメント、DHAM−キナーゼをコードする核酸又はDHAM−キナーゼの機能的同等物、誘導体、変異体、突然変異体又はフラグメントをコードする核酸を、溶解形態又は結合形態で、又は細胞区画又は小胞内に含むことができる。適当な細胞系としては、例えば、適当な原核細胞又は真核細胞、例えば、DHAM−キナーゼ又はDHAM−キナーゼの機能的同等物、誘導体、変異体、突然変異体又はフラグメント、DHAM−キナーゼをコードする核酸又はDHAM−キナーゼの機能的同等物、誘導体、変異体、突然変異体又はフラグメントをコードする核酸を含む原核細胞又は真核細胞があげられる。本発明の前記試験系に使用するのに適当な細胞は、組換え技術により、例えば、所望のDHAM−キナーゼ又はDHAM−キナーゼの機能的同等物、誘導体、変異体、突然変異体又はフラグメントを発現するのに適当な組換えベクターで形質転換するか又は形質移入した後に得ることができる。或いは、そのような適当な細胞は、所望のDHAM−キナーゼ又はDHAM−キナーゼの機能的同等物、誘導体、変異体、突然変異体又はフラグメントを発現する天然原料から単離される細胞又は細胞系であり得る。本発明の試験系は、対象の物質がDHAM−キナーゼの活性剤であるか又は阻害剤であるかを試験するのが望まれているか又は必要であるとき、DHAM−キナーゼの天然又は人工のリガンドを含むことができる。
【0013】
本発明の試験方法は、例えば、細胞系を細胞系の表現型を監視するのに使用するとき、読み出しを測定すること、例えば試験系における表現型の変化を測定することを含む。そのような変化は、例えば以下の実施例に詳細に説明するように、DHAM−キナーゼ活性又は阻害に対して起こる細胞の、天然の応答又は人工的な応答における変化であり得る。
本発明の試験方法は、一方では物質が本発明の活性剤であるか又は阻害剤であるかを測定するのに適当な高速処理(high throughput)試験に有用であり得る。また、例えば、高速処理試験において確認されたヒット化合物又はリード化合物の二次試験又は確認にも有用であり得る。
【0014】
本発明はまた、本発明の方法において本発明のDHAM−キナーゼの活性剤又は阻害剤であると確認された物質に関する。本発明の物質は、本発明のDHAM−キナーゼの機能を活性化又は阻害することができる、好ましくは阻害することができる、あらゆる化合物である。DHAM−キナーゼの機能を活性化又は阻害する方法の別の例としては、DHAM−キナーゼの発現レベルに影響を与えることである。DHAM−キナーゼの機能を活性化又は阻害する方法の別の例としては、適用した物質の性質に応じて可逆的又は不可逆的に行うことができる物質をDHAM−キナーゼに直接結合させ、それによってDHAM−キナーゼの機能的ドメインを活性化するか又は阻止することである。
従って、DHAM−キナーゼの生物学的活性を活性化するか又は阻害するのに有用な物質としては、差別的に発現する核酸配列の発現に作用する物質、例えば、対応する遺伝子又は調節配列とハイブリダイズし、それにより遺伝子発現に影響する核酸フラグメント、又はDHAM−キナーゼ自体又は他の天然に発生する細胞成分により活性化又は阻害するのに作用する物質、例えば、本発明のタンパク質に酵素学的に作用する他のタンパク質、例えば、タンパク質キナーゼがあげられる。
【0015】
それ故、本発明は、例えば、DHAM−キナーゼの遺伝子をコードする核酸配列、又は該核酸配列のフラグメント、誘導体、突然変異体又は変異体である物質であって、該核酸配列又はそのフラグメント、誘導体、突然変異体又は変異体が、遺伝子発現レベルに影響を与えることができる前記物質、例えば、アンチセンス核酸、リボザイムとして適当な核酸分子、又は三重らせん形成に適当な核酸分子に関する。
本発明はまた、例えば、DHAM−キナーゼに直接結合しているか又はDHAM−キナーゼの活性化と相互作用し、それによりその生物学的活性に影響を与える有機若しくは無機化合物又は抗体である物質に関する。
【0016】
更なる観点において、本発明は、DHAM−キナーゼをコードする核酸、好ましくはメッセンジャーRNA、又は細胞、好ましくはマクロファージ、より好ましくは炎症部位から単離したマクロファージ、さらにより好ましくは慢性炎症性気道疾患に罹っている被験者の炎症部位から単離したマクロファージにおける本発明のタンパク質自身の発現レベルを測定するための方法に関する。そのような方法は、例えば、物質が本発明の活性剤であるか又は阻害剤であるか測定するための上に概要を示した方法において、差別的に発現する核酸配列発現レベルに物質が影響を与えることができるかどうか試験するのに使用することができる。しかしながら、本発明の発現レベルを測定するための方法はまた、マクロファージの活性化状態を試験するのに、例えば、活性化過剰マクロファージにより引き起こされる疾患の治療の結果を調査するか又は診断するために使用することができる。前記マクロファージは、哺乳類であるのが好ましく、ヒト細胞であるのがより好ましい。従って、本発明のマクロファージは、哺乳類の炎症部位、より好ましくはヒトの炎症部位から得るのが好ましい。従って、本発明はまた、慢性炎症性疾患の診断方法、又は該疾患の監視方法、例えば、マクロファージにおいてDHAM−キナーゼをコードする核酸、好ましくはメッセンジャーRNA、又はDHAM−キナーゼ自身の発現レベルを測定することを含む、慢性炎症性疾患の治療が必要な患者の治療結果を監視する方法に関する。
【0017】
本発明のタンパク質をコードする核酸、好ましくはメッセンジャーRNA、又は本発明のタンパク質自身の発現レベルを測定する方法は、発現レベルの測定目的に応じ、ルシフェラーゼアッセイ等のレポーター遺伝子駆動アッセイを介するか又はハイブリダイゼーション技術を介する各RNA転写物の濃度を測定するといった公知の方法により、又はそれぞれの抗体を使用する本発明のタンパク質のタンパク質濃度を測定することにより行うことができる。
本発明はまた、慢性炎症性気道疾患を治療するための本発明の物質の使用に関する。本発明の別の態様は、活性剤又は阻害剤であると測定された本発明の物質の少なくとも1種を含有する医薬組成物に関する。本発明の組成物は、それ自体公知の方法により、例えば、慣用の混合、溶解、粉砕、ドラジェ製造、微粒子化(levigating)、粉末化、乳化、カプセル化、包括化(entrapping)又は凍結乾燥方法により製造することができる。
【0018】
本発明の活性化するか又は阻害する物質を慢性炎症性気道疾患を治療するための薬剤として使用するために、該物質を動物モデルで、例えば、炎症性気道疾患に罹っている動物又は本発明のDHAM−キナーゼを発現するトランスジェニック動物で試験することができる。
本発明の物質の毒性及び治療効果は、細胞培養及び動物実験をしてIC50、LD50及びED50を測定することを含む、標準的な医薬的方法により測定することができる。得られたデータは、動物、より好ましくはヒトの投与量範囲を見積もるのに使用する。投与量範囲はまた投与形態(錠剤、カプセル、エアゾールスプレー、アンプル等)及び投与ルート(例えば、経皮、経口、口内(buccal)、点鼻、非経口、吸入、気管内又は直腸)にもまた依存する。
【0019】
有効成分として本発明の物質の少なくとも1種を含有する医薬組成物は、慣用の方法により処方することができる。そのような組成物の製造方法は、例えば、“Remington Pharmaceutical Science”に記載されている。本発明の物質の少なくとも1種を処方するのに有用な成分の例は、国際公開公報第99/18193号パンフレットに記載されている。この文献は本明細書に含まれるものとする。
更なる観点において、本発明は、本発明の慢性炎症性気道疾患を治療する方法に関する。該方法は、慢性炎症性気道疾患の治療が必要な生物、好ましくはヒトに、DHAM−キナーゼの活性剤であるか又は阻害剤であるかを測定するための本発明の方法により活性剤であるか又は阻害剤であると測定された少なくとも1種の物質を含有する医薬組成物の適当な量を投与することを含む。
【0020】
他の態様において、本発明は、本発明のDHAM−キナーゼの活性剤であるか又は阻害剤であると測定された物質を投与することを含む、マクロファージにおけるDHAM−キナーゼ濃度を選択的に調節する方法に関する。
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、限定的に解釈すべきではない。しかしながら、以下の実施例は本発明の最も好ましい態様を示すものである。
【0021】
実施例
実施例1:比較発現プロファイリング
以下は、本発明のDHAM−キナーゼを同定するために、どのようにしたら比較発現プロファイリングを行うことが出来るかを具体的に示すものである。
1.1. 被験者の選択
3群の被験者について研究した:健康な非喫煙者、健康な喫煙者及びCOPD患者。
肺機能を評価するために、被験者は肺活量を測定しなければならない。年齢及び身長に基づく簡単な計算を使用して結果を特徴付けた。COPD患者については、その予測FEV1%が<70%の者について研究した。健康な喫煙者は、COPD患者と年齢及び喫煙暦を合わせたが正常な肺機能を有する者である。健康な非喫煙者は、正常な肺機能を有し、これまで喫煙したことがない。健康な非喫煙者の群は、喘息を除外するためメタコリン挑戦(challenge)を有する。この方法は、各投与間で肺活量を測定することにより、被験者に投与するメタコリン量を増やすことを必要とする。FEV1が20%低下したとき、試験を中止し、PC20を計算する。これがFEV1を20%低下させるメタコリンの投与量に相当する。喘息が存在しない証拠として、32より大きい値を必要とする。全被験者は通常のアレルゲンに対する皮膚プリックテストをし、陰性の結果を有することを必要とする。これによりアトピー性の個体を除く。被験者の病歴を監視し、付随する(concomitant)疾患を除外した。
【0022】
1.2. BAL (気管支肺胞洗浄 (bronchoalveolar lavage) )方法
BAL前にミダゾラムを投与して被験者を落ち着かせた。局所麻酔スプレーを使用して咽頭の裏に麻酔をした。7mm オリンパス気管支鏡を使用した。洗浄領域は右側中央部の突出部(lobe)である。250mlの滅菌生理食塩水を点滴し(instill)、直ぐに吸引した。得られた吸引液はマクロファージを含有した。
1.3. BAL 処理
滅菌ガーゼを通してBALを濾過し、細片を除去した。該細胞をHBSS中で2回洗浄し、1ml HBSS (Hank’s Balanced Salt Solution)に再懸濁し、計測した。マクロファージを引き出して、15 ml Falcon blue−cap ポリプロピレンを使用してペレットにし、10,000,000細胞当たり1 ml Trizol試薬濃度においてTrizol 試薬(Gibco BRL Life Technologies)に再懸濁し、次いで、−70℃において凍結した。
【0023】
1.4. 差別的( Differential )遺伝子発現分析
全RNAを、実施例1.3により得たマクロファージサンプルから抽出した。ピペットを通してTrizol中細胞懸濁液をホモジナイズし、室温で5分間インキュベートした。Trizol 1mL当たり200μLのクロロホルムを添加し、該混合物を注意深く15秒間混合し、室温で3分以上インキュベートした。サンプルを4℃において、15分間10000gでスピンした。上相を新しい反応チューブに移し、室温で10分間、Trizol 1mL当たり0.5 mlのイソプロパノールを添加することによりRNAを沈殿させた。次いで、4℃において10000gで10分間ミクロ遠心分離器を使用することにより該沈殿物をペレット状にし、該ペレットを75%エタノールで2回洗浄し、風乾し、及びDEPC−H2Oに再懸濁した。
Qiagen RNeasy Total RNA単離キット(Qiagen)によりRNAの洗浄を行い、RNAの純度を上げた。RNAの純度は、アガロースゲル電気泳動により測定し、濃度は260nmにおけるUV吸収により測定した。
【0024】
5μgの各RNAをcDNA合成に使用した。第一及び第二ストランド合成は、SuperScript Choice system (Gibco BRL Life Technologies)により行った。総体積11μLのRNA及び1μLの100μM T7−(dt)24プライマー中で、配列番号1に記載の配列を70℃まで10分間加熱し、氷上で2分間冷却した。最終濃度の1倍(1×)にするための第一ストランド溶液、濃度10 mMにするためのDTT及び最終濃度0.5mMにするためのdNTP混合物を、総体積18μLに添加した。該反応混合物を42℃において2分間インキュベートし、2μLのSuperscript II 逆転写酵素(200 U/μL)を添加した。第二ストランドを合成するため、1.15x第二ストランド溶液、230μM dNTPs、10U E.coli DNA リガーゼ(10U/μL)、E.coli DNA ポリメラーゼ(10 U/μL), RNase H (2U/μL)を含有する130μLの混合物を、第一ストランド合成の反応に加え、ピペットで注意深く混合した。16℃において2時間第二ストランド合成を行い、次いで2μLのT4 DNA ポリメラーゼ(5U/μL)を添加し、16℃で5分間インキュベートし、10μLの0.5 M EDTAを添加することにより、反応を停止した。
【0025】
cRNA合成の前に、二本鎖cDNAを精製した。該cDNAを等量のフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)と混合し、未結合のヌクレオチドからcDNAを分離するために、ミクロ遠心分離中で相ロック(lock)ゲル(Eppendorf)のゲルマトリックスによりスピンした。水相を酢酸アンモニウム及びエタノールで沈殿させた。続いて、cDNAをin vitro転写に使用した。製造業者(ENZO Diagnostics)の手順に従いENZO BioArray High Yield RNA Transcript Labeling Kitを使用してcRNA合成を行った。簡単に説明すると、cDNAを、総体積40μLの1x HY 反応溶液、1×ビオチンラベルしたリボヌクレオチド、1x DTT、1x Rnase阻害剤混合物及び1x T7 RNAポリメラーゼと共に37℃で5時間インキュベートした。次いで、該反応混合物をRneasyカラム(Qiagen)を通して精製し、酢酸アンモニウム及びエタノールでcRNAを沈殿させ、最後にDEPC処理水に再懸濁した。260nmにおいてUV分光器により濃度を測定した。残りのcDNAを1x 断片化緩衝液(5x断片化緩衝液:200mM 酢酸トリス、pH 8.1、 500 mM KOAc、150 mM MgOAc)と共に94℃において35分間インキュベートした。
【0026】
DNAチップをハイブリダイズするために、15μgのcRNAを使用し、総体積300μLの50pMビオチンラベルしたコントロールB2 オリゴヌクレオチド、配列番号2に示した配列、1x cRNAカクテル、0.1mg/ml herring 精子DNA、0.5mg/mlアセチル化BSA、1x MES (2−[N−モルホリノ]−エタンスルホン酸)ハイブリダイゼーション溶液と混合した。該ハイブリダイゼーション混合物を99℃まで5分間混合し、45℃に10分間で冷却し、200μLの混合物を使用してプローブ配列に満たした。45℃において60rpmで16時間ハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーション後、チップ上のハイブリダイゼーション混合物を、300μLの非ストリンジェント洗浄液(100 mM MES, 100 mM NaCl, 0.01% Tween 20)と置換した。このチップをAffymetrix Fluidicsステーションに挿入し、EukGE−WS2手順により洗浄及び染色した。チップ当たりの染色溶液は、600μLの1x 染色液(100 mM MES, 1 M NaCl, 0.05% Tween 20)、2mg/ml BSA、10μg/ml SAPE (ストレプトアビジンフィコエリトリン) (Dianova)を含有し、抗体溶液は、1x染色液、2 mg/ml BSA、0.1 mg/ml ヤギIgG, 3μg/ml ビオチニル化抗体を含有した。洗浄及び染色処理後、チップをHP Gene Array Scanner (Hewlett Packard)でスキャンした。
【0027】
データ分析は、COPD喫煙者から単離したRNAでハイブリダイズしたチップと、健康な喫煙者から単離したRNAでハイブリダイズしたチップとの比較により行った。
以下に、差別的に発現した遺伝子及び本発明の方法により確認したその機能を具体的に示す。
【0028】
実施例2 : PAK2
COPD患者において下方制御していると一貫して確認されている遺伝子は、PAK2 (配列番号3, 4)をコードする。PAK2は、活性化Cdc42及びRacと優先的に相互作用するが、Rhoとは相互作用しないセリン/スレオニンキナーゼである。この組合せ(association)により、PAK2の自己リン酸化及びそのキナーゼ活性の活性化を引き起こす。PAK2は、ミオシンII、MLCK (ミオシン軽鎖キナーゼ)、p47phox (NADPHオキシダーゼ)、及びRaf−1をリン酸化することができる。PAK2は、アクチン再編成(reorganization)及び細胞運動に関与する(Knaus et al. 1995, Frost et al. 1996, Goeckeler et al. 2000, Zeng et al. 2000)。
PAK2は、健康な喫煙者と比較してCOPD喫煙者では、一貫して下方制御であることが分かった(47%)。これを、“avg diff”値(表1)及び“倍(fold)変化”値(表2)に示した。COPD喫煙者と健康な喫煙者を含む2つの別々の群のp値は0.001及び0.004であった。
【0029】
【表1】
【0030】
【表2】
2.1. PAK2 のクローニング
健康なボランティアから単離したヒトPMNs (多形核好中球)から抽出した全RNAから、PAK2をクローン化した。5μg RNAを、オリゴ(dt)18プライマー、1x第一ストランド緩衝液、10 mM DTT、0.5 mM dNTPs及び2U Superscript II (Gibco BRL)により42℃において50分間cDNAに逆転写した。次いで、70℃、15分間で該反応を終了し、cDNA濃度をUV分光光度計で測定した。PAK2を増幅させるために、PAK2用の配列特異性プライマー(配列番号5の前(forward)プライマー及び配列番号6の逆(reverse)プライマー)10pmoles及びcDNA100ngをPCRに使用した。反応条件は以下の通りである:94℃で2分間、94℃で30秒間を35サイクル、53℃で30秒、72℃で90秒、次いでTaq DNA−ポリメラーゼにより72℃で7分間。反応混合物を2%アガロースゲルで分離し、約1000bpのバンドを切断し、QIAEX II 抽出キット(Qiagen)を使用して精製した。精製したバンドの濃度を測定し、約120ngを、300ngのpDONR201、Gateway system (Life Technologies)のドナーベクター、1x BPクローナーゼ(clonase)反応緩衝液、Bpクローナーゼ酵素混合物(総体積20μL)と共に、25℃で60分間インキュベートした。次いで、反応物を2μLのプロテイナーゼKと共にインキュベートし、37℃で10分間インキュベートした。次いで、該反応混合物をコンピテントDB3.1細胞に電気穿孔し、カナマイシン含有プレートで培養した。配列決定によりクローンを確認した。データベースに入れた配列と同じ配列(acc. U24153)を有する、pDONR−PAK2と命名したクローンを次の実験に使用した。
【0031】
2.2 PAK2 発現ベクター
上述したPAK2含有ベクターを使用して、CMVプロモータの制御下でPAK2が発現する、Gateway cloning system (Life Technologies)の“attR1”及び“attR2”組換え部位を含む発現ベクターpcDNA3.1(+)/attRにPAK2用cDNAを移した。150ngの“エントリーベクター”pDONR−PAK2を、TE(Tris/EDTA)で20μLにした、150ngの“目的(destination)ベクター”pcDNA3.1(+)/attR、4μLのLR クローナーゼ酵素混合物及び4μLのLR クローナーゼ反応緩衝液と共に混合し、25℃で60分間インキュベートした。次いで、2μLのプロテイナーゼK溶液を添加し、37℃で10分間インキュベートした。氷上で30分間、DNAと共に細胞をインキュベートした後、42℃で30秒間熱ショックを与えることにより、1μLの反応混合物を50μLのDH5αに形質転換した。細胞に熱ショックを与えた後、450μLのS.O.C.を添加し、37℃で60分間細胞をインキュベートした。細胞(100μL)を、100μg/mlアンピシリンを含有するLBプレートに塗抹し、一晩インキュベートした。
【0032】
挿入物としてPAK2と共にpcDNA3.1(+)/attRを含有するコロニーをpcDNA/PAK2と命名し、形質移入研究に使用した。
PAK2の恒常的に活性な突然変異体で同様のクローニング反応を行った。この突然変異体は、ヌクレオチドACC(コード領域の位置1420−1422)とGAAとを置換することにより生成した。それにより、461位におけるアミノ酸スレオニンを、グルタミン酸と置換した。該クローンをpcDNA/PAK2T461Eと呼ぶ。
【0033】
2.3. PAK2 用の Myc で標識した( tagged )発現ベクター
PAK2のC末端をMycで標識したものを生成するために、停止コドンを欠くPAK2のコード配列を、配列番号7の前プライマー及び配列番号8の逆プライマーで、上述した反応条件によりPCRで増幅した。PCR生成物をEcoRI及びXbaIで消化し、1%アガロースゲルで分離し、切断し、及びQIAEX II抽出キット(Qiagen)で精製した。次いで、該生成物をフレーム内でpcDNA3.1/myc−His (Clontech)にクローン化し、EcoRI及びXbaIで消化した。同様に、PAK2の恒常的に活性な突然変異体のクローニング配列を、pcDNA3.1/myc−Hisにクローン化した。
【0034】
2.4.Myc で標識化した PAK2 の精製
Mycで標識化したPAK2を免疫沈降するために、Dynabeads M−280 (Dynal)に結合している抗mycマウスモノクローナル抗体(9E10) (Santa Cruz Biotechnology)を使用した。緩衝液A (20 mM Tris/HCl、pH 8、0.2 mM EDTA、10%グリセロール、5 mM MgCl2、100 mM KCl)中、1mg/ml BSAの存在下、10分間、ダイナビーズ(dynabeads)を予備インキュベートした。ビーズを2回洗浄し、インキュベート前と同体積の緩衝液A中に再懸濁した。5μgの抗myc抗体及び50μLのダイナビーズM−280と共に室温で2時間クローニングを行った。次いで、500μLのRIPA緩衝液(10 mM Tris/HCl、pH 8、140 mM NaCl、1 mM EDTA、1% NP40、0.1%SDS、1%デオキシコーレート)で3回洗浄し、次いで緩衝液Aで2回洗浄した。更に、4℃で2時間、Mycで標識化したPAK2を含有する300μLの細胞内可溶質(cytosolic)抽出物と共にビーズをインキュベートした。磁気装置でビーズを集め、氷冷したキナーゼ緩衝液(50 mM Tris/HCl、pH 7.5、5 mM MgCl2、1 mM EDTA、1 mM EGTA、10 mM β−メルカプトエタノール、脱リン酸酵素阻害剤(50 mM NaF、5 mM Na4P2O7、2 mM Na3VO4、10 nM オカダ酸)及びタンパク質分解酵素阻害剤(40μg/ml ロイペプチン、40μg/mlペプスタイン、40μg/ml アプロチニン、500μM PMSF (フェニルメチルスルホニルフルオライド)で4回洗浄した。
【0035】
2.5. PAK2 構築物による THP−1 細胞の形質移入
5% CO2で加湿した雰囲気中、37℃において、100μg/mlストレプトマイシン、2 mM グルタミン及び1x 非必須アミノ酸、100U/ml ペニシリンを入れた10% FCSを含有するRPMI 1640培地(Bio Whittaker)中でTHP−1細胞を増殖させた。THP−1細胞を新しく継代培養した2−5x105細胞を35mmペトリ皿に培養体積2mLで接種した。
6μL FuGene6 (Roche Biochemicals)を100μLの血清無含有培地に添加し、室温で5分間平衡させた。次いで、2μgの精製したpcDNA/PAK2又はpcDNA/PAK2T461Eを、予め希釈したFuGene6溶液に添加し、穏やかに混合し、さらに室温で15分間インキュベートした。次いで、FuGene6/DNA溶液を細胞に滴下し、培地を撹拌することにより均等に分配した。24時間後、該培地を200μg/ml G418を含有する培地と交換した。
【0036】
PAK2又はPAK2T461Eを発現する安定なクローンを生成するために、48時間後、室温で5分間500×gで細胞をスピンした。該培地を吸引し、RPMI 1640、10% FCS、2 mM グルタミン、100 U/ml ペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン及び200μg/ml G418と交換した。その後5日間毎日交換し、死細胞及び細片を洗浄した。394ウェルプレートに有限的に希釈することにより単一コロニーを単離した。単一クローンを拡大させ、幾つかのクローンにおいてPAK2特異性抗体(クローンV−19, Santa Cruz Biotechnology)によりPAK2の発現を試験した。
【0037】
2.6. PAK2 の自己リン酸化
活性化Cdc42によりPAK2の自己リン酸化を誘発した。それ故、500ngのCdc42を180μM GTPγS (Roche Biochemicals)で10分間30℃で予備的に負荷をかけた(preload)。自己リン酸化のため、500ngのmycで標識化したPAK2又はPAK2T461Eを、反応容積20μLで、50mM Tris/HCl、pH 7.4、10mM MgCl2、30mM β−メルカプトエタノール、0.2mM [γ−32P]ATP (1000 cpm/pmol) (Amersham)中でインキュベートした。濃度範囲0.5〜300nMの本発明の物質及び500ngのGTPγS−負荷Cdc42を添加し、30℃で30分間インキュベートした。10mlのトリクロロ酢酸(30%)を添加することにより該反応を停止し、Packard細胞ハーベスター上、GF/Bガラス繊維フィルター(Whatman)で濾過した。50mM Tris/HCl、pH 7.4、10mM MgCl2、30mMβ−メルカプトエタノールで2回洗浄した。30μLのMicroscintカクテル(Packard)を添加した後、フィルター結合放射能を、マイクロプレートシンチレーションカウンターで計測した。
【0038】
2.7. ヒストン h4 のリン酸化
PAK2を活性化するために、PAK2を活性化Cdc42で誘発した。それ故、500ngのCdc42を、180μM GTPγS (Roche Biochemicals)により30℃において10分間予備的に負荷をかけた。自己リン酸化のため、500ngのmycで標識化したPAK2又はPAK2T461Eを、50mM Tris/HCl、pH 7.4、10mM MgCl2、30mM β−メルカプトエタノール、0.2mM [γ−32P]ATP (1000cpm/pmol) (Amersham)中、反応容積20μLでインキュベートした。500ngのGTPγSで負荷をかけたCdc42、20mgヒストンh4(Sigma)及び本発明の物質を0.5〜300nMの範囲の濃度で添加し、30℃で30分間インキュベートした。2x Laemmli緩衝液を添加することにより反応を停止し、該反応混合物を12% SDS ポリアクリルアミドゲル (Biorad)上で分離した。ヒストンh4に導入した放射能を、蛍光物質イメージング(Storm 860, Molecular Dynamics)により測定した。
【0039】
2.8. キナーゼ活性についての SPA アッセイ ( シンチレーション近接アッセイ( scintillation proximity assay ) )
384ウェルプレート(Packard Optiplate, 白色, 平底, 製造番号. 6005214)でSPAアッセイを行った。N末端にビオチンを有するヒストンを組換えPAK2の基質として使用した。50mM Tris/ 0.1 mM EGTA / 0.1% 2−メルカプトエタノール/ 10mM ステアリン酸マグネシウム/0.1mM ATP/pH 7.5中で酵素ストックを、−80℃においてアリコートで保存した。
方法:
384ウェルプレートにおいて、脱塩水中10μLの試験化合物(5% DMSO含有、最終濃度1%)を、15μLのPAK2(1 U/ml μM; f.c. 0.3 U/ml)と酵素希釈緩衝液(1 mg/ml BSA/ 50 mM Tris/ 0.1 mM EGTA/ 0.1% 2−メルカプトエタノール/ pH 7.5)中で混合し、室温で15分間インキュベートした。“陰性”コントロール(100% CTL、酵素活性を阻害していないもの)として、試験化合物を上述の混合物から除いた。“陽性”コントロール(0% CTL、完全に酵素活性を阻害したもの)として、試験化合物をスタウロスポリン(100μM, f.c. 20 μM)と置換した。ビオチニル化ヒストン(1.5μM, f.c. 0.75μM)及びγ33PでラベルしたATP (0.17μCi/ウェル)を25μLの2×キナーゼアッセイ緩衝液(50mM Tris/ 10mM β−グリセロホスフェート/4mM ジチオスレイトール/200μMバナジン酸ナトリウム/20mM MgCl2/pH7.5)に添加した。次いで、該プレートを室温で2時間インキュベートした。インキュベート時間終了後、0.1mg/ウェルのLEADシーカーストレプトアビジンで被覆したポリスチレンビーズを、100mM Tris/10 mM EDTA/100μM 冷ATPを含有する30μLの溶液に添加した。室温で1時間インキュベーション後、該プレートを500gで1分間遠心分離にかけた。各アッセイミクロ滴定プレートは、上述した“陰性”及び“陽性”コントロールを含むウェルを含有した。データ分析は、“陽性”コントロールを減じた後、“陰性”コントロールのシンチレーションと比較した、試験化合物中に存在するシンチレーションのパーセンテージを計算することにより行った:
%CTL=(シンチレーション(サンプル)−シンチレーション(“陽性”コントロール))×100/(シンチレーション(“陰性”コントロール)−シンチレーション(“陽性”コントロール)
PAK2酵素の阻害剤では、100 %CTL (阻害せず)と0 %CTL (完全に阻害)の間の値が得られると思われる。100 %CTLより大きい値は通常、アロステリック制御等の化合物特異性物理化学的性質又は間接的生化学的性質と関連する。
【0040】
2.9. PAK2 による表現型効果 / 細胞効果
以下のアッセイは、PAK2又はPAK2/T461Eで過渡的に又は安定的に形質移入されている細胞系THP−1 (Tsuchiya et al., 1980)又はMonoMac 6 (Ziegler−Heitbrock et al., 1988)で行い、読出した情報を、形質移入したようにみせかけた細胞と比較した。また、PAK2の活性を刺激する本発明の物質を添加した。
サイトカインの製造及び放出
単球/マクロファージ細胞系を、2.5〜5x105細胞/mlの細胞密度で、10nM PMA、20ng/ml M−CSF、20ng/ml GM−CSF、20μg/ml LPS (サルモネラミネソタ(Salmonella minnessota)Re595由来)等、種々の刺激で刺激した。0、1、3、6、12、24、48及び72時間後に細胞を捕集し、更に研究するために上澄みを凍結し、細胞をPBSで洗浄し、143mMβ−メルカプトエタノールを含む400μLのRLT緩衝液(Qiagen RNeasy Total RNA Isolation Kit)中に再懸濁し、DNAを20gの針で少なくとも5回切断し、−70℃で保存した。
【0041】
煙リッチ培地により、タバコの煙による細胞刺激を行った。サプリメント無含有100mL RPMI培地を、2本のタバコの煙で灌流した。タバコの煙を50mLシリンジ中に引き(タバコ1本当たり50mL体積の約20体積)、次いで培地中に灌流した。その後、培地のpHを7.4に調整し、0.2μmフィルタを通して培地を濾過滅菌(filtersterilize)した。細胞を煙リッチ培地に再懸濁し、1x106細胞/mlの細胞密度で、37℃で10分間インキュベートした。次いで細胞をRPMI 1640で2回洗浄し、上述した時間でフラスコ又は24ウェルプレート(MonoMac6)に播種した。
全RNAを、Qiagen RNeasy Total RNA Isolation Kit (Qiagen)により、製造業者の手順に従い単離した。精製したRNAをTaqMan分析に使用した。サイトカインTNFα、IL−1β、IL−8及びIL−6の発現レベルを測定した。
【0042】
分泌したサイトカインの検出
培養及び刺激した細胞の上澄み中のタンパク質を、最終濃度が10%になるまで三塩素酸(TCA)を添加することにより沈殿させた。沈殿物を80%エタノールで2回洗浄し、ペレットを50mM Tris/HCl、pH 7.4、10 mM MgCl2、1mM EDTA中に再懸濁した。ブラッドフォード法によりタンパク質濃度を測定し、各サンプル50μgを12% SDSポリアクリルアミドゲルにかけた。ゲルをPVDF膜上にブロットし、TBST中5%BSA中で1時間ブロックし、商業的に入手可能な、ヒトTNFα、IL−1β、IL−8及びIL−6に対する抗体と共に1時間インキュベートした。TBSTで洗浄後、セイヨウワサビパーオキシダーゼに結合している抗ヒトIgGと共にブロットをインキュベートし、再度洗浄し、ECL化学ルミネッセンスキット(Amersham)で展開した。バンドの強度をBioMax X線フィルム(コダック)で可視化し、濃度計で定量した。
【0043】
分泌したマトリックス金属プロテアーゼ及び他のプロテアーゼの検出
サイトカインについて使用した方法と同じ方法を使用した。ウエスタンブロットに使用した抗体は、ヒトMMP−1、MMP−7、MMP−9及びMMP−12にあわない。
分泌したマトリックス金属プロテアーゼの活性
蛍光物質を使用してプロテアーゼ活性を測定した。刺激した細胞と未刺激の細胞とから単離した上澄み(既述のもの)を、総体積50μLで、1μMの基質(Dabcyl−Gaba−Pro−Gln−Gly−Leu−Glu (EDANS)−Ala−Lys−NH2 (Novabiochem))と共に5分間室温でインキュベートした。反応当たり125ngの精製したMMP−12で陽性コントロールを行った。励起320nm及び発光405nmにおいて蛍光光度分析によりプロテアーゼ活性を測定した。
【0044】
タンパク質分解活性及び細胞遊走を測定するための別のアッセイにおいて、走化性(Boyden)チャンバを使用した。チャンバの上方部分のウェルにおいて、細胞(ウェル当たり105細胞)を、Matrigel (Becton Dickinson)の8μm層で被覆したフィルター上に置いた。区画の下方部分で、MCP−1 (10ng/ml)、ロイコトリエンB4 (10ng/ml)等の化学遊走物質を培地に添加した。5日後フィルターを除き、Matrigelを通り抜けてきた、下面の細胞を、メタノールで固定し、Diff−Quik染色キット(Dade Behring)で染色し、光学顕微鏡により高性能視野(400x)で3回(in three)カウントした。
【0045】
走化性アッセイ
走化性を測定するために、48ウェルの走化性(Boyden)チャンバ(Neuroprobe)を使用した。細胞を、24時間、FCS無含有RPMI培地中で飢えさせた。化学遊走物質(50ng/ml IL−8、10ng/ml MCP−1、10nM lipoxin A4)及び本発明の物質を、FCS無含有RPMI培地中で希釈し、30μLを下方区画のウェルと置換した。ポリカーボネートフィルター(孔径8μm)で上方区画を下方区画から離した。50μLの細胞懸濁液(5 x104)を上方区画のウェルに置いた。該チャンバを、5%CO2で加湿した雰囲気中、37℃で5時間インキュベートした。次いで、フィルターを除き、上面の細胞をこすり落とし、下面の細胞をメタノール中で5分間固定し、Diff−Quik染色セット(Dade Behring)で染色した。遊走した細胞を光学顕微鏡により高性能視野(400x)で3回カウントした。
【0046】
粘着アッセイ
細胞を捕集し、PBSで洗浄し、PBS及び1μM BCECF((2’−7’−ビス−(カルボキシエチル)−5(6’)−カルボキシフルオレセインアセトキシメチル)エステル、Calbiochem)中に再懸濁し(4x106/ml)、37℃で20分間インキュベートした。PBS中で細胞を洗浄し、0.1% BSAを含有するPBS中に再懸濁した(3.3x 106/ml)。3x105 細胞(90μL)を、ラミニン(Becton Dickinson)で被覆した96ウェルの平底プレートの各ウェルに添加し、10分間放置した。本発明の物質を添加し、37℃で20分間インキュベートした。0.1%BSAを含有するPBSで細胞を洗浄し、37℃で20分間プレートをインキュベートした。0.1%BSAを含有するPBSで細胞を洗浄し、粘着細胞を100μLの0.025M NaOH及び0.1% SDSで可溶化した。蛍光測定により定量した。
【0047】
食作用
細胞懸濁液(2.5x104 細胞/ml)を、5mlのU937又はTHP−1と共に6ウェルプレートに播種するか、又は2mlのMonoMac6と共に24ウェルプレートに播種し、本発明の物質の存在下、5%CO2で加湿した雰囲気中、37℃で1時間インキュベートした。熱により不活性化したSaccharomyces boulardii (20酵母/細胞)の分散懸濁溶液40μLを各ウェルに添加した。細胞を3時間より長くインキュベートし、PBSで2回洗浄し、細胞遠心分離した(cytocentrifuge)。サイトスピン調製物をMay−Grunwald−Giemsaで染色し、食菌した粒子を光学顕微鏡によりカウントした。
【0048】
実施例3: PAK2
同定した別の遺伝子によりPAK2(配列番号9,10)をコードした。PAK2は、プロテインキナーゼのPKCクラスに関連するセリン/スレオニンキナーゼである。PAK2は小さいGTPases Rac及びRhoAの下流エフェクターであり、細胞運動の過程に関与すると思われる(Vincent and Settleman 1997)。
PAK2は、健康な喫煙者と比較してCOPD喫煙者において一貫して下方制御(54.8%)であることが分かった。これは、“avg diff”値(表3)に示した。COPD喫煙者と健康な喫煙者との間で比較したp値は0.02である。
【0049】
【表3】
【0050】
実施例2.9と類似の方法で、PAK2の代わりにPRK2でアッセイした。
実施例4: GUK1
同定した別の遺伝子は、グアニレートキナーゼ1(GUK1;配列番号11,12)である。グアニレートキナーゼ1は、アデノシン三リン酸(ATP)からグアノシン一リン酸(GMP)又はdGMPへリン酸塩が移行するのを触媒する。この酵素はcGMPの回収において機能し、それ故、シグナル伝達経路へのグアニンヌクレオチドの供給を制御すると考えられる(Brady et al. 1996)。
GUK1は、健康な喫煙者と比較してCOPD喫煙者において一貫して上方制御(52%)であることが分かった。これは、“倍変化”(FC)値(表4)に示した。COPD喫煙者と健康な喫煙者とを比較した2つの別々の群のp値は0.02と0.17であった。
【0051】
【表4】
実施例2.9と類似の方法で、PAK2の代わりにGUK1でアッセイした。
Literature:
PAK2
Knaus, U.G., Morris, S., Dong, H.−J., Chernoff, J., and Bokoch, G.M. (1995). Science 269, 221−223.
Frost, J.A., Xu, S., Hutchison, M.R., Marcus, S., and Cobb, M.H. (1996). Mol. Cell. Biol. 16, 3707−3713.
Goeckeler, Z.M., Masaracchia, R.A., Zeng, Q., Chew, T.−L., Gallagher, P., and Wysolmerski, R.B. (2000), J. Biol. Chem. 275, 18366−18374.
Zeng, Q., Lagunoff, D., Masaracchia, R., Goeckeler, Z., Cote, G., and Wysolmerski, R. (2000). J. Cell Sci. 113, 471−482.
PRK2
Vincent, S., and Settleman, J. (1997). Mol. Cell. Biol. 17, 2247−2256.
GUK1
Brady, W.A., Kokoris, M.S., Fitzgibbon, M., and Black, M.E. (1996). J. Biol. Chem. 271, 16734−16740.
Cell lines
Tsuchiya, S., Yamabe, M., Kobayashi, Y., Konno, T., and Tada, K. (1980) Int.J. Cancer 26, 171−176.
Ziegler−Heitbrock, H.W., Thiel, E., Futterer, A., Herzog, V., Wirtz, A., and Riethmuller, G. (1988) Int.J.Cancer 41, 456−461
Claims (41)
- 物質が、タンパク質の機能の活性剤であるかまたは阻害剤であるかを測定するための方法であって、
該タンパク質が、DHAM−キナーゼであるかまたは対応するDHAM−キナーゼの機能を有するDHAM−キナーゼの変異体、突然変異体またはフラグメントであり、
該方法が、DHAM−キナーゼまたはDHAM−キナーゼの機能を有するDHAM−キナーゼの変異体、突然変異体またはフラグメントと、DHAM−キナーゼの所望の機能の阻害剤であるか又は活性剤であるかを試験するための該物質とを接触させ、及び所望の機能が阻害剤であるか又は活性剤であるかを測定することを含む前記方法。 - 所望の機能が阻害されているかまたは活性化されているかを直接測定する請求項1記載の方法。
- 所望の機能が阻害されているかまたは活性化されているかを間接的に測定する請求項1記載の方法。
- DHAM−キナーゼが哺乳類のDHAM−キナーゼである請求項1記載の方法。
- DHAM−キナーゼがヒトDHAM−キナーゼである請求項4記載の方法。
- 分析を、細胞系を使用して行う請求項1記載の方法。
- 分析を、無細胞系を使用して行う請求項1記載の方法。
- 前記DHAM−キナーゼが、PAK2(配列番号4)、PRK2(配列番号10)及びGUK1(配列番号12)からなる群から選ばれる請求項1記載の方法。
- PAK2(配列番号4)又は同じ機能を有する変異体、突然変異体またはそれらのフラグメントを使用する、請求項8記載の方法。
- PRK2(配列番号10)又は同じ機能を有する変異体、突然変異体またはそれらのフラグメントを使用する、請求項8記載の方法。
- GUK1(配列番号12)又は同じ機能を有する変異体、突然変異体またはそれらのフラグメントを使用する、請求項8記載の方法。
- 該機能が、キナーゼ活性である請求項1記載の方法。
- 該機能が、基質結合である請求項12記載の方法。
- 機能が、基質を特異的にリン酸化することである請求項12の方法。
- マクロファージで発現するDHAM−キナーゼのレベルを測定することを含む、DHAM−キナーゼの発現レベルを測定する方法。
- 前記マクロファージが哺乳動物マクロファージである請求項15記載の方法。
- 前記マクロファージがヒトマクロファージである請求項16記載の方法。
- 前記DHAM−キナーゼが、PAK2(配列番号4); PRK2(配列番号10)及びGUK1(配列番号12)からなる群から選ばれる請求項15記載の方法。
- PAK2(配列番号4)又は同じ機能を有する変異体、突然変異体またはそれらのフラグメントを使用する、請求項18記載の方法。
- PRK2(配列番号10)又は同じ機能を有する変異体、突然変異体またはそれらのフラグメントを使用する、請求項18記載の方法。
- GUK1(配列番号12)又は同じ機能を有する変異体、突然変異体またはそれらのフラグメントを使用する、請求項18記載の方法。
- 慢性炎症性気道疾患を診断または監視するための請求項15記載の方法。
- 慢性炎症性気道疾患が、慢性気管支炎及びCOPDからなる群から選ばれる請求項22記載の方法。
- 分析が、炎症の部位から得られるマクロファージまたはそれらの部分を使用して行われる請求項22記載の方法。
- 物質が、あるタンパク質の機能の活性剤であるかまたは阻害剤であるかを測定するための試験系であって、該タンパク質が、DHAM−キナーゼであるかまたは対応するDHAM−キナーゼの機能を有するDHAM−キナーゼの変異体、突然変異体またはフラグメントである前記試験系。
- 前記DHAM−キナーゼが、PAK2(配列番号4); PRK2(配列番号10);及びGUK1(配列番号12)からなる群から選ばれる請求項25記載の試験系。
- DHAM−キナーゼを発現する細胞を含む請求項25記載の試験系。
- DHAM−キナーゼの活性剤であるかまたは阻害剤であると測定された物質。
- DHAM−キナーゼの活性剤または阻害剤である、ある疾患を治療するための物質。
- 前記疾患が慢性炎症性気道疾患である請求項29記載の物質。
- 前記慢性炎症性気道疾患が慢性気管支炎及びCOPDからなる群から選ばれる請求項30記載の物質。
- DHAM−キナーゼの活性剤であるかまたは阻害剤であるかと測定された少なくとも1種の物質を含む医薬組成物。
- 慢性炎症性気道疾患を治療するための医薬組成物を製造するための、DHAM−キナーゼの活性剤であるかまたは阻害剤であると測定された物質の使用。
- 慢性炎症性気道疾患が慢性気管支炎及びCOPDからなる群から選ばれる請求項33記載の物質の使用。
- DHAM−キナーゼの活性剤であるかまたは阻害剤であると測定された少なくとも1種の物質を含む医薬組成物を、慢性炎症性気道疾患の治療が必要な生物に適当量投与することを含む慢性炎症性気道疾患を治療するための方法。
- 哺乳類を治療するための請求項35記載の方法。
- ヒトを治療するための請求項35記載の方法。
- 慢性気管支炎及びCOPDからなる群から選ばれる慢性炎症性気道疾患を治療するための請求項35記載の方法。
- ADHAM−キナーゼの活性剤であるかまたは阻害剤であると測定された物質を投与することを含む、マクロファージ中でDHAM−キナーゼを選択的に調整するための方法。
- マクロファージが、慢性炎症性気道疾患に関与する請求項39記載の方法。
- 慢性炎症性気道疾患が、慢性気管支炎及びCOPDからなる群から選ばれる請求項40記載の方法。
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