JP4728615B2

JP4728615B2 - 免疫賦活能を有する酵母およびそれを含む食品

Info

Publication number: JP4728615B2
Application number: JP2004260771A
Authority: JP
Inventors: 雅之東; 寛大嶋
Original assignee: Oriental Yeast Co Ltd
Current assignee: Oriental Yeast Co Ltd
Priority date: 2004-09-08
Filing date: 2004-09-08
Publication date: 2011-07-20
Anticipated expiration: 2024-09-08
Also published as: JP2006075039A

Description

本発明は、その細胞自身に高い免疫賦活能を有する微生物に関するものである。更に詳細には食品産業に広く利用されている酵母細胞自身に高い免疫賦活能という新規な機能を与え、それを食品に応用する方法に関するものである。

免疫作用とは、外部から生体内に侵入したウイルスや細菌、癌細胞等による生体攻撃から、自己を防御する作用である。しかしながら、免疫作用が低下すると上記攻撃からの防御が不完全になり、感染の悪化や、癌細胞の増殖などを引き起こすこととなる。したがってこのような免疫作用の異常による疾患（免疫疾患）を治療もしくは予防する方法が、これまで多方面から検討され、様々な提案がされてきた。

従来の免疫賦活剤・方法としては、ラクトフェリンの加水分解物を用いるもの（特許文献１等）、キチン（特許文献２）、トレハロース（特許文献３）、フコイダン（特許文献４）等の糖質を用いるもの、植物由来物質を用いるもの（特許文献５等）、ペプチド（特許文献６等）やインターロイキン（特許文献７等）を用いるもの、核酸を用いるもの（特許文献８等）、グルタチオン（特許文献９等）、アミノ酸（特許文献１０等）、ポリリジン（特許文献１１等）を用いるもの、腸内細菌（特許文献１２等）、乳酸菌（特許文献１３等）、エンテロコッカス属細菌（特許文献１４等）等の微生物を用いるもの等が公知である。

また近年ではβグルカンの免疫賦活効果が注目されており、例えば酵母あるいはキノコ類からβグルカンを精製し、それを用いた免疫賦活方法が提案されている（特許文献１５、特許文献１６）。

しかしながら、上記のような免疫賦活物質を大量に精製するには多くの作業工程・労力・費用が必要となるため、より安価で簡便な免疫賦活物質の提供が求められていた。
特開平５−１７８７５９号公報特開平６−２７１４７０号公報特開２００３−８１８３９号公報特開２００１−１８１３０３号公報特開平６−５６６８５号公報特許第２８７３４３４号公報特開２００２−３３９５号公報特許第２５２９６０５号公報特開平１１−４９６９６号公報特開２０００−２８１５７１号公報特開２００３−１２８５８９号公報特開平６−５６６７８号公報特開平７−２２８５３６号公報特開平１１−９２３８９号公報特開２００１−３５４５７０号公報特開２００３−１８３１７６号公報

本発明が解決しようとする問題点は、顕著な免疫賦活効果を有する微生物及びその用途を提供することである。

上記課題に鑑み、発明者らによる鋭意研究の結果、酵母の特定の遺伝子破壊株に顕著な免疫賦活効果が存在することを明らかにし、本発明を完成するに至った。課題を解決するための手段は以下のとおりである。
（１）（ａ）ＭＣＤ４遺伝子、ＧＡＳ１遺伝子、及びＢＩＧ１遺伝子からなる群のうちのいずれか１つの遺伝子が破壊されている酵母、並びに、（ｂ）前記ＧＡＳ１遺伝子及びＣＷＨ４１遺伝子の２つの遺伝子が破壊されている酵母、のいずれかの酵母を含有し、免疫賦活能を有することを特徴とする免疫賦活組成物である。
（２）免疫賦活能がマクロファージ活性化能である前記（１）に記載の免疫賦活組成物である。
（３）（ａ）１つの遺伝子が破壊されている酵母が、ＭＣＤ４遺伝子ａ型、ＭＣＤ４遺伝子α型、及びＧＡＳ１遺伝子ａ型のいずれかの遺伝子が破壊されている酵母であり、
（ｂ）２つの遺伝子が破壊されている酵母が、ＧＡＳ１遺伝子及びＣＷＨ４１遺伝子ａ型が破壊されている酵母、又はＧＡＳ１遺伝子及びＣＷＨ４１遺伝子α型が破壊されている酵母である前記（１）から（２）のいずれかに記載の免疫賦活組成物である。
（４）ＭＣＤ４遺伝子が破壊された酵母が、ＡＴＣＣ４００５０１５、ＡＴＣＣ４０１５０１５、ＡＴＣＣ４０２５０１５、及びＡＴＣＣ４０３５０１５の少なくともいずれかであり、
ＧＡＳ１遺伝子が破壊された酵母が、ＡＴＣＣ４０００８９７、ＡＴＣＣ４０１０８９７、ＡＴＣＣ４０２０８９７、及びＡＴＣＣ４０３０８９７の少なくともいずれかであり、
ＣＷＨ４１遺伝子が破壊された酵母が、ＡＴＣＣ４００４３９５、ＡＴＣＣ４０１４３９５、ＡＴＣＣ４０２４３９５、及びＡＴＣＣ４０３４３９５の少なくともいずれかであり、
ＢＩＧ１遺伝子が破壊された酵母が、ＡＴＣＣ４０１１９２９、ＡＴＣＣ４０２１９２９、及びＡＴＣＣ４０３１９２９の少なくともいずれかである前記（１）から（３）のいずれかに記載の免疫賦活組成物である。
（５）マクロファージ活性化能が、ＴＮＦ−α活性化能であり、
前記ＴＮＦ−α活性化能が、野生型の酵母と比較して２倍以上である前記（２）から（４）のいずれかに記載の免疫賦活組成物である。
（６）前記（１）から（５）のいずれかに記載の免疫賦活組成物を含有することを特徴とする食品である。

本発明では、免疫能、例えばマクロファージを活性化する物質を精製する作業を行うことなく、特定の遺伝子が破壊された酵母細胞自身を免疫賦活物質として直接利用することが可能となる。

本発明は、強い免疫賦活能を有する微生物、特にマクロファージ活性化能を持つ微生物に関するものである。本発明に用いられる微生物の種類としては一般に食用微生物として使用されているものが望ましく、特に限定されないが、望ましくはパン酵母、ビール酵母、ワイン酵母、清酒酵母及び味噌醤油酵母などの食用酵母を用いるのが良い。

食用酵母としては、例えばサッカロミセス（Saccharomyces）属、トルロプシス（Torulopsis）属、ミコトルラ（Mycotorula）属、トルラスポラ（Torulopsis）属、キャンディダ（Candida）属、ロードトルラ（Rhodotorula）属、ピキア（Pichia）属などが挙げられる。

本発明は、上記酵母のうち、MCD4遺伝子に変異を持つ酵母とGAS1遺伝子およびCWH41遺伝子の両方に変異を持つ酵母を用いることを特徴とする。MCD4は小胞体膜に存在する膜タンパク質であり、酵母細胞中におけるGPIアンカーの合成に必須であることが公知である（Mol Biol Cell. 1999 Mar;10(3):627-48.）。またGAS1は酵母細胞においてGPIアンカーを構成するタンパク質であり、β-1,3グルカンの生合成に関与し（Mol Genet Genomics. 2003 Jul;269(4):562-73. Epub 2003 Jun 25.）、CWH41は、酵母細胞においてアスパラギン結合型糖タンパク質の生合成に関わるグルコシダーゼＩの遺伝子として公知である（Protein Expr Purif. 2004 Jan;33(1):11-8.）。

上記の遺伝子破壊株の作製は、遺伝子破壊用の各種ベクターを用いることにより可能である。例えば、１倍体酵母がもつ、目的遺伝子内にＵＲＡ３（ウリジル酸合成酵素）やＡＤＥ２、ＬＹＳ２などのマーカー遺伝子を挿入すれば、目的遺伝子は破壊されて発現しなくなり、代りに挿入されたＵＲＡ３や栄養要求性マーカー遺伝子が発現して、遺伝子破壊を確認することができる。挿入するＵＲＡ３や他のマーカー遺伝子は、セルフクローニングを達成するためにサッカロミセス・セレビシエ、特にパン酵母のものが好ましい。

あるいはMCD4遺伝子、GAS1遺伝子、BIG1遺伝子またはCWH41遺伝子に変異を持つ酵母は、例えばSaccharomyces Genome Deletion Project
（http://www-sequence.stanford.edu/group/yeast_deletion_project/deletions3.html）などを通じ、ATCC（American Type Culture Collection）から一般に入手が可能である。

上記酵母の培養方法は特に限定されるものではなく、公知の方法、例えばバッチ培養、流加連続培養、流加バッチ培養などが挙げられる。培養は、ジャーファーメンターを用いて好適に行うことができ、このときのジャーファーメンターにおける条件としては、特に制限はなく適宜決定することができるが、例えば、培養温度としては２８〜３３℃程度であり、培養時間としては１〜１２０時間程度であり、ｐＨとしては４〜７程度であり、通気量としては０〜５ｖｖｍ程度であり、攪拌速度としては１００〜７００ｒｐｍ程度である。

なお、上記酵母を破砕物の形態で用いる場合、その破砕物は、破砕したままで乾燥させない液状物であってもよく、あるいは破砕後に乾燥させた乾燥物であってもよい。なお、前記破砕の方法としては、顕微鏡観察下で未破砕菌体がなくなる程度の破砕度合いであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ダイノミル等の物理的破砕処理であってもよいし、化学的破砕処理であってもよい。

本発明の酵母またはその破砕物は、食品または飲料に含有させ、使用することができる。なお、その使用の態様は特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、パン、ビスケットやクラッカー等の製菓、流動食、水産・食肉加工品、麺類、調味料、ジュース等の飲料、または各種健康食品・飲料等が好ましい。前記食品または飲料を経口摂取することにより、生体の免疫賦活、特にマクロファージ活性の上昇が可能となる。

前記食品はヒト、ヒトを除く動物（ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ラマ等の家畜、マウス、ラット、モルモット、ウサギ等の実験動物、鶏、アヒル、七面鳥、ダチョウ等の家禽、マダイ、イシダイ、ヒラメ、カレイ、ブリ、ハマチ、ヒラマサ、マグロ、シマアジ、アユ、サケ・マス類、トラフグ、ウナギ、ドジョウ、ナマズ等の魚類、クルマエビ、ブラックタイガー、タイショウエビ、ガザミ等の甲殻類等、アワビ、サザエ、ホタテ貝、カキ等の貝類、ペット動物としてイヌ、ネコ等）に適用することができる。

以下に本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

本実施例において、酵母の遺伝子破壊株による免疫担当細胞の活性化に関する解析を行った。免疫担当細胞として、マウスBALB/c由来のマクロファージであるRAW264.7を使用し、マクロファージが培地中に分泌するTNF-α量を活性化の指標とした。TNF-α量はMouse TNF-α Immunoassay Systemを用いて測定した。

本実施例で使用する酵母で、ＭＣＤ４、ＧＡＳ１、ＢＩＧ１、ＲＯＴ１及びＣＷＨ４１遺伝子の破壊株（Ｓｃｉｅｎｃｅ２８５：９０１−６（１９９９））については、ＡＴＣＣ（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）より入手した（表１）。

二重破壊株は各遺伝子の破壊株を常法により掛け合わせることで作製し、またMCD４、BIG1及びROT1遺伝子の破壊株は、浸透圧保護のために培地中に1.0Mソルビトールを加えた培地でヘテロ二倍体から一倍体を分離し、本実施例に用いた。

定常期直前の酵母を遠心分離により回収し、70%アルコールで30分以上固定した後、培養細胞に用いる培地に懸濁し、マクロファージ活性化試験に用いた。

培養細胞の培養には、RPMI1640に10%血清を加えた培地を用いた。5×10⁵cells/mlの細胞を一晩培養し、3回洗浄した後、新しい培地に懸濁した。そこに固定した細胞を3×10⁷cells/mlになるように加え、6時間マクロファージを培養した。遠心分離により培養上清を回収し、TNF-α量をMouse TNF-α Immunoassay Systemで測定した。その結果、MCD4遺伝子に変異を持つ株とCWH41及びGAS1遺伝子の二重破壊株（特にα型）では、野生型と比較しTNF-α活性化能が極端に高い（MCD4遺伝子破壊株では５〜６倍、GAS1及びCWH1遺伝子二重破壊株では３〜４倍）ことが明らかとなった（表２）。

本発明によれば、各種免疫性疾患および感染症の予防、治療、改善の効果、特に低下した免疫機能を向上させる効果を有する免疫賦活組成物を提供することができる。本発明の免疫賦活組成物は、各種免疫性疾患の予防、治療改善を目的として摂取することができ、特に腫瘍性の癌の予防、治療、改善、再発・転移の予防、感染症の予防に効果的である。

Claims

（ａ）ＭＣＤ４遺伝子、ＧＡＳ１遺伝子、及びＢＩＧ１遺伝子からなる群のうちのいずれか１つの遺伝子が破壊されている酵母、並びに、（ｂ）前記ＧＡＳ１遺伝子及びＣＷＨ４１遺伝子の２つの遺伝子が破壊されている酵母、のいずれかの酵母を含有し、免疫賦活能を有することを特徴とする免疫賦活組成物。
免疫賦活能がマクロファージ活性化能である請求項１に記載の免疫賦活組成物。
（ａ）１つの遺伝子が破壊されている酵母が、ＭＣＤ４遺伝子ａ型、ＭＣＤ４遺伝子α型、及びＧＡＳ１遺伝子ａ型のいずれかの遺伝子が破壊されている酵母であり、
（ｂ）２つの遺伝子が破壊されている酵母が、ＧＡＳ１遺伝子及びＣＷＨ４１遺伝子ａ型が破壊されている酵母、又はＧＡＳ１遺伝子及びＣＷＨ４１遺伝子α型が破壊されている酵母である請求項１から２のいずれかに記載の免疫賦活組成物。
ＭＣＤ４遺伝子が破壊された酵母が、ＡＴＣＣ４０２５０１５であり、
ＧＡＳ１遺伝子が破壊された酵母が、ＡＴＣＣ４０００８９７、ＡＴＣＣ４０１０８９７、ＡＴＣＣ４０２０８９７、及びＡＴＣＣ４０３０８９７の少なくともいずれかであり、
ＣＷＨ４１遺伝子が破壊された酵母が、ＡＴＣＣ４００４３９５、ＡＴＣＣ４０１４３９５、ＡＴＣＣ４０２４３９５、及びＡＴＣＣ４０３４３９５の少なくともいずれかであり、
ＢＩＧ１遺伝子が破壊された酵母が、ＡＴＣＣ４０２１９２９である請求項１から３のいずれかに記載の免疫賦活組成物。
マクロファージ活性化能が、ＴＮＦ−α活性化能であり、
前記ＴＮＦ−α活性化能が、野生型の酵母と比較して２倍以上である請求項２から４のいずれかに記載の免疫賦活組成物。
請求項１から５のいずれかに記載の免疫賦活組成物を含有することを特徴とする食品。