JP4689967B2 - 顕微鏡画像撮影装置 - Google Patents

Description

この発明は、例えば蛍光プローブによる生細胞等の標本の生態機能観察に適用される顕微鏡画像撮影装置に関する。

近年、光学顕微鏡を用いて蛍光プローブによるイオン濃度、膜電位などの可視化が行われるようになっており、例えば標本として神経細胞などの生態機能観察、特に動的挙動の観察が行われるようになっている。
このような動的挙動を観察するものとしては、顕微鏡写真撮影装置が知られている（例えば、特許文献１参照）。
特開２０００−２７５５３９号公報

しかしながら、このような従来の顕微鏡写真撮影装置は、標本の動的な挙動に合わせて写真を撮影する（静止画像を取得する）ものであり、標本の動的な挙動が静止してから微小時間経過した後にシャッタが切られるようになっているため、どうしても焦点位置がズレ、写真（静止画像）がぼやけてしまうといった問題点があった。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであり、動的な挙動を示す標本から鮮明な画像を得ることのできる顕微鏡画像撮影装置を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、この発明は、以下の手段を提供する。
本発明は、動的な挙動を示す標本を撮像する撮像手段と、前記標本の動的な挙動を検出する挙動検出手段と、該挙動検出手段により検出された前記標本の動的な挙動と前記撮像手段により撮像された前記標本の画像とを関連づけて記憶する画像記憶手段と、該画像記憶手段に記憶された前記標本の画像から前記標本の動的な挙動に基づいて、略静止状態にある標本の画像を抽出する静止状態画像抽出手段とを備える顕微鏡画像撮影装置を提供する。

この発明によれば、撮像手段により撮像された標本の画像と、挙動検出手段により検出された標本の動的な挙動とが、相互に関連づけられた状態で画像記憶手段に記憶される。標本の画像には標本の拍動や脈動、あるいは蠕動のような生理現象による動的な挙動の際に撮像された画像と、それらの画像の間に配される略静止状態の画像とが含まれる。標本が動いているか略静止状態にあるかの情報は、画像に関連づけて記憶されている標本の動的な挙動の情報に含まれているので、該標本の動的な挙動の情報をキーとして、標本が略静止状態にある画像のみを抽出することにより、ブレを抑えた標本の画像を取得することが可能となる。すなわち、本発明によれば、生きたままの標本を撮像してブレを抑えた鮮明な画像を得ることができる。

上記発明において、前記挙動検出手段が心電計であることが好ましい。
この発明によれば、標本の動的な挙動を心電計により周期的な波形として捉えることができるようになるので、その周期と位相を決定することにより略静止状態にある画像をより簡単に選択することができる。

上記発明において、前記標本上で光を走査するスキャナが設けられており、前記標本の動的な挙動に基づいて、前記スキャナが制御されるように構成されていることが好ましい。
この発明によれば、画像がいくつかのブロックに分割して取得されることとなり、一回に取得する画像領域を小さくすることができて、スキャナの走査範囲を狭めることができ、より鮮明な画像を得ることができる。

本発明によれば、動的な挙動を示す標本から鮮明な画像を得ることのできる顕微鏡画像撮影装置を提供することができる。

以下、本発明の第１実施形態に係る顕微鏡画像撮影装置について、図面を参照して説明する。
本実施形態に係る顕微鏡画像撮影装置１は、図１に示すように、光学ユニット２と、スキャンユニット３と、このスキャンユニット３に取り付けられた対物光学系４と、光学ユニット２およびスキャンユニット３を接続する光ファイバ５と、挙動検出手段６と、画像記憶手段７と、制御装置（静止状態画像抽出手段）８と、ディスプレイ９とを主たる要素として構成されたものである。

光学ユニット２は、レーザ光源部１０と、検出光学系１１とを備えている。
レーザ光源部１０は、半導体レーザからなるレーザ光源と、レンズとピンホールとからなるコリメート光学系と、ダイクロイックミラーとを備えている。
検出光学系１１は、ダイクロイックミラー１２と、ミラー１３と、光電子増倍管（撮像手段）１４と、アナログ−ディジタル変換器（ＡＤ）１５と、コントローラ１６と、バリアフィルタと、レンズと、共焦点ピンホールとを備えている。

スキャンユニット３は、光ファイバ５からの励起光を略平行にするコリメート光学系と、このコリメート光学系からの励起光を標本Ａの上で走査させる光走査部と、この光走査部からの励起光を中間像位置に結像させる瞳投影光学系とを備えている。
コリメート光学系は、このコリメート光学系を構成しているコリメートレンズを光軸方向に移動可能な位置調整機構を備えている。
また、光走査部は、直交する軸線回りに揺動可能な２枚のガルバノミラー（スキャナ）１７を備えており、コリメート光学系から発せられた平行光を２次元的に走査させることができるようになっている。
さらに、スキャンユニット３には、レーザ光源部１０からの励起光を標本Ａに導くとともに、標本Ａからの蛍光を検出光学系１１の光電子増倍管（Photomultiplier Tube）１４に導くためのダイクロイックミラー１８が設けられている。

対物光学系４は、瞳投影光学系において結像された励起光の中間像を標本Ａの上に再結像させるように構成されたものであり、瞳投影光学系によって、光走査部を構成している２つのガルバノミラー１７の中心位置近傍において焦点位置が共役となるように構成されたものである。

光ファイバ５は、前述したレーザ光源部１０から発せられた励起光を伝達する一方、標本Ａから発せられた蛍光を検出光学系１１まで導くものである。

これにより、標本Ａから発せられた蛍光は、対物光学系４、瞳投影光学系、光走査部、コリメート光学系、および光ファイバ５を経た後、光学ユニット２に収められた検出光学系１０の光電子増倍管１４によって検出されるようになっている。
光電子増倍管１４により検出された標本Ａの画像は、アナログ−ディジタル変換器１５によりディジタル信号に変換され、コントローラ１６および制御装置８を介して画像記憶手段７に出力されるようになっている。

挙動検出手段６は、標本Ａの動的な挙動（本実施形態では血管の脈動）を検出する脈動検出器１９と、アナログ−ディジタル変換器（ＡＤ）２０とを備えている。
標本Ａの脈動は、脈動検出器１９により図２の上に示すような波形データとして検出された後、アナログ−ディジタル変換器２０によりディジタル信号に変換され、制御装置８を介して画像記憶手段７に出力されるようになっている。

画像記憶手段７は、アナログ−ディジタル変換器１５から送られてきた画像データと、アナログ−ディジタル変換器２０から送られてきた脈動データとを関連づけた後、それらのデータを記憶しておくものである。
制御装置８は、画像記憶手段７に記憶されたデータのうち、脈動がない部分の画像データ、すなわち、図２の上に平坦で示す部分（図２の下に「とる」と示した部分）に対応する画像データ（いわゆる、略静止状態の標本Ａの画像）を抽出するとともに、抽出した画像データをディスプレイ９に出力するものである。
また、この制御装置８は、レーザ光源の波長制御、ダイクロイックミラーやフィルタ等の波長選択、波長分離素子の制御、検出光学系１１の光電子増倍管１４により受光された検出情報の解析および表示、光走査部の駆動制御等を行うようになっている。

これにより、ディスプレイ９の画面上に、標本Ａの脈動がないときの画像、すなわち、焦点距離のあった鮮明な画像（略静止状態にある画像）のみを映し出すことができる。

本発明に係る顕微鏡画像撮影装置の第２実施形態について、図３を用いて説明する。
本実施形態における顕微鏡画像撮影装置２１には、挙動検出手段として心電検出器（心電計）２６が設けられているという点で前述した第１実施形態のものと異なる。その他の構成要素については前述した実施形態のものと同じであるので、ここではそれら構成要素についての説明は省略する。
なお、前述した第１実施形態と同一の部材には同一の符号を付している。

心電検出器２６は、標本Ａの心臓の活動電位の時間的変化を記録するもので、心筋の興奮による活動電流を、空間的・時間的に合成された電位変化として、標本Ａの表面に貼付した電極２６ａを介して、図２の上に示すような波形データを得るものである。

このような心電検出器２６により得られた波形データ（すなわち、心電図）は、周期的な波形として表示されるため、その周期と位相を決定することにより略静止状態にある画像をより簡単に選択することができる。
その他の作用効果については第１実施形態のものと同じであるので、ここではその説明を省略する。

本発明に係る顕微鏡画像撮影装置の第３実施形態について、図４を用いて説明する。
本実施形態における顕微鏡画像撮影装置３１には、挙動検出手段として超音波検出器３６が設けられているという点で前述した第１実施形態のものと異なる。その他の構成要素については前述した実施形態のものと同じであるので、ここではそれら構成要素についての説明は省略する。
なお、前述した実施形態と同一の部材には同一の符号を付している。

超音波検出器３６は、超音波を利用した医学用診断装置で、パルス状の超音波により体内の組織構造の情報を得るものである。本実施形態では、超音波センサ３６ａを介して標本Ａの血流を計り、それを血管の脈動として検出するようにしている。
このようにしても、前述した実施形態と同様、図２の上に示すような波形データを得ることができる。

超音波検出器３６は、超音波を利用しているため、標本Ａへの有害な影響が少なく、安全に脈動による波形データを得ることができる。
その他の作用効果については第１実施形態のものと同じであるので、ここではその説明を省略する。

本発明に係る顕微鏡画像撮影装置の第４実施形態について、図５を用いて説明する。
本実施形態における顕微鏡画像撮影装置４１には、挙動検出手段として音検出器４６が設けられているという点で前述した第１実施形態のものと異なる。その他の構成要素については前述した実施形態のものと同じであるので、ここではそれら構成要素についての説明は省略する。
なお、前述した実施形態と同一の部材には同一の符号を付している。

音検出器４６は、標本Ａの脈動を音波という形式で検出するものである。本実施形態では、音センサ（エレクトレッド・コンデンサ・マイク：ECM）４６ａを介して標本Ａから発せられる脈の音（あるいは心音）を計り、それを脈動として検出するようにしている。
このようにしても、前述した実施形態と同様、図２の上に示すような波形データを得ることができる。

標本Ａから発せられる音を検出する音センサ４６ａは、前述した電極２６ａや超音波センサ３６ａのように標本Ａの表面に添付したり、あるいは密着用ジェルを介して密着させたりする必要がないので、脈動による波形データをより簡単に得ることができる。
その他の作用効果については第１実施形態のものと同じであるので、ここではその説明を省略する。

本発明に係る顕微鏡画像撮影装置の第５実施形態について、図６を用いて説明する。
本実施形態における顕微鏡画像撮影装置５１には、挙動検出手段として光干渉断層計５６が設けられているという点で前述した第１実施形態のものと異なる。その他の構成要素については前述した実施形態のものと同じであるので、ここではそれら構成要素についての説明は省略する。
なお、前述した実施形態と同一の部材には同一の符号を付している。また、図中の符号５２，５３，５４，５５，５７，５８はそれぞれ、コリメータレンズ、ミラー、ハーフミラー、レンズ、瞳投影レンズ、および対物レンズを示している。

光干渉断層計（Optical Coherence Tomography：以下、「OCT」という）５６は、光検出器５６ａと、低コヒーレンス光源５６ｂと、ファイバーカップラ５６ｃと、ミラー５６ｄとを主たる要素として構成されたものである。
低コヒーレンス光源５６ｂから出た光（干渉性の悪い光である低コヒーレンス光）は、ファイバーカップラ５６ｃで二つの光に分割され、それぞれの光は、ミラー５６ｄと標本Ａとに向かうようになっている。このとき、標本Ａ側から戻ってくる反射光には、標本Ａの表面で反射した光、物体内部の浅い位置で反射した光、あるいは物体内部の深部で反射した光などさまざまな位置からの反射光が含まれている。しかし、入射光が低コヒーレンス光であるため、干渉が観測される反射光は、ファイバーカップラ５６ｃからミラー５６ｄまでの距離をＬ、コヒーレンス長をΔＬとすると、ファイバーカップラ５６ｃからの距離がＬ±Δ１／２の位置に存在する反射面からの反射光のみになる。したがって、ファイバーカップラ５６ｃからミラーまでの距離を変えれば、その距離に対応した標本Ａ内反射面からの反射光のみを選択的に検出することができ、標本Ａ内部の任意の位置での反射率を求めることができる。このようにして求めた反射率の分布を映像化することにより標本Ａ内部の構造情報を可視化することが可能になる。
このような構造情報をもとにしても、前述した実施形態と同様、図２の上に示すような波形データを得ることができる。

OCT５６は、近赤外光を利用しているため、標本Ａへの有害な影響が少なく、安全に脈動による波形データを得ることができるとともに、マイクロメートルオーダーの高い分解能を有しており、さらに安価で装置の小型化に優れているという特徴を持っている。
また、このようなOCT５６を使用しても、第４実施形態のところで説明した音検出器４６同様、前述した電極２６ａや超音波センサ３６ａのように標本Ａの表面に添付したり、あるいは密着用ジェルを介して密着させたりする必要がないので、脈動による波形データをより簡単に得ることができる。
さらに、低コヒーレンス光源５６ｂの光軸とレーザ光源部１０の光軸とを共軸とすることができるので、装置の小型化を図ることができる。
その他の作用効果については第１実施形態のものと同じであるので、ここではその説明を省略する。

本発明に係る顕微鏡画像撮影装置の第６実施形態について、図７を用いて説明する。
本実施形態における顕微鏡画像撮影装置６１には、挙動検出手段としてスペックルを用いた面外変位計測装置６６が設けられているという点で前述した第１実施形態のものと異なる。その他の構成要素については前述した実施形態のものと同じであるので、ここではそれら構成要素についての説明は省略する。
なお、前述した実施形態と同一の部材には同一の符号を付している。

面外変位計測装置６６は、標本Ａの表面にレーザ光を照射するレーザ照射部６６ａと、標本Ａの表面上で散乱、反射することで生じたスペックルパターンを画像として捉えるカメラ６６ｂと、カメラ６６ｂで捉えられた画像、すなわち、スペックルの移動量から脈動量を検出して、脈動による波形データに変換する処理装置６６ｃとを有するものである。
このようにしても、前述した実施形態と同様、図２の上に示すような波形データを得ることができる。

このようなスペックルを用いた面外変位計測装置６６を使用しても、第４実施形態のところで説明した音検出器４６同様、前述した電極２６ａや超音波センサ３６ａのように標本Ａの表面に添付したり、あるいは密着用ジェルを介して密着させたりする必要がないので、脈動による波形データをより簡単に得ることができる。
また、レーザ照射部６６ａから発せられたレーザの跳ね返りを捉えるようにしているので、ノイズが少なく、より正確な波形データを得ることができる。
その他の作用効果については第１実施形態のものと同じであるので、ここではその説明を省略する。

本発明に係る顕微鏡画像撮影装置の第７実施形態について、図８を用いて説明する。
本実施形態における顕微鏡画像撮影装置７１には、直交する軸線回りに揺動可能な２枚のガルバノミラー１７の代わりに、一つのディジタル・マイクロミラー・デバイス（以下、「DMD」という）７７と、一枚のガルバノミラー１７とが設けられているとともに、光電子増倍管１４の代わりにCCD（Charge Coupled
Devices）７４が設けられているという点で前述した第１実施形態のものと異なる。その他の構成要素については前述した実施形態のものと同じであるので、ここではそれら構成要素についての説明は省略する。
なお、前述した実施形態と同一の部材には同一の符号を付している。また、図中の符号７２，７３はそれぞれ、シリンドリカルレンズ、および結像レンズを示している。

DMD（スキャナ）７７は、複数枚の微小ミラーがライン上に並べられたものであり、入射された光を線状に出射するものである。
CCD７４は、光（光子）の入力に応じて蓄電容量が変化する半導体素子（フォトダイオード）を用いた、光（画像）信号を電気信号に変換するものである。
また、これらDMD７７、CCD７４、およびガルバノミラー１７はそれぞれ、制御装置８によりその駆動等が制御されるようになっている。

このように光走査部にDMD７７を使用することにより、標本Ａの画像を高速で取得することができるとともに、より明るい画像を取得することができる。

本発明に係る顕微鏡画像撮影装置の第８実施形態について、図９を用いて説明する。
本実施形態における顕微鏡画像撮影装置８１には、スキャナとして使用するとともに共焦点ピンホールとして使用するDMD８７が設けられているという点で前述した第７実施形態のものと異なる。その他の構成要素については前述した実施形態のものと同じであるので、ここではそれら構成要素についての説明は省略する。
なお、前述した実施形態と同一の部材には同一の符号を付している。

このようにスキャナおよび共焦点ピンホールとして使用するDMD８７を配置することにより、標本Ａのコンフォーカル像を高速で取得することができるとともに、より明るい画像を取得することができる。

以上説明した実施形態において、スキャナを、例えば、図１０に示す各区間で、図１１に示すように制御することもできる。
すなわち、図１０に示す第一の波形Ｗ１とその次に現れる第二の波形Ｗ２との間において図１１の（１）に示すＡ画像を取得し、第二の波形Ｗ２とその次に現れる第三の波形Ｗ３との間において図１１の（２）に示すＢ画像を取得し、第三の波形Ｗ３とその次に現れる第四の波形Ｗ４との間において図１１の（３）に示すＣ画像を取得して、最後に図１１の（４）に示すような一つの画像をディスプレイ９に表示させることもできる。
言い換えれば、一つの画像をいくつかのブロックに分割して取得し、これら画像を最後に合成して一つの画像を得るようにすることもできる。

このようにすることにより、一回に取得する画像領域が小さくてすみ、スキャナの走査範囲が狭められることになるので、より鮮明な画像を得ることができるようになる。
また、動的挙動が早いために、一回の略静止状態の間に撮像可能な画像範囲が小さくなってしまう場合に、スキャナの動作範囲を制限して、より狭い範囲の画像のみを撮像することにしてもよい。

なお、本発明は上述した実施形態のものに限定されるものではなく、挙動検出手段としてレーザ測距器を用いることもできる。
また、挙動検出手段としては、標本Ａの動的な挙動、すなわち、血管の脈動、呼吸による肺の動き、胃腸の蠕動、心臓の鼓動等を検出できるものであればどの様なものであってもよく、種々の変形実施が可能である。

本発明の第１実施形態に係る顕微鏡画像撮影装置の概略構成図である。 挙動検出手段により得られる波形データを示す図である。 本発明の第２実施形態に係る顕微鏡画像撮影装置の概略構成図である。 本発明の第３実施形態に係る顕微鏡画像撮影装置の概略構成図である。 本発明の第４実施形態に係る顕微鏡画像撮影装置の概略構成図である。 本発明の第５実施形態に係る顕微鏡画像撮影装置の概略構成図である。 本発明の第６実施形態に係る顕微鏡画像撮影装置の概略構成図である。 本発明の第７実施形態に係る顕微鏡画像撮影装置の概略構成図である。 本発明の第８実施形態に係る顕微鏡画像撮影装置の概略構成図である。 スキャナの動かし方の一例を説明するための図である。 図２と同様、挙動検出手段により得られる波形データを示す図であって、図１０を説明するための図である。

符号の説明

１ 顕微鏡写真撮影装置
６ 挙動検出手段
７ 画像記憶手段
８ 制御装置（静止状態画像抽出手段）
１４ 光電子増倍管（撮像手段）
１７ ガルバノミラー（スキャナ）
２１ 顕微鏡写真撮影装置
２６ 挙動検出手段
３１ 顕微鏡写真撮影装置
３６ 挙動検出手段
４１ 顕微鏡写真撮影装置
４６ 挙動検出手段
５１ 顕微鏡写真撮影装置
５６ 挙動検出手段
６１ 顕微鏡写真撮影装置
６６ 挙動検出手段
７１ 顕微鏡写真撮影装置
７４ ＣＣＤ（撮像手段）
７７ ＤＭＤ（スキャナ）
８１ 顕微鏡写真撮影装置
８７ ＤＭＤ（スキャナ）
Ａ 標本

Claims (3)

1. 動的な挙動を示す標本を撮像する撮像手段と、
   前記標本の動的な挙動を検出する挙動検出手段と、
   該挙動検出手段により検出された前記標本の動的な挙動と前記撮像手段により撮像された前記標本の画像とを関連づけて記憶する画像記憶手段と、
   該画像記憶手段に記憶された前記標本の画像から前記標本の動的な挙動に基づいて、略静止状態にある標本の画像を抽出する静止状態画像抽出手段とを備えることを特徴とする顕微鏡画像撮影装置。
2. 前記挙動検出手段が心電計であることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡画像撮影装置。
3. 前記標本上で光を走査するスキャナが設けられており、前記標本の動的な挙動に基づいて、前記スキャナが制御されるように構成されていることを特徴とする請求項１または２に記載の顕微鏡画像撮影装置。

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