JP4694587B2 - 核酸および他の生体活性分子を高等真核細胞の核に電流を用いて導入する回路装置 - Google Patents
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Description
真核生物DNAの作用部位は細胞核であるため、外部から供給されるDNAが読み取られるためには、該DNAが核に入り込む必要がある。従来のトランスフェクション方法では、DNAが細胞膜を通過して細胞質へと輸送されるのみである。ただし、高等真核生物の細胞分裂の場合、核膜が一時的に溶解されるため、DNAが受動的に核に入り込むことができ、その結果、前記DNAによってコードされたタンパク質が発現しうる。極めて小さなDNA分子(オリゴヌクレオチド)のみが自由に核膜の孔を通過して拡散しうる。したがって、休止細胞または弱分裂活性細胞の有効なトランスフェクションのためには、十分な量のより大きなDNA分子が核膜を通過して核に入り込むことを誘導する条件をつくることが必要である。本願に記載された回路装置は、高等真核細胞においてこれを可能にする。
電流によって緩衝液から細胞にDNAを導入できることは、以前から知られている。しかしながら、これまでに記載されたエレクトロポレーション(電気穿孔)のための回路装置は、高等真核細胞の細胞質へとDNAを輸送することを目的とする。したがって、トランスフェクトされたDNAの発現は依然として、細胞分裂中の核膜の溶解に依存する。これまでに知られているエレクトロポレーションのための回路装置では、高等真核細胞の核にDNAを電気的かつ特異的に導入することに取り組んだものはない。したがって、電気的な核輸送用に最適化されたエレクトロトランスフェクションのための回路装置は知られ
ていない。
、すなわちトランスフェクトされた細胞の比率に対する影響が強くなる。電流密度が低ければ低いほど、より多くの第2パルスが、第1のパルスを通じてすでにトランスフェクトされた細胞へと純粋なDNAを輸送するようになる。トランスフェクトされた細胞の発現レベルはパルスの持続時間の増大とともに増加するが、トランスフェクトされた細胞の割合は増加しない。トランスフェクション率、発現レベル、および細胞生命力について正確な細胞特異的制御を維持するためには、第2のパルスのパルス持続時間および電流密度を制御しなければならない。
ベットの抵抗が測定される。測定された抵抗がこの範囲の外にある場合は、障害が存在し、パルス放出が行なわれない。
FACS 蛍光活性化細胞分類法
FCS ウシ胎児血清
PBMC 末梢血単核球
PE サイコエリスリン(psycoerythrin)
[実施例]
以下の実施例は本発明を例示するものだが、本発明を限定的には理解すべきではない。
新しく調製した未刺激(未分裂)ヒト末梢血単核球(PBMC)を、マウスMHCクラスIタンパク質H−2KKの重鎖をコードするベクターでトランスフェクトした。高緩衝能(48mM×pH-1)および高イオン強度(280mM)の緩衝液中に、ベクターDNA5[μg]とともに、5×106個の細胞を電極間距離が2[mm]のキュベットに室温で添加し、さらに、持続時間が100[μs]の1000[V]のパルスと、それに引き続く、電流密度が5[A・cm-2]で持続時間が40[ms]の電流とによってトランスフェクトした。その直後に、400[μl]の細胞培養培地を用いてキュベットから細胞を洗い出し、37℃で10分間インキュベートし、次いで、あらかじめ温めておいた培地を含む培養シャーレに前記細胞を移動させた。24時間インキュベーションした後、ヒト細胞毒性T細胞を同定するために、PerCP結合抗CD8−抗体に加えて、ジゴキシゲニン結合抗H−2KK抗体およびCy5結合抗ジゴキシゲニン抗体を用いて、細胞を連続的にインキュベートし、フローサイトメーター(FACScalibur,べクトン・ディッキンソン(Becton Dickinson))を用いて細胞を分析した。ヨウ化プロピジウム(Propidiumjodid)を用いた染色によって、死細胞の数を決定した
。図1に示すように、生細胞の74.3%がH−2KK抗原を発現した。この結果は、きわめて高いトランスフェクション効率に相当する。
実施例1で記載したように、新しく調製されたPBMCから磁気細胞分離によってCD34陽性細胞をあらかじめ濃縮した。次いで、それぞれ1×104個のCD34陽性細胞を1×106個のPBMCと混合し、これらの細胞を5[μg]のH−2KK発現ベクターDNAとともに、高緩衝能(54mM×pH-1)および高イオン強度(260mM)の緩衝液中に、電極間距離が2[mm]のキュベットに室温で添加し、さらに、持続時間が100[μs]の1000[V]のパルスと、それに引き続く、電流密度が4[A・cm-2]で持続時間が20[ms]の電流とによってトランスフェクトした。その直後に、400[μl]の細胞培養培地を用いてキュベットから細胞を洗い出し、37℃で10分間インキュベートし、次いで、あらかじめ温めておいた培地を含む培養シャーレに細胞を移動させた。16時間インキュベーションした後、ヒト造血幹細胞を同定するために、APC結合抗CD34抗体に加えて、サイコエリスリン(phycoerythrin)結合抗H−2KK抗体を用いて、細胞を連続的にインキュベートし、フローサイトメーター(FACScalibur(べクトン・ディッキンソン(Becton Dickinson))を用いて細胞を分析した。ヨウ化プロピジウム(Propidiumjodid)を用いた染色によって、死細胞の数を決定した。図2に示すように、生細胞の66.7%がH−2KK抗原を発現した。この結果は、高いトランスフェクション効率に相当する。
ヒト新生児皮膚線維芽細胞(5×105細胞(個))を、5[μg]のH−2KK発現ベクターDNAとともに、高緩衝能(67mM×pH-1)および高イオン強度(380mM)の緩衝液中に、電極間距離が2[mm]のキュベットに室温で添加し、さらに、持続時間が100[μs]の1000[V]のパルスと、それに引き続く、電流密度が6[A・cm-2]で持続時間が33[ms]の電流とによってトランスフェクトした。その直後に、400[μl]の細胞培養培地を用いてキュベットから細胞を洗い出し、37℃で10分間インキュベートし、次いで、あらかじめ温めておいた培地を含む培養シャーレに細胞を移動させた。5時間インキュベーションした後、Cy5結合抗H−2KK抗体とともに細胞をインキュベートし、フローサイトメーター(FACScalibur(べクトン・ディッキンソン(Becton Dickinson))を用いて細胞を分析した。ヨウ化プロピジウム(Propidiumjodid)を用いた染色によって、死細胞の数を決定した。図3に示すように、細胞の93%がH−2KK抗原を発現した。この結果は、きわめて高いトランスフェクション効率に相当する。
ヒト新生児メラニン細胞(2.5×105細胞(個))を、5[μg]のH−2KK発現ベクターDNAとともに、高緩衝能(54mM×pH-1)および高イオン強度(260mM)の緩衝液中に、電極間距離が2[mm]のキュベットに室温で添加し、さらに、持続時間が100[μs]の1000[V]のパルスと、それに引き続く、電流密度が6[A・cm-2]で持続時間が33[ms]の電流とによってトランスフェクトした。その直後に、400[μl]の細胞培養培地を用いてキュベットから細胞を洗い出し、37℃で10分間インキュベートし、次いで、あらかじめ温めておいた培地を含む培養シャーレに細胞を移動させた。5時間インキュベーションした後、Cy5結合抗H−2KK抗体とともに細胞をインキュベートし、フローサイトメーター(FACScalibur(べクトン・ディッキンソン(Becton Dickinson))を用いて細胞を分析した。ヨウ化プロピジウム(Propidiumjodid)を用いた染色によって、死細胞の数を決定した。図4に示すように、細胞の75.1%がH−2KK抗原を発現した。この結果は、きわめて高いトランスフェクション効率に相当する。
ヒト臍帯静脈由来内皮細胞(1×106細胞(個))を、5[μg]のH−2KK発現ベクターDNAとともに、高緩衝能(67mM×pH-1)および高イオン強度(378mM)の緩衝液中に、電極間距離が2mmのキュベットに室温で添加し、さらに、持続時間が100[μs]の1000[V]のパルスによってトランスフェクトした。その直後に、400[μl]の細胞培養培地を用いてキュベットから細胞を洗い出し、37℃で10分間インキュベートし、次いで、あらかじめ温めておいた培地を含む培養シャーレに細胞を移動させた。5時間インキュベーションした後、Cy5結合抗H−2KK抗体とともに細胞をインキュベートし、フローサイトメーター(FACScalibur(べクトン・ディッキンソン(Becton Dickinson))を用いて細胞を分析した。ヨウ化プロピジウム(Propidiumjodid)を用いた染色によって、死細胞の数を決定した。図5に示すように、生細胞の49.7%がH−2KK抗原を発現した。この結果は、きわめて高いトランスフェクション効率に相当する。
K562細胞(1×106細胞(個))を、5[μg]のH−2KK発現ベクターDNAとともに、高緩衝能(24mM×pH-1)および高イオン強度(254mM)の緩衝液中に、電極間距離が2[mm]のキュベットに室温で添加し、さらに、持続時間が100[μs]の1000[V]のパルスと、それに引き続く、電流密度が8[A・cm-2]で持続時間が10[ms]の電流とによってトランスフェクトした。その直後に、400[μl]の細胞培養培地を用いてキュベットから細胞を洗い出し、37℃で10分間インキュベートし、次いで、あらかじめ温めておいた培地を含む培養シャーレに細胞を移動させた。4時間インキュベーションした後、Cy5結合抗H−2KK抗体とともに細胞をインキュベートし、フローサイトメーター(FACScalibur(べクトン・ディッキンソン(Becton Dickinson))を用いて細胞を分析した。ヨウ化プロピジウム(Propidiumjodid)を用いた染色によって、死細胞の数を測定した。図6に示すように、細胞の69.5%がH−2KK抗原を発現した。この結果は、きわめて高いトランスフェクション効率に相当する。
第2のパルス中に流れる電荷量の関数として、トランスフェクトされた細胞のトランスフェクション効率および平均蛍光強度を検査するために、それぞれ7×105個のCHO細胞を、5[μg]のサイクル3−GFP−ベクターDNAとともに、エレクトロポレーション緩衝液中に、電極間距離が2mmのキュベットに添加し、持続時間が10[μs]の1000[V]のパルスと、それに引き続く第2のパルスとによってトランスフェクトした。第2のパルスでは、電流強度あるいは電流密度およびパルス時間のバリエーションを変化させた。5時間の培養後、フローサイトメーター(flow cytometer)を用いて細胞を
分析した。図7は、パルス時間にわたって電流の積分値の関数として決定されたトランスフェクション効率を示している(電荷量Q)。トランスフェクション効率は電流強度の増加とともに上昇しうることが明らかである(開放円)。これに対して、電流強度が一定である場合、パルス時間の増加によって効率が大幅に上昇することはない(閉鎖円)。トランスフェクトされた細胞の蛍光強度(輝度)は、電荷量Qの増加とともに上昇するが、Qが高い場合飽和に達する。Qの増加が電流強度の上昇(開放円)またはパルス長の増加(閉鎖円)によって達成されたかどうかについては、大きな違いは示されていない。
第2のパルス中に流れる電荷量の関数として、トランスフェクトされた細胞のトランスフェクション効率および平均蛍光強度を検査するために、それぞれ4.5×105個のジャーカット細胞を、5[μg]のサイクル3−GFP−ベクターDNAとともに、エレクトロポレーション緩衝液中に、電極間距離が2mmのキュベットに添加し、持続時間が10[μs]の1000[V]のパルスと、それに引き続く第2のパルスとによってトランスフェクトした。第2のパルスでは、電流強度あるいは電流密度およびパルス時間のバリエーションを変化させた。5時間の培養後、フローサイトメーターを用いて細胞を分析した。図8は、パルス時間にわたって電流の積分値の関数として決定されたトランスフェクション効率を示している(電荷量Q)。CHO細胞を用いる場合、トランスフェクション効率は電流強度の増加とともに上昇しうることが明らかである(開放円)。これに対して、電流強度が一定である場合、パルス時間の増加によって効率が大幅に上昇することはない(閉鎖円)。トランスフェクトされた細胞の蛍光強度(輝度)は、電荷量Qの増加とともに上昇するが、Qが高い場合飽和に達する。Qの増加が電流強度の上昇(開放円)またはパルス長の増加(閉鎖円)によって達成されたかどうかについては、大きな違いは示され
ていない。
続され、ここで、記憶装置7、8は、使用される電界強度およびパルス持続時間に応じて1つまたは複数のキャパシタからなることができる。パワー半導体9は、例えばIGBTからなることができ、パワー半導体10はMOSFETからなることができる。しかしながら、「パワー半導体」という用語は、他のすべての電気的構成要素または電気的構成要素集合体を包含すべきであり、それらによって本発明の範囲内で切り替えられる電圧および電流が、必要とされる切り替え時間によって切り替えられることを意味する。IGBTの出力部はキュベット接続部15と直接接続されているのに対し、MOSFET10の出力部は抵抗16およびダイオード17を介してキュベット接続部15と接続されている。
したがって、両方のパワー半導体9、10が同時に制御された場合、第2のパワー半導体10を経由してパルスが逆流することはない。この目的のために、ダイオード17がキュベット接続部15と陰極側で接続されている。第2のキュベット接続部18は抵抗19を経由してアースと接続されている。抵抗19は電圧降下を測定し、過電流切り替えステージ20に供給するメス−シャント(measuring shunt)を含む。過電流切り替えステージ20は、スイッチ21を用いて、潜在的な分離ステージ11およびHVスイッチ13を経由したパルス放出を中断させることができるのに対し、第2の過電流切り替えステージ22はスイッチ23を経由してMOSFET10用の制御ユニット14の制御システムを中断する。最大電流を超えた場合に電流を切断するために、抵抗16を経由して付加された電圧は、過電流切り替えステージ22に供給される。抵抗16が高電圧回路内に直接配置されていることにより、スイッチ23は潜在的な分離ステージ12の後に配置されている。これにより、高圧パルスが制御ユニット3に達することはないため、操作員が危険にさらされることはない。過電流切り替えステージ20の場合、低抵抗の測定抵抗19がキュベット接続部15、18の後に配置され、この測定抵抗19がアースに接続されていることにより、高電圧パルスの伝達を排除することができる。エレクトロポレータ1の使用目的に応じて、付属の記憶装置7、8を伴う1つまたは複数の高電圧電源5、6と、必須の潜在的な分離ステージ11、12と、パワー半導体9、10を制御するためのHVスイッチ13あるいは制御ユニット14と、を使用することができる。必要な容量およびブレークダウン電圧の1項または複数のキャパシタが記憶装置7、8に設けられることにより、適切な高い電荷量を蓄積でき、前記電荷はキュベット接続部15へと伝達できる。
図19は、本発明の好ましい実施形態による制御ユニット3(図10参照)によって制御されるパルス放出プロセスの操作手順を模式的に示す流れ図(フローチャート)である。まず、手動またはメモリーカードからの読み出しによって、必要なパルスパラメータをあらかじめ設定する(図示せず)。操作の開始(例えば、相当する押ボタンの作動による)後、キュベット接続部15、18に低電圧(例えば、12[V])を印加し、次いでステップ44において電流を測定(例えば、2[ms])することによって、キュベットのオーム性抵抗が最初に測定される。照会45では、この抵抗が所定の範囲内にあるかどうかを確認する。この抵抗が範囲内にない場合、その後のプロセスを中断する。測定された抵抗値は、本発明の本実施形態における電荷電圧U2の計算には以降利用されない。抵抗が適切に所定の範囲内にある場合は、ステップ46において、記憶装置7、8を所定の電圧U1およびU2に荷電する。所望の電荷電圧に達した場合、HV電源5、6による荷電を切断する。次のパルス放出中に記憶装置の再荷電は行われない。その後、高電圧パルスのパルス放出は、ステップ47において、半導体スイッチ9の閉鎖によって開始する。その結果、比較的高い電流が細胞を通過して流れる。電流の急上昇が過電流遮断ステージ20によって確認された場合、安全のためにスイッチ9が直ちに開放され、実験は停止される。本実施形態によれば、高電圧パルスは、あらかじめ設定された時間(数マイクロ秒)後に終了し、その後、第2のパルスが直ちに中断なく続く。このため、ステップ48において、第1の半導体スイッチ9の開放直前に第2の半導体スイッチ10はすでに閉鎖されているため、両方のパルス間の中断なしの移行が生じる。短い時間間隔で両方の高電圧スイッチ9、10が同時に閉鎖され、ダイオード17が、記憶装置7から記憶装置8へとより高電圧が印加されるのを阻止する。半導体スイッチ10は次いで、あらかじめ設定された電荷Qがキュベットに流れるまで(過電流遮断ステージ22によって最大電流を超えない限り)開放し続ける。このため、ステップ49において、キュベットを流れる電流が所定の時間間隔(例えば、1ms)で測定および積分される。あらかじめ設定された電荷に到達次第(照会50参照)、スイッチ10が開放し、実験は終了する。記憶装置8の容量は、第2のパルスの持続時間中に電圧が段階的にあるいはゆっくり低下するように選択される。障害により、記憶装置がほぼ完全に放電したのにも関わらず、依然としてあらかじめ設定された所望の電荷に到達しない場合においても、適切に選択された時間制限を超えた後に操作を中断することができる。
2 調整ユニット
3 制御ユニット
4 電圧供給ユニット
5 HV電源
6 HV電源
7 記憶装置
8 記憶装置
9 パワー半導体
10 パワー半導体
11 分離ステージ
12 分離ステージ
13 HVスイッチ
14 制御ユニット
15 キュベット接続部
16 抵抗
17 ダイオード
18 キュベット接続部
19 抵抗
20 過電流遮断ステージ(過電流切り替えステージ)
21 スイッチ
22 過電流遮断ステージ(過電流切り替えステージ)
23 スイッチ
30 スイッチキー
31 表示要素
32 LED
33 コネクタ
34 カードリーダ
35 転換スイッチ
36 変換装置(変換ステージ)
37 整流器
38 電圧制御装置
39 制御ステージ
40 変換装置ステージ
41 ソルダパッド
42 ソルダパッド
43 パルス監視ステージ
44 51ステップまで
Claims (15)
- 核酸、ペプチド、タンパク質および/またはその他の生体活性分子を電流によって真核細胞の細胞核に導入し、その場合に少なくとも1つの電圧パルスを細胞に供給する方法であって、
電圧パルスによって供給される電荷量を、少なくとも1つの選択可能な時間間隔で測定し、その場合に、あらかじめ設定された所望の電荷量と実際に供給された電荷量との比較を行い、電圧パルスが所望の電荷量に到達した時点あるいは所望の電荷量を超過した時点で電圧パルスを停止することを特徴とする方法。 - キャパシタ電圧(U 1 )を伴う第1のパルスを細胞に供給した後、中断なしにキャパシタ電圧(U 2 )を伴う少なくとも1つの第2のパルスを供給することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 電荷供給量を、対応する記憶装置(7、8)の通常の電荷と残留電荷との差から決定することを特徴とする請求項1または2に記載の方法。
- 電界強度が2〜10[kV/cm]、持続時間が10〜100[μs]、かつ電流密度が少なくとも2[A・cm -2 ]である第1のパルスを細胞に印加した後、中断なしに電流密度が2〜14[A・cm -2 ]で最大持続時間が100[ms]である第2のパルスをも細胞に供給することを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 供給電荷を決定する時間間隔を、第1のパルスおよび/または好ましくは第2のパルスまたはさらに別の各パルスの電荷の供給と同時に指定することを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 第2のパルスのスイッチオン時間(T 2 )が、所望の電荷量と、測定時間までに供給された実際の電荷量との比較を行うことによって指定され、所望の電荷量に到達した時点で終了することを特徴とする請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 実際の電荷量を決定するために1[msec]の測定サイクルを選択し、その場合に、時間(T 2 )の間にキャパシタ電圧が指数関数的に低下し、パルスが規定電荷量(Q 2 )に到達した時点でパルスを停止することを特徴とする請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 1つの第1のパルスおよび/または第2のパルスを発生させた後、少なくとも1つのあらかじめ定められた時間間隔後に、流れる電流を測定し、前記電流が定格値を超過する場合または定格値に満たない場合、電荷供給量を一定に保持するためにパルスの持続時間を再調整することを特徴とする請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 1つの第1のパルスおよび/または第2のパルスを発生させた後、少なくとも1つのあらかじめ定められた時間間隔後に、流れる電流を測定し、前記電流が定格値を超過する場合または定格値に満たない場合、エラーメッセージが生じることを特徴とする請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 1つの第1のパルスおよび/または第2のパルスを誘発した後、少なくとも1つのあらかじめ定められた時間間隔後に、流れる電流を測定し、前記電流が定格値を超過する場合または定格値に満たない場合、定格値を再調整することを特徴とする請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- パルスのあらかじめ選択された設定パラメータ(U 1 、T 1 、I 2 、T 2 、K 2 )を、手作業あるいはコード入力により入力することを特徴とする請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
- 第1のパルスおよび第2のパルスに対する過電流遮断を実行することを特徴とする請求項1〜11のいずれかに記載の方法。
- (U 2 )の計算に用いられるキュベットの抵抗Rを、パワー半導体(9、19)を起動する前に抵抗測定によって決定することを特徴とする請求項1〜12のいずれかに記載の方法。
- (U 2 )の計算に用いられるキュベットの抵抗Rをあらかじめ設定することを特徴とする請求項1〜12のいずれかに記載の方法。
- パルスのあらかじめ選択された設定パラメータ(U 1 、T 1 、I 2 、T 2 、K 2 、R)を、メモリーカードを介して読み取ることを特徴とする請求項1〜14のいずれかに記載の方法。
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