JP4634027B2

JP4634027B2 - ビタミンｄ様活性代替用剤

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Publication number: JP4634027B2
Application number: JP2003380652A
Authority: JP
Inventors: 英剛藤中; 純二中村; 大樹村瀬; 初美惣野; 久高小林
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2003-05-16
Filing date: 2003-11-11
Publication date: 2011-02-16
Anticipated expiration: 2023-11-11
Also published as: JP2005002090A

Description

本発明は、ビタミンＤ様活性を有し、ビタミンＤ類の代わりに医薬品や食品に配合することができるビタミンＤ様活性代替用剤に関する。

ビタミンＤ類としては、ビタミンＤのほか、活性型ビタミンＤ（１α，２５（ＯＨ）₂ビタミンＤ、１α，２４（ＯＨ）₂ビタミンＤ、１α（ＯＨ）ビタミンＤ）が知られている。現在、活性型ビタミンＤは皮膚疾患や副甲状腺、悪性腫瘍、骨などの疾患に対する治療剤として幅広く使用検討がなされている。例えば皮膚疾患の分野においては活性型ビタミンＤが尋常性乾癬に非常に有効であることが報告されている（非特許文献１）。尋常性乾癬とは、厚い白色あるいは銀白色の鱗屑を付着した紅斑が肘頭、膝蓋、頭部などを中心として全身皮膚に多発するという臨床症状を示す皮膚疾患である。また活性型ビタミンＤは、悪性腫瘍、特に前立腺癌、大腸癌、乳癌、血液性悪性腫瘍等に対して有効であると考えられている（非特許文献２）。それぞれ疫学的な調査からその発生や進行に活性型ビタミンＤの欠乏が関与しているとの報告もあり、効果の差異は悪性腫瘍の種類によってあるものの活性型ビタミンＤ投与によって一定の効果が挙げられている（非特許文献３）。

また、食餌性ビタミンＤの欠乏に陥ると血中のミネラル低下に伴うクル病が発症することは古くより知られており、活性型ビタミンＤは骨代謝疾患に対する治療薬としても使用されている。

ビタミンＤを多く含むキノコ類又はビタミンＤ本体と動物の肝臓及び腎臓のホモジェネートを加えることで活性型ビタミンＤ強化組成物を調製できる旨の報告もある（特許文献１及び２）。これらは、そのままでは一般に生理作用を発現しないビタミンＤに、肝臓や腎臓中に含まれるビタミンＤ活性化酵素を添加することで活性化ビタミンＤを合成しようとすることを意図している。しかし、上記臓器には活性型ビタミンＤを分解する２４−水酸化酵素も含まれている点や、様々な物質が入り混じるホモジェネートを基質であるビタミンＤに添加・インキュベートしただけという点などにおいて、効率的な活性型ビタミンＤ強化剤を提供するには問題が多い。

また、一方で活性型ビタミンＤの反復投与により、高カルシウム血症になることで体重減少などの副作用が起こりうることが知られており、使用に際しては更なる注意が必要である（非特許文献４）。

一方、糖リン酸エステルの生理作用については、pH緩衝作用（特許文献３）、輸液への応用（特許文献４）、カルシウム強化剤としての利用（特許文献５及び６）、赤血球保存剤への応用（特許文献７）、ヘキソースリン酸カルシウムを有効成分とする低カルシウム血症及び骨代謝異常症の予防治療剤（特許文献８）、糖リン酸エステルを含有する無機物質の消化管吸収促進剤（特許文献９）、糖リン酸エステル又はその塩からなるミネラル呈味改善剤（特許文献１０）が報告されている。しかし、これらの報告中に糖リン酸エステルがビタミンＤ様活性を有するか否かについての記載はない。
小林仁ら MB Derma. 2:53-62,1997 秋澤忠男ら:ビタミンD Update 2001, メディカルチュア,2001 Cummingham D. et al, Br. Med. J., 291:1153-1155(1985） Weber K. et al：J. Bone Miner. Res.,10(4). 639-651(2001) 特開平１０−２３６９７１号公報特開平１１−１５８０７４号公報特開昭６２−２４３６７５号公報特開平０２−２５０８２１号公報特開２００２−１４５８９３号公報特開２００２−２５３１７０号公報特開昭６２−１５８２２１号公報特開昭６４−２２号公報特開平２−２４９４６８号公報特開２００３−７９３３７号公報

このように従来のビタミンＤ、活性型ビタミンＤ及びそれらの誘導体には副作用が発生する等の問題がある。従って、本発明の目的は、活性型ビタミンＤと同様の作用を有し、副作用がなく安全に長期間投与可能な素材を提供することにある。

そこで本発明者は、活性型ビタミンＤの標的遺伝子の発現量を指標としてスクリーニングした。すなわち、活性型ビタミンＤは、標的細胞内のビタミンＤレセプター（ＶＤＲ）と結合し、さらにレチノイドＸレセプターとヘテロダイマーを形成する。次いでこの複合体が遺伝子上のビタミンＤ応答配列に結合することにより、この応答配列をプロモーターとして有するいくつかの遺伝子の転写が活性化することにより種々の生理作用を生じる（Ohyama Y. et al：J. Biol. Chem., 269, 10545-10550, 1994）。当該活性型ビタミンＤの標的遺伝子として２４−水酸化酵素、ＣＹＰ３Ａ、ＣａＴ１、カルビンディンＤ９Ｋ、カルビンディンＤ２８Ｋ、オステオカルシン、オステオポンチンなどが知られている。そこで、種々の化合物を用いて当該標的遺伝子の発現を亢進する成分のスクリーニングをしたところ、全く意外にも糖リン酸エステル又はその塩に優れた標的遺伝子発現亢進作用があり、これがビタミンＤ様活性代替用剤として有用であることを見出した。
すなわち、本発明は糖リン酸エステル又はその塩を有効成分とするビタミンＤ様活性代替用剤を提供するものである。

本発明によれば、安全に長期投与可能なビタミンＤ様活性代替用剤が提供できる。

本発明のビタミンＤ様活性代替用剤に用いられる糖リン酸エステルとしては、単糖リン酸エステル、すなわちヘキソースリン酸エステル又はペントースリン酸エステルが挙げられる。当該単糖リン酸エステルとしては、グルコース−１−リン酸、グルコース−６−リン酸、グルコース−１，６−二リン酸、マルトース−１−リン酸、フルクトース−１−リン酸、フルクトース−６−リン酸、ガラクトース−１−リン酸、ガラクトース−６−リン酸、ラクトース−１−リン酸、スクロース−１−リン酸等を挙げることができる。このうち、グルコース−１−リン酸、グルコース−６−リン酸、フルクトース−６−リン酸がより好ましい。

これらの糖リン酸エステルのうち、グルコース−１−リン酸は、糖代謝でのグリコーゲンからＴＣＡサイクルまでの解糖系における中間生成物であり、通常我々が摂取する食品中にも広く存在することが報告されている（Fisheries Science, 64(1),125-130,1998、 Anal Biochem, 176(2),449-456,1989）。また、グルコース−１−リン酸は、単回及び反復投与による毒性試験においても非常に高い安全性が多数報告されており（Fournier E.et al:Therapie,26(1):27-37,1971等）、医薬品のみならず食品分野においても安全に摂取できるものであることから特に好ましい。

また、これら糖リン酸エステルの塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マグネシウム塩等が挙げられる。このうちナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩は、水に対する溶解性が高いことからより好ましく、ナトリウム塩が特に好ましい。また、これらの糖リン酸エステル又はその塩は水和物であってもよい。

これらの糖リン酸エステルは、例えば特開昭６１−２２０９６号、特開平１−６３９５８９号、特開２００２−３００８９９号等に記載のように、固定化酵素法や菌体を用いた発酵法により安価かつ大量に製造することができる。本発明の腸管機能改善剤には、これらの製造法により得られ、単離精製した糖リン酸エステル又はその塩を用いてもよいが、発酵生産物をそのまま用いることもできる。

糖リン酸エステル又はその塩は、後記実施例に示すように、活性型ビタミンＤの標的遺伝子である２４−水酸化酵素、ＣＹＰ３Ａ及びＣａＴ１の発現量を顕著に亢進させ、ビタミンＤ様活性を有する。従って、糖リン酸エステル又はその塩はビタミンＤ様活性代替用剤として有用であり、ビタミンＤ様活性が必要な医薬や食品、例えば皮膚疾患、副甲状腺、悪性腫瘍、骨疾患等の予防又は治療用の医薬又は食品に使用できる。

本発明のビタミンＤ様活性代替用剤の剤型は、通常の経口投与用製剤であればよく、例えば粉末、錠剤、顆粒、散剤、カプセル剤、水溶液、懸濁液等の形態が好ましい。また、本発明ビタミンＤ様活性代替用剤は食品、例えば機能性食品等として使用でき、その形態は特に制限されず、果汁；野菜汁；ソース、味噌、醤油等の調味料；豆乳、納豆等の大豆食品；クリーム、ドレッシング、マヨネーズ及びマーガリン等の乳化食品；水産加工食品；食肉加工品；清涼飲料、酒類、コーヒー、ココア、紅茶、緑茶、発酵茶、半発酵茶、粉末飲料及び機能性飲料等の飲料；漬物類；麺類；粉末スープを含むスープ類；ゼリー；チーズ、ヨーグルト、牛乳等の乳製品；パン、ケーキ等の小麦粉食品；スナック菓子、チューインガム、キャンディー、チョコレート等の菓子類；錠剤、顆粒剤等の健康食品等が挙げられる。

本発明のビタミンＤ様活性代替用剤には、トコフェロール、アスコルビン酸およびその誘導体、フィロキノン、メナキノン、メナジオン及びその誘導体、β−カロチン、ビタミンＡ、チアミン、リボフラビン、ビタミンＢ６、シアノコバラミン、葉酸等のビタミン類；オリゴ糖、ヘキソース、ペントース及び糖アルコール等の糖類；エタノール等のアルコール類；クエン酸、リンゴ酸等の有機酸；乳清蛋白、カゼイン等の牛乳由来蛋白、大豆蛋白等の蛋白、ペプチド類；カテキン、イソフラボン等のフラボノイド類；コンドロイチン硫酸、ゲルタマン硫酸等のプロテオグリカン；チョウジ、ジュニパーベリー、アスナロ等のエキス、生薬類等を配合できる。また、増粘剤、ゲル化剤、乳化安定剤であるカラギーナン、カルボキシメチルセルロース、グアーガム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアガム、ローカストビーンガム、トラガントガム、ジェランガム、アルギン酸、デキストラン、プルラン、カードラン等との併用も可能である。

本発明のビタミンＤ様活性代替用剤の投与、摂取量は、糖リン酸エステル又はその塩として成人１日当たり０．０５〜１５ｇ、特に０．１〜１０ｇが好ましい。

実施例１
活性型ビタミンＤと糖リン酸エステルの標的細胞として、小腸上皮様に分化することが知られているＣａｃｏ−２細胞（大日本製薬）を用いた。フィブリラーコラーゲンカルチャープレート（ベクトンディッキンソンＩｎｃ．）のインサートに、Ｃａｃｏ−２細胞を培養用培地（１０％ウシ胎児血清、ＭＥＭ用非必須アミノ酸、２００mMグルタミン酸／ＭＥＭアール）に懸濁して添加した。一方、プレートにも培養用培地を添加し定法にて培養した。インサートおよびプレートの培地は定期的に交換し、培養１５日目に試験に供した。その後インサート内に１α，２５（ＯＨ）₂ビタミンＤ（シグマアルドリッチジャパン）１０nM、又は糖リン酸エステルであるグルコース−１−リン酸ナトリウム（Solchem社製(Italy)）を１mMになるように添加し、２４時間毎に培地交換しながら７２時間培養した。その後、Isogen（和光純薬）にてＣａｃｏ−２細胞のｍＲＮＡを抽出し、各プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ法にて標的遺伝子、ＣＹＰ３Ａ遺伝子、２４−水酸化酵素遺伝子及びＣａＴ１遺伝子のｍＲＮＡ量を定量した。

その結果、図１〜３に示すように、グルコース−１−リン酸ナトリウムは、活性型ビタミンＤと同様に、顕著に２４−水酸化酵素、ＣＹＰ３Ａ、ＣａＴ１の遺伝子発現を亢進した（各遺伝子発現量はハウスキーピング遺伝子であるＧ３ＰＤＨで除した）。以上より、ＶＤＲを介して発現が制御されている蛋白分子を指標としてビタミンＤ様活性を評価した場合、糖リン酸エステルであるグルコース−１−リン酸ナトリウムは活性型ビタミンＤと同等の作用があり、ビタミンＤ様活性代替用剤になることが判明した。

実施例２添加食品
グルコース−１−リン酸ナトリウム６０重量％とデキストリン４０重量％を混合し、１包２ｇの包装品、又は本混合品を常法により錠剤に成形し、１錠２ｇの錠剤とすることにより、１包装又は１錠が一人用の調理時に用いる簡便な添加用食品を得ることができる。

実施例３粉末飲料
ブドウ糖６０重量％、デキストリン１５重量％、クエン酸ナトリウム５重量％、ビタミンＣ１重量％、グルコース−１−リン酸ナトリウム１５重量％に香料（レモンフレーバー）４重量％を加え、十分に混合した後１０ｇ分包にし、１日１回摂取用の水や湯に溶かして摂取する香味良好な粉末飲料を得ることができる。

実施例４錠菓
無水結晶ぶどう糖６０重量％、フロストシュガー９重量％、粉末オレンジ香料４．５重量％、グアーガム２重量％、アスコルビン酸２．５重量％、クエン酸（結晶）１．５重量％、乳性カルシウム５重量％、グルコース−１−リン酸ナトリウム１５重量％、ショ糖脂肪酸エステル（ＨＬＢ２０）０．５重量％、色素適量を均一混合し、常法により１５mmΦの径を有する２ｇの錠剤を打錠し、風味良好な１日に５錠摂取する香味良好な錠菓を得ることができる。

実施例５ゼリー食品
水４０重量％にカラギーナンとローカストビーンガムの混合ゲル化剤０．６５重量％、グレープフルーツの５０％濃縮果汁１０重量％、クエン酸０．０５重量％、ビタミンＣ０．０５重量％、グルコース−１−リン酸ナトリウム１．５重量％を混合し、グレープフルーツフーレバー適量を添加したのちに液糖を適量加え、さらに水を加えて１００重量％とした溶液を１kg得る。８５℃で５分間保持して殺菌処理後、１００mLの容器に分注し、静置して徐冷しながら５℃に冷却して、ゲル化させ、口に含んだ時に口溶け性が良好で、果実風味を有し食感香味良好なゼリー食品を得ることができる。

実施例６乳飲料
市販牛乳５kgにグルコース−１−リン酸ナトリウム３０ｇを添加溶解し、２００mLの缶詰とし、常法にて殺菌することにより、乳飲料を得ることができる。

実施例７清涼飲料水
果糖ブドウ糖液糖１３重量％、クエン酸０．３重量％、アスコルビン酸０．０３重量％、クエン酸ナトリウム０．０２重量％、香料（ライムフレーバー）０．１重量％、炭酸カルシウム０．５重量％、グルコース−１−リン酸ナトリウム１．２重量％に水を加えて溶解し、pHを３．５に調製後、５リットルの飲料を得る。溶液は、１００mLをガラスビン容器に分注し、常法により殺菌を行ない風味良好な清涼飲料水を得ることができる。

実施例８水
市販ミネラルウォーター５kgにグルコース−１−リン酸ナトリウム３０ｇを溶解し、ロ過後、２００mL缶容器に充填し、常法による殺菌を行い、容器充填水を得ることができる。

実施例９茶飲料
茶飲料として、ウーロン茶葉５０ｇから５kgの抽出液を得た後、グルコース−１−リン酸ナトリウム２０ｇとアスコルビン酸Ｎａ１ｇを添加溶解し、重曹を用いてpH５．５に調整、３５０mLの缶詰とし、常法にて殺菌し、香味良好なウーロン茶を得ることができる。

実施例１０コーヒー飲料
コーヒーとして、焙煎コーヒー豆（モカ、コロンビア）２５０ｇから４kgの抽出液を得た後、蔗糖２００ｇ、牛乳５００ｇを添加し、グルコース−１−リン酸ナトリウム３０ｇを添加溶解後、水及び重曹を用いてpH６の溶液５kgを得、２００mLの缶詰とし、常法にて殺菌し、香味良好なコーヒー飲料を得ることができる。

実施例１１野菜入り混合果汁飲料
市販混合果実飲料２kgにグルコース−１−リン酸ナトリウム１２ｇを添加溶解し、２００mLの缶詰とした後、常法にて殺菌し、野菜入り混合果汁飲料を得ることができる。

実施例１２アイスクリーム
牛乳２kgに蔗糖６０ｇとグルコース−１−リン酸ナトリウム３０ｇ及び適量のフレーバーを添加し、攪拌冷却しながらクリームを調製し、２０個に小分けした後、更なる冷却により、香味良好なアイスクリームを得ることができる。

実施例１３小麦粉食品（カップケーキ）
薄力粉１００ｇ、鶏卵１００ｇ、砂糖１００ｇ、ショートニング３５ｇ、マーガリン３５ｇ、ベーキングパウダー２．５ｇ、洋酒６ｇ、グルコース−１−リン酸ナトリウム１５ｇ、水適量の組成からなる生地をカップケーキ調製の要領で調製した後、１０個の型に分け、常法により焼成、製造し、風味良好なカップケーキを得ることができる。

実施例１４調味料（醤油）
市販醤油又は減塩醤油１kgにグルコース−１−リン酸ナトリウム１００ｇを添加溶解し、殺菌し、１日の醤油使用量が２０ｇとなるように調製した醤油又は減塩醤油を得ることができる。

実施例１５ドリンク剤
タウリン８００mg、ショ糖１１０００mg、カラメル５０mg、安息香酸ナトリウム３０mg、ビタミンＢ１硝酸塩５mg、ビタミンＢ２２０mg、ビタミンＢ６２０mg、ビタミンＣ２０００mg、ビタミンＥ１００mg、ニコチン酸アミド２０mg、グルコース−１−リン酸ナトリウム１２００mgを適量の精製水に加えて溶解し、リン酸水溶液でpH３に調節した後さらに精製水を加えて全量を１００mLとした。これを８０℃で３０分滅菌して、香味良好なすぐれたドリンク剤を得ることができる。

グルコース−１−リン酸ナトリウム及び活性型ビタミンＤのＣＹＰ３Ａ遺伝子発現に及ぼす作用を示す図である。グルコース−１−リン酸ナトリウム及び活性型ビタミンＤの２４−水酸化酵素遺伝子発現に及ぼす作用を示す図である。グルコース−１−リン酸ナトリウム及び活性型ビタミンＤのＣａＴ１遺伝子発現に及ぼす作用を示す図である。

Claims

グルコース−１−リン酸ナトリウムを有効成分とする活性型ビタミンＤ標的遺伝子発現亢進剤。
活性型ビタミンＤ標的遺伝子が、２４−水酸化酵素遺伝子、ＣＹＰ３Ａ遺伝子又はＣａＴ１遺伝子である請求項１記載の活性型ビタミンＤ標的遺伝子発現亢進剤。