JP4705754B2 - 生体粒子のイオン移動度分析 - Google Patents
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Description
本出願は、2001年11月13日出願の「Ion Mobility Analysis of Biological Particles」という名称の米国仮特許出願番号60/338,214の優先権を主張するものである。
米連邦の助成に関する記載
本発明は、米国政府の支援を受け、米国エネルギー省(the U.S.Department of Energy)とカリフォルニア大学理事会(The Regents of the University of California)との間で締結されたローレンスバークレー国立研究所(the Lawrence Berkeley National Laboratory)の管理および運営のための契約第DE−AC03−76SF00098号の下でなされたものである。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
臨床診療では、リポタンパク質粒子の測定が、心臓血管の健康リスクおよび脂質に関連した他の健康リスクを評価し、治療プロトコルを決定し、治療レジメンの効能を追跡するために使用される。リポタンパク質粒子は、コレステロールおよび他の生化学物質を包み込んだ巨大分子を構成し、これらの物質の血流による輸送を可能にする。リポタンパク質粒子の粒径分布は、遺伝的および非遺伝的影響のため人によって異なる。リポタンパク質粒子の粒径は一般に約7nmから約120nmである。この粒径範囲には、心臓血管疾患の重要な予測因子であるリポタンパク質粒子のいくつかのサブフラクションが存在する。例えば、超低密度リポタンパク質はトリグリセリドを血流にのせて輸送し、血流中の高い超低密度リポタンパク質レベルは、高トリグリセリド血症(hypertriglyceremia)を指示する。これらのサブフラクションは、物質の量をリポタンパク質粒子の粒径または密度の関数として表示する分析技法によって識別される。
一般的な標準脂質測定には、空腹時の総コレステロール、トリグリセリド、HDLコレステロールおよびLDLコレステロールが含まれる。現在、最も広く使用されているLDLコレステロール測定法は間接Friedewald法(Friedewald他、Clin.Chem.、第18巻、499〜502ページ、1972年)である。このFriedewald検定法には次の3つのステップが必要である:1)血漿トリグリセリド(TG)および総コレステロール(TC)の測定、2)VLDLおよびLDLの沈殿、3)HDLコレステロール(HDLC)の定量。VLDLCを血漿トリグリセリドの1/5(TG/5)と推定することによって、LDLコレステロール濃度(LDLC)は次式によって計算される:LDLC=TC−(HDLC+VLDLC)。Friedewald法は全般的に有用ではあるが、ケースによってはその正確さが限定される。上記の3つのステップのいずれにおいても誤差は起こりうる。これは一つには、この方法では、それぞれのステップでさまざまな手法を使用する必要があるためである。Friedewald法は、VLDLC濃度を血漿トリグリセリド濃度の1/5と仮定するので、ある程度間接的な方法である。患者のVLDLがこの比率から外れるときにはさらに不正確になる。400mg/dLを超えるTGを有する患者に対してFriedewald法は使用できないので、いくつかの試料に対しては、LDLコレステロールの分離およびその後の測定のために超遠心法を使用しなければならない。
現在、リポタンパク質亜種を分析する普及した方法には、核磁気共鳴、バーティカルオートプロファイル(vertical auto profile)、および電気泳動ゲル分離が含まれる。次に、これらのそれぞれの方法について簡単に論じる。
Otvosは、リポタンパク質サブクラスの濃度を求める、Friedewald法よりも正確な核磁気共鳴(NMR)手法を教示している(米国特許第5343389号、1994年8月30日発行)。Otvosの方法ではまず最初に、血漿または血清試料のNMR化学シフトスペクトルを得る。次いで、観察された血漿試料全体のスペクトルを、コンピュータソフトウェアプログラム中に記憶されたリポタンパク質サブクラスのNMRスペクトルの既知の加重和と突き合わせる。次いで、試料スペクトルと計算スペクトルの間の最適合致を与える重み係数を使用して、血液試料中の構成リポタンパク質サブクラスの濃度を推定する。この手法は、短時間で済むというの追加の利点を有する。
臨床的に使用されている他のリポタンパク質サブフラクション測定法が、バーティカルオートプロファイル(VAP)である(Kulkarni他、J.Lip.Res.、第35巻、159〜168ページ、1994年)。バーティカルオートプロファイル法では、フローアナライザを使用して、ショートスピンシングルパーティカル超遠心法によって分離したリポタンパク質クラス中のコレステロールの酵素分析を実施し、続いて分光測光法、得られたデータのソフトウェア解析を実施する。役立つ進歩ではあるが、この技法はLDLを、電気泳動勾配ゲル分離によって同定される全7亜種にまでは分割しない。
このゲル分離法は、参照によって本明細書に組み込まれる1999年7月20日発行のR.M.Krauss他の「Low Density Lipoprotein Fraction Assay for Cardiac Disease Risk」という名称の米国特許5925229号(229号特許)に示されている。この229号特許には、LDLサブクラスを分離するための勾配ゲル電気泳動手法が開示されている。LDLフラクションは、超遠心器によって得られる結果に匹敵する結果を生み出す勾配ゲル電気泳動によって分離される。この方法はLDLサブクラスの細分割を生み出し、主に研究機関で使用されている。しかし、勾配ゲル電気泳動は完了までに多くの時間がかかる。勾配ゲル電気泳動の分離時間を短縮し、分析を単純化することができ、その結果、高分解能脂質分析を、臨床検査室での血液試料のルーチンのスクリーニングの一部として、冠状動脈性疾患の危険因子の割当てに使用することができるようになれば有用であろう。
「生体粒子」は、共有結合以外の方法で結合した生物由来分子の集合体を有する物質を意味する。その例には、アポリポタンパク質と脂質とから形成されたリポタンパク質粒子、共有結合以外の方法で結合したコートタンパク質と糖タンパク質とから形成されたウイルス構成要素、抗体とその同系抗原とから形成された免疫複合物などが含まれるが、細胞全体は含まれない。
図1に、生体粒子のイオン移動度分析に関与する主要な機能構成要素を示す。マイクロ遠心管410に試料を入れ、次いでこれを遠心器420にかけて、後に「D.精製リポタンパク質粒子試料の調製」の項で説明するLp(a)や他の細胞成分などの望ましくない成分を除去する。細胞成分およびLp(a)を除去し、さらに密度超遠心法でリポタンパク質だけを選択した後、試料溶液455を試験用マイクロ遠心管450に入れ、次いでこれを加圧室460に入れる。高圧可変電源430によって、加圧室460および試料溶液455にPt線435を通して正バイアスをかける。この正バイアスおよび高い相対圧力によって、毛細管100が、テイラー円錐(Taylor cone)150を形成して加圧室460から粒子小滴を発射する。図3には毛細管100がより詳細に示されている。
リポタンパク質は、ヒトの血漿中に見られる複雑な巨大分子であり、脂質を包み込んでリポタンパク質粒子となっている。循環系中のリポタンパク質粒子は特に、細胞で使用するコレステロールを輸送する機能を有する。リポタンパク質粒子は、密度および粒径に基づいてさまざまなクラスおよびサブクラスに区分されている。リポタンパク質粒子の密度は、平衡密度超遠心法および分析超遠心法によって直接に求めることができる。リポタンパク質粒子の密度は、粒径ならびに粒径と密度との間の既知の関係に基づいて、間接的に求めることもできる。粒径は、ゲル電気泳動を含むいくつかの方法によって求めることができる。
イオン移動度粒径とゲル電気泳動粒径との間で観察される差は、電気泳動ゲルの固有印加電界の影響下でゲルマトリックスに衝突するときにリポタンパク質粒子がゆがめられることに起因するとも考えられる。この粒径の差は、(分析超遠心分離によって得られた)粒子密度を電子顕微鏡法から得られた粒径に変換するのに使用された歴史的データによるものとも考えられる。図2は、一般的な科学文献に公表されているゲル電気泳動ランに対して受け入れられたリポタンパク質の粒径を表している。イオン移動度粒径のほうがゲル粒径よりも正確であるというのが本発明の発明者の意見だが、これは確認を要する。
試料調製は一般に以下のステップを含む:血液試料を採取するステップ、細胞物質から血漿を分離するステップ、超遠心法、親和ゲルへの吸着など、いくつかあるうちの1つの方法によって非リポタンパク質タンパク質を血漿から除去するステップ、透析ろ過をおこなって、粒子揮発性および/または粒径に影響を及ぼすと思われる密度調整用成分を除去するステップ、エレクトロスプレー小滴の形成を容易にするために揮発性試薬を添加するステップ、リポタンパク質粒子試料溶液を希釈するステップ、および試料溶液のpHを調整するステップ。
本発明で使用するエレクトロスプレー毛細管を図3に軸対称に示す。毛細管本体100は、その中を試料溶液130が輸送される中空の中心部を有する。試料溶液130をエレクトロスプレーするときに試料溶液130中の物質が吸着しないように、毛細管100は、毛細管100の内孔110の中空心に沿ってメチル誘導体化などのコーティングで不活性化されたものを使用することが好ましい。このような付着が生じると毛細管が詰まる傾向があり、十分に清掃されるまで管が使用できなくなるからである。メチル化試薬で誘導体化された毛細管は、内孔110の表面のシラノールおよびSi−O−基をメチル基で置換し、これによって毛細管への試料の吸着およびその後の目詰まりを最小化する。
イオン電気移動度分析は、分析を受ける荷電粒子が電界にさらされているときに、その荷電粒子の粒径を決定する技法である。以下に、荷電粒子の粒径決定に使用する分析方法を説明する。
移動度スペクトルの記録に使用する検出器490は凝縮粒子検出器、好ましくはTSI社のモデル3025A凝縮粒子検出器(Condensation Particle Detector)である。凝縮粒子検出器は、リポタンパク質粒子などの粒子を過飽和状態の蒸気凝縮室に通し、粒子の表面で蒸気を凝縮させる。粒子は凝縮核の生成場所となる。1つ1つの全てのリポタンパク質粒子が凝縮核を生成し溶媒小滴を生み出すので、この装置は単一粒子レベルの感度を有する。それぞれの凝縮小滴の内側には1つのリポタンパク質粒子が完全に包み込まれている。この凝縮プロセスは事実上リポタンパク質粒子の粒径を大きくし、その粒径を数十nmから数μmにまで成長させる。
次に、生体粒子、具体的にはリポタンパク質のイオン移動度分析の実施に関与するハードウェア構成要素を示す図1を参照する。試料溶液は、ほぼ中性のpHに緩衝された25mM酢酸アンモニウム水溶液を含む。
得られるリポタンパク質粒径分布を分析することによって、リポタンパク質の微分移動度分光法をさらに、冠状動脈性心疾患(CHD)リスクの迅速な判定に使用することができる。
どのようにしてイオン移動度分析を実施できるかを示す他の例を図6のデータを用いて示す。リポタンパク質粒子を、NaCl/D2O中での非平衡超遠心法を用いて分画した。1.0から1.08g/cm3の範囲の粒子を、複数の液体フラクションとして超遠心管から取り出した。粒子が超遠心器管内の平衡浮選位置に達する前に超遠心ステップは終了したので、それぞれのフラクションとともに取り出されたリポタンパク質粒子の密度は、その粒子の真の密度の推定値だが合理的な推定値であり、推定密度として表示した。図6は、それぞれのフラクションの溶液密度に対するリポタンパク質粒子の粒径のプロットであり、粒径と密度との間の予想される逆線形関係を明らかにしている。図6の縦軸は、イオン移動度分析によって測定した粒径(nm)、横軸は、非平衡超遠心法によって得た推定粒子密度(g/cm3)である。
この検出方法の線形性を、特定のLDL粒子セットの一連の希釈を分析することによって確認した。このLDL粒子は、ゲルろ過によって他のクラスのリポタンパク質粒子から分離した。このLDL粒子の出発濃度を、溶液のアポリポタンパク質Bの濃度を測定することによって求めた。それぞれのLDL粒子にはアポリポタンパク質B分子が1つずつ存在する。アポリポタンパク質Bの濃度を使用することによって、試料中のLDL粒子の数を計算することができる。この特定の試料を順番に希釈し、それぞれの希釈物中の粒子の数(「IMSピーク高さ、個/cm3」軸)を微分移動度分光測定によって求め、それぞれの希釈物の計算アポリポタンパク質B濃度(「粒子、個/mL」軸)に対してプロットした。このTSI社製機器と一緒に供給される商業ソフトウェアで使用可能な1つのオプションは、微分移動度分析器を通過する空気1cm3当たりの検出粒子数をプロットする。図7には、イオン移動度ピーク高さが、アポリポタンパク質Bの測定から求めたLDL粒子の個数濃度に対してプロットされている。このプロット(図7)は、この測定が、1012粒子/mLから1014粒子/mLまでの3桁を超える範囲にわたって線形であることを示している。さらなる詳細として、図7のはめ込みグラフは、8×1012粒子/mLまでの範囲を示している。図7は、リポタンパク質サブクラスの濃度の変動は、1000:1すなわち0.1%の範囲で正確に測定されることを示唆している。
微分移動度分析は、さまざまなリポタンパク質クラスおよびサブクラスにわたって非常に線形独立であるように見える。この線形独立性を、図8〜23に示すように検証した。これらの図では、1つのヒト血液試料を16個の異なる平均密度に分画した。使用した方法は非平衡超遠心法である。このタイプの分画の1つの副産物は、平均密度を中心とした密度分布が常に存在することである。ここでは生体粒子を取り扱っているので、特定の平均密度を有するフラクションの中に幅の広い範囲の粒径が含まれる。それぞれのリポタンパク質粒子サブクラスを表す密度フラクションを選択することを試みた。
原則として、これらのサブクラスに表現されたリポタンパク質に関しては、それぞれのリポタンパク質サブクラスの線形重ね合わせによって、血漿試料全体を数学的に表現することができる。最終的にたとえ複数のピークが残っても、最小2乗法、特異値分解などの従来の数値的データ相関方法を使用して、試料全体のそれぞれのリポタンパク質サブクラスの量を求めることができる。したがって、1回の微分移動度スペクトル走査で、血漿試料中のそれぞれのリポタンパク質サブクラスの量を決定することができる。これが決定されれば、それぞれのリポタンパク質の量およびタイプも分かるであろう。結果として得られるサブクラス情報を、集団死亡率および危険因子と統計学的に相関させることによって、冠状動脈性心疾患リスクのより正確な評価が得られると考えられる。具体的には、複峰対単峰HDL分布、およびLDL分布のピークリポタンパク質粒径のこの既知の特徴を、100%A型パターン(低リスク)から100%B型パターン(高リスク)までの危険因子に容易に変換することができる。
本明細書で言及した全ての文献、特許および特許出願は、それぞれを特に個別に本明細書に組み込むと指示したのと同じ程度に、参照によって本明細書に組み込まれる。
Claims (40)
- (a)リポタンパク質粒子を含む生理的試料を得るステップと、
(b)前記リポタンパク質粒子を濃縮するステップと、
(c)前記リポタンパク質粒子を荷電状態でスプレーするステップと、
(d)前記リポタンパク質粒子の荷電状態を均一な単一の電荷まで低減させるステップと、
(e)電荷を帯びた前記リポタンパク質粒子を微分移動度分析器に供給し、それによって電荷を帯びた前記リポタンパク質粒子を粒径に基づいて分離するステップと、
(f)前記リポタンパク質粒子を分析して、前記リポタンパク質粒子の粒径分布を形成するステップと、
(g)前記リポタンパク質粒子の前記粒径分布を基準粒径分布と比較するステップと
を含む、リポタンパク質粒子の粒径分布を分析するための方法。 - リポタンパク質粒子の前記粒径分布を分析して、VLDL、IDL、LDL、HDLおよびカイロミクロンならびにこれらのサブクラスを区別するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記微分移動度分析器の選択電圧を走査して、電荷を帯びた前記リポタンパク質粒子がさまざまな大きさの静電気力を受けるようにし、それによってさまざまな粒径のリポタンパク質粒子をサンプリングするステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 粒径分布を分析する前記ステップが、約1.7nmから約120nmの粒径範囲にわたる、粒径に対するリポタンパク質粒子の数を示す表示をコンピュータ可読媒体に出力するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 定義された前記サンプリング時間の間に計数された、粒径に対する、電荷を帯びたリポタンパク質粒子イオンの表示を、コンピュータ可読媒体に出力するステップをさらに含む、請求項5に記載の方法。
- 前記希釈されたリポタンパク質試料が、1エレクトロスプレー小滴あたり1リポタンパク質粒子の希釈度となるように希釈されており、前記エレクトロスプレー小滴が、脱溶媒和後に、実質上個別のリポタンパク質粒子を生じる、請求項5に記載の方法。
- 前記希釈された生体試料が、酢酸アンモニウム水溶液によって希釈されている、請求項8に記載の方法。
- 冠状動脈性心疾患リスクを評価するために、電荷を帯びたリポタンパク質粒子の出力ヒストグラムを得る方法であって、
(a)血球全体、非リポタンパク質タンパク質およびLp(a)を生体試料から除去し、これによって血漿試料を形成するステップと、
(b)前記血漿試料に1種または数種の希釈剤を加え、これによって希釈試料を形成するステップと、
(c)前記希釈試料をエレクトロスプレーするステップと、
(d)エレクトロスプレーした前記試料を均一な単一の電荷まで低減させるステップと、
(e)電荷を均一に帯びた前記希釈試料を揮発室へ通して、前記希釈剤を蒸発させ、均一な単一の電荷を有する個々の電荷を帯びたリポタンパク質粒子イオンを形成するステップと、
(f)電荷を帯びた前記リポタンパク質粒子イオンを粒径選択可能微分移動度分析器の中へ輸送するステップと、
(g)前記選択可能微分移動度分析器のそれぞれの粒径選択sの定義されたサンプリング時間dtの間の電荷を帯びたリポタンパク質粒子イオンの数dn + を計数し、下記粒径出力
(h)粒径選択を、220から285オングストロームの範囲を含む粒径選択範囲にわたって走査して、粒径に対する、定義された前記サンプリング時間の間に計数された、電荷を帯びたリポタンパク質粒子の出力ヒストグラムを得るステップと
を含む方法。 - 前記サンプリング時間が一定に保たれ、その結果、粒径に対する、電荷を帯びたリポタンパク質粒子イオンの出力ヒストグラムn + が得られる、請求項10に記載の方法。
- 冠状動脈性心疾患リスクを評価するために、電荷を帯びたリポタンパク質粒子の出力ヒストグラムを得る方法であって、
(a)アルブミンおよび血球全体を全血試料から除去し、これによって血漿試料を形成するステップと、
(b)1種または数種の希釈剤を用いて前記血漿試料を希釈して、希釈試料を形成するステップと、
(c)前記希釈試料をエレクトロスプレーして、エレクトロスプレー小滴を形成するステップと、
(d)前記エレクトロスプレー小滴にα放射線源を照射し、これによって電荷を中和し、または1つ以下の正電荷を残すステップと、
(e)照射された前記エレクトロスプレー小滴を揮発室へ通して、前記希釈剤を蒸発させ、実質上、前記血漿試料に由来するリポタンパク質粒子からなる、電荷を帯びたリポタンパク質粒子イオンを形成するステップと、
(f)電荷を帯びた前記リポタンパク質粒子イオンを粒径選択可能微分移動度分析器の中へ輸送するステップと、
(g)前記粒径選択可能微分移動度分析器のそれぞれの粒径選択sの定義されたサンプリング時間dtの間の電荷を帯びた前記生体粒子イオンの数dn + を計数し、下記粒径出力
(h)前記粒径出力を約
(i)前記粒径選択をある粒径選択範囲にわたって走査して、密度ρに対する、定義された前記サンプリング時間の間に計数された所与の密度の電荷を帯びたリポタンパク質粒子の出力ヒストグラムを得るステップと
を含む方法。 - 生体試料から抽出したリポタンパク質粒子の粒径分布を決定するための装置であって、
(a)複数のリポタンパク質試料を所定の順序で供給する試料供給手段と、
(b)前記リポタンパク質試料をメチル誘導体化された毛細管を通してスプレーし、前記試料を、均一の電荷のスプレー粒子に変換するエーロゾル発生器と、
(c)出口を有する粒子移動度分析器であって、電圧が印加され、それによって電荷を帯びた前記粒子がその粒子の移動度の関数として前記微分移動度分析器を出るところの粒子移動度分析器と、
(d)前記粒子移動度分析器を出る粒子を計数する粒子計数器と、
(e)粒径分布を生成し、この分布を、心臓疾患リスクに応じて識別された人に見られる既知のリポタンパク質粒子分布と比較して、前記リポタンパク質試料のリスク評価を得るコンピュータ化された手段と、
(f)前記リスク評価を含む、この装置に関連づけられたコンピュータ可読媒体と
を備えた装置。 - 前記エーロゾル発生器が、リポタンパク質粒子を、2nmから120nmの粒径分布でスプレーするのに適している、請求項13に記載の装置。
- 前記粒子計数器が凝縮計数器である、請求項13に記載の装置。
- 前記粒子計数器が飛行時間計数器である、請求項13に記載の装置。
- 前記エーロゾル発生器が、超低密度リポタンパク質(VLDL)、中間密度リポタンパク質(IDL)、低密度リポタンパク質(LDL)、高密度リポタンパク質(HDL)およびカイロミクロンからなるグループから選択されたエーロゾル粒子をスプレーするのに適している、請求項13に記載の装置。
- リポタンパク質粒子を含む試料の粒径分布を決定するための方法であって、
(a)前記試料を調製して、非リポタンパク質汚染物質を除去するステップと、
(b)前記試料をエレクトロスプレー装置に導入し、これによって1小滴につき1つのリポタンパク質粒子を生成するステップと、
(c)実質上、複数の前記小滴からなるエーロゾルを形成するステップと、
(d)前記エーロゾルを走査微分移動度分析器に導入し、それによって、帯電した小滴を、空気中でのその移動度に従って分離するステップと、
(e)前記微分移動度分析器を出た前記粒子を計数するステップと、
(f)計数された粒子からのデータを取得して、前記試料中の前記リポタンパク質粒子の粒径分布を生み出すステップであって、前記分布が19〜25nmの範囲を含むところのステップと
を含む方法。 - 前記試料がヒトの血液または血液成分である、請求項18に記載の方法。
- 前記試料が実質上、超低密度リポタンパク質(VLDL)、中間密度リポタンパク質(IDL)、低密度リポタンパク質(LDL)、高密度リポタンパク質(HDL)およびカイロミクロンからなるグループからの粒子からなる、請求項18に記載の方法。
- リポタンパク質粒子の粒径分布を分析するための方法であって、
(a)濃縮されたリポタンパク質粒子を含む試料を得るステップと、
(b)前記生体粒子を、均一に電荷を帯びた状態でスプレーするステップと、
(c)電荷を帯びた前記粒子を微分移動度分析器に供給し、それによって粒子を粒径に基づいて分離するステップと、
(d)72オングストロームから285オングストロームまでを含む範囲にわたって電荷を帯びた前記粒子の前記粒径分布を分析し、これによってLDLおよびHDL粒子を網羅するステップと、
(e)前記リポタンパク質粒子の前記粒径分布を表するデータをコンピュータ可読媒体に記憶するステップと
を含む方法。 - 前記コンピュータ可読媒体に記憶された前記データを分析して、前記粒径分布を、VLDL、IDL、LDLおよびHDLからなるグループから選択された少なくとも1つのクラスおよびそのサブクラスに分離するステップをさらに含む、請求項21に記載の方法。
- 粒径分布の前記クラスがLDLおよびその少なくとも1つのサブクラスである、請求項22に記載の方法。
- 患者試料中のリポタンパク質粒子の粒径分布を決定するための方法であって、
(a)複数の前記リポタンパク質粒子と希釈剤とからなる混合物を、帯電した状態でスプレーするステップと、
(b)前記混合物の前記希釈剤を乾燥させるステップであって、それによって乾燥した前記混合物が実質上前記リポタンパク質粒子だけを含むところのステップと、
(c)前記リポタンパク質粒子の前記荷電状態を、主に中性または単一正電荷の荷電状態にまで低減させるステップと、
(d)電荷が低減された前記リポタンパク質粒子を微分移動度分析器(DMA)に供給し、それによって電荷が低減された前記リポタンパク質粒子を移動度に基づいて分級するステップと、
(e)移動度によって分級された電荷が低減された前記リポタンパク質粒子を検出するステップと、
(f)前記DMAの前記移動度分級を走査して、前記患者のリポタンパク質粒子の粒径分布を生み出すステップと
を含む方法。 - 前記粒径分布が、粒子移動度、粒径、粒子密度、粒子質量、粒径区間内の粒子数および粒径区間内の粒子質量からなるグループから選択された少なくとも1つの測定値を含む、請求項24に記載の方法。
- (a)前記患者からのリポタンパク質粒子の前記粒径分布を、心臓血管疾患または状態、あるいは前記心臓血管疾患または状態を発達させる素因と相関させるステップをさらに含む、請求項25に記載の方法。
- (a)リポタンパク質粒子をエレクトロスプレーして、前記リポタンパク質粒子を電荷を帯びた状態にするステップと、
(b)前記リポタンパク質粒子を微分移動度分析器に供給するステップと、
(c)前記微分移動度分析器によって、前記リポタンパク質粒子を粒径に基づいて分離するステップと、
(d)分離された前記リポタンパク質粒子の粒径分布を決定するステップと
を含む、リポタンパク質粒子の粒径分布を決定するための方法。 - 前記粒径分布を基準粒径分布と比較するステップをさらに含む、請求項27に記載の方法。
- 前記リポタンパク質粒子を微分移動度分析器に供給するステップに先立って、前記リポタンパク質粒子を含む試料を処理して、非リポタンパク質成分を除去することを特徴とする、請求項27に記載の方法。
- 前記粒径分布を少なくとも1つのリポタンパク質クラスにおいて分析するステップをさらに含み、前記クラスは、超低密度リポタンパク質(VLDL)、中間密度リポタンパク質(IDL)、低密度リポタンパク質(LDL)及び高密度リポタンパク質(HDL)からなるグループから選択されることを特徴とする、請求項27に記載の方法。
- 粒子移動度、粒径、粒子密度、粒子質量、粒径区間内の粒子数、または、粒径区間内の粒子質量を測定するステップをさらに含む、請求項27に記載の方法。
- (a)既に得られ、濃縮されたリポタンパク質粒子を含む試料を準備するステップと、
(b)電荷を帯びたリポタンパク質粒子を生成するのに適した条件で、前記サンプルをスプレーするステップと、
(c)電荷を帯びた前記リポタンパク質粒子を微分移動度分析器に供給し、それによって粒子を粒径に基づいて分離するステップと、
(d)電荷を帯びた前記粒子の粒径分布を、低密度リポタンパク質(LDL)の粒子の粒径分布の少なくとも一部を含む範囲にわたって分析するステップと
を含む、リポタンパク質粒子の粒径分布を分析するための方法。 - 微分移動度分析器に供給される、電荷を帯びた前記リポタンパク質粒子は、均一な電荷を有していることを特徴とする、請求項32に記載の方法。
- 低密度リポタンパク質(LDL)の粒子の粒径分布の少なくとも一部を含む、粒径分布の前記範囲は、72オングストロームから285オングストロームまでを含むことを特徴とする、請求項32に記載の方法。
- 前記分析の結果を、コンピュータ可読媒体に記憶することを特徴とする、請求項32に記載の方法。
- 前記試料がヒトの血液または血液成分であることを特徴とする、請求項32に記載の方法。
- 前記リポタンパク質粒子が、超低密度リポタンパク質(VLDL)、中間密度リポタンパク質(IDL)、低密度リポタンパク質(LDL)、高密度リポタンパク質(HDL)、および、カイロミクロンリポタンパク質からなるグループから選択されることを特徴とする、請求項32に記載の方法。
- 生体試料中におけるリポタンパク質粒子の粒径分布を決定するための装置であって、
(a)前記試料をスプレーして、電荷を帯びたリポタンパク質を生成するエーロゾル発生器と、
(b)出口を有する粒子移動度分析器であって、電圧が印加され、それによって電荷を帯びた前記粒子がその粒子の移動度の関数として前記微分移動度分析器を出るところの粒子移動度分析器と、
(c)前記粒子移動度分析器を出る粒子を計数する粒子計数器と、
(e)粒子の粒径分布を生成するためのコンピュータ化された手段と
を備えた装置。 - 前記粒子計数器が凝縮計数器である、請求項38に記載の装置。
- 前記粒子計数器が飛行時間計数器である、請求項38に記載の装置。
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