KR20050114214A - 백내장 및 녹내장을 진단 및 치료하기 위한 ｓｇｋ 유전자패밀리의 용도 - Google Patents

백내장 및 녹내장을 진단 및 치료하기 위한 ｓｇｋ 유전자패밀리의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 백내장, 녹내장 또는 당뇨병성 신경병증의 치료 및/또는 예방용 약제를 제조하기 위한 hsgk1 단백질 또는 hsgk3 단백질의 기능적 저해제 또는 hsgk1 유전자 또는 hsgk3 유전자 전사의 음성적 조절인자의 용도에 관한 것이다.
다른 측면으로, 본 발명은 백내장, 녹내장 및/또는 당뇨병성 신경병증의 발병 소질을 진단하기 위한, 수탁 번호 NM_005627에 따른 hsgk1 서열 또는 그의 단편 중 하나를 포함하거나, 수탁 번호 AF169035에 따른 hsgk3 서열 또는 그의 단편 중 하나를 포함하는 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산의 용도, 및 백내장, 녹내장 및/또는 당뇨병성 신경병증의 발병 소질을 진단하기 위한 상기 언급된 핵산을 함유하는 키트에 관한 것이다.
본 발명은 또한 다수의 시험 물질로부터 백내장, 녹내장 및 당뇨병성 신경병증 중에서 선택된 적어도 하나의 질병을 치료 및/또는 예방하기 위해 사용되는 치료 유효 물질을 동정 및 규명하기 위한 상이한 스크리닝 방법에 관한 것이다.

Description

백내장 및 녹내장을 진단 및 치료하기 위한 ＳＧＫ 유전자 패밀리의 용도{USE OF THE SGK GENE FAMILY FOR DIAGNOSIS AND THERAPY OF CATARACTS AND GLAUCOMA}
본 발명은 백내장, 녹내장 또는 당뇨병성 신경병증의 치료 및/또는 예방용 약제를 제조하기 위한, hsgk1 단백질 또는 hsgk3 단백질의 기능적 저해제(functional inhibitor) 또는 hsgk1 유전자 또는 hsgk3 유전자 전사의 음성적 조절인자(negative regulator)의 용도에 관한 것이다.
다른 측면으로, 본 발명은 백내장, 녹내장 및/또는 당뇨병성 신경병증의 발병 소질을 진단하기 위한, 수탁 번호 NM_005627에 따른 hsgk1 서열 또는 그의 단편 중 하나를 포함하거나, 수탁 번호 AF169035에 따른 hsgk3 서열 또는 그의 단편 중 하나를 포함하는 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산의 용도, 및 백내장, 녹내장 및/또는 당뇨병성 신경병증의 발병 소질을 진단하기 위한 상기 언급된 핵산을 함유하는 키트에 관한 것이다.
본 발명은 또한 다수의 시험 물질로부터 백내장, 녹내장 및 당뇨병성 신경병증 중에서 선택된 적어도 하나의 질병을 치료 및/또는 예방하기 위해 사용되는 치료 유효 물질을 동정 및 규명하기 위한 상이한 스크리닝 방법에 관한 것이다.
혈청 및 글루코코르티코이드로부터 유도가능한 키나제 hsgk1이 글루코코르티코이드-감수성 유전자로서 최초로 클로닝되었다[Webster et al, Characterization of sgk, a novel member of the serine/threonine protein kinase gene family which is transcriptionally induced by glucocorticoids and serum. Mol Cell Biol 1993; 13:2031-2040].
그 후의 연구에 의해 hsgk1은 다수의 흥분제[Lang F, Cohen P. Regulation and physiological roles of serum- and glucocorticoid-induced protein kinase isoforms. Science STKE. 2001 Nov 13; 2001 (108):RE17], 예를 들어 특히 무기질 코르티코이드[Chen et al, Epithelial sodium channel regulated by aldosterone-induced protein sgk. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96:2514-2519; Naray-Fejes-Toth et al, sgk is an aldosterone-induced kinase in the renal collecting duct. Effects on epithelial Na+ channels. J Biol Chem 1999; 274:16973-16978; Shigaev et al, Regulation of sgk by aldosterone and its effects on the epithelial Na (+) channel. Am J Physiol 2000; 278:F613-F619; Brenan FE, Fuller PJ. Rapid upregulation of serum and glucocorticoid-regulated kinase(sgk) gene expression by corticosteroids in vivo. Mol Cell Endocrinol. 2000; 30; 166:129-36; Cowling RT, Birnboim HC. Expression of serum- and glucocorticoid-regulated kinase(sgk) mRNA is up-regulated by GM-CSF and other proinflammatory mediators in human granulocytes. J Leukoc Biol. 2000; 67:240- 248]에 의해 영향을 받는다는 사실이 밝혀졌다.
hsgk1은 포스포이노시톨-3-키나제(PI3 키나제) 및 포스포이노시톨-의존성 키나제 PDK1으로 시그널 캐스케이드를 거쳐 인슐린 유사 성장 인자 IGF1, 인슐린 및 산화적 스트레스에 의해 자극받는다[Park et al., Serum and glucocorticoid-inducible kinase(SGK) is a target of the PI 3-kinase-stimulated signaling pathway, EMBO J 1999; 18:3024-3033; Kobayashi et al., Characterization of the structure and regulation of two novel isoforms of serum- and glucocorticoid-induced protein kinase. Biochem. J. 1999; 344:189-197]. PDK1에 의한 hsgk1의 활성화는 422번 위치의 세린에서 인산화를 수반한다. 이러한 세린의 아스파테이트(S422DSGK1)로의 돌연변이는 구조적으로 활성인 키나제를 초래한다[Kobayashi T, Cohen P: Activation of serum- and glucocorticoid-regulated protein kinase by agonists that activate phosphatidylinositide 3-kinase is mediated by 3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1 (PDK1) and PDK2. Biochem J. 1999; 339:319-328].
초기 연구는 hsgk1이 신장의 상피 Na+ 채널의 강력한 자극제임을 보여주었다[De la Rosa et al, The serum and glucocorticoid kinase sgk increases the abundance of epithelial sodium channels in the plasma membrane of Xenopus oocytes. J Biol Chem 1999; 274:37834-37839; Boehmer et al, The Shrinkage-activated Na+ Conductance of Rat Hepatocytes and its Possible Correlation to rENaC. Cell Phys Biochem. 2000; 10:187-194; Lang et al., Deranged transcriptional regulation of cell volume sensitive kinase hSGK in diabetic nephropathy. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97:8157-8162]. hsgk1이 상피 Na+ 채널 ENaC를 발현하지 않는 다수의 조직에서 발견되었기 때문에, hsgk1의 기능은 Na+ 채널을 조절하는 것에 한정되지 않을 것이다[Klingel et al, Expression of the cell volume regulated kinase h-sgk in pancreatic tissue. Am J Physiol (Gastroint. Liver-Physiol.) 2000; 279:G998-G1002; Waldegger et al, Cloning and characterization of a putative human serine/threonine protein kinase transcriptionally modified during anisotonic and isotonic alterations of cell volume. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94:4440-4445; Waldegger et al, h-sgk Serine-Threonine protein kinase gene as early transcriptional target of TGF-β in human intestine. Gastroenterology 1999; 116:1081-1088].
hsgk1이 아마도 아직까지 밝혀지지 않은 방식으로 다수의 다른 시그널 형질도입 경로 또는 이들 경로의 성분을 조절할 것이라는 사실로, hsgk1 및 그의 인간 동족체는 다수의 질병을 진단하기 위한 수단으로 상당한 가능성을 갖는다. 특히, DE 197 08 173 A1으로부터 hsgk1은 고나트륨혈증, 저나트륨혈증, 당뇨병, 신부전증, 과다이화작용, 간성 뇌병증 및 미생물 또는 바이러스성 감염과 같은 다수의 질병과 관련하여 진단용으로 사용될 수 있음이 명백하며, 여기에서 세포 부피 변화는 중요한 병태생리학적 역할을 한다.
WO 00/62781호는 hsgk1이 상피 Na+ 채널을 활성화하여 신장 Na+ 재흡수를 증가시킨다고 보고하였다. 이와 같은 신장 Na+ 재흡수 증가는 고혈압에 의해 수반되기 때문에, 상기 특허에서는 hsgk1의 발현 증가는 고혈압의 원인이 되는 반면, hsgk1의 발현 감소는 궁극적으로 저혈압의 원인이 된다고 가정하였다.
DE 100 421 37호는 또한 인간 동족체 hsgk2 및 hsgk3의 과다발현 또는 과다활성과 ENaC의 과다활성화 간의 유사 관계, 이로부터 야기된 신장 Na+ 재흡수 증가 및 이로부터 발병된 고혈압을 보고하였다. 또한, 상기 특허는 동맥성 고혈압과 관련하여 hsgk2 및 hsgk3의 키나제의 진단 가능성에 대해 이미 논의하였다.
W0 02/074987 A2호는 hsgk1 유전자에서 개별 뉴클레오티드의 두개의 상이한 다형체(단일 뉴클레오티드 다형체(SNP)) 출현과 유전자적으로 결정된 고혈압 소질의 관계에 대해 개시하였다. 이들 다형체는 hsgk1 유전자에서 인트론(intron) 6(T→C)에서의 다형체 및 엑손(exon) 8(C→T)에서의 다형체이다.
sgk1은 다수의 조직에서 발현되고 sgk1은 다수의 미지 기질을 가질 것으로 예상되기 때문에, sgk 패밀리의 인간 동족체, 특히 hsgk1 유전자(NM_005627), hsgk2 유전자 및 hsgk3 유전자(AF169035)의 기능과 다른 질병 발병 간에 추가의 상관관계가 있을 것으로 추정될 수 있다. sgk1이 연루된 이들 다른 특이적 질병 상관관계가 밝혀짐에 따라 상응하는 sgk 단백질의 기능 또는 발현에 영향을 미치는 sgk 패밀리의 인간 동족체 유전자의 다형 영역을 함유하여 다른 질병의 소질을 진단하기 위해 사용될 수 있는 핵산을 도출할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 목적은 또한 sgk 패밀리의 인간 동족체 기능과 새로운 질병 간의 상관관계를 추가로 밝혀내어 sgk 패밀리의 인간 동족체 유전자의 다형 영역을 함유하는 핵산이 진단학적으로 사용될 수 있다는 새로운 가능성을 제공하는데 있다.
본 발명의 목적은 hsgk1 및 hsgk3이 글루코스 트랜스포터 Glut1을 강력하게 자극할 수 있다는 놀라운 발견으로 이루게 되었다(참조: 도 1). 그 중에서도, 글루코스 트랜스포터 Glut1은 글루코스가 특히 눈의 각종 세포로 흡수되는 것에 관여한다[Busik et al., Glucose-induced activation of glucose uptake in cells from the inner and outer blood-retinal barrier. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2002; 43:2356-63; Takata K, Kasahara T, Kasahara M, Ezaki O, Hirano H. Ultracytochemical localization of the erythrocyte/HepG2-type glucose transporter(GLUT1) in the ciliary body and iris of the rat eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1991; 32:1659-66]. 글루코스에 이어 물이 삼투적으로 동반되는데, 이는 Glut1의 활성 증가가 세포 팽윤을 야기함을 의미한다. 결과적으로, Glut1의 활성 증가는 백내장을 발생시킬 수 있다[Gong et al., Development of cataractous macrophthalmia in mice expressing an active MEK1 in the lens. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2001; 42:539-48]. 이 외에도, Glut1의 과다발현은 결합조직 단백질의 형성 및 침착을 촉진하는 것으로 밝혀졌다[Ayo et al., Increased extracellular matrix synthesis and mRNA in mesangial cells grown in high-glucose medium. Am J Physiol. 1991; 260:F185-191; Heilig et al., Overexpression of glucose transporters in rat mesangial cells cultured in a normal glucose milieu mimics the diabetic phenotype. J Clin Invest. 1995; 96:1802-1814]. 이와 같은 결합조직 단백질의 침착은 안구액의 이탈을 방해하여 안압을 상승시킴으로써 결국에는 망막을 손상시키게 된다[Fingert et al., Evaluation of the myocilin(MYOC) glaucoma gene in monkey and human steroid-induced ocular hypertension. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2001; 42(1):145-52, Ueda et al., Distribution of myocilin and extracellular matrix components in the juxtacanalicular tissue of human eyes. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2002; 43:1068-76]. SGK1의 발현을 촉진하는 글루코코르티코이드(상기 참조)는 동시에 녹내장의 발생을 초래한다[Fingert et al. 2001]. 그러나, 이전에 hsgk1이 원인적인 역할을 할 것으로는 전혀 의심되지 않았다.
상기 언급된 장애는 hsgk1의 활성이 증가된 임의의 상황과 연계해, 즉 상기 언급된 임의 호르몬의 과다 존재 하에 일어날 것이다. 혈압 증가와 상관관계가 있는 hsgk1 유전자의 특정 다형체[Busjahn et al., Serum- and glucocorticoid-regulated kinase(SGK1) gene and blood pressure. Hypertension 40(3):256-260,2002]는 동시에 백내장 및 녹내장의 발생을 증가시킬 수 있다. 동일한 유전자 변형이 또한 너무 이르게 나타나는 백내장 및/또는 녹내장과 관련이 있음에 틀림없다.
상기 발견은 글루코스 트랜스포터 Glut1의 조절에 완전히 새로운 메카니즘을 제시한다. 따라서, hsgk1의 활성 증가는 세포에 글루코스의 흡수를 증가시킨다. hsgk1의 전사는 혈청[Webster et al. 1993], 글루코코르티코이드[Brenan & Fuller 2000, Webster et al. 1993], 무기질 코르티코이드[Chen et al. 1999, Naray-Fejes-Toth et al. 1999, Shigaev et al. 2000, Brennan and Fuller 2000, Cowling and Birnboim 2000], 고나도트로핀[Alliston et al, Follicle stimulating hormone-regulated expression of serum/glucocorticoid-inducible kinase in rat ovarian granulosa cells: a functional role for the Spl family in promoter activity. Mol Endocrinol. 1997; 11:1934-1949; Alliston et al, Expression and localization of serum/glucocorticoid-induced kinase in the rat ovary: relation to follicular growth and differentiation. Endocrinology. 2000; 141: 385-395; Gonzalez-Robayna et al, Follicle-Stimulating hormone(FSH) stimulates phosphorylation and activation of protein kinase B(PKB/Akt) and serum and glucocorticoid-lnduced kinase(Sgk): evidence for A kinase-independent signaling by FSH in granulosa cells. Mol Endocrinol. 2000; 14:1283-1300, Richards et al, Ovarian cell differentiation: a cascade of multiple hormones, cellular signals, and regulated genes. Recent Prog Horm Res., 1995; 50:223-254] 및 다수의 사이토킨[Lang & Cohen 2001], 특히 TGF-β[Fillon S. et al., Expression of the Serine/Threonine kinase hsgk1 in chronic viral hepatitis. Cell Physiol Biochem 2002; 12:47-54; Lang et al. 2000, Waldegger et al. 1999, Warntges S et al, Excessive transcription of the human serum and glucocorticoid dependent kinase hsgk1 in lung fibrosis. Cell Physiol Biochem 2002, 12:135-142]에 의해 촉진된다. 이 외에도, hsgk1의 전사는 상기 언급된 [Waldegger 등에 의한 1997 논문에 의해 보여진 바와 같이, 세포 수축에 의해 증가된다. 당뇨병에서 발생하는 글루코스 농도의 증가는 세포 수축 및/또는 TGF-β의 형성 증가에 의해 hsgk1의 발현을 촉진한다[Lang et al. 2000]. 발현된 hsgk1은 인슐린 유사 성장 인자 IGF1, 인슐린 또는 산화적 스트레스에 의해 활성화된다[Kobayashi & Cohen 1999, Park et al. 1999, Kobayashi et al. 1999].
본 발명에 따른 발견에 기초하여, hsgk1의 발현 증가는 글루코스 트랜스포터 Glut-1의 활성을 증가시킨다. 그 결과, 더 많은 글루코스가 세포속으로 흡수되며, 이어서 삼투압으로 동반된 물은 세포를 팽윤시킨다. 이것은 물이 각막 및 수정체에 증가된 수준으로 도입되어 투명도를 감소시켜 백내장에 이르게 하는 경로이다[Gong etal. 2001].
녹내장은 또한 유사한 방식 및 결합조직의 혼입으로 발병한다[Fingert et al. 2001].
세포 팽윤이 또한 당뇨병성 신경병증의 원인인 것으로 추측되고 있다[Burg et al., Sorbitol, osmoregulation, and the complications of diabetes. J Clin Invest 1988; 81:635-40]. 그러나, Glut1의 활성 증가는 당뇨병에서 뿐만 아니라 글루코코르티코이드의 영향하에 또는 유전자적으로 결정된 hsgk1의 과다활성을 나타내는 환자에게서 예상되는 것이다[Busjahn et al., Serum- and glucocorticoid-regulated kinase(SGK1) gene and blood pressure. Hypertension 40 (3):256-260, 2002]. 글루코코르티코이드는 실제로 녹내장을 야기한다[Fingert et al. 2001]. 글루코코르티코이드 투여와 관련하여 녹내장 발병에 관여하는 메카니즘은 이전에 알려지지 않았다. 특히, hsgk1이 이 메카니즘에 관여함으로써 녹내장을 진단 및 치료하는데 표적 단백질로 사용하기에 적합하다는 사실은 아직 알려지지 않았다.
따라서, 본 발명에 따른 관찰 결과는 놀랍게도 hsgk1 및 hsgk3이 비상피 글루코스 운반을 증가시킬 뿐만 아니라 상피 Na+ 채널을 증가시키는 것을 입증한다. 그 결과, hsgk1 및 hsgk3은 중요한 진단 및 치료/예방 결과를 제공하는 완전히 새로운 병태생리학적 유의성을 보유함이 밝혀졌다.
따라서, 본 발명은 세포 팽윤을 감소시키기 위한, hsgk1 단백질 또는 hsgk3 단백질의 기능적 저해제 또는 hsgk1 유전자 또는 hsgk3 유전자 전사의 음성적 조절인자의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 백내장, 녹내장 또는 당뇨병성 신경병증의 치료 및/또는 예방용 약제를 제조하기 위한, hsgk1 단백질 또는 hsgk3 단백질의 기능적 저해제 또는 hsgk1 유전자 또는 hsgk3 유전자 전사의 음성적 조절인자의 용도에 관한 것이다.
상기 hsgk1 단백질 또는 hsgk3 단백질의 기능적 저해제는 hsgk1 단백질 또는 hsgk3 단백질의 정상적인 생리학적 활성을 저해하는 임의 성질의 화학 물질일 수 있다. hsgk1 단백질 또는 hsgk3 단백질의 기능적 저해제는 바람직하게는 저분자량 화학 물질("소형 분자") 또는 단백질 또는 펩타이드이다. hsgk1 단백질 또는 hsgk3 단백질의 기능적 저해제는 특히 hsgk1 단백질 또는 hsgk3 단백질의 기질-결합 부위를 봉쇄함과 동시에 hsgk1 또는 hsgk3에 의해 임의적인 촉매 전환을 이용할 수 없는 효소의 길항제일 수 있다. 이 경우 적합한 길항제는 바람직하게는 hsgk1 단백질 또는 hsgk3 단백질의 천연 기질, 즉, 특히 인산화 가능한 아미노산 세린 및 트레오닌과 구조적으로 유사한 분자이다.
스타우로스포린(staurosporine) 및 첼레리트린(chelerythrine)은 hsgk1의 공지된 두 기능적 저해제이다. 따라서 특히 바람직한 구체예로, 스타우로스포린 또는 첼레리트린은 백내장, 녹내장 및 당뇨병성 신경병증 중 적어도 하나를 치료 및/또는 예방하기 위한 hsgk1 또는 hsgk3의 기능적 저해제로 사용된다.
hsgk1 유전자 또는 hsgk3 유전자 전사의 음성적 조절인자는 hsgk1 유전자 또는 hsgk3 유전자의 발현을 전사 수준으로 활성화하는 물질로 정의된다.
실질적인 활성 화합물, 즉 hsgk1 또는 hsgk3의 기능적 저해제 또는 hsgk1 또는 hsgk3의 전사 음성적 조절인자 이외에, 백내장, 녹내장 또는 당뇨병성 신경병증을 치료 및/또는 예방하기 위한 본 발명에 따른 약제는 또한 안정화제 및/또는 담체 물질, 예를 들어 전분, 락토스, 스테아르산, 지방, 왁스, 알콜 또는 다른 첨가제, 예를 들어 방부제, 염료 또는 향미제를 포함할 수 있다.
약제는 임의의 방법, 특히 정제, 과립제 또는 캅셀제의 형태로 또는 액제로서 경구적으로 투여될 수 있다. 다른 특히 적합한 투여 형태는 연고, 팅크제 또는 스프레이 또는 임의의 타입의 주사제(예: 경피 또는 정맥내) 또는 주입제 형태로 직접 투여하는(예: 피부 또는 눈에) 것이다.
본 발명은 또한 백내장, 녹내장 및/또는 당뇨병성 신경병증 발병의 소질을 진단하기 위한, 수탁 번호 NM_005627에 따른 hsgk1 서열 또는 그의 단편 중 하나를 포함하는 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산의 용도에 관한 것이다. 이와 관련하여 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산이 포함할 수 있는 hsgk1 단편은 적어도 10개의 뉴클레오티드/염기쌍, 바람직하게는 적어도 15개의 뉴클레오티드/염기쌍 및 특히 적어도 20개의 뉴클레오티드/염기쌍의 길이를 갖는다.
이와 관련하여, 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산은 바람직하게는 hsgk1 유전자의 적어도 하나의 다형 뉴클레오티드, 특히 hsgk1 유전자의 싱글 뉴클레오티드 다형체(SNP)를 포함한다.
특히 바람직한 구체예로, 상기와 관련하여 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산은 hsgk1 유전자의 하기 SNP 중 적어도 하나를 포함한다:
- hsgk1 유전자의 인트론 2의 732/733번 위치에의 G 삽입,
- hsgk1 유전자의 인트론 6의 2071번 위치에의 T/C 치환(W0 02/074987 A2),
- hsgk1 유전자의 엑손 8의 2617번 위치에의 T/C 치환(W0 02/074987 A2).
상기 언급된 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산은 바람직하게 하기 방법에 의해 환자의 게놈 DNA 또는 cDNA에서 hsgk1 유전자의 상기 SNP를 검출하기 위해 사용될 수 있다:
- 상기 핵산을 사용하여 게놈 DNA 또는 cDNA를 직접 서열화,
- 상기 핵산을 사용하여 게놈 DNA 또는 cDNA를 특이적으로 하이브리드화,
- PCR 올리고뉴클레오티드 연장 어세이 또는 결찰 어세이.
이와 관련하여, 환자로부터 채취한 신체 샘플, 특히 타액, 혈액, 조직 또는 세포로부터 환자의 게놈 DNA 또는 cDNA를 분리하는 것이 바람직하다.
발현된 hsgk1 유전자의 활성은 환자의 hsgk1 유전자에 있는 다형체의 변형에 좌우되며, 따라서 이들 다형체를 적어도 하나 함유하는 핵산은 백내장, 녹내장 및/또는 당뇨병성 신경병증 발병의 소질을 진단하는데 매우 적합한 것으로 추정되고 있다.
본 발명은 또한 백내장, 녹내장 및/또는 당뇨병성 신경병증 발병의 소질을 진단하기 위한, 수탁 번호 AF169035에 따른 hsgk3 서열 또는 그의 단편 중 하나를 포함하는 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산의 용도에 관한 것이다. 이와 관련하여 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산이 포함할 수 있는 hsgk3 단편은 적어도 10개의 뉴클레오티드/염기쌍, 바람직하게는 적어도 15개의 뉴클레오티드/염기쌍 및 특히 적어도 20개의 뉴클레오티드/염기쌍의 길이를 갖는다.
이와 관련하여, 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산은 바람직하게는 hsgk3 유전자의 적어도 하나의 다형 뉴클레오티드, 특히 hsgk3 유전자의 단일 뉴클레오티드 다형체(SNP)를 포함한다.
상기 언급된 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산 이외에, sgk 패밀리의 인간 동족체의 기질에 대한 항체가 또한 백내장, 녹내장 및 당뇨병성 신경병증 중 적어도 하나의 발병 소질을 진단하는데 적합하다. 이들 진단 항체는 바람직하게는 인산화 형태 또는 비인산화 형태로 기질의 인산화 부위를 함유하는 sgk 패밀리(특히 hsgk1 및 hsgk3)의 인간 동족체 에피토프에 대한 것이다.
예를 들어, hsgk1 유전자의 개별 유전적 구성에 기인하여 일어나는 hsgk1 단백질의 과다발현은 hsgk의 기질 전환 증가, 즉 hsgk1에 의한 기질의 효소적 인산화 증가를 초래할 수 있다. 동시에, hsgk1 단백질의 과다발현은 글루코스 트랜스포터 Glut1을 자극하여 궁극적으로 눈 세포에 글루코스를 높은 수준으로 흡수시키고 나서 삼투에 의해 물을 높은 수준으로 흡수시켜 백내장, 녹내장 및 당뇨병성 신경병증 발병의 소질을 야기할 수 있다. 따라서, 인산화 형태 또는 비인산화 형태로 hsgk1의 인산화 부위를 함유하는 대상 기질 영역에 대한 항체로 hsgk1 기질의 보다 빈번한 인산화를 검출하는 것은 백내장, 녹내장 및 당뇨병성 신경병증 발병의 소질을 진단하는 한 방법임을 예시할 수 있다.
바람직한 구체예로, 유비퀴틴 단백질 리가제 Nedd4-2(수탁 번호 BAA23711)가 sgk 패밀리의 인간 동족체의 기질로 사용된다. 이 유비퀴틴 단백질 리가제는 sgk 패밀리의 인간 동족체에 의해 특이적으로 인산화되는 단백질이다[Debonneville et al., Phosphorylation of Nedd4-2 by sgk1 regulates epithelial Na(+) channel cell surface expression. EMBO J., 2001; 20:7052-7059; Snyder et al., Serum and glucocorticoid-regulated kinase modulates Nedd4-2-mediated inhibition of the epithelial Na(+) channel. J. Biol. Chem., 2002, 277:5-8]. hsgk1에 대한 인산화 부위는 공통 서열(R X R X X S/T)(여기에서, R은 아르기닌이고, S는 세린이며, T는 트레오닌이고, X는 임의의 아미노산이다)을 보유한다. Nedd4-2 2(수탁 번호 BAA23711)에는 상기 언급된 공통 서열과 일치하는 hsgk1에 대한 두개의 잠재적인 인산화 부위, 즉 아미노산 382번 위치에 세린 및 아미노산 468번 위치에 세린이 존재한다.
따라서, 백내장, 녹내장 및 당뇨병성 신경병증 중 적어도 하나의 발병 소질을 진단하기 위한 상기 언급된 항체는 바람직하게는 기질 Nedd4-2 및 특히 바람직하게는 hsgk1에 대한 잠재적인 인산화 부위의 서열, 즉 공통 서열(R X R X X S/T)를 가지는 Nedd4-2 단백질 영역에 대한 것이다. 특히, 이들 항체는 아미노산 382번 위치 및/또는 아미노산 468번 위치에 적어도 두개의 잠재적인 인산화 세린 부위를 포함하는 Nedd4-2 단백질 영역에 대한 것이다.
본 발명은 또한 백내장, 녹내장 및 당뇨병성 신경병증 질병중 하나를 진단하기 위한 키트에 관한 것으로, 이는 하기 성분 중 적어도 하나를 포함한다:
- hsgk1 또는 hsgk3에 대한 항체,
- 엄격한 조건 하에서 수탁 번호 NM_005627에 따른 hsgk1 유전자 또는 수탁 번호 AF169035에 따른 hsgk3 유전자와 하이브리드할 수 있는 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산; 특히 다형 뉴클레오티드, 특히 hsgk1 유전자 또는 hsgk3 유전자의 "SNP"를 포함하는 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산,
- sgk 패밀리의 인간 동족체의 기질에 대한 항체; 바람직하게는 인산화 또는 비인산화 형태의 기질의 인산화 부위에 대한 항체; 특히 인산화 또는 비인산화 형태의 Nedd4 또는 Nedd-2의 인산화 부위에 대한 항체.
본 발명은 또한 하기 단계 a) 내지 c)를 포함하여, 다수의 시험 물질로부터 백내장, 녹내장 및 당뇨병성 신경병증 중에서 선택된 적어도 하나의 질병을 치료 및/또는 예방하기 위해 사용되는 치료 유효 물질을 동정 및 규명하기 위한 스크리닝 방법에 관한 것이다:
a) 세포에서
i) 글루코스 트랜스포터 Glut1 및
ii) hsgk1 및/또는 hsgk3을 이종 공발현시키는 단계,
b) 하나 이상의 세포 분획 A1 내지 AX를 각각 세포 분획의 지수 1 내지 X에 따라 상이한 하나 이상의 시험 물질 존재 하에 배양하고, 대조 세포 분획 B를 시험 물질 부재 하에 배양하는 단계,
c) 대조 세포 분획 B에서의 글루코스 트랜스포터 Glut1의 활성과 비교하여 세포 분획 A1 내지 AX에서의 글루코스 트랜스포터 Glut1의 활성을 측정하는 단계.
물질 라이브러리, 바람직하게는 소형 분자 라이브러리 또는 단백질 라이브러리 등이 "다수의 시험 물질"로 사용될 수 있다.
단계 a)에서, 적합한 세포, 바람직하게는 포유동물 세포 또는 세포주, 특히 인간 세포 또는 세포주가 전기천공법, CaPO4 침전, 리포펙션(lipofection) 등과 같은 표준방법을 이용하여 Glut1 및 hsgk1 및/또는 hsgk3을 발현하기에 적합한 발현 카세트를 함유하는 적합한 발현 벡터로 형질전환된다. 발현 카세트는 표적 유전자를 적당량으로 발현할 수 있으며 해당 세포 타입에 활성인 적합한 프로모터 조절하에 관련 표적 유전자(Glut1, hsgk1, hsgk3)의 게놈 DNA 또는 cDNA를 함유한다. 발현 벡터는 또한 선택 표지를 함유할 수 있다.
그후, 형질전환된 세포는 표적 유전자 i) 및 ii)를 발현할 수 있는 조건 하에 배양된다.
단계 b)에서, a)로부터의 형질전환된 세포를 상이한 세포 분획 A1 내지 AX 및 대조 세포 분획 B로 분류한다. 세포 분획 A1 내지 AX를 각각 하나 이상의 시험 물질 존재 하에 배양한다. 각 경우 세포 분획 A1 내지 AX에 첨가된 시험 물질(들)은 서로 상이하다(각 세포 분획 A1 내지 AX의 지수 1 내지 X에 좌우). 한편, 대조 세포 분획 B는 시험 물질없이 배양된다.
단계 c)에서, 세포 분획 A1 내지 AX에서의 글루코스 트랜스포터 Glut1의 활성을 대조 세포 분획 B에서의 글루코스 트랜스포터 Glut1의 활성과 비교하여 정량적으로 측정한다. hsgk1 또는 hsgk3를 기능적으로 저해하거나 그의 발현을 감소시킬 수 있는 시험 물질을 세포 분획 A1 내지 AX에 첨가하는데, 여기에서 Glut1의 활성은 대조 세포 분획 B와 비교하여 현저히 낮은 값으로 측정되었다. 이러한 물질은 백내장, 녹내장 및 당뇨병성 신경병증 중의 적어도 하나를 치료하는데 적합할 수 있다.
또 다른 구체예로, 다수의 시험 물질로부터 백내장, 녹내장 및 당뇨병성 신경병증으로 구성된 그룹중에서 선택된 적어도 하나의 질병을 치료 및/또는 예방하기 위해 사용되는 치료 유효 물질을 동정 및 규명하기 위한 본 발명에 따른 스크리닝 방법은 하기 단계 d) 내지 f)를 포함한다:
d) 하나 이상의 세포 분획 A1 내지 AX에서
i) 글루코스 트랜스포터 Glut1 및
ii) hsgk1 및/또는 hsgk3을 이종 공발현시키는 단계,
하나 이상의 세포 분획 B1 내지 BX에서
i) 글루코스 트랜스포터 Glut1을 이종 발현시키며,
e) 세포 분획 A1 내지 AX 및 B1 내지 BX를 각각 세포 분획의 지수 1 내지 X에 따라 상이한 하나 이상의 시험 물질 존재 하에 배양한 후,
f) 세포 분획 A1 내지 AX 및 세포 분획 B1 내지 BX에서의 글루코스 트랜스포터 Glut1의 활성을 비교 측정하는 단계.
상기 개별 단계 a) 내지 c)에 대해 주어진 설명이 본 발명에 따른 또 다른 스크리닝 방법의 단계 d) 내지 f)에 동등하게 적용된다.
본 발명이 도 1을 참조로 하여 좀 더 상세히 설명된다.
2-데옥시글루코스 흡수(pmol/1/10 분/난모세포)(산술평균 ±SEM)를 도 1의 A 세로좌표상에 플롯팅하였다. 발톱개구리(제노푸스 라에비스(Xenopus laevis)) 난모세포에 Glut-1 cRNA를 SGK1, SGK2, SGK3 또는 단백질 키나제 B(PKB) cRNA와 함께, 또는 이들을 사용하지 않고 주입하였다(실시예 1 참조).
도 1은 스스로 Glut-1을 발현하는 난모세포와 비교하여 볼 때, Glut-1 이외에도 hsgk1 또는 hsgk3을 발현하는 난모세포에서 2-데옥시글루코스 흡수 증가가 일어남을 나타낸다. 이는 hsgk1 및 hsgk3의 기능이 글루코스 트랜스포터 Glut-1의 활성을 자극함을 입증한다. 유사한 효과가 hsgk1 또는 hsgk3 대신 hsgk2 또는 PKBmut를 발현하는 난모세포의 경우에는 발견되지 않았다.
이하, 본 발명이 하기 실시예로 좀 더 상세히 설명될 것이다.
실시예 1: 이전극 전압 클램프 및 발톱개구리 난모세포에서의 발현
정상 SGK1 cRNA[Waldegger S, Barth P, Raber G, Lang F: Cloning and characterization of a putative human serine/threonine protein kinase transcriptionally modified during anisotonic and isotonic alterations of cell volume. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94:4440-4445], 구조적으로 활성인 SGK1(S422DSGK1) cRNA[Kobayashi & Cohen 1999] 및 정상 Glut1 cRNA[Iserovich P, Wang D, Ma L, Yang H, Zuniga FA, Pascual JM, Kuang K, De Vivo DC, Fischbarg J. Changes in glucose transport and water permeability resulting from the T310I pathogenic mutation in Glut1 are consistent with two transport channels per monomer. J Biol Chem. 2002; 277:30991-7]을 시험관내에서 합성하였다. 발톱개구리의 난소 절개와 수집 및 난모세포 처리가 문헌 [Wagner CA, Friedrich B, Setiawan I, Lang F, Broeer S: The use of Xenopus laevis oocytes for the functional characterization of heterologously expressed membrane proteins. Cell Physiol Biochem 2000; 10:1-12]에 상세히 기술되어 있다. 난모세포에 인간 Glut1 5 ng, 인간 S422DSGK1 7.5 ng 및/또는 제노푸스 Nedd4-2 5 ng을 주입하였다. 대조 난모세포에는 물을 주입하였다. 방사성 표지화된 글루코스의 흡수를 각각의 cRNA를 주입한 후 이틀동안 실온에서 측정하였다. 대조 배스 용액은 96 mM NaCl, 2 mM KC1, 1.8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 및 5 mM HEPES(pH 7.4)를 함유한다. 모든 물질은 주어진 농도로 사용하였다. 최종 용액을 HCl 또는 NaOH로 pH 7.4로 적정하였다.
계산
데이터는 산술평균 ±SEM으로 주어졌고; n은 조사된 난모세포수이다. 모든 실험은 적어도 세개의 상이한 난모세포 그룹으로 수행하였다. 결과를 스튜던트 t-테스트(Student's t-test)를 사용하여 유의차에 대해 테스트하였다. P가 0.05 미만인 결과만이 통계적으로 유의적인 것으로 간주된다.
[서열목록]

Claims (15)

  1. 세포 팽윤을 감소시키기 위한, hsgk1 단백질 또는 hsgk3 단백질의 기능적 저해제(functional inhibitor) 또는 hsgk1 유전자 또는 hsgk3 유전자 전사의 음성적 조절인자(negative regulator)의 용도.
  2. 백내장, 녹내장 또는 당뇨병성 신경병증의 치료 및/또는 예방용 약제를 제조하기 위한, hsgk1 단백질 또는 hsgk3 단백질의 기능적 저해제 또는 hsgk1 유전자 또는 hsgk3 유전자 전사의 음성적 조절인자의 용도.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, hsgk1 단백질 또는 hsgk3 단백질의 기능적 저해제가 스타우로스포린(staurosporine) 및 첼레리트린(chelerythrine)임을 특징으로 하는 용도.
  4. hsgk1 단백질 또는 hsgk3 단백질의 기능적 저해제 또는 hsgk1 유전자 또는 hsgk3 유전자 전사의 음성적 조절인자를 포함하는, 백내장, 녹내장 또는 당뇨병성 신경병증의 치료 및/또는 예방용 약제.
  5. 백내장, 녹내장 및/또는 당뇨병성 신경병증 발병의 소질을 진단하기 위한, 수탁 번호 NM_005627에 따른 hsgk1 서열을 포함하는 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산, 또는 그의 단편 중 하나의 용도.
  6. 제5항에 있어서, 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산이 hsgk1 유전자의 적어도 하나의 다형 뉴클레오티드, 특히 hsgk1 유전자의 "SNP"를 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
  7. 제6항에 있어서, hsgk1 유전자의 SNP가 hsgk1 유전자의 인트론 2의 732/733번 위치에서의 G 삽입, hsgk1 유전자의 인트론 6의 2071번 위치에서의 T/C 치환 및 hsgk1 유전자의 엑손 8의 2617번 위치에서의 T/C 치환을 포함하는 SNP 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
  8. 백내장, 녹내장 및/또는 당뇨병성 신경병증 발병의 소질을 진단하기 위한, 수탁 번호 AF169035에 따른 hsgk3 서열을 포함하는 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산, 또는 그의 단편 중 하나의 용도.
  9. 제8항에 있어서, 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산이 hsgk3 유전자의 적어도 하나의 다형 뉴클레오티드, 특히 hsgk1 유전자의 "SNP"를 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
  10. 백내장, 녹내장 및 당뇨병성 신경병증 중 적어도 하나의 발병 소질을 진단하기 위한, sgk 패밀리의 인간 동족체의 기질에 대해 유도된 항체의 용도로서, 상기 항체는 인산화 형태 또는 비인산화 형태로 인산화 부위를 함유하는 인간 동족체의 에피토프에 대해 유도된 것인 용도.
  11. 제10항에 있어서, sgk 패밀리의 인간 동족체의 기질이 수탁 번호 BAA23711의 Nedd4-2인 것을 특징으로 하는 용도.
  12. hsgk1 또는 hsgk3에 대해 유도된 항체를 포함하거나, 엄격한 조건 하에서 수탁 번호 NM_005627에 따른 hsgk1 유전자 또는 수탁 번호 AF169035에 따른 hsgk3 유전자와 하이브리드할 수 있는 핵산을 포함하거나, 상기 항체 및 핵산을 함께 포함하는, 백내장, 녹내장 및 당뇨병성 신경병증 질병 중 하나를 진단하기 위한 키트.
  13. 제12항에 있어서, 엄격한 조건 하에서 핵산이 다형 뉴클레오티드, 특히 hsgk1 유전자 또는 hsgk3 유전자의 "SNP"를 포함하는, 수탁 번호 NM_005627에 따른 hsgk1 유전자 또는 수탁 번호 AF169035에 따른 hsgk3 유전자의 DNA 영역과 하이브리드할 수 있음을 특징으로 하는 키트.
  14. a) 세포에서
    i) 글루코스 트랜스포터 Glut1 및
    ii) hsgk1 및/또는 hsgk3을 이종 공발현시키는 단계,
    b) 하나 이상의 세포 분획 A1 내지 AX를 각각 세포 분획의 지수 1 내지 X에 따라 각각 상이한 하나 이상의 시험 물질 존재 하에 배양하고, 대조 세포 분획 B를 임의의 시험 물질 부재 하에 배양하는 단계,
    c) 대조 세포 분획 B에서의 글루코스 트랜스포터 Glut1의 활성과 비교하여 세포 분획 A1 내지 AX에서의 글루코스 트랜스포터 Glut1의 활성을 측정하는 단계
    를 포함하는, 다수의 시험 물질로부터 백내장, 녹내장 및 당뇨병성 신경병증을 포함하는 그룹에서 선택된 적어도 하나의 질병을 치료 및/또는 예방하기 위해 사용되는 치료 유효 물질을 동정 및 규명하기 위한 스크리닝 방법.
  15. d) 하나 이상의 세포 분획 A1 내지 AX에서
    i) 글루코스 트랜스포터 Glut1 및
    ii) hsgk1 및/또는 hsgk3을 이종 공발현시키는 단계,
    하나 이상의 세포 분획 B1 내지 BX에서
    i) 글루코스 트랜스포터 Glut1을 이종 발현시키는 단계,
    e) 세포 분획 A1 내지 AX 및 B1 내지 BX를 각각 세포 분획의 지수 1 내지 X에 따라 각각 상이한 하나 이상의 시험 물질 존재 하에 배양하는 단계,
    f) 세포 분획 A1 내지 AX 및 세포 분획 B1 내지 BX에서의 글루코스 트랜스포터 Glut1의 활성을 비교 측정하는 단계
    를 포함하는, 다수의 시험 물질로부터 백내장, 녹내장 및 당뇨병성 신경병증을 포함하는 그룹에서 선택된 적어도 하나의 질병을 치료 및/또는 예방하기 위해 사용되는 치료 유효 물질을 동정 및 규명하기 위한 스크리닝 방법.
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