MXPA03009666A - Disposicion de circuitos para introducir acidos nucleicos y otras moleculas biologicamente activas al nucleo de celulas eucarioticas superiores usando corriente electrica. - Google Patents

Abstract

La invencion se relaciona con una novedosa disposicion de circuitos para electrotransfeccion o electrofusion, que permite el transporte de ADN y/u otras moleculas biologicamente activas al nucleo de eucarioticas superiores o la fusion de celulas, independientemente de la division celular y con baja mortalidad celular.

Description

DISPOSICIÓN DE CIRCUITOS PARA INYECTAR ÁCIDOS NUCLEICOS Y OTRAS MOLÉCULAS BIOLÓGICAMENTE ACTIVAS AL NUCLEO DE CÉLULAS EUCARIÓTICAS SUPERIORES POR MEDIO DE CORRIENTE ELÉCTRICA ¦ CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con una configuración de circuitos para introducir ácidos nucleicos, péptidos, proteínas y/u otras moléculas biológicamente activas al núcleo celular de células eucarióticas por medio de corriente eléctrica o para el tratamiento mediante corriente eléctrica de células, derivados celulares, partículas subcelulares y/o vesículas, que consiste al menos de dos dispositivos de almacenamiento para cantidades de carga eléctrica, cada uno abastecido por una fuente de energía de alto voltaje que tienen por lo menos un semiconductor de energía para transferir las cantidades de carga presentes en los dispositivos de almacenamiento a una suspensión en una cubeta y por lo menos un dispositivo de control que controla el semiconductor de energía.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Puesto que el sitio de acción del ADN eucariótico es el núcleo celular, .el ADN suministrado desde el exterior tiene que entrar al núcleo a fin de ser leído. Los métodos de transfección convencionales sólo efectúan el transporte de ADN al citoplasma a través de la membrana celular. Debido a que la membrana nuclear se disuelve de manera temporal durante la división celular de las células eucarióticas superiores, el ADN puede introducirse pasivamente al núcleo para que puedan expresarse las proteínas que codifica. Sólo las moléculas muy pequeñas de ADN (oligonucleótidos) se pueden difundir con libertad a través de los poros de la membrana nuclear. Para la transfección eficaz de células en reposo o en división lenta,' es necesario generar condiciones que permitan entrar moléculas más grandes de ADN al núcleo a través de la membrana celular, en suficiente cantidad. La disposición de circuitos que aquí se describe hace posible lo anterior en células eucarióticas superiores.

ESTADO DE LA TÉCNICA Desde hace tiempo se tiene conocimiento de que se puede introducir ADN a las células a partir de una solución tampón con la ayuda de corriente eléctrica. Sin embargo, las disposiciones de circuitos para electroporación hasta ahora descritas, tienen como base el transporte del ADN al citoplasma de las células eucarióticas superiores y así la expresión del ADN transfectado depende de la disolución de la membrana nuclear durante la división celular. Ninguna de las disposiciones de circuitos para electroporación hasta ahora conocidas incluye la introducción del ADN al núcleo de células eucarióticas superiores específicamente por medio de corriente eléctrica. Por lo tanto,' no se tiene conocimiento de una disposición de circuitos para electrotransfección optimizado para el transporte eléctrico al núcleo. La Patente de los Estados Unidos No. 4,750,100 de Bio-Rad Laboratories, Richmond, USA (1986) , describe la estructura de un equipo específico que puede proporcionar un máximo de 3000 V a un máximo de 125 A por descarga del capacitor . La Patente de los Estados Unidos No. 5,869,326 (Genetronics , Inc., San Diego, USA, 1996) describe la estructura de un equipo específico mediante el cual se pueden generar dos, tres o una pluralidad de pulsos utilizando dos fuentes de corriente separadas. Sin embargo, no se reclama o se muestra que estos pulsos tengan un efecto que vaya más allá del transporte del ADN al citoplasma. La Patente de los Estados Unidos No. 6,008,038 y la solicitud de patente europea EP 0 866 123 Al (Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburgo, 1998) describen un dispositivo con el cual se pueden generar pulsos cortos de 10 a 500 µß y un máximo de 1.5 kV pero tampoco se dan indicaciones respecto a que ciertas condiciones pudieran dar lugar al transporte del ADN al núcleo. Ninguna de las disposiciones de circuitos hasta ahora conocidas tiene las cualidades óptimas que permitan que el ADN y/u otras moléculas biológicamente activas se transporten al núcleo de la célula de manera eficaz y con baja mortalidad celular. El objetivo de la invención es proporcionar una disposición de circuitos que permita que el ADN y/u otras moléculas biológicamente activas se transporten al núcleo de la célula de manera eficaz y con baja mortalidad celular .

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Con el fin de lograr el objetivo de conformidad con la invención, se dispone que el primer dispositivo de almacenamiento esté cargado con un voltaje (??) fijado previamente como un parámetro y el segundo dispositivo de almacenamiento esté cargado con un voltaje U2 = R x I2 x 2/ donde R es la resistencia de la cubeta y la suspensión contenida en la misma, I2 es la corriente deseada y K2 es un valor de corrección en el que están consideradas las propiedades de la cubeta y en donde se puede transferir a la célula con el voltaje del capacitor ("¾) del dispositivo de almacenamiento, al menos un primer pulso durante un tiempo fijado previamente (Ti) mediante el control de un semiconductor de energía. En un aspecto del desarrollo de la invención se dispone que sin interrupción también se pueda aplicar al menos un segundo pulso a la cubeta con el voltaje del capacitor (U2) .del dispositivo de almacenamiento,, mediante el control de un semiconductor de energía, en donde al menos en un intervalo de tiempo seleccionable, la cantidad de carga suministrada se pueda medir con el dispositivo de monitoreo, en donde la cantidad de carga deseada que se fija previamente, se compara con la cantidad de carga real suministrada y al alcanzar o exceder la cantidad de carga deseada se bloquea el semiconductor de energía. Además de la posibilidad de determinar la cantidad de carga suministrada con el flujo de corriente del dispositivo de almacenamiento, como alternativa, la cantidad de carga deseada preestablecida se compara con la cantidad de carga real suministrada en un intervalo de tiempo y al alcanzar o exceder la cantidad de carga deseada se bloquea el semiconductor de energía. En este caso, dependiendo de la forma del pulso utilizado y del número de pulsos, es posible predefinir en forma individual el intervalo de tiempo que se puede seleccionar para la determinación, por ejemplo, para determinar la cantidad de carga suministrada durante el primero o cada uno de los pulsos siguientes . La cantidad de carga suministrada se puede determinar mediante la diferencia entre la carga original de al menos uno de los dispositivos de almacenamiento y la carga residual.' En este caso, es posible que según el número de pulsos utilizados, más de uno de los dos o más dispositivos de almacenamiento se use . como en modo de circuito, en donde cada dispositivo de almacenamiento está asignado por lo menos a una fuente de energía de alto voltaje, a un dispositivo de monitoreo y a un semiconductor de energía para transferir la cantidad de carga a la cubeta que contiene la suspensión de células.

Para la transferencia del pulso se dispone que el primer semiconductor de energía transfiera un pulso de 2-10 kV/cm con una duración de 10 - 100 |ixs y una densidad mínima de corriente de 2 A*cm"2 y sin interrupción, que el segundo semiconductor de energía transfiera un pulso que tiene una densidad de corriente de 2 - 14 A«cm"2 y una duración máxima de 100 ms . El intervalo de tiempo para determinar la cantidad de carga suministrada puede entonces especificarse con el suministro de un primer y/o de preferencia un segundo o cada pulso adicional. De preferencia, se monitorea la cantidad de carga suministrada del segundo pulso, en donde el tiempo "switch-on" (T2) del segundo pulso puede especificarse al comparar la cantidad de carga deseada con la cantidad real de carga suministrada en el tiempo de medición y que termina cuando se alcanza la cantidad de carga deseada y en donde se realiza un ciclo de medición de 1 mseg para determinar la cantidad de carga real, en donde durante el tiempo (T2) el voltaje del capacitor disminuye exponencialmente y el semiconductor de energía se puede bloquear al alcanzar la cantidad de carga especificada (Q2) . Como alternativa, es posible que después de al menos un intervalo de tiempo predeterminado posterior a la activación de un primer y/o segundo pulso, se mida el flujo de corriente y si excede o decae con respecto a un valor deseado, la duración del pulso pueda reajustarse con el fin de que la cantidad de carga permanezca constante . En otra alternativa, es posible que después de al menos un intervalo de tiempo predeterminado posterior a la activación de un primer y/o segundo pulso, se mida el flujo de corriente y si excede o decae con respecto a un valor deseado, se genere un mensaje de error que avise al usuario del dispositivo. También es posible que después de al menos un intervalo de tiempo predeterminado posterior a la activación de un primer y/o segundo pulso, se mida el flujo de corriente y si excede o decae con respecto a un valor deseado, éste se reajuste. Con el fin de determinar cualquiera de las constantes necesarias, en especial de la cubeta utilizada con la suspensión celular, se dispone que se haga una medición preliminar de la resistencia de la cubeta con la suspensión de células. Los otros parámetros de pulso necesarios, de preferencia se preseleccionan en forma manual o si es necesario se especifican al introducir un código. También es posible utilizar datos recuperables mediante un lector de tarjeta. Al mismo tiempo, el lector de tarjeta también se puede emplear para almacenar el perfil de tiempo del voltaje aplicado a la cubeta o el flujo de corriente a través de la cubeta, con fines de documentación, para uno o una pluralidad de procesos de suministro de pulsos en una tarjeta de memoria de las que se encuentran disponibles en el comercio. De preferencia, esta tarjeta de memoria se utiliza al mismo tiempo para almacenar los parámetros de pulso que se establecen. Como resultado de la regulación del suministro de pulsos con el circuito, la transferencia de la cantidad de carga prevista, se monitorea de manera confiable y ventajosa al menos para un pulso y se puede lograr una transferencia controlada y dependiente de la muestra de una cantidad de carga preestablecida, asi como un monitoreo controlado para evitar cualquier daño a las células presentes en la muestra. Para mayor seguridad del usuario y de las muestras, se dispone que se prevea un corte de sobrecorriente para el primero y cada uno de los siguientes pulsos. El corte de sobrecorriente permite que el pulso de alto voltaje se interrumpa en cualquier momento en caso que se rebasen los valores límite preestablecidos. El pulso de alto voltaje de 2 a 10 kV/cm descrito, es adecuado para crear las condiciones en las que el ADN pueda introducirse al . núcleo de la célula independientemente de la división celular. Con el fin de que exista poco daño celular, este pulso se limita entre 10 y un máximo de 200 µß, de preferencia 10 - 50 ¿s . Esto es suficiente para lograr una transfección independiente de la división celular. Por ejemplo, se encontró que un solo pulso corto de alto voltaje es óptimo para la transfección de células endoteliales procedentes del cordón umbilical. Otro pulso de corriente de intensidad de campo menor o de intensidad o densidad de corriente menores pero de mayor duración, que continúe sin interrupción, influye en la eficiencia de la transfección. Debido a la densidad de corriente significativamente menor, este pulso puede persistir durante más tiempo sin provocar daño celular. La densidad de corriente óptima o la duración del segundo pulso se obtienen dependiendo del tipo de célula y de su sensibilidad. Los pulsos así combinados son óptimos, por ejemplo, para fibroblastos dérmicos humanos primarios, melanocitos o varias células sanguíneas humanas . En experimentos en los que se utilizaron diferentes líneas celulares y sistemas de expresión, se demostró lo siguiente: mientras mayor es la densidad de corriente del segundo pulso, mayor es la influencia en la velocidad -de transfección, es decir, el porcentaje de células transfectadas . Mientras menor es la densidad de corriente, más se logra que el segundo pulso transporte ADN puro a las células ya transfectadas por el primer pulso. El nivel de expresión de las células transfectadas se incrementa al aumentar la duración del pulso, pero no la fracción de células transfectadas . Con el fin de mantener un control celular específico y preciso de la velocidad de transfección, el nivel de expresión y la vitalidad celular, tendrá que controlarse la duración del pulso y la densidad de corriente del segundo pulso. Con el fin de tener un control preciso del pulso realmente suministrado a la suspensión celular, en una modalidad preferida, se controla la cantidad de carga suministrada. Para controlar la intensidad o la densidad de corriente mediante un voltaje seleccionable del capacitor de la unidad de almacenamiento, la resistencia de la cubeta y la suspensión contenida en la misma, se tiene que predefinir al inicio. Se encontró que cuando se . utilizan electrodos de aluminio, la resistencia de las cubetas varía durante el pulso debido a procesos electroquímicos. Esta variación se considera en un valor de corrección predefinido específico del pulso. De este modo, las formas de pulso precisas para el segundo pulso, se pueden predeterminar utilizando U2 = R x I2 x K*2, controlando la carga, en donde U2 es el voltaje capacitor con el cual se carga. el dispositivo de almacenamiento, R es la resistencia de la cubeta y la suspensión celular contenida en la misma, I2 es la corriente deseada y K2 es el valor de corrección específico del pulso. En una modalidad de la invención, la resistencia óhmica R de la cubeta se puede medir directamente antes de comenzar el suministro del pulso, aplicando una prueba de voltaje y considerándola en el cálculo del voltaje U2. Puesto que la resistencia que se determina antes del suministro del pulso está sometida a mayores fluctuaciones que la resistencia durante el suministro del pulso, supuestamente como consecuencia de procesos electroquímicos, se han encontrado ventajas en predefinir la resistencia R para calcular el voltaje U2 del capacitor como un parámetro. En una modalidad preferida de la invención, la resistencia de la cubeta se mide antes de comenzar el suministro del pulso y sin considerarlo, a fin de determinar si queda dentro de una ventana de resistencia predeterminada. Si la resistencia medida queda fuera de esta ventana, se registra como falla y no se libera el suministro del pulso.

Para todo tipo de célula se pueden establecer las condiciones óptimas de velocidad de transfección, intensidad de transfección y vitalidad celular. En una modalidad preferida de la disposición de circuitos, se pueden seleccionar la intensidad.de campo y la duración del primer pulso y la intensidad inicial de corriente o la densidad de corriente y la duración empírica del segundo pulso y se pueden establecer de una manera muy simple las condiciones óptimas a través de un código para varios tipos de células. La disposición de circuitos se puede usar con ventajas para la transfección de células eucarióticas en división o en reposo. Del mismo modo, la disposición de circuitos también es adecuada para la transfección de células primarias, por ejemplo, células sanguíneas humanas, células precursoras pluripotenciales provenientes de sangre humana, fibroblastos humanos primarios, células endoteliales , células musculares o melanocitos; · también puede utilizarse para fines de diagnóstico o para la fabricación de productos medicinales para terapia génica e -vivo . La disposición de circuitos según la invención también es adecuada, por ejemplo, para electrofusión, es decir, los métodos que utilizan corriente eléctrica para fusión de las células, derivados celulares, partículas subcelulares y/o vesículas, en donde, por ejemplo, como primer paso las células, derivados celulares, partículas subcelulares y/o vesículas se suspenden a una densidad adecuada en una solución acuosa, después la suspensión se transfiere a una cubeta y por último se aplica un voltaje eléctrico a los electrodos de la cubeta y se genera una corriente a través de la suspensión. Como alternativa, por ejemplo, se pueden fusionar células adherentes, derivados celulares, partículas subcelulares y/o vesículas o también células adherentes con células suspendidas, derivados celulares, partículas subcelulares o vesículas. La disposición de circuitos que aquí se describe genera altas intensidades de campo de 2 a 10 kv/cm las cuales tienen como efecto que el ADN o las moléculas biológicamente activas puedan entrar al núcleo independientemente de la división celular. Estas intensidades de campo son mucho más altas que las que normalmente se utilizan para electroporacion y también más altas que las suficientes para abrir los poros de la membrana celular (en promedio 1 kV/cm según Lurquin, 1997, Mol. Biotechnol. 7, 5). La materia de la invención es entonces una disposición de circuitos para implementar un método que permita introducir ácidos nucleicos, péptidos, proteínas y/u otras moléculas biológicamente activas al núcleo celular de eucarióticas superiores utilizando corriente eléctrica, en el que la introducción al núcleo se logra mediante un pulso que tiene una intensidad de campo 2 a 10 veces mayor que la suficiente para abrir los poros de la membrana celular y una duración mínima de 10 y una densidad de corriente de al menos 2 A-cirf2. La introducción de ácidos nucleicos, péptidos, proteínas y/u otras moléculas biológicamente activas al núcleo celular se puede lograr mediante un pulso de 2 a 10 kV/cm, de preferencia 3 a 8 kV/cm, en donde el pulso tiene una longitud máxima de 200 µ3. La disposición de circuitos está diseñada de tal manera que al primer pulso le puede seguir sin interrupción un flujo de corriente con una densidad de corriente de 2 A'cnf2 hasta un máximo de 14 A*cm"2, de preferencia hasta de 5 A»cm~2, con una longitud de 1 ms hasta un máximo de 100 ms, de hasta 50 ms . Puesto que la disposición de circuitos hace posible la transfección sin tomar en cuenta la división celular, también se pueden transfectar las células en división, las células primarias en reposo o en división incipiente . En otras modalidades preferidas las células eucarióticas superiores incluyen fibroblastos humanos primarios, células endoteliales y melanocitos.

Las células eucarióticas transfectadas mediante el uso de la disposición de circuitos según la invención, también se pueden usar con fines analíticos y de diagnóstico para producir un producto farmacéutico para terapia génica ex-vivo. La disposición de circuitos según la invención permite lograr la transfección independiente de la división celular y de este modo acelerar considerablemente los experimentos de transfección. En los experimentos de transfección que utilizan vectores de expresión, se puede hacer un análisis según el promotor y la proteína expresada incluso a unas pocas horas posteriores a la transfección. El concepto "moléculas biológicamente activas" se refiere a péptidos, proteínas, polisacáridos , lípidos o combinaciones o derivados de estas moléculas, siempre que las mismas desarrollen afinidad biológica en la célula. Los tampones de electroporación que tienen alta fuerza iónica y alta capacidad amortiguadora son muy adecuados para utilizarse con la disposición de circuitos según la invención. Se puede utilizar el siguiente protocolo para introducir ácidos nucleicos al núcleo celular de células eucarióticas : 1 x 105 - 1 x 107 células y hasta 10 g de ADN se incuban en 100 µ? de tampón de electroporación en una cubeta que tiene un espacio interelectrodos de 2 mm, durante 10 min. a temperatura ambiente y luego se transfectan en las condiciones según la invención. Después de lo anterior y de inmediato las células se lavan fuera de la cubeta con 400 µ? de medio de cultivo celular y se incuban durante 10 min. a 37°C. Luego, las células se depositan en un medio de cultivo celular a 37°C. Las cubetas adecuadas son las que se encuentran comercialmente disponibles para electroporación de procariotes, que tienen por ejemplo, un espacio interelectrodos de 1 ó 2 mm. La evidencia de que los ácidos nucleicos se introducen a la célula independientemente de la división celular, se puede obtener analizando las células que no se han dividido entre la transfección y el análisis. Esto se lleva a cabo por un lado mediante la transfección de células no divididas, por ejemplo, células de sangre periférica humana y por el otro para las células en división, mediante un análisis realizado pocas horas después de la transfección en un momento en el que a lo sumo se ha dividido una fracción de las células. Además de las abreviaturas de uso general, se utilizan las siguientes: FACS Clasificación celular activada por fluorescencia FCS Suero fetal de bovino PBMC Células mononucleares de sangre periférica PE Ficoeritrina Ejemplos Los siguientes ejemplos son ilustrativos .de la invención pero no deben considerarse como restrictivos.

Ejemplo 1 Transíección de células T citotóxicas provenientes de sangre humana Se transfectaron células mononucleares recién preparadas sin estimular (no divididas) provenientes de sangre periférica humana (PBMC) con un vector que codifica para la cadena pesada de proteína MHC clase 1 de ratón H-2Kk. Se colocaron 5 x 10s células junto con 5 g ADN vector en un amortiguador con una- capacidad (48 mM x pH"1) y alta fuerza iónica (280 mM) a temperatura ambiente en una cubeta que tiene un espacio interelectrodos de 2 mm y se transfectaron mediante un pulso de 1000 V con una duración de 100 ¿US, seguido de un flujo de corriente con una densidad de corriente de 5 A-cm-2 y 40 ras . Después y de inmediato, las células se lavaron fuera de la cubeta utilizando 400 µ? de medio de cultivo, se incubaron durante 10 minutos a 37°C y luego se transfirieron a una caja de cultivo con medio precalentado . Después de incubar durante 24 h, las células se incubaron sucesivamente con anticuerpo anti-H-2 k acoplado con dioxigenina y también con anticuerpo Cy5- acoplado con dioxigenina, anti-CD8 acoplado con PerCP, se identificaron células T citotóxicas humanas y se analizaron por medio de un citómetro de flujo (FACScalibur, Becton Dickinson) . El número de células muertas se determinó mediante tinción con yoduro de propidio. Como se muestra en la Figura 1, 74.3% de las células vivas expresan el antigeno H-2Kk que corresponde a una eficiencia de transfeccion muy alta.

Ejemplo 2 Transfeccion de células del tallo hematopoyéticas humanas (CD34) Células CD34 positivas se enriquecieron previamente a partir de PBMC recién preparadas como en el Ejemplo 1 por clasificación celular magnética. Respectivamente 1 x 104 células CD34 positivas se mezclaron con 1 x 106 PBMCs, se colocaron junto con 5 g de ADN vector de expresión H-2Kk- en un amortiguador de alta capacidad (54 mM x pH"1) y alta fuerza iónica (260 mM) a temperatura ambiente en una cubeta que tiene un espacio interelectrodos de 2 mm y se transfectaron mediante un pulso de 1000 V con una duración de 100 µß , seguido de un flujo de corriente con una densidad de corriente de 4 ?·aa"2 y 20 ms. Inmediatamente después, las células se lavaron fuera de la cubeta utilizando 400 µ? de medio de cultivo, se incubaron durante 10 minutos a 37°C y luego se trans irieron a una caja de cultivo con medio precalentado. Después de incubar durante 16 h, las células se incubaron sucesivamente con anticuerpo anti-H-2Kk- acoplado con ficoeritrina y también con anticuerpo anti-CD34 acoplado con APC, se identificaron células del tallo hematopoyéticas humanas y se analizaron por medio de un citómetro de flujo (FACScalibur, Becton Dickinson) . El número de células muertas se determinó mediante tinción con yoduro de propidio. Como se muestra en la Figura 2, 66.7% de las células expresan el antígeno H-2Kk que corresponde a una eficiencia de transfección muy alta.

Ejemplo 3 Transfección de fibroblastos dérmicos neonatales humanos (NHDF-Neo) Fibroblastos dérmicos neonatales humanos (5 x 105 células) junto con 5 ¿g de ADN vector de- expresión H-2Kk se colocaron en un amortiguador de alta capacidad (67 mM x pH"1) y alta fuerza iónica (380 mM) a la temperatura ambiente én una cubeta que tiene, un espacio interelectrodos de 2 mm y se transfectaron mediante un pulso de 1000 V con una duración de 100 /AS, seguido de un flujo de corriente con una densidad de corriente, de 6 A«cirf2 y duración de 33 ms . Inmediatamente después, las células se lavaron fuera de la cubeta utilizando 400 µ? de medio de cultivo, se incubaron durante 10 minutos a 37°C y luego se transfirieron a una caja de cultivo con medio precalentado. Después de incubar durante 5 h, las células se incubaron con anticuerpo anti-H-2Kk acoplado a Cy5 y se analizaron por medio de un citómetro de flujo (FACScalibur, Becton Dickinson) . El número de células muertas se determinó mediante tinción con yoduro de propidio . Como se muestra en la Figura 3, 93% de las células expresan el antígeno H-2Kk que corresponde a una eficiencia de transfección muy alta.

Ejemplo.4 Transfección de melanocxtos neonatales humanos Melanocitos neonatales humanos (2.5 x 105 células) junto con 5 µg de ADN vector de expresión H-2Kk-se colocaron en un amortiguador de alta capacidad (54 mM x pH_1) y alta fuerza iónica (260 mM) a la temperatura ambiente en una cubeta que tiene un espacio interelectrodos de 2 mm y se transfectaron mediante un pulso de 1000 V con una duración de 100 µß , seguido de un flujo de corriente con una densidad de corriente de 6 A'Cirf2 y duración de 33 ms . Inmediatamente después, las células se lavaron fuera de la cubeta utilizando 400 µ? de medio de cultivo, se incubaron durante 10 minutos a 37°C y luego se transfirieron a una caja de cultivo con medio precalentado . Después de incubar durante 5 h, las células se incubaron con anticuerpo anti-H-2Kk acoplado a Cy5 y se analizaron por medio de un citómetro de flujo (FACScalibur, Becton Dickinson) . El número de células muertas se determinó mediante tinción con yoduro de propxdio. Como se muestra en la Figura 4, 75.1% de las células expresan el antígeno H-2Kk que corresponde a una eficiencia de transfección muy alta .

Ejemplo 5 Transfección de células endoteliales humanas provenientes del cordón umbilical (HÜVEC) Células endoteliales humanas provenientes del cordón umbilical (1 x 106 células) junto con 5 µg de ADN vector de expresión H-2Kk- se colocaron en un amortiguador de alta capacidad (67 mM x pET1) y alta fuerza iónica (378 mM) a la temperatura ambiente en una cubeta que tiene un espacio interelectrodos de 2 mm y se transfectaron mediante un pulso de 1000 V con una duración de 100 µ3.

Inmediatamente después, las células se lavaron fuera de la cubeta utilizando 400 µ? de medio de cultivo, se incubaron durante 10 minutos a 37°C y luego se transfirieron a una caja de cultivo con medio precalentado. Después de incubar durante 5 h, las células se incubaron con anticuerpo anti-H-2Kk acoplado a Cy5 y se analizaron por medio de un citómetro de flujo (FACScalibur, Becton Dickinson) . El número de células muertas se determinó mediante tinción con yoduro de propidio. Como se muestra en la Figura 5, 49.7% de las células expresan el antigeno H-2Kk que corresponde a una eficiencia de transfección muy alta.

Ejemplo 6 Transfección de la línea celular humana 562 Células 562 (1 x 105 células) junto con 5 de ADN vector de expresión H-2Kk se colocaron en un amortiguador de alta capacidad (24 m x pH"1) y alta fuerza iónica (254 mM) a la temperatura ambiente en una cubeta que tiene un espacio interelectrodos de 2 mm y se transfectaron mediante un pulso de 1000 V con una duración de 100 /zs, seguido de un flujo de corriente con una densidad de corriente de 8 A*crrf2 y duración de 10 ms . Inmediatamente después, las células se lavaron fuera de la cubeta utilizando 400 µ? de medio de cultivo, se incubaron durante 10 minutos a 37°C y luego se transfirieron a una caja de cultivo con medio precalentado . Después de incubar durante 4 h, las células se incubaron con anticuerpo anti-H-2Kk acoplado a Cy5. y se analizaron por medio de un citómetro de flujo (FACScalibur, Becton Dickinson) . El número de células muertas se determinó mediante tinción con yoduro de propidio. Como se muestra en la Figura 6, 69.5% de las células expresan el antígeno H-2Kk que corresponde a una eficiencia de transfección muy alta.

Ejemplo 7 Eficiencia de transfeccion e intensidad de fluorescencia promedio de células CHO transfectadas con Cycle3-GFP Con la finalidad de investigar la eficiencia de transfeccion y la intensidad de fluorescencia promedio de las células transfectadas en función de la cantidad de carga que fluye en el segundo pulso, respectivamente 7 x 105 células CHO junto con 5 //g de ADN vector Cycle3-GFP se colocaron en un amortiguador de electroporación en una cubeta que tiene un espacio interelectrodos de 2 mm y se transfectaron mediante un pulso de 1000 V con una duración de 10 µ3, seguido de otros pulsos que difieren en la variación de la intensidad de corriente o en la densidad de corriente y el tiempo de pulso. Después de cultivar durante 5 horas, las células se analizaron mediante un citómetro de flujo. La Figura 7 muestra la eficiencia de transfeccion determinada en función de la integral de la corriente con respecto al tiempo de pulso (la cantidad de carga Q) . Se encontró que la eficiencia de transfeccion se puede incrementar al aumentar la intensidad de corriente (circuios abiertos) . Por otro lado, con un incremento en el tiempo de pulso para la misma intensidad de corriente no se observa un aumento considerable de la eficiencia (círculos cerrados) . La intensidad de fluorescencia (brillantez) de las células transfectadas se incrementa con un aumento en la cantidad de carga Q y se llega a la saturación con valores de Q altos . No se encontraron diferencias importantes si el incremento en Q se logra al aumentar la intensidad de corriente (círculos abiertos) o al aumentar la longitud del pulso (círculos cerrados) .

Ejemplo 8 Eficiencia de transfección e intensidad de fluorescencia promedio de células Jurkat transfectadas con Cycle3-GFP Con la finalidad de investigar la eficiencia de transfección y la intensidad de fluorescencia promedio de células transfectadas en función de la cantidad de carga que fluye en el segundo pulso, respectivamente 4 x 105 células Jurkat junto con 5 g de ADN vector Cycle3~GFP se colocaron en un amortiguador de electroporación en una cubeta que tiene un espacio interelectrodos de 2 mm y se transfectaron mediante un pulso de 1000 V con una duración de 10 /¿s, seguido de otros pulsos que difieren en la variación de la intensidad de corriente o en la densidad de corriente y el tiempo de pulso. Después de cultivar durante 5 horas, las células se analizaron mediante un citómetro de flujo. La Figura 8 muestra la eficiencia de transfección determinada en función de la integral de la corriente con respecto al tiempo de pulso (la cantidad de carga Q) . Igual que cuando se utilizaron las células CHO, Se encontró que la eficiencia de transfección se puede, incrementar al aumentar la intensidad de corriente (circuios abiertos) . Por otro lado, con un incremento en el tiempo de pulso para la misma intensidad de corriente no se observa un aumento considerable en la eficiencia (círculos cerrados) . La intensidad de fluorescencia (brillantez) de las células transfectadas se incrementa con un aumento en la cantidad de carga Q y se llega a la saturación con valores de Q altos. No se encontraron diferencias importantes si el incremento en Q se logra al aumentar la intensidad de corriente (círculos abiertos) o al aumentar la longitud del pulso (círculos cerrados) .

Ej emplo 9 Eficiencia de transfección e intensidad de fluorescencia promedio de células Jurkat transfectadas con H-2Kk Con la finalidad de investigar la eficiencia de transfección y la intensidad de fluorescencia promedio de las células transfectadas en función de la cantidad de carga que fluye en el segundo pulso, respectivamente 1 x 106 células Jurkat junto con 2 µg de ??? vector de expresión H-2Kk se colocaron en un amortiguador de electroporación en una cubeta que tiene un espacio interelectrodos de 2 mra y se transíectaron mediante un pulso de 1000 V con una duración de 10 ß, seguido de otros pulsos que difieren en la variación de la intensidad de corriente o en la densidad de corriente y el tiempo de pulso. Después de cultivar durante 3.5 horas, las células se incubaron con anti-H2Kk acoplado con Cy5 y se analizaron mediante un citómetro de flujo. La Figura 9 muestra la eficiencia de transfección determinada en, función de la integral de la corriente con respecto al tiempo de pulso (la cantidad de carga Q) . Se encontró que la eficiencia de transfección se puede incrementar al aumentar la intensidad de corriente (círculos abiertos) . Por otro lado, con un incremento en el tiempo de pulso para la misma intensidad de corriente no se observa un aumento considerable de la eficiencia (circuios cerrados) . La intensidad de fluorescencia (brillantez) de las células transfectadas se incrementa con un aumento en la cantidad de carga Q y se llega a la saturación con valores de Q altos. No se encontraron diferencias importantes si el incremento en Q se logra al aumentar la intensidad de corriente (círculos abiertos) o al aumentar la longitud del pulso (círculos cerrados) . La invención se comprenderá más al hacer referencia a las siguientes figuras. En las figuras : La Figura 1 muestra una transfeccion de células T citotóxicas provenientes de sangre humana, la Figura 2 muestra una transfección de células precursoras pluripotenciales provenientes de sangre humana, la Figura 3 muestra una transfección de fibroblastos dérmicos neonatales humanos, la Figura 4 muestra una transfección de melanocitos dérmicos neonatales humanos, la Figura 5 muestra una transfección de células endoteliales humanas provenientes del cordón umbilical, la Figura 6 muestra una transfección de la línea celular K562 (analizadas 4 horas después de la transfección) , la Figura 7 muestra una investigación de la eficiencia de transfección en función de la intensidad de corriente, él tiempo de pulso y cantidad de carga y de la expresión de intensidad en función de la cantidad de carga, en el experimento se usa la línea celular CHO, la Figura 8 muestra una investigación de la eficiencia de transfección en función de la intensidad de corriente, el tiempo de pulso y cantidad de carga y de la expresión de intensidad en función de la cantidad de carga, en el experimento se usa la línea celular Jurkat, la Figura 9 muestra una investigación de la eficiencia de transfección en función de la intensidad de corriente, el tiempo de pulso y cantidad de carga y de la expresión de intensidad en función de la cantidad de carga, en el experimento se usa la línea . celular Jurkat y la proteína marcadora de superficie H-2Kk, la Figura 10 muestra un diagrama de bloque de un circuito electroporador, la Figura 11 muestra un diagrama de circuito de un panel de control, la Figura 12 muestra un diagrama de circuito de un panel de lector de tarjeta, la Figura 13 muestra un diagrama de circuito de un panel de una fuente de energía, la Figura 14 muestra un diagrama de circuito de una fuente de energía HV, la Figura 15 muestra un diagrama de circuito de un interruptor HV, la Figura 16 muestra un diagrama de circuito de un sistema de regulación de corriente, la Figura 17 muestra un diagrama de circuito de un sistema de reconocimiento instantáneo, la Figura 18 muestra un diagrama de circuito de un sistema de control, y la Figura 19 es un diagrama de flujo que explica la secuencia de los procesos de suministro de pulsos. La Figura 1 muestra el análisis citométrico de flujo de células PBMC que se han transfectado con un vector de expresión H-2Kk. Las células se incubaron sucesivamente con anticuerpo anti-H-2Kk acoplado con dioxigenina · y anticuerpo antidioxigenina acoplado con Cy5, y también con anticuerpo anti-CD8 acoplado con PerCP, se identificaron células T citotóxicas humanas y se analizaron por medio de un citómetro de flujo (FACScalibur, Becton Dickinson) . (FL-2, FL-3 = canal de fluorescencia 2, 3; SSC = dispersión lateral, FSC = dispersión frontal, PerCP = proteina peridinin clorofila, CD = racimo de diferenciación) . La Figura 2 el análisis por citometría de flujo de células del tallo CD34 positivas enriquecidas a partir de células PBMC que han sido transfectadas con el vector de expresión H-2Kk. Las células se incubaron sucesivamente con anticuerpo anti-H-2Kk acoplado a ficoeritrina y también con un anticuerpo anti-CD34 acoplado a APC, se identificaron células del tallo hematopoyéticas humanas CD34 positivas y se analizaron por medio de un citómetro de flujo (FACScalibur, Becton Dickinson) . (FL-1, FL-3 = canal de fluorescencia 1, 3; SSC = dispersión lateral, FSC dispersión frontal, PE = ficoeritrina, APC aloficocianina, CD = racimo de diferenciación) . La Figura 3 muestra el análisis por citometría de flujo de fibroblastos dérmicos neonatales humanos (NHDF-Neo) , que se hablan transfectado con el vector de expresión H-2Kk. Las células se incubaron con anticuerpo anti-H-2Kk acoplado a Cy5 y se analizaron por medio de un citómetro de flujo (FACScalibur, Becton Dickinson) . (FL-1, FL-2, FL-3 .= canal de fluorescencia 1, 2, 3; SSC = dispersión lateral, FSC = dispersión frontal) . La Figura 4 muestra el análisis por citometría de flujo de melanocitos neonatales humanos ( HEM-Neo) , que se hablan transfectado con el vector de expresión H-2Kk. Las células se incubaron con anticuerpo anti-H-2Kk acoplado a Cy5 y se analizaron por medio de un citómetro de flujo (FACScalibur, Becton Dickinson) . (FL-1, FL-2, FL-3 = canal de fluorescencia 1, 2, 3; SSC = dispersión lateral, FSC = dispersión frontal) . La Figura 5 muestra el análisis por citometría de flujo de células endoteliales provenientes del cordón umbilical (HUVEC) , que se habían transfectado con el vector de expresión H-2Kk. Las células se incubaron con anticuerpo anti-H-2Kk acoplado a Cy5 y se analizaron por medio de un citómetro de flujo (FACScalibur, Becton Dickinson) . (FL-1, FL-2, FL-3 = canal de fluorescencia 1, 2, 3; SSC = dispersión lateral, FSC = dispersión frontal). La Figura 6 muestra el análisis por citometría de flujo de la línea celular humana K562 que se había transfectado con el vector de expresión H-2Kk. Las células se incubaron con anticuerpo anti-H-2Kk acoplado a Cy5 y se analizaron por medio de un citómetro de flujo (FACScalibur, Becton Dickinson) . (FL-1, FL-2, FL-3 = canal de fluorescencia 1, 2, 3; SSC = dispersión lateral, FSC = dispersión frontal) . La Figura 7 muestra una · representación gráfica de la eficiencia de transfección de células CHO y la intensidad de fluorescencia promedio (brillantez) de las células positivas en función de la cantidad de carga Q que ha fluido. Las células CHO se transfectaron con el vector de expresión Cycle3-GFP y se analizaron después de cinco horas por medio de un citómetro de flujo (FACScalibur, Becton Dickinson) . Los círculos cerrados corresponden a un incremento gradual en el tiempo de pulso para la misma intensidad de corriente (2 A) o densidad de corriente (4 A*cm~2), los círculos abiertos corresponden a un incremento en la intensidad de corriente . La Figura 8 muestra una representación gráfica de la eficiencia de transfección de células Jurkat y la intensidad de fluorescencia promedio (brillantez) de las células positivas en función de la cantidad de carga Q que ha fluido. Las células Jurkat se transfectaron con el vector de expresión Cycle3-GFP y se analizaron después de cinco horas por medio de un citómetro de flujo (FACScalibur , Becton Dickinson) . Los circuios cerrados corresponden a un incremento gradual en el tiempo de pulso para la misma intensidad de corriente (2 A) o densidad de corriente (4 A'crrf2), los circuios abiertos corresponden a un incremento en la intensidad de corriente. La Figura 9 muestra una representación gráfica de la eficiencia de transfección de células Jurkat y la intensidad de fluorescencia promedio (brillantez) de las células positivas en función de la cantidad de carga Q que ha fluido. Las células Jurkat se transfectaron con el vector de expresión H-2Kk, se incubaron después de 3.5 horas con anticuerpo H-2Kk acoplado a Cy5 y se analizaron después de cinco horas por medio de un citómetro de flujo (FACScalibur, Becton Dickinson) . Los círculos cerrados corresponden a un incremento gradual en el tiempo de pulso para la misma intensidad de corriente (2 A) o densidad de corriente (4 A«cirf2), los circuios abiertos corresponden a un incremento en la intensidad de corriente. La Figura 10 muestra un diagrama de bloque del electroporador 1 con los componentes individuales necesarios. Estos comprende una unidad de ajuste 2, una unidad de control 3 a la cual está conectada una fuente de tensión 4 asi como al menos dos fuentes de energía HV 5, 6 con dispositivos de almacenamiento 7, 8 y dos semiconductores de energía 9, 10 dispuestos para el suministro de pulsos. Los semiconductores de energía 9, 10 se controlan mediante elementos divisores de potencial 11, 12 con la unidad de control 3 por medio de un interruptor HV 13 y una unidad reguladora 14. Los dispositivos de almacenamiento 7, 8 se conectan directamente a las entradas de los semiconductores de energía 9, 10, los dispositivos de almacenamiento 7, 8 pueden estar constituidos por uno o una pluralidad de capacitores dependiendo de la fuerza de campo y de la duración del pulso. Por ejemplo, el semiconductor de energía semiconductor 9 puede estar formado por un IGBT y el semiconductor de energía 10 de un MOSFET. Sin embargo, el término "semiconductor de energía" incluirá otros componentes electrónicos o unidades de componentes mediante los cuales los voltajes y corrientes que se modificarán dentro del alcance de la invención puedan modificarse en los tiempos requeridos. La salida del IGBT está directamente conectada a la conexión de la cubeta 15 mientras que la salida de la MOSFET 10 está conectada a través de una resistencia 16 y un diodo 17 a la conexión de la cubeta 15 de tal manera que ningún pulso pueda fluir hacia atrás a través del segundo semiconductor de energía 10 si los dos semiconductores de energía 9, 10 se controlan en forma simultánea. Para este fin el diodo 17 se conecta a la conexión de la cubeta 15 en el lado del cátodo. La segunda conexión de cubeta 18 se conecta a tierra por medio de la resistencia 19. La resistencia 19 consta de una derivación de medición que permite medir la caída de voltaje y alimentar a un elemento de interrupción de sobrecorriente 20. El elemento de interrupción de sobrecorriente 20 puede interrumpir el suministro de pulsos por medio de un interruptor 21 a través del elemento divisor de potencial 11 y el interruptor HV 13 mientras que un segundo elemento interrupción de sobrecorriente 22 interrumpe un sistema de control de la unidad reguladora 14 para el MOSFET 10 a través de un interruptor 23. El voltaje aplicado por medio de la resistencia 16 se alimenta al segundo elemento de interrupción de sobrecorriente 22 con el fin de que la corriente se interrumpa en el caso de que se rebase la corriente máxima. Puesto que la resistencia 16 está colocada directamente en el circuito de alto voltaje, el interruptor 23 está ubicado después del elemento divisor de potencial 12 para que no puedan entrar pulso de alto voltaje a la unidad de control 3 y el personal que lleva a cabo las operaciones no corra riesgos . En el caso del elemento de interrupción de sobrecorriente 20, la resistencia de medición de baja resistencia 19 queda detrás de las conexiones de cubeta 15, 18 y está conectada a tierra para que se pueda eliminar la transmisión de pulsos de alto voltaje. Dependiendo del uso al que se destine el electroporador 1, se pueden utilizar uno o una pluralidad de fuentes de energía de alto voltaje 5, 6 con los correspondientes dispositivos de almacenamiento 7, 8 y los elementos divisores de potencial necesarios 11, 12 y el interruptor HV 13 o la unidad reguladora 14 para controlar los . semiconductores de energía 9, 10. Los dispositivos de almacenamiento 7, 8 están provisto de uno o una pluralidad de capacitores con la capacidad y la tensión disrruptiva requeridas para que se pueda almacenar una cantidad de carga adecuadamente alta y se transfiera a la conexión de cubeta 15. Las siguientes Figuras 11 a 18 muestran diagramas de circuito de los componentes individuales del diagrama de bloque . La Figura 11 muestra un diagrama de circuito del panel de control para introducir las señales establecidas, en donde éstas pueden preseleccionarse por medio de un interruptor de botón 30 y verificarse en forma visual con los elementos de visualización 31. Los LED 32 indican cuando el equipo está listo para iniciar la operación. Los parámetros necesarios se preparan en el circuito y se transmiten a través del conector 33 al sistema de control, según la Figura 1 . La Figura 12 muestra un diagrama de circuito de un lector de tarjeta 34 por medio del cual se leen los parámetros preestablecidos para ciertas substancias biológicas y se transmiten a la unidad de control tal como se muestra en la Figura 14. La Figura 13 muestra un diagrama de circuito de la fuente de energía la cual en esencia consiste de un inversor de .corriente 35 de 150/230 volts, un elemento transformador 36 con embobinado lateral primario y conductor de voltaje y elementos reguladores secundarios para producir los voltajes de operación necesarios. Con este propósito se inserta una pluralidad de reguladores de voltaje 38 después del rectificador 37. La Figura 14 muestra un diagrama de circuito de las dos fuentes de energía HV 5, 6 que se pueden identificar el diagrama de bloque. Las dos fuentes de energía HV 5, 6 se hacen funcionar con el voltaje ¾ proveniente de la unidad de alimentación, en donde cada elemento regulador 39 recibe una señal de control U3on, U5on del sistema de control y el voltaje aplicado Ui carga el dispositivo de almacenamiento 7, 8 que consta de una pluralidad de capacitores, en modo de pulsación a través del elemento transformador 40. El voltaje deseado se transmite a través de las señales de salida U3sense, U5sense del sistema de control tal como se muestra en la Figura 15. El voltaje U5 del dispositivo de almacenamiento 7 se alimenta a un interruptor HV 13 como se muestra en la Figura 15 y el voltaje U3 del dispositivo de almacenamiento 8 se alimenta a un elemento regulador de corriente tal como se muestra en la Figura 16. La Figura 15 muestra un diagrama de circuito del interruptor HV 13. El interruptor HV 13 recibe la señal HIN generada por el elemento de monitoreo de pulso tal como se muestra en la Figura 16 para controlar el primer semiconductor de energía 9. Este transmite el voltaje aplicado U5 a un atenuador (" solder pad") 41 para que el cable HV se conecte a la cubeta que a su vez se conecta a tierra a través de un segundo atenuador ("soldeir pad") 42 por medio de la resistencia de medición de baja resistencia. Un elemento de corte de sobrecorriente 20 emite una señal de control para la unidad de control tal como se muestra en la Figura 18 para desconectar el semiconductor de energía 9 en caso de que una elevación de corriente rebase el máximo preestablecido. El primer atenuador 41 se conecta también a la salida de voltaje U del elemento regulador de corriente de la Figura 12 con el fin de que se pueda lograr un flujo de corriente controlado a la cubeta para suministrar una cantidad específica de carga posterior al pulso de alto voltaje. El elemento regulador de corriente de la Figura 16 recibe las señales de control de la unidad de control de la Figura 18 por medio de un elemento divisor de potencial y regula el voltaje U3 aplicado al dispositivo de almacenamiento 8 para el voltaje U4 suministrado a través del atenuador 41. En este caso, según la- invención, se utiliza la regulación de Q o la regulación de corriente, por lo cual la carga en el dispositivo de almacenamiento 8 se determina a intervalos de tiempo predefinidos, por ejemplo, de un milisegundo y la cantidad de carga suministrada se determina considerando la carga original . La Figura 18 muestra un diagrama de circuito de la unidad de control 3 que toma en cuenta los valores manuales preestablecidos o los valores introducidos a través del lector de tarjeta 34 y controla la unidad reguladora de corriente 14, tal como se muestra en la Figura 16, en función de las señales de monitoreo adicionales. Sin embargo, el interruptor HV 13 según se muestra en la Figura 15, se controla después de activar manualmente el pulso de alto voltaje a través de un elemento de monitoreo de pulso 43 tal como se muestra en la Figura 17 de manera que después de que el pulso HV se ha suministrado, la cantidad de carga se pueda monitorear mediante la unidad reguladora de corriente 14 como se muestra en la Figura 16. Por un lado los parámetros de pulso se pueden preestablecer en forma manual y por el otro a través de un lector de tarjeta de manera que cuando un pulso se activa manualmente por medio de los elementos electrónicos de regulación presentes, se pueda suministrar un pulso de alto voltaje con o sin monitoreo del flujo de corriente y en su caso una señal de corriente continua con monitoreo de la cantidad de carga, a través de una segunda fuente de energía. HV. La Figura 19 muestra un diagrama de flujo esquemático de la secuencia de operación de un proceso de suministro de pulso controlado por la unidad de control 3 (véase la Figura 10) , según una modalidad preferida de la invención. Primero, los parámetros de pulso requeridos se predefinen en forma manual o por la lectura de una tarjeta de memoria (no se muestra) . Después del inicio del proceso (por ejemplo, al accionar el correspondiente botón de activación) , se mide la resistencia óhmica de la cubeta primero al aplicar brevemente un voltaje bajo (por ejemplo, 12 V) a las conexiones de la cubeta 15, 18 y después se mide la corriente (por ejemplo, durante 2 ms) en la etapa 44. Con relación a la interrogación 45 se verifica si esta resistencia queda dentro de una ventana predefinida. En caso contrario, se interrumpe el proceso que sigue. En la presente modalidad de la invención, la resistencia medida no se utiliza para calcular el voltaje de carga U2. Si la resistencia queda dentro de la ventana predefinida, los dispositivos de almacenamiento 7, 8 se cargan a los voltajes predefinidos ¾ y U2 en la etapa 46. Cuando se obtienen los voltajes de carga deseados, se interrumpe el suministro de las fuentes de energía HV 5, 6. Durante el suministro de pulso siguiente, no se efectúa recarga de los dispositivos de almacenamiento. El suministro de pulso para el pulso de alto voltaje comienza en la etapa 47 al cerrar el interruptor semiconductor 9. Como resultado, una corriente relativamente alta fluye a través de la celda. Un aumento excesivamente brusco de la corriente se detecta a través del elemento de corte de sobrecorriente 20, como resultado y por seguridad de inmediato se abre el interruptor 9 y se interrumpe la rutina. En esta modalidad el pulso de alto voltaje se termina después de un tiempo predefinido de unos pocos microsegundos después de los cuales sigue de inmediato el segundo pulso y sin interrupción. Con este fin en la etapa 48 el segundo interruptor semiconductor 10 ya está cerrado poco antes de que se abra el primero interruptor semiconductor 9 para que haya una transición sin interrupción entre los dos pulsos . En el corto intervalo en el que los dos interruptores de alto voltaje 9, 10 se cierran en forma simultánea, el diodo 17 impide que cualquier voltaje mayor fluya del dispositivo de almacenamiento 7 al dispositivo de almacenamiento 8. El interruptor semiconductor 10 permanece abierto (siempre que la corriente máxima no sea rebasada por un elemento de corte de sobrecorriente 22) hasta que la carga predefinida Q haya fluido a través de la cubeta. Con este propósito, en la etapa 49 la corriente que fluye a través de la cubeta se mide y se integra en intervalos de tiempo predefinidos (por ejemplo, 1 ms) . En cuanto se obtiene la carga predefinida (véase la interrogación 50) , el interruptor 10 se abre y la rutina se termina. La capacidad del dispositivo de almacenamiento 8 se selecciona de manera que el voltaje disminuya gradual o lentamente durante el segundo pulso. Si como resultado de alguna falla, aún no se obtiene la carga deseada predefinida aun cuando el dispositivo de almacenamiento esté casi descargado por completo, el proceso también se interrumpirá después de que se haya rebasado un tiempo límite adecuadamente seleccionado.

Lista de referencia 1 Electroporador 2 Unidad de ajuste 3 Unidad de control 4 Unidad de alimentación de voltaje 5 Fuente de energía HV 6 Fuente de energía HV 7 Dispositivo de almacenamiento 8 Dispositivo de almacenamiento 9 Semiconductor de energía 10 Semiconductor de energía 11 Elemento divisor de potencial 12 Elemento divisor de potencial 13 Interruptor HV 14 Unidad reguladora 15 Conexión de la cubeta 16 Resistencia 17 Diodo 18 Conexión de cubeta 19 Resistencia 20. Elemento de corte de sobrecorriente 21 Interruptor 22 Elemento de corte de sobrecorriente 23 Switch 30 Botón interruptor 31 Elemento de visualización 32 LED 33 Conector 34 Lector de tarjeta 35 Inversor de corriente 36 Transformador 37 Rectificador 38 Regulador de voltaje 39 Elemento regulador 40 Elemento transformador 41 Atenuador 42 Atenuador 43 Elemento de monitoreo de pulso 44 a 51 etapas

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES ; 1. Una disposición de circuitos para introducir ácidos nucleicos, péptidos, proteínas y/o otras moléculas biológicamente activas al núcleo celular de células eucarióticas por medio de corriente eléctrica, o para el tratamiento de células, derivados de células, partículas subcelulares y/o vesículas con corriente eléctrica, que consiste de al menos dos dispositivos de almacenamiento para cantidades de carga eléctrica, cada una provista por un suministro de energía de alto voltaje, cada una tiene al menos un semiconductor de energía para transferir las cantidades de carga presentes a los dispositivos de almacenamiento a una suspensión en una cubeta, y al menos un dispositivo de control, para controlar el semiconductor de energía, en donde el primer dispositivo de almacenamiento está cargado con un voltaje (Ux) fijado previamente como un parámetro, y el segundo dispositivo de almacenamiento está cargado con un voltaje U2 = R x I2 x K2, en donde R es la resistencia de la cubeta y la suspensión contenida en la misma, I2 es la corriente deseada y 2 es un valor de corrección que toma en cuenta las propiedades de la cubeta, y en donde el dispositivo de control está diseñado para controlar los semiconductores de energía de una manera que al menos un primer pulso con el voltaje del capacitor (Ua) del dispositivo de almacenamiento se puede transferir a la cubeta por un tiempo fijado previamente ( a) controlando un semiconductor de energía, en donde la cantidad suministrada de carga de al menos un pulso en al menos un intervalo de tiempo seleccionable se puede medir por el dispositivo de monitoreo, y en donde una cantidad de carga deseada fijada previamente se compara con la cantidad de carga actual suministrada, y al alcanzar o exceder la cantidad de carga deseada, el semiconductor de energía se bloquea. 2. La disposición de circuitos según la reivindicación 1, caracterizada porque, sin interrupción al menos un segundo pulso con el voltaje del capacitor (U2) del dispositivo de almacenamiento se puede transferir también a la cubeta controlando un semiconductor de energía. 3. La disposición de circuitos según la reivindicación 1 o la 2, caracterizada porque la cantidad de carga suministrada se determina de la diferencia entre la carga original del dispositivo de almacenamiento correspondiente y la carga residual. 4. La disposición de circuitos según cualquiera o varias de las reivindicaciones 1-3, caracterizada porque el primer semiconductor de energía transfiere un pulso de 2-10 kv/cm que tiene una duración de 10-100 µ? , y una densidad de corriente de al menos 2 A-cm"2 a la cubeta, y el segundo semiconductor de energía transfiere un pulso que tiene una densidad de corriente de al menos 2-14 ?-crrf2 y una duración máxima de 100 ms sin interrupción. 5. La disposición de circuitos según cualquiera o varias de. las reivindicaciones 1-4, caracterizada porque el intervalo de tiempo para determinar la carga suministrada se puede especificar como sincronizado con el suministro de la carga del primero y/o preferentemente un segundo de cada pulso adicional . 6. La disposición de circuitos según cualquiera o varias de las reivindicaciones 1-5, caracterizada porque el tiempo de aplicación de energía (T2) del segundo pulso se puede especificar comparando la cantidad de carga deseada con la cantidad actual de carga suministrada por el tiempo de medición, y termina cuando se alcanza la cantidad de carga deseada. 7. La disposición de circuitos según cualquiera o varias de las reivindicaciones 1-6, caracterizada porque para determinar la cantidad de carga actual se proporciona un ciclo de medición de 1 mseg, en donde durante el tiempo (T2) el voltaje del capacitor disminuye exponencialmente, y al alcanzar la cantidad de carga especificada (Q2) el semiconductor de energía se puede bloquea . 8. La disposición de circuitos según cualquiera o varias de las reivindicaciones 1-7, caracterizada porque después de al menos un intervalo de tiempo determinado previamente después de suministrar un primero y/o segundo pulso se mide la corriente que fluye, y si ésta excede o si cae por debajo de un valor deseado, la duración del pulso se puede reajustar para mantener constante la cantidad de carga suministrada. 9. La disposición de circuitos según cualquiera o varias de las reivindicaciones 1-7, caracterizada porque después de al menos un intervalo de tiempo determinado previamente después de suministrar un primero y/o segundo pulso se mide la corriente que fluye, y si ésta excede o si cae por debajo de un valor deseado, se da un mensaje de error . 10. La disposición de circuitos según cualquiera o varias de las reivindicaciones 1-7, caracterizada porque después de al menos un intervalo de tiempo determinado previamente después de suministrar un primero y/o segundo pulso se mide la corriente que fluye, y si ésta excede o si cae por debajo de un valor deseado, se reajusta el valor deseado. 11. La disposición de circuitos según cualquiera o varias de las reivindicaciones 1-10, caracterizada porque los parámetros de ajuste seleccionados previamente del pulso (Ux, ?, I2, T2, 2) se pueden introducir manualmente o introduciendo un código . 12. La disposición de circuitos según cualquiera o varias de las reivindicaciones 1-11, caracterizada porque se proporciona un corte de sobrecorriente para el primer y segundo pulso. 13.. La disposición de circuitos según cualquiera, o varias de las reivindicaciones 1-12, caracterizada porque la resistencia R de la cubeta usada para calcular U2 se puede medir por una medición de resistencia antes de controlar un semiconductor de energía. 1 . La disposición de circuitos según cualquiera o varias de las reivindicaciones 1-12, caracterizada porque la resistencia R de la cubeta usada para calcular U2 se determina previamente. 15. La disposición de circuitos según cualquiera o varias de las reivindicaciones 1-14, caracterizada porque los parámetros de ajuste seleccionados previamente del pulso (!¼., Tlt I2, T2, 2, R) se pueden registrar vía una tarjeta de memoria. 16. La disposición de circuitos según cualquiera o varias de las reivindicaciones 1-15, caracterizada porque se proporciona un dispositivo para medir y registrar el perfil de tiempo del voltaje aplicado a la cubeta y/o la corriente que fluye a través de la cubeta, y en donde el perfil de tiempo medido del voltaje y/o corriente se puede almacenar en una tarjeta de memoria. 17. El uso de la disposición de circuitos según cualquiera de las reivindicaciones 1-16, para la transfección de células eucarióticas en reposo o en división . 18. El uso de la disposición de circuitos según cualquiera de las reivindicaciones 1-16, para la transfección de células primarias. 19. El uso de la disposición de circuitos según cualquiera de las reivindicaciones 1-16, para la transfección de células sanguíneas humanas . 20. El uso de la disposición de circuitos según cualquiera de las reivindicaciones 1-16, para la transfección de células precursoras pluripotenciales de sangre humana. 21. El uso de la disposición de circuitos según cualquiera de las reivindicaciones 1-16, para la transfección de fibroblastos primarios humanos, células eridoteliales , células, musculares o melanocitos. 22. El uso de la disposición de circuitos según cualquiera de las reivindicaciones 1-16, para la fusión de células, derivados de células, partículas subcelulares y/o vesículas . 23. El uso de células eucarióticas transfectadas con la disposición de circuitos según cualquiera de las reivindicaciones 1-16, para propósitos analíticos o diagnósticos . 24. El uso de células eucarioticas transfectadas con la disposición de circuitos según cualquiera de las reivindicaciones 1-16, para la manufactura de un producto farmacéutico para terapia génica ex vivo .