MXPA03004797A - Metodo para identificar sustancias que influyen positivamente en las condiciones inflamatorias de enfermedades inflamatorias cronicas de las vias respiratorias. - Google Patents

Metodo para identificar sustancias que influyen positivamente en las condiciones inflamatorias de enfermedades inflamatorias cronicas de las vias respiratorias.

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Abstract

La presente invencion se refiere a cinasas involucradas en procesos inflamatorios y a la modulacion de la funcion de tal cinasa con el fin de influir positivamente en enfermedades inflamatorias.

Description

METODO PARA IDENTIFICAR SUSTANCIAS QUE INFLUYEN POSITIVAMENTE EN LAS CONDICIONES INFLAMATORIAS DE ENFERMEDADES INFLAMATORIAS CRONICAS DE LAS VIAS RESPIRATORIAS INTRODUCCION La presente invención pertenece al campo de la modulación de procesos inflamatorios, en particular de enfermedades inflamatorias crónicas de las vías respiratorias, en las cuales los macrófagos juegan un papel importante. Los procesos inflamatorios pueden ser modulados de acuerdo a la invención mediante la influencia de la actividad biológica de una c'inasa identificada por estar involucrada en el proceso inflamatorio . Los ejemplos de enfermedades crónicas de las vias respiratorias, en las cuales los macrófagos juegan un papel importante es la bronquitis crónica (CB) . CB puede ocurrir con o sin limitación del flujo de aire e incluye enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) . CB es una enfermedad compleja que abarca síntomas de diferentes trastornos: la bronquitis crónica que está caracterizada por tos e hipersecreción mucosa, enfermedad leve de las vias respiratorias, incluyendo inflamación y fibrosis peribronquial , enfisema, y limitación de las vías respiratorias. CB está caracterizada por una disminución acelerada e irreversible de la función pulmonar. El factor de mayor riesgo para desarrollar CB es fumar cigarrillos en forma continua. Ya que sólo aproximadamente 20% de todos los fumadores están afectados con CB, también es probable que una predisposición genética contribuya a la enfermedad. Los eventos iniciales en el inicio temprano de CB son inflamatorios, afectando las vías respiratorias pequeñas y grandes. Una irritación provocada por fumar cigarrillos atrae a los macrófagos y a los neutrófilos, el número de los cuales se incrementa en el esputo de los fumadores. Fumar perpetuamente produce un progreso de la respuesta inflamatoria en el pulmón mediante la liberación de mediadores de los macrófagos, neutrófilos y células epiteliales que reclutan células inflamatorias a los sitios de la lesión. Hasta ahora no existe terapia disponible para revertir el curso de CB . El cese de fumar puede reducir la declinación de la función pulmonar. Únicamente unos pocos fármacos son conocidos hasta la fecha que proporcionan algún alivio a los pacientes. Una variedad de antagonistas para eventos inflamatorios están bajo investigación como los inhibidores de LTB4. Existe una necesidad continua para proporcionar fármacos para el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas de las vias respiratorias. Las enfermedades inflamatorias crónicas de las vias respi atorias pueden ser atribuidas a las células inmunes inflamatorias activadas, por ejemplo los macrófagos. Por lo tanto existe una necesidad para fármacos que modulen la- función de los macrófagos con el fin de eliminar una fuente de procesos inflamatorios.
DESCRIPCION DE LA INVENCION En la presente invención se encontró que los macrófagos involucrados en un proceso inflamatorio, particularmente en una enfermedad inflamatoria crónica de las vias respiratorias, más particularmente en bronquitis crónica COPD, muestran un patrón de secuencia de ácido nucleico diferencialmente expresada y expresión de proteína que difiere del patrón de la expresión genética de macrófagos provenientes de donadores saludables o donadores en un estado irritado, los cuales posteriormente contienen macrófagos en un estado activado. Por lo tanto, los macrófagos muestran niveles de activación diferentes bajo condiciones inflamatorias diferentes. Por ejemplo, se muestra en la presente invención que los macrófagos involucrados en un proceso inflamatorio en fumadores con COPD muestran patrón de expresión génico diferente que los macrófagos provenientes de fumadores saludables, in.dicando que en fumadores con COPD los macrófagos están en un estado diferente, de aquí en adelante denominado "hiperactivo" . La presente invención proporciona la posibilidad de inhibir la hiperactivación o reducir el estado de hiperactivo de un macrófago al permitir la identificación de sustancias que modulan las cinasas involucradas en la hiperactivación o el mantenimiento del estado hiperactivo . El término "enfermedad inflamatoria crónica de las vías respiratorias" como se utiliza en la presente incluye, por ejemplo, Bronquitis Crónica (CB) y Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica (COPD) . El significado preferido del término "enfermedad inflamatoria crónica de las vías respiratorias" es CB y COPD, el significado más preferido es CB o COPD. La invención está basada en la identificación de una secuencia de ácido nucleico expresada diferencialmente en un macrófago hiperactivo comparado a un macrófago que no es hiperactivo. Tal secuencia de ácido nucleico codifica para una cinasa que está involucrada en la iperactivación o el mantenimiento del estado hiperactivo de un macrófago involucrado en un proceso inflamatorio, preferentemente en una enfermedad inflamatoria de las vias- respiratorias. Tal secuencia de ácido nucleico diferencialmente expresada o proteina codificada por tal secuencia de ácido nucleico es de aquí en adelante también denominada secuencia de ácido nucleico diferencialmente expresada o proteina de la invención respectivamente. En particular, la presente invención enseña un enlace entre los cambios genotipicos en macrófagos debido al patrón de expresión de secuencia de ácido nucleico y proteina diferencialmente expresada y a la implicación de macrófagos en procesos inflamatorios y, de este modo, proporciona una base para una variedad de aplicaciones. Por ejemplo, la presente invención proporciona un método y un sistema de prueba para determinar el nivel de expresión de una proteina de macrófago de la invención o secuencia de ácido nucleico diferencialmente expresada de la invención y mediante lo cual proporciona por ejemplo métodos para el diagnostico o la verificación periódica de los procesos inflamatorios que involucran macrófagos hiperactivos en mamíferos, preferentemente seres humanos, especialmente tales seres que sufren de un proceso inflamatorio, preferentemente en una enfermedad inflamatoria crónica de las vías respiratorias, más preferentemente en bronquitis crónica o COPD. La invención también se refiere a un método para identificar una sustancia por medio de una secuencia de ácido nucleico diferencialmente expresada o proteína de la invención, cuya sustancia modula, por ejemplo actúa como un inhibidor o activador en la secuencia de ácido nucleico diferencialmente expresada o proteína de la invención y mediante esto influye positivamente en los procesos inflamatorios crónicos mediante la inhibición de la hiperacti ación o la reducción del estado hiperactivo de macrófagos, y con lo cual permite el tratamiento de mamíferos, preferentemente seres humanos, que sufren de tal enfermedad. La invención también se refiere a un método para modular selectivamente tal secuencia de ácido nucleico diferencialmente expresada o proteína de la invención en un macrófago, que comprende administrar una sustancia determinada para ser un modulador de la proteína o la secuencia de ácido nucleico diferencialmente expresada. La presente invención incluye el uso de las sustancias para el tratamiento de seres en necesidad de un tratamiento para un proceso inflamatorio . En la presente invención, en un primer paso, es identificada una secuencia de ácido nucleico diferencialmente expresada de la invención, que tiene un patrón de expresión diferente en un macrófago hiperactivo comparado a un macrófago que no es hiperactivo. Para fines de concisión, esta descripción se conduce particularmente con la investigación de macrófagos involucrados en COPD, sin embargo, pueden ser obtenidos resultados equivalentes con muestras de sujetos que sufren de otras enfermedades inflamatorias crónicas de las vías respiratorias, por ejemplo otros síntomas de bronquitis crónica. La investigación de los patrones de expresión diferentes conduce a la identificación de una serie de secuencias de ácido nucleico diferencialmente expresadas, expresadas en dependencia del estado de activación de un macrófago involucrado en un proceso inflamatorio, como se ejemplifica en los ejemplos más adelante. En resumen, tal secuencia de ácido nucleico diferencialmente expresada de la invención es identificada mediante experimentos del perfil de expresión comparativo utilizando una célula o extracto celular de un macrófago hiperactivo, por ejemplo del sitio de inflamación en COPD y del sitio correspondiente del ser de control que no sufre de la enfermedad, sin embargo, que sufre de la misma condición de irritación como exposición a fumar cigarrillos . En un segundó paso, las proteínas son identificadas las cuales son codificadas por la secuencia de ácido nucleico diferencialmente expresada, por ejemplo proteínas que juegan un papel en la mediación de la hiperactivación o en el mantenimiento del estado hiperactivo. Una clase de secuencias de ácidos nucleicos diferencialmente expresada de la invención puede ser identificada por codificar una clase de cinasas, que está caracterizada porque ésta se expresa en un macrófago que es hiperactivado de acuerdo a la invención en un nivel menor o mayor que el nivel control en un macrófago que no es hiperactivo. Tal cinasa ' de la invención es de aqui en adelante denominada DHAM-cinasa (cinasa "desregulada en macrófagos hiperactivos" ) . Un ejemplo preferido de una DHi¾M-cinasa de acuerdo a la presente invención es guanilato-cinasa 1 (GUK1), serin-treonin-cinasa PAK2 , o serin-treonin-cinasa PRK2 , descrita en el listado de secuencias.
La actividad biológica de una DHAM-cinasa de acuerdo a la invención, por ejemplo mediadora de la implicación de un macrófago en un proceso inflamatorio de acuerdo a la invención, es dependiente, por ejemplo, de la fosforilación del sustrato 'y/o de otras funciones de DHAM-cinasa similares al reconocimiento del sustrato y/o al enlace del sustrato. La invención también se refiere a equivalentes funcionales, derivados, variantes, mutantes y fragmentos de una DHAM-cinasa, preferentemente de las cinasas preferidas mencionadas anteriormente en la présente. Funcional en este contexto significa que tiene una función de la DHAM-cinasa correspondiente respectiva que está involucrada en su actividad biológica, por ejemplo fosforilación, reconocimiento, y/o enlace del sustrato. De acuerdo a la presente invención, la actividad biológica de una DHAM-cinasa expresada a un nivel inferior que el nivel control es preferentemente activada con el fin de inhibir la hiperactivación o reducir un estado hiperactivo de un macrófago, mediante lo cual la actividad biológica de una DHAM-cinasa que es expresada a un nivel mayor que el nivel control es preferentemente inhibida con el fin de inhibir la hiperactivación o reducir un estado hiperactivo de un macrófago . En una modalidad, la presente invención se refiere a un método de prueba para determinar si una sustancia es un activador o un inhibidor de una DHAM-cinasa. Ya que una DHAM-cinasa está involucrada en una enfermedad inflamatoria crónica de las vias respiratorias y juega un papel en la medición de inflamación, una sustancia que modula la actividad biológica de una DHAM-cinasa puede ser utilizada para el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas de las vias respiratorias o puede ser utilizada como compuesto guia para la optimización de la función de la sustancia, de una manera que la sustancia utilizada es adecuada para el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas de las vias respiratorias. Para llevar a cabo un método de la invención, puede ser utilizado un sistema de prueba de acuerdo a la invención . La presente invención también se refiere a un sistema de prueba para determinar si una sustancia es un activador o un inhibidor de una DHAM-cinasa. Un sistema de prueba útil para realizar un método de la invención comprende un sistema celular o un sistema libre de células. Por ejemplo, una modalidad de la invención se refiere a un sistema de prueba que está diseñado de una manera para permitir la prueba de sustancias que actúan sobre el nivel de expresión de la secuencia de ácido nucleico diferencialmente expresada, por ejemplo utilizando la expresión de un gen reportero, por ejemplo el gen de luciferasa o similar, como una lectura externa medible. Otra modalidad de la invención se refiere a un sistema de prueba que está diseñado de una manera para permitir la prueba de sustancias que interactúan directamente con una función, por ejemplo la actividad enzimática, de la DHAM-cinasa o que interfiere con la activación de una función, por ejemplo la actividad enzimática, de la DHAM-cinasa por un activador natural o uno artificial pero apropiado de la DHAM-cinasa, por ejemplo una cinasa apropiada o similar. Un sistema de prueba de acuerdo a la invención comprende una DHAM-cinasa, o u equivalente funcional, derivado, variante, mutante o un fragmento de una DHAM-cinasa, un ácido nucleico que codifica para una proteina o que codifica para un equivalente funcional, derivado, variante, mutante o fragmento de una DHAM-cinasa y/o elementos reguladores, en donde un equivalente funcional, derivado, variante o fragmento de una DHAM-cinasa o un ácido nucleico que codifica para una DHAM-cinasa o un equivalente funcional, variante, mutante o fragmento de una DHAM-cinasa es capaz de interactuar con una sustancia que va a ser probada de una manera que la interacción directa conduce a una lectura externa medible indicadora del cambio de actividad biológica respectiva de una DHAM-cinasa y/o para el cambio de la expresión de una DHAM-cinasa . Un sistema de prueba de la invención comprende, por ejemplo, elementos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, sistemas libres de células pueden incluir, por ejemplo, una DHAM-cinasa o un equivalente funcional, derivado, variante, mutante o fragmento de una DHAM-cinasa, un ácido nucleico que codifica para un DHAM-cinasa o que codifica para un equivalente funcional, derivado, variante, mutante o fragmento de una DHAM-cinasa en forma enlazada o soluble o en compartimentos celulares o vesículas. Los sistemas celulares adecuados incluyen, por ejemplo, una célula procariótica o célula eucariótica adecuada, por ejemplo que comprende una DHAM-cinasa o un equivalente funcional, derivado, variante, mutante o fragmento de una DHAM-cinasa, un ácido nucleico que codifica para una DHAM-cinasa o que codifica para un equivalente funcional, derivado, variante, mutante o fragmento de DHAM-cinasa . Una célula adecuada para utilizarse en un sistema de prueba de la invención, puede ser obtenida mediante técnicas recombinantes , por ejemplo después de la transformación o la transfección con un vector recombinante adecuado para la expresión de una DHAM-cinasa deseada o equivalente funcional, derivado, variante, mutante o fragmento de una DHAM-cinasa, o puede por ejemplo ser una linea celular o una célula aislada de una fuente natural que expresa una DHAM-cinasa o equivalente funcional, derivado, variante, mutante o fragmento de DHAM-cinasa . Un sistema de prueba de la invención puede incluir un ligando natural o artificial de una DHAM-cinasa si es deseable o necesario para probar si una sustancia de interés es un inhibidor o activador de una DHAM-cinasa. Un método de prueba de acuerdo a la invención comprende la medición de una lectura externa, por ejemplo un cambio fenotipico en el sistema de prueba, por ejemplo, si se utiliza un sistema celular se verifica periódicamente un cambio fenotipico de la célula. Tal cambio puede ser un cambio en una respuesta de origen natural o artificial de la célula o la inhibición de DHAM-cinasa, por ejemplo como se detalla en los ejemplos más adelante.
Un método de prueba de acuerdo a la invención puede por un lado ser útil para prueba de alto rendimiento, adecuado para determinar si una sustancia es un inhibidor o activador de la invención, pero también por ejemplo para prueba o validación secundaria en una sustancia guia u objetivo identificada en la prueba de alto rendimiento. La presente invención también se refiere a una sustancia identificada en un método de acuerdo a la invención por ser un inhibidor o activador de una DHAM-cinasa de la invención. Una sustancia de la presente invención es cualquier compuesto que sea capaz de activar o preferentemente de inhibir una función de una DHAM-cinasa de acuerdo a la invención. Un ejemplo de una manera para activar o inhibir una función de una DHAM-cinasa es mediante la influencia del nivel de expresión de la DHAM-cinasa. Otro ejemplo de una manera para activar o inhibir una función de una DHAM-cinasa es aplicar una sustancia que se enlaza directamente a la DHAM-cinasa y mediante lo cual se activa o se bloquean los dominios funcionales de la DHAM-cinasa, lo cual puede ser realizado de manera reversible o irreversible, dependiendo de la naturaleza de la sustancia aplicada.
En consecuencia, una sustancia útil para activar o inhibir la actividad biológica de una ????-cinasa incluye una sustancia que actúa sobre la expresión de la secuencia de ácido nucleico diferencialmente expresada, por ejemplo un fragmento de ácido nucleico que se hibrida con el gen correspondiente o la secuencia reguladora y mediante lo cual se influye en la expresión génica, o una sustancia que actúa sobre una DHAM-cinasa misma o sobre su activación o inhibición por otros componentes celulares de origen natural, por ejemplo otra proteina que actúa enzimáticamente sobre una proteina de la invención, por ejemplo una proteina cinasa. Por lo tanto, la invención se refiere, por ejemplo, a una sustancia que es una secuencia de ácido nucleico que codifica para el gen de una DHAM-cinasa, o un fragmento, derivado, muíante o variante de tal secuencia de ácido nucleico, cuya secuencia de ácido nucleico o un fragmento, derivado, mutante o variante de la misma es capaz de influir en el nivel de expresión génica, por ejemplo una molécula de ácido nucleico adecuada como ácido nucleico antisentido, ribozima, o para la formación de triple hélice. La invención también se refiere a una sustancia que es por ejemplo un anticuerpo o un compuesto orgánico o inorgánico que se enlaza directamente a o interfiere con la activación de una DHAM-cinasa y mediante lo cual afecta su actividad biológica . En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para determinar un nivel de expresión de un ácido nucleico que codifica para una DHAM-cinasa, preferentemente ARN mensajero, o proteina de la invención misma, en célula, preferentemente en un macrófago, más preferentemente en un macrófago aislado de un sitio de inflamación, aún más preferentemente de un sitio de inflamación en un sujeto que sufre de una enfermedad inflamatoria crónica de las vías respiratorias. Tal método puede ser utilizado; por ejemplo, para probar si una sustancia es capaz de influenciar los niveles de expresión de la secuencia de ácido nucleico diferencialmente expresada en un método descrito anteriormente, para determinar si una sustancia es un activador o un inhibidor de acuerdo a la presente invención. Un método para determinar un nivel de expresión de acuerdo a la presente invención puede, sin embargo, también ser utilizado para probar el estado de activación de un macrófago, por ejemplo para fines de diagnóstico o para investigación del éxito del tratamiento para una enfermedad que es provocada por el macrófago hiperactivo. El macrófago es preferentemente uno de mamífero, más preferentemente una célula humana. En consecuencia, los macrófagos de la presente invención son preferentemente obtenibles del sitio de inflamación en un mamífero y más preferentemente de un sitio de inflamación en un ser humano. Por lo tanto, también la invención se refiere a un método para diagnóstico de una enfermedad inflamatoria crónica, o la verificación periódica de tal enfermedad, por ejemplo la verificación periódica del éxito en el tratamiento de seres en necesidad de tratamiento para tal enfermedad, que comprende determinar un nivel de expresión de un ácido nucleico que codifica para una DHAM-cinasa, preferentemente ARN mensajero, o una DHAM-cinasa misma en un macrófago. Un método para determinar los niveles de expresión de un ácido nucleico que codifica para una proteína de la invención, preferentemente ARN mensajero, o proteina de la invención misma puede, dependiendo del propósito de determinación del nivel de expresión, ser realizado por procedimientos conocidos tales como medición de la concentración de los transcritos de ARN respectivos vía técnicas de hibridación o vía ensayos de accionamiento de gen reportero tales como ensayos de luciferasa o por la medición de la concentración de dicha proteina de la invención, utilizando anticuerpos respectivos. La presente invención también se refiere al uso de una sustancia de acuerdo a la invención para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria crónica de las vías respiratorias. Otra modalidad de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos una de las sustancias de acuerdo a la invención, determinada por ser un activador o un inhibidor. La composición puede ser fabricada de una manera que es conocida por si misma, por ejemplo por medio de mezcla convencional, disolución, granulación, fabricación en grageas, levigación, pulverización, emulsificación, encapsulación , entrampado o procesos de liofilización. Con el fin de utilizar sustancias que activan o inhiben de acuerdo a la invención como fármacos para el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas de las vías respiratorias, las sustancias pueden ser probadas en modelos animales, por ejemplo un animal que sufre de un trastorno inflamatorio de las vías respiratorias o un animal transgénico que expresa una DHAM-cinasa de acuerdo a la invención. La toxicidad y la eficacia terapéutica en la sustancia de acuerdo a la invención pueden ser determinadas mediante procedimientos f rmacéuticos estándares, los cuales incluyen conducir cultivos celulares y experimentos en animales para determinar los IC50, LD50 y ED50. Los datos obtenidos son utilizados para estimar el intervalo de dosis en animales o más preferentemente en humanos, la cual dependerá ' de la forma de dosificación (tabletas, cápsulas, recios de aerosol, ampolletas, etc.) y la ruta de administración (por ejemplo transdérmica , oral, bucal, nasal, enteral, parenteral, por inhalación, intratraqueal , o rectal) . Una composición farmacéutica que contiene al menos una sustancia de acuerdo a la invención como un ingrediente activo puede ser formulada de manera convencional. Los métodos para fabricar tales formulaciones se pueden encontrar en manuales, por ejemplo "Remington Pharmaceutical Science". Los ejemplos para los ingredientes que son útiles para la formulación de al menos una sustancia de acuerdo a la presente invención, también se encuentran en el documento O 99/18193, el cual se incorpora en la presente a manera de referencia. En un aspecto adicional, la invención se refiere a un método para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria crónica de las vias respiratorias de acuerdo a la invención. Tal método comprende administrar a un ser, preferentemente a un ser humano en necesidad de tal tratamiento, una cantidad adecuada de una composición farmacéutica que comprende al menos una sustancia determinada por ser 'un activador o inhibidor mediante un método de acuerdo a la invención para determinar si una sustancia es un activador o un inhibidor de una DHAM-cinasa. En otra modalidad, la invención se refiere a un método para modular selectivamente la concentración de DHAM-cinasa en un macrófago, que comprende administrar una sustancia determinada por ser un activador o inhibidor de una DHAM-cinasa de acuerdo a la invención. Los siguientes ejemplos se dan para ilustrar la presente invención, sin embargo, no deben ser construidos como limitación. No obstante, los ejemplos describen las modalidades más preferidas de la invención .
Ej emplos Ejemplo 1: Perfil Comparativo de Expresión Lo siguiente es una ilustración de cómo se puede realizar el perfil comparativo de expresión, con el fin de identificar una DHAM-cinasa de acuerdo a la presente invención. 1.1 Selección de Sujetos Tres grupos de sujetos se estudiaron: no fumadores saludables, fumadores saludables y pacientes con COPD. Con el fin de evaluar la función pulmonar, a los sujetos se les realizó espirometría. Un cálculo simple basado en la edad y el peso se utilizó para caracterizar los resultados. Los sujetos con COPD se incluyeron si su FEVi% predicho es menor al 70%. Los fumadores saludables son de edad e historial de fumador acoplados con los sujetos de COPD pero que tienen función pulmonar normal. Los no fumadores saludables tienen función pulmonar normal y nunca han fumado. El último grupo tiene un reto con metacolina para excluir el asma. Esta técnica requiere dosis incrementadas de metacolina para ser administradas al sujeto, con espirometría entre cada dosis. Cuando el FEVi cae 20%, la prueba se detiene y se calcula el PC20- Esta es la dosis de metacolina que provoca una caída de 20% en FEVi y nosotros requeriremos un valor mayor a 32 como evidencia de ausencia de asma. A todos los sujetos se les realizaron pruebas de pinchazo en la piel para los alérgenos comunes y se les requirió tener resultados negativos. Esto excluye a los individuos atópicos. La historia clínica de los sujetos es verificada periódicamente y examinada con el fin de excluir enfermedad concomitante. 1.2 Procedimiento de BAL (Lavado Bronqueoalveolar) Los sujetos se sedaron con midazolam antes del BAL. Se utilizó rocío anestésico local para anestesiar la parte posterior de la garganta. Se utilizó un broncoscopio Olympus de 7 mi. El área del lavado es el lóbulo medio derecho. 250 mi de solución salina estéril se instilan e inmediatamente se aspiran. El aspirado resultante contiene macrofagos. 1.3 Proceso de BAL El BAL se filtra a través de gasa estéril para eliminar los desechos. Las células se lavan dos veces en HBSS, se resuspenden en 1 mi de HBSS (solución salina balanceada de Hank) y se cuentan. Los macrofagos son centrifugados hasta una pella utilizando 15 mi de polipropileno con tapa de azul Falcon, resuspendidos en reactivo Trizol (Gíbco BRL Life Technologies) a una concentración de 1 mi de reactivo de Trizol por 10 millones de células y luego se congelaron a -70°C. 1.4 Análisis de Expresión Génica Diferencial El ARN total se extrajo de muestras de macrófagos obtenidas de acuerdo al ejemplo 1.3. Las suspensiones celulares en Trizol se homogenizan a través de pipeta y se incuban a temperatura ambiente por 5 minutos. 200 µ? de cloroformo por mi de Trizol se agregan, la mezcla se agita cuidadosamente por 15 segundos y se incuba por 3 minutos más a temperatura ambiente. Las muestras se centrifugan a 1000 g por 15 minutos a 4°C. La fase superior es transferida a un tubo de reacción nuevo y el ARN se precipita mediante la adición de 0.5 mi de isopropanol por mi de Trizol por 10 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente el precipitado es convertido en pellas mediante el uso de una microcentrifuga por 10 minutos a 4°C con 10,000 g, la pella es lavada dos veces con 75% de etanol, secada al aire y resuspendida en DEPC-H20. Se efectúa una limpieza de ARN con equipo de aislamiento de ARN total Qiagen RNeasy Total (Qiagen) con el fin de mejorar la pureza del ARN. La pureza del ARN se determina mediante electroforesis en gel de agarosa y la concentración se mide por absorción de UV a 260 nm . 5 µa de cada ARN se utilizan para síntesis de ADNc . La síntesis de primera y segunda hebra se realiza con el sistema SuperScript Choice (Gibco BRL Life Technologies). En un volumen total de 11 yl de ARN y 1 µ? de cebador T7-(dt)24 100 µ?, la secuencia mostrada en la SEQ ID NO. 1, se calientan hasta 70°C por 10 minutos y luego se enfrían en hielo por 2 minutos. El amortiguador de la primera hebra hasta una concentración final de Ix, DTT hasta una concentración de 10 mM y una mezcla de dNTP hasta una concentración final de 0.5 mM se agregan hasta un volumen total de 18 µ? . La mezcla de reacción se incuba a 42°C por 2 minutos y se agregan 2 µ? de transcriptasa inversa SuperScript II (200 ?/µ?) . Para la síntesis de la segunda hebra, se agregan 130 µ? de una mezcla qué contiene 1.15x del amortiguador .de la segunda hebra, dNTPS 230 µ?, 10 U de ADN-ligasa de E. coli (10 ?/µ?), ADN-polimerasa de E. coli (10 U/µ?), ARNasa H (2 ?/µ?) a la reacción de la síntesis de la primera hebra y se mezclan cuidadosamente con una pipeta. La síntesis de la segunda hebra se efectúa a 16°C por 2 horas, luego se agregan 2 µ? de ADN-polimerasa T4 (5 U/µ?), se incuban por 5 minutos a 16°C y la reacción se detiene al agregar 10 µ? de EDTA 0.5 M. Antes de la síntesis de AR c, se purifica el ADNc de doble hebra. El ADNc se mezcla con un volumen igual de fenol : cloroformo : alcohol isoamílico (25:24:1) y se centrifuga a través de la matriz de gel de los geles de cierre de fase (Eppendorf) en una microcentrífuga con el fin de separar el ADNc de los nucleótidos no enlazados. La fase acuosa se precipita con acetato de amonio y etanol . Posteriormente, el ADNc se utiliza para la trascripción in vitro. La síntesis de ARNc se efectúa con un equipo de marcación de trascrito ARN de alto rendimiento ENZO BioArray de acuerdo al protocolo del fabricante (Enzo Diagnostics). En resumen, el ADNc se incuba con Ix de amortiguador de reacción HY, Ix de ribonucleótidos marcados con biotina, lx de DTT, Ix de mezcla de inhibidor de ARNasa y lx de ARN-polimerasa T7 en un volumen total de 40 µ? por 5 horas a 37°C. Posteriormente, la mezcla de reacción se purifica vía las columnas RNeasy (Qiagen), el ARNc se precipita con acetato de amonio y etanol y finalmente se resuspende en agua tratada con DEPC. La concentración se determina por medio de espectrometría de UV a 260 nm. El ARNc remanente se incuba con lx de amortiguador de fragmentación (5x de amortiguador de fragmentación : acetato de tris 200 mM, pH 8.1, KOAc 500 mM, MgOAc 150 mM) a 94 °C por 35 minutos. Para la hibridación de la hojuela de ADN, se utilizan 15 yg de ARNc, se mezclan con oligonucleótido B2 control marcado con biotina 50 pM, la secuencia mostró la SEQ ID NO. 2, Ix de coctel de ARNc, 0.1 mg/ml de ADN de csperma de arenque, 0.5 mg/ml de BSA acetilado, lx de amortiguador de hibridación MES (ácido 2- [N-morfolino] -etansulfónico en un volumen total de 300 µ?) . La mezcla de hibridación se calienta hasta 99°C por 5 minutos, se enfria hasta 45°C por 10 minutos y 200 µ? de la mezcla se utilizan para llenar el arreglo de sonda. La hibridación se efectúa a 45°C a 60 rpm por 16 horas. Después de la hibridación, la mezcla' de hibridación en la hojuela es reemplazada por 300 µ? de amortiguador con lavado no riguroso (MES 100 mM, NaCl 100 mM, T een 20 al 0.01%). La hojuela es insertada en una estación Affymetrix Fluidics y el lavado y la tinción se realizan de acuerdo al protocolo EukGE-WS2. La solución de tinción por hojuela consiste de 600 µ? de amortiguador de tinción lx (MES 100 mM, NaCl 1 M, Tween 20 al 0.05%), 2 mg/ml de BSA, 10 µ?/p?? de SAPE ( estreptavidin-picoeritrina ) (Dianova), la solución de anticuerpo consiste de amortiguador de tinción lx, 2 mg/ml de BSA, 0.1 mg/ml de IgG de cabra, 3 pg/ml de anticuerpo biotinilado. Después del procedimiento de lavado y tinción, las hojuelas se exploran en el explorador de arreglo HP Gene (Hewlett Packard) . El análisis de datos se efectúa mediante comparaciones por pares entre las hojuelas hibridadas con ARN aislado de fumadores con COPD y hojuelas hibridadas con ARN aislado de fumadores saludables. Lo siguiente es una ilustración de genes diferencialmente expresados y su función como se identifica de acuerdo al procedimiento de la presente invención .
Ejemplo 2: PAK2 Un gen que es identificado como subregulado consistentemente en individuos con COPD, codifica para PAK2 (SEQ ID NO. 3, 4). PAK2 es una serina/treonina-cinasa que preferentemente interactúa con Cdc42 activado y Rae, pero no con Rho. Esta asociación conduce a la autofosforilación ce PAK2 y a la activación de su actividad de cinasa. PAK2 puede fosforilar la miosina II, MLCK (cinasa de cadena ligera de miosina), p47phox (NAPDH-oxidasa ] , y Raf-1. PAK2 está involucrado en la reorganización de actina y la motilidad celular (Knaus eta al. 1995, Frost et al . 1996, Goeckeler et al . 2000, Zeng et al. 2000). PAK2 se encontró consistentemente subregulado (47%) en fumadores con COPD en comparación a los fumadores saludables. Esto se muestra por los valores "dif. promedio" (tabla 1) y los valores "veces del cambio" (tabla 2). Los valores p para dos grupos separados que se comparan con los fumadores con COPD y fumadores saludables son 0.001 y 0.004.
Tablas la y Ib: Niveles de expresión de PAK2 : valores "dif. promedio" para cada paciente son listados asi como la media y los valores de la mediana para los tres grupos de sujetos; OS significa fumador obstruido, HS fumador saludable, NS no fumador.
Tabla la: Sujeto (OS) Dif. Sujeto (HS) Dif. promedio promedio P01 912.4 P02 752.3 P03 813.5 P37 965.7 pr nv n 427.3 r> .1 X ¿. O *i . w P06 511.0 P56 1180.5 P39 443.5 P57 1143.0 P44 519.8 P58 1215.2 P62 1586.4 Media + DS 604.6+205.8 1161.0+259.8 Mediana 515.4 1180.5 Tabla Ib: Tabla 2: Valores de veces del cambio (FC) para comparaciones entre fumador obstruido y fumadores saludables. En promedio PAK2 está subregulado por 1.78 veces, la mediana es 1.9 veces 2.1 Clonación de PAK2 PAK2 se clonó a partir de un ARN total extraído de P Ns humano (neutrófilos polimorfonucleares ) aislado de voluntarios saludables. 5 iq de ARN se transcribieron a la inversa en ADNc con 5 ng de cebador oligo (dt )?ß/ lx de amortiguador de la primera hebra, DTT 10 mM, dNTPs 0.5 mM y 2 U de Superscript II (Gibco BRL) a 42°C por 50 minutos. Posteriormente, la reacción se terminó a 60°C por 15 minutos y la concentración de ADNc se determinó mediante espectro!"otometria de UV. . Para la amplificación de PAK2, se utilizan 100 ng del ADNc y 10 pmoles de cebadores especificos de secuencia para PAK2 (SEQ ID NO. 5 cebador delantero y SEQ ID NO. 6 cebador inverso) para PCR. Las condiciones de reacción son: 2 minutos de 94°C, 35 ciclos con 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 53°C, 90 segundos a 73°C, seguido por 7 minutos a 72°C con ADN-polimerasa Taq. La mezcla de reacción se separa sobre un gel de agarosa al 2%, una banda de aproximadamente 1000 pares de bases se corta y se purifica con el equipo de extracción QIAEX II (Qiagen) . La concentración de la banda purificada se determina y aproximadamente 120 ng se incuban con 300 ng de pDONR201, el vector donador del sistema Gateway (Life Technologies), Ix de amortiguador de reacción BP-clonasa, mezcla enzimática de BP-clonasa en un volumen total de 20 µ? por 60 minutos a 25°C. Enseguida, las reacciones se incuban con 2 µ? de proteinasa K y se incuban durante 10 minutos a 37°C. La mezcla de reacción es entonces electroporada en células DB3.1 competentes y colocada en placa, sobre placas que contienen kanamicina. Los clones se verifican mediante secuenciamiento. Un clon, designado pD0NR-PAK2, con secuencia idéntica a la base de la entrada de datos (acc. U24153) es utilizado para experimentos posteriores . 2.2 Vector de expresión PAK2 El vector que contiene PAK2 descrito anteriormente se utiliza para transferir el ADNc para PAK2 al vector de expresión pcDNA3.1 ( + ) /attR que contiene los sitios de recombinación "attRl" y ,attR2" del sistema de clonación Gateway (Life Technologies) en donde PAK2 es expresado bajo el control del promotor CMV. 150 ng del "vector de entrada" pD0NR-PAK2 se mezclan con 150 ng del "vector destino" pcDNA3.1 (+) /attR, 4 µ? de la mezcla enzimática LR-clonasa, 4 µ? del amortiguador de reacción LR-clonasa, se agregan con TE (Tris/EDTA) hasta 20 µ? y se incuban a 25°C por 60 minutos. Posteriormente, se agregan 2 µ? de solución de proteinasa K y se incuban por 10 minutos a 37°C. 1 µ? de la mezcla de reacción se transforma en 50 µ? de DH5a por un choque térmico de 30 segundos a 42°C después de incubar las células con ADN por 30 minutos en hielo. Después del choque térmico de las células, se agregan 450 µ? de S.O.C. y las células se incuban a 37°C por 60 minutos. Las células (100 µ?) se colocan en placas, sobre placas LB que contienen 100 g/ml de ampicilina y se incuban toda la noche.
Una colonia que contiene pcDNA3.1 ( + ) /attR con PAK2 como un inserto es designada pcDNA/PAK2 y se utiliza para estudios de transfección . Una reacción de clonación similar se efectúa con un mutante constitutivamente activo de PAK2. Este mutante es generado mediante el reemplazo de los nucleótidos ACC (posición 1420-1422 de la región de codificación) con GAA. Mediante esto, el aminoácido treonina en la posición 461 es reemplazado por ácido glutámico. El clon es denominado pcDNA/PAK2T461E . 2.3 Vector de expresión marcado con Myc para PAK2 Con el fin de generar una versión marcada con Myc C-terminal de PAK2, la secuencia de codificación de PAK2 desprovista del codón de detención es amplificada mediante PCR de acuerdo a las condiciones de reacción indicadas anteriormente con el cebador delantero SEQ ID NO. 7 y el cebador inverso SEQ ID NO. 8. El producto de PCR es digerido con EcoRI y Xbal, separado sobre un gel de agarosa al 1%, cortado y purificado con el equipo de extracción QIAEX II (Qiagen). El producto es luego clonado intraestructuralmente en pcDNA3.1 /myc-His (Clontech) , que es digerido con EcoRI y Xbal. Similarmente, la secuencia de codificación del mutante constitutivamente activo de PAK2 es clonada en pcDNA3.1/myc-His . 2.4. Purificación de PAK2 marcado con Myc Para la inmunoprecipitación de PAK2 marcado con myc se utilizaron anticuerpos monoclonales de ratón anti-myc (9E10) (Santa Cruz Biotechnology) que son acoplados a esferas Dyna M-280 (Dynal) . Las esferas Dyna son preincubadas en amortiguador A (Tris/HCl 20 mM, pH 8, EDTA 0.2 mM, glicerol al 10%, MgCl2 5 mM, KC1 100 mM) en presencia de 1 mg/ml de BSA por 10 minutos. Las esferas se lavan 2 veces y se resuspenden en el mismo volumen como la incubación anterior en amortiguador A. El acoplamiento se efectúa por dos horas a temperatura ambiente con 5 \iq de anticuerpos anti-myc y 50 µ? de esferas Dyna M-280. Posteriormente, las esferas se lavan 3 veces con 500 µ? de amortiguador RIPA (Tris/HCl 10 mM, pH8, NaCl 140 mM, EDTA 1 mM, 1% de NP40, SDS al 0.1%, desoxicolato al 1%) , seguido por dos lavados con amortiguador A. Las esferas entonces son incubadas en 2 horas a 24 °C con 300 µ? de extracto citosólico que contiene PAK2 marcado con myc. Las esferas son recolectadas con el dispositivo magnético y lavadas 4 veces en amortiguador de cinasa enfriado con hielo (Tris/HCl 50 mM, pH 7.5, MgCl2 5 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mMf ß-mercaptoetanol 10 mM, inhibidores de fosfatasa (NaF 50 mM, ?34?207 5 mM, Na3VC>4 2 mM, ácido okadaico 10 nM) e inhibidores de proteasa (40 pg/ml de leupeptina, 40 g/ml de pepstatina, 40 yg/ml de aprotinina, PMSF (fluoruro de fenilmetilsulfonilo ) 500 µ?. 2.5. Transfección de células THP-1 con construcciones de PAK2 Las células THP-1 se desarrollan en medio RPMI 1640 (Bio hittaker) , que contiene FCS al 10% suplementado con 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina, glutamina 2 mM, y Ix de aminoácidos no esenciales en una atmósfera humidificada con C02 al 5% a 37°C. 2-5xl05 células de células THP-1 recientemente pasadas son sembradas en una caja de petri de 35 mm en un volumen de cultivo de 2 mi. Se agregan 6 µ? de FuGene6 (Roche Biochemicals ) a 100 µ? de medio de cultivo sin suero y se equilibran por 5 minutos, a temperatura ambiente. Enseguida, se agregan 2 µ.? de pcDNA_/PAK2 purificado o pcDNA/PAK2T461E a la solución prediluida de FuGene6, suavemente mezclada, y posteriormente se incuba a temperatura ambiente por 15 minutos. Enseguida, la solución de FuGene6/ADN se agrega gota a gota a las células y se distribuye uniformemente bajo agitación turbulenta del medio. Después de 24 horas, el medio es reemplazado por medio que contiene 200 g/ml de G418. Con el fin de generar clones estables que expresen PAK2 o PAK2T461E las células son centrifugadas después de 48 horas por 5 minutos a temperatura ambiente a 500 xg . El medio es aspirado y reemplazado por RPMI 1640, FCS al 10%, glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina, y 200 yg/ml de G418. Durante los siguientes 5 dias, el medio es reemplazado diariamente hasta que las células muertas y los desechos se lavan. Las colonias simples se aislan mediante dilución limitada en placas de 394 pozos. Los clones simples se expanden y la expresión de PÁK2 en diversos clones se prueba via anticuerpos específicos de PAK2 (clon V-19, Santa Cruz Biotechnology ) . 2.6. Autofosforilación de PA 2 La autofosforilación de PAK2 es inducida por Cdc42 activado. Por lo tanto, 500 ng de Cdc42 se precargan con GTPyS 180 µ? (Roche Biochemicals ) por 10 minutos a 30°C. Para la autofosforilación, 500 ng de PAK2 marcado con Myc o PAK2T461E se incuban en un volumen de reacción de 20 µ? en Tris 50 m /HCl, pH 7.4, gCl2 10 mM, ß-mercaptoetanol 30 mM, [Y-32P]ATP 0.2 mM (1000 cpm/pmol) (Amersham) . 500 ng de Cdc42 cargado con GTPYS y las sustancias de acuerdo a la invención en un intervalo de concentración desde 0.5 hasta 300 nM, se agregan y se incuban por 30 minutos a 30°C. Las reacciones se detienen al agregar 10 mi de ácido tricloroacético (30%), se filtran a través de filtros de fibra de vidrio GF/B (Whatman) en un cosechador de células Packard, y se lavan dos veces con Tris 50 mM/HCl, pH 7.4, MgCl2 10 mM^ ß-mercaptoetanol 30 mM, . Después de agregar 30 µ? de coctel Microscint (Packard) la radioactividad enlazada por filtros se cuenta en un contador de cintilación de microplaca. 2.7. Fosforilación de histona h4 Con el fin de activar ???2 , PAK2 es inducido por Cdc42 activado. Por lo tanto 500 ng de Cdc42 se precargan con GTPYS 80 µp? (Roche Biochemicals ) por 10 minutos a 30°C. Para la autofosforilación se incuban 500 ng de PAK2 marcado con Myc o PAK2T461E en un volumen de reacción de 20 µ? en Tris 50 mM/HCl, pH 7.4, MgCl2 10 mM, ß-mercaptoetanol 30 mM, [Y-32P]ATP 0.2 mM (1000 cpm/pmol) (Amersham). 500 ng de Cdc42 cargado con GTPYS, 20 mg de histona h4 (Sigma) y sustancias de acuerdo a la invención en un intervalo de concentración desde 0.5 hasta 300 nM se agregan y se incuban por 30 minutos a 30°C. Las reacciones se detienen mediante la adición de amortiguador de Laemmli 2x y las mezclas de reacción se separan sobre geles de SDS al 12%-poliacrilamida (Biorad) . La radioactividad incorporada en histona h4 se determina mediante formación de imagen fosforescente (Storm 860, Molecular Dynamics). 2.8. Ensayo de SPA (ensayo de proximidad de cintilació ) para la actividad de cinasa El ensayo se realiza en placas de 384 pozos (Packard Optiplate, blanco, fondo plano, producto No. 6005214). La histona con una biotina en el extremo N se utiliza como un sustrato para PAK2 recombinante . La reserva enzimática se almacena en Tris 50 mM/EGTA 0.1 mM/0.1% de 2-mercaptoetanol /acetato de magnesio 10 mM/ATP 0.1 mM/pH 7.5 y se almacenó en alícuotas a -80°C.
Método : En las placas de 384 pozos, se mezclaron 10 µ? del compuesto de prueba en agua desmineralizada (que contiene DMSO al 5%, concentración final de 1%) con 15 µ? de PAK2 (1 U/ml µ?; f.c. 0.3 U/ml) en amortiguador de dilución de enzima (1 mg/ml BSA/Tris 50 mM/EGTA 0.1 mM/0.1% de 2-mercaptoetanol /pH 7.5) y se incubaron por 15 minutos a temperatura ambiente. Para los controles "negativos" ( CT1 al 100%, actividad enzimática no inhibida), el compuesto de prueba se omitió de la mezcla anterior. Para los controles "positivos" (0% de CTL, la actividad enzimática se inhibió totalmente), el compuesto de prueba se reemplazó por estaurosporina (100 µ? f.c. 20 µ? ) . La historia biotinilada (1.5 µ?, f.c. 0.75 µ?) y ATP marcada con Y-33P (0.17 µ??/????) se agregan en 25 µ? de un amortiguador de ensayo de cinasa 2x (Tris 50 mM/beta-glicerofosfato 10 mM/ditiotreitol 4 mM/vanadato de sodio 200 pM/ gCl2 20 mM/pH 7.5). Las placas se incuban posteriormente por 2 horas. Después del periodo de incubación 0.1 mg/pozo de esferas de poliestireno cubiertas con estreptavidina de buscador LEAD se agregan en 30 µ? de una solución que contiene Tris 100 mM/EDTA 10 mM/ATP frió 100 µ . Después de una hora de incubación a temperatura ambiente, las placas se centrifugan por 1 minuto a 500 g. Cada placa de microtitulación de ensayo contiene pozos con controles "negativos" y "positivos" como se describe anteriormente. El análisis de los datos se realiza por el cálculo del porcentaje de cintilación en presencia del compuesto de prueba comparado a la cintilación del control "negativo" después de sustraer el control "positivo": %CTL = (cintilación (muestra) -cintilación (control "positivo") ) *100/ (cintilacion {control "negativo") -cintilacion (control "positivo") ) . Un inhibidor de la enzima PAK2 dará los valores entre 100% de CTL (sin inhibición) y 0% CTL (inhibición completa) . Los valores de más de 100% CTL están normalmente relacionados a las propiedades fisicoquímicas especificas del compuesto o a los efectos bioquímicos indirectos tal como la regulación alostérica . 2.9. Efectos fenotipicos/celulares provocados por PAK2 Se realizaron los siguientes ensayos con lineas celulares THP-1 (Tsuchiya et al., 1980) o MonoMac 6 ( Ziegler-Heitbrock et al., 1988) que son transitoriamente o establemente transfectados con PAK2 o PAK2/T461E y las lecturas externas se comparan a las células transfectadas imitación. Además, las sustancias de acuerdo a la invención que estimulan la actividad de PAK2 , son agregadas.
Producción y liberación de citocinas Lineas celulares monocíticas/macrófagos son estimuladas con diversos estímulos, como PMA 10 nM, 20 ng/ml de M-CSF, 20 ng/ml de GM-CSF, 20 pg/ml de LPS (de Salmonella minnessota Re595) a densidades celulares entre 2.5 y 5 x 105 células/ml. Las células se cosechan después de 0, 1, 3, 6, 12, 24, 48, y 72 horas, el sobrenadante se congela para investigación posterior, las células se lavan con PBS, y se resuspenden en 400 µ? de amortiguador RLT (proveniente de equipo de aislamiento de ARN total RNeasy de Qiagen) con ß-mercaptoetanol 143 mM, el ADN se cortó con una aguja de 20 g por al menos 5 veces y se almacenó a -70°C. La estimulación de células por humo de cigarrillos se realiza por un medio enriquecido en humo. 100 mi RPMI sin suplementos se esparce con el humo de cigarrillo de dos cigarrillos. El humo de los cigarrillos es absorbido en una jeringa de " 50 mi (aproximadamente 20 volúmenes de un volumen de 50 mi por cigarrillo) y luego esparcido en el medio. Después de esto, el pH del medio es ajustado a 7.4, y el medio es esterilizado por filtración a través de un filtro de 0.2 pm. Las células son resuspendidas en medio enriquecido con humo e incubadas 10 minutos a 37 °C a una densidad de IxlO6 células/ml. Posteriormente, las células son lavadas dos veces con RPMI 1640 y sembradas en matraces o placas de 24 pozos (MonoMac6) por los tiempos indicados anteriormente.
Los ARNs totales son aislados con el equipo de aislamiento de ARN total Qiagen RNeasy (Qiagen) de acuerdo al protocolo del fabricante. El ARN purificado se utiliza para el análisis de Taqman. Los niveles de expresión de citocinas TNFOÍ, IL-?ß, IL-8, e IL-6 se miden.
Detección de citocinas secretadas Las proteínas en los sobrenadantes de las células cultivadas y estimuladas son precipitadas mediante la adición de ácido triclórico (TCA) hasta una concentración final de 10%. Los precipitados son lavados 2 veces con etanol al 80% y las pellas se resuspenden en Tris 50 mM/HCl, pH 7.4, MgCl2 10 mM, EDTA 1 mM. La concentración proteica se determina vía el método de Bradford y se cargan 50 g de cada muestra sobre geles de SDS-poliacrilamida al 12%. Los geles son secados sobre membranas de PVDF, bloqueados por una hora en BSA al 5% en TBST, e incubados por una hora por anticuerpos comercialmente disponibles contra TNFa, IL-1ß, IL-8, e IL-6 humanos. Después de lavar con manchas de TBST, son incubados con IgG antihumano conjugado a peroxidasa de rábano, lavados nuevamente y desarrollados con equipo de quimioluminiscencia ECL (Amersham) . La intensidad de las bandas se visualiza con películas de rayos X BioMax (Kodak) y se cuantifica por densitometría .
Detección de metaloproteasas de matriz secretadas y otras proteasas El procedimiento es idéntico a aquél utilizado para las citocinas . Los anticuerpos utilizados para el manchado de Western son contra MMP-1, MMP-7, MMP-9, y MMP-12 humano.
Actividad de metaloproteasas de matriz secretadas La actividad de proteasa se determina con un sustrato fluorescente. Los sobrenadantes aislados a partir de las células estimuladas y no estimuladas (descritas anteriormente) son incubados en un volumen total de 50 µ? con 1 µ? del sustrato ( Dabcyl-Gaba-Pro-Gln-Gly-Leu-Glu ( EDANS ) -Ala-Lys-NH2 (Novabiochem) ) por 5 minutos a temperatura ambiente. Los controles positivos son desarrollados con 125 ng de MMP-12 purificado por reacción. La actividad de proteasa es determinada por fluorometría con una excitación a 320 nm y una emisión a 405 mm. En un ensayo alternativo para determinar la actividad proteolítica y la migración celular, se utilizó una cámara de quimiotaxis (Boyden) . En los pozos de la parte superior de la cámara, las células (105 células por pozo) son colocadas en placas sobre filtros recubiertos con una capa de 8 µp? de atrigel (Becton Dickinson) . En el compartimiento inferior los quimioatrayentes como el leucotrieno B4 (10 ng/ml), MCP-1 (10 ng/ml) son agregados al medio. Después de 5 días, los ' filtros son retirados,. las células en la superficie inferior que han atravesado el Matrigel son fijadas con metanol, teñidas con equipo de tinción Diff-Quik (Dade Behring) y contadas en tres campos de alta energía (400x) por microscopio luminoso.
Ensayo de Quimiotaxis Con el fin de determinar la quimiotaxis, se utilizó una cámara de quimiotaxis de 48 pozos (Boyden) (Neuroprobe) . Las células son cosechadas por 24 horas en medio RPMI sin FCS . Los quimioatrayentes (50 ng/ml IL-8, 10 ng/ml MCP-1, lipoxina A4 10 nM) y sustancias de acuerdo a la invención son diluidos en medio RPMI sin FCS y se colocan 3 µ? en los pozos del compartimiento inferior. El compartimiento superior es separado del conpartimiento inferior por un filtro de policarbonato (tamaño de poro de 8 i ) . 50 µ? de la suspensión celular (5xl04) son colocados en el pozo del compartimiento superior. La cámara es incubada por 4 horas a 37°C en una" atmósfera humidificada con C02 al 5%. Posteriormente el filtro se retira, las células sobre el lado superior son retiradas raspando, las células en la parte inferior son fijadas por 5 minutos en metanol y teñidas con el equipo de tinción Diff-Quik (Dade Behring). Las células migradas son contadas en tres campos de alto poder (400x) por microscopio luminoso .
Ensayo de adherencia Las células son cosechadas, lavadas en PBS y resuspendidas (4xl06/ml) en PBS y BCECF 1 µ? (éster acetoximetílico de ( 2 ' -7 ' -bis- ( carboxietil ) -5 ( 6' ) -carboxifluoresceina, Calbiochem) e incubadas por 20 minutos a 37°C. Las células son lavadas en PBS y resuspendidas (3.3 x 106/ml) en PBS que contiene BSA al 0.1%. 3 x 105 células (90 µ?) se agregan a cada pozo de una placa con fondo plano de 96 pozos recubierta con laminina (Becton Dickinson) y se dejan asentar por 10 minutos. Las sustancias de acuerdo a la invención son agregadas y colocadas en placas e incubadas por 20 minutos a 37 °C. Las células son lavadas con PBS que contiene BSA al 0.1% y las células adherentes son solubilizadas con 100 µ? de NaOH 0.025 M y SDS al 0.1%.
La cuantificación se lleva a cabo por medición de fluorescencia .
Fagocitosis Las suspensiones celulares (2.5 x 104 células/ml ) son sembradas en placas de 6 pozos con 5 mi de U937 o THP-1 o en placas de 24 pozos con 2 mi de MonoMac6 e incubadas por 1 hora a 37 °C en una atmósfera humidificada con C02 al 5% en presencia de sustancias de acuerdo a la invención. 40 µ? de una suspensión dispersada de Saccharomyces boulardii inactivada por calor (20 levadura/célula) se agregan a cada pozo. Las células se incuban por otras 3 horas, se lavan dos veces con PBS y se citocentrifugan . Las preparaciones de citosina son teñidas con May-Grünwald-Giemsa y las partículas fagocitosadas son contadas por microscopio luminoso .
Ejemplo 3: PRK2 Otro gen identificó los códigos para PRK2 (SEQ ID NO. 9, 10) . PRK2 es serina/treonina-cinasa relacionada a la clase PKC de las proteínas cinasas. Éste es un efector corriente debajo de GTPasas pequeño Rae y RhoA y parece estar involucrado en los procesos de la motilidad celular (Vincent and Settleman 1997).
PRK2 se encontró consistentemente subregulado (54.8%) en fumadores con COPD en comparación a los fumadores saludables. Esto se muestra por los valores "Dif. promedio" (tabla 3). El valor p para las comparaciones entre los fumadores con COPD y los fumadores saludables es de 0.02.
Tabla 3: los niveles de expresión de PRK2 : valores de "Dif. promedio" para cada paciente se listan asi como los valores de la media y la mediana para los tres grupos de sujetos; OS significa fumador obstruido, HS fumador saludable, NS no fumador Sujeto Dif. Suj eto Dif. Paciente Dif. (OS) promedio (HS) promedio (NS) promedio P01 234.4 P02 366.2 P48/49 150 .0 P03 366.7 P37 1593.9 P50/52 1185.8 P05 291.4 P43 486.3 P54/61 1187.3 P06 504.5 P56 1387.0 P39 857.2 P57 736.6 P44 257.5 P58 1074.0 P62 1090.7 Media + 418+236.1 962.1+454.8 1294.0+186.2 DS Mediana 328.6 1074.0 1187.3 Los ensayos son construidos con PRK2 en vez de PAK2 de una manera análoga al ejemplo 2.9.
Ejemplo 4: GUKl Otro gen identificado es guanilato-cinasa 1 (GUKl; SEQ ID NO. 11, 12). La guanilato-cinasa 1 cataliza la transferencia de fosfato a partir de trifosfato de adenosina (ATP) a monofosfato de guanosina (GNP) o dGMP . Esta enzima funciona en la recuperación de cGMP y es, por lo tanto, conocida por regular el suministro de los nucleótidos guanina a las vías de transducción de señal (Brady et al. 1996). Se encontró que GUKl es consistentemente subregulado (52%) en fumadores con COPD en comparación a los fumadores saludables. Esto se muestra por los valores "veces del cambio" (FC) (tabla 4). Los valores p en dos grupos separados en comparación a los fumadores con COPD y los fumadores saludables son de 0.02 y 0.17.
Tabla 4: Valores de veces del cambio (FC) para comparaciones entre fumador obstruido y fumadores saludables. En GUKl promedio está subregulado por 2.05 veces, la mediana es de 2.05 veces.
Los ensayos son construidos con GUK1 en vez de PAK2 de manera análoga en el ejemplo 2.9.
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Claims (34)

REIVINDICACIONES
1. Un método para determinar si una sustancia es un activador o un inhibidor de una función de una proteína, caracterizado porque la proteína es una DHAM-cinasa, variante, mutante, o fragmento de una DHA -cinasa que tiene una función de la DHAM-cinasa correspondiente, y caracterizado porque el método comprende poner en contacto la DHAM-cinasa o la variante, mutante, o fragmento de la misma que tiene una función de DHAM-cinasa con una sustancia a ser probada si esta es un inhibidor o un activador de una función deseada de la DHAM-cinasa, y medir si la función deseada es inhibida o activada.
2. Un método de conformidad con la reivindicación 1, en el cual la inhibición o la activación de la función deseada es medida directamente.
3. Un método de conformidad con la reivindicación 1, en el cual la inhibición o activación de la función deseada es medida indirectamente.
. Un método de conformidad con la reivindicación 1, en el cual la DHAM-cinasa es una DHAM-cinasa de mamífero.
5. Un método de conformidad con la reivindicación 1, en el cual la DHAM-cinasa es una DHAM-cinasa de humano.
6. Un método de conformidad con la reivindicación 1, en el cual el análisis se realiza utilizando un sistema celular.
7. Un método de conformidad con la reivindicación 1, en el cual el análisis se realiza utilizando un sistema libre de células.
8. Un método de conformidad con la reivindicación 1, en el cual la DHAM-cinasa se selecciona del grupo que consiste de PAK2 (SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 10); y GUK1 (SEQ ID NO. 12) .
9 Un método de conformidad con la reivindicación 8, en el cual se utiliza PAK2 (SEQ ID NO. 4) o una variante, mutante o fragmento del mismo que tiene la misma función.
10. Un método de conformidad con la reivindicación 8, en el cual se utiliza PRK2 (SEQ ID NO. 10) o una variante, mutante o fragmento del mismo que tiene la misma función.
11. Un método de conformidad con la reivindicación 8, en el cual se utiliza GUK1 (SEQ ID NO. 12) o una variante, mutante o fragmento del mismo que tiene la misma función.
12. Un método de conformidad con la reivindicación 1, en el cual la función es una actividad de cinasa .
13. Un método de conformidad con la reivindicación 12, en el cual la función es un enlace de sustrato .
14. Un método de conformidad con la reivindicación 12, en el cual la función es una fosforilación especifica de un sustrato.
15. Un método para determinar un nivel de expresión de una DEAM-cinasa que comprende determinar el nivel de DHAM-cinasa expresada en un macrófago.
16. Un método de conformidad con la reivindicación 15, en el cual el macrófago es un macrófago de mamífero.
17. Un método de conformidad con la reivindicación 8, en el cual el macrófago es un macrófago de humano.
18. Un método de conformidad con la reivindicación 15, en el cual la DHAM-cinasa se selecciona del grupo que consiste de PAK2 (SEQ ID NO. 4); PRK2 (SEQ ID NO.10); y GUK1 (SEQ ID NO. 12).
19. Un método de conformidad con la reivindicación 18, en el cual se utiliza PA 2 (SEQ ID NO. 4) o una variante, mutante o fragmento del mismo que tiene la misma función.
20. Un método de conformidad con la reivindicación 18, en el cual se utiliza PRK2 (SEQ ID NO. 10) o una variante, mutante o fragmento del mismo que tiene la misma función.
21. Un método de conformidad con la reivindicación 18, en el cual se utiliza GUK1 (SEQ ID NO. 12) o una variante, mutante o fragmento del mismo que tiene la misma función.
22. Un método de conformidad con la reivindicación 15 para el diagnóstico o verificación periódica de una enfermedad inflamatoria crónica de las vias respiratorias.
23. Un método de conformidad con la reivindicación 22 , en el cual la enfermedad inflamatoria crónica de las vias respiratorias se selecciona del grupo que consiste de bronquitis crónica y COPD.
24. Un método de conformidad con la reivindicación 22, en el cual el análisis se realiza utilizando un macrófago o una parte del mismo obtenible a partir del sitio de inflamación.
25. Un sistema de prueba para determinar si una sustancia es un activador o un inhibidor de una función de una proteina, caracterizado porque la proteina es una DHAM-cinasa o una variante, mutante o fragmento de una DHAM-cinasa que tiene una función de la DRAM-cinasa correspondiente .
26. Un sistema de prueba de conformidad con la reivindicación 25, en el cual la DHAM-cinasa se selecciona del grupo que consiste de PAK2 (SEQ ID NO.4); PRK2 (SEQ ID NO. 10); y GUK1 (SEQ ID NO. 12).
27. Un sistema de prueba de conformidad con la 5 reivindicación 25, que comprende una célula que expresa una DHAM-cinasa.
28. Una sustancia determinada por ser un activador o inhibidor de una DHAM-cinasa. 10
29. Una sustancia que es un activador o inhibidor de una DHAM-cinasa para el tratamiento de una enfermedad.
30. Una sustancia de conformidad con la 15 reivindicación 29, en la cual la enfermedad es una enfermedad inflamatoria crónica de las vias respiratorias.
31. Una sustancia de conformidad con la reivindicación 30, en la cual la enfermedad inflamatoria • 20 crónica de las vias respiratorias se selecciona del grupo que consiste de bronquitis crónica y COPD.
32. Una composición farmacéutica que comprende al menos una sustancia determinada por ser un activador o 25 inhibidor de una DHAM-cinasa.
33. El uso de una sustancia determinada por ser un activador o inhibidor de una DHAM-cinasa para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria crónica de las vias respiratorias.
34. El uso de una sustancia de conformidad con la reivindicación 30, en el cual la enfermedad inflamatoria crónica de las vias respiratorias se selecciona del grupo que consiste de bronquitis crónica y COPD.
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