JP4607223B2 - エレクトロスプレー質量分析を用いたマイクロアレイの読取りのためのサンプリングプローブ - Google Patents

Description

本発明は一般に、測定物質の運搬、イオン化、その後の分析のための方法および装置に関し、より具体的にはエレクトロスプレー質量分析を利用してアレイ上の複数の試料スポットを分析する方法および装置に関する。

細胞、組織または生物体全体の蛋白質補体の研究はプロテオミクスと呼ばれている。プロテオミクスは、大きな関心を呼んでおり、新しい分析技術が可能になったことで、近年になって大部分がかなりの進歩を遂げた。プロテオミクスの１つのテーマは、生物学的システムが刺激に応答する際のシステム内の蛋白質発現をモニタリングすることである。現在では、２次元ゲル電気泳動（２−ＤＥ）はそのような蛋白質補体を測定するための最も一般的で力強い原理である。このアプローチは、複数の試料中にある何千もの蛋白質の発現プロファイリングを支援することができる。

しかし２−ＤＥには、複数の重大な制約がある。これらの制約としては、例えば膜蛋白質の泳動が困難であること、ゲル画像分析が複雑であること、ゲルの調製および泳道が手動であることが挙げられる。その上２−ＤＥは、スポットを切出して洗浄し、特異性および感受性が高い質量分析に基づく蛋白質同定方法を利用する必要がある。それゆえ、複雑な試料内での蛋白質発現プロファイリングのための他の測定原理が模索されている。

蛋白質「アレイ」または「チップ」は、潜在的な別法の１つである。この技術は、蛋白質発現プロファイリングに加えて、薬物送達法における蛋白質間相互作用、蛋白質基質、または潜在的候補物質の同定で使用される可能性がある。蛋白質活性をスクリーニングするためのこのアプローチは、ｍＲＮＡ発現分析のための市販のＤＮＡマイクロアレイ、即ち高処理量の平行定量マイクロスケール分析と同様の利点を与える。それは、ＤＮＡマイクロアレイを上回る利点も有している。

ほとんどの遺伝子の最終的活性産物は蛋白質であり、蛋白質発現とｍＲＮＡ発現とは、必ずしも定量的に関連するわけではないため、真の発現分析は、蛋白質レベルで行わなければならない。その上、蛋白質は、活性および不活性形態の両方で合成することができる。遺伝子の生物学的機能を理解するために、一般には活性遺伝子産物の量を測定しなければならない。

核酸チップの分析は、通常、被分析物に結合した蛍光プローブレポータを用いて実施される。蛋白質アレイの読取りのためにこのアプローチを用いることは、多くの問題を伴う。第一に、そして最も重要なこととして、蛍光的アプローチは、被分析物のみが捕捉分子に結合すること、および非特異的結合が極少ないことが求められる。特に結合条件を各特異的相互作用に最適化できない場合には、このアプローチは通常、蛋白質には適合しない。第二の問題は、蛍光プローブで蛋白質を標識することによってそれらの結合特性を変化させる可能性があり、溶液中に存在する蛋白質複合体を破壊する可能性がある、ということである。最後に蛍光的アプローチは、所定の蛋白質の異なる形態を区別することができない。これには、活性および不活性形態の蛋白質が捕捉されて同等量のシグナルが与えられるような状況が含まれる。この両方の問題は、捕捉／検出フォーマット上で操作する蛋白質の検出および定量法のための現行の平行標準法である酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）にも関連している。

質量分析（ＭＳ）法は、蛋白質の検出および同定の両方に利点を与える。現在では、蛋白質分析での質量分析によって得られる分析の速度、感受性、および分子量の高精度測定の組合せをしのぐ技術は他にない。高分解能の精密な質量測定によって、他の入手可能な技術による評価が困難な蛋白質の翻訳後修飾を、蛋白質混合物中であっても検出することができる。現在では、酵素によって生成され、質量分析によって分析される蛋白質のペプチド断片を日常的に用いて、オンライン蛋白質データベース検索（ペプチドマッピング）によって分子全体が同定されている。

あるいは、新しい方法によって、酵素消化を必要とせずに、タンデム質量分析を用いて気相のインタクトな蛋白質から生成された断片からの蛋白質を同定させる。タンデム質量分析は、２段階の質量分析を利用しており、その１番目は、イオンを予め選択することであり、２番目は、例えばアルゴンまたはヘリウムなどの不活性気体の衝突によって導入された断片を分析することである。この２重分析は時間的に直列にして行うことができ、あるいはより一般的には空間的に直列にして行うことができる。空間的に直列にする測定は、２台の一続きの質量分析計を用いて実行される。

質量分析は、現在では蛋白質マイクロアレイ読取りの方法として大きな可能性を有すると考えられている。質量分析で分析するため、蛋白質から気相イオンを発生させるのに一般に用いられるイオン化法は２種類ある。これらの方法は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）およびエレクトロスプレー（ＥＳ）イオン化法である。これらの２種の方法のうち、蛋白質アレイ読取りに最も多く選択されるのが、ＭＡＬＤＩ−ＭＳであり、これは表面分析である。

蛋白質チップ読取りのＭＡＬＤＩ−ＭＳ法は、２つの異なる会社、サイファージェン・バイオシステムズ社（カリフォルニア州フレモント）およびイントリンジック・バイオプローブズ社（アリゾナ州タクソン）によって現在市場性を開発されている。それらは、それぞれ４〜８箇所の相互作用部位を含むＭＡＬＤＩ−ＭＳ用の蛋白質チップを提供する。これらの市販製品は、備え付けられた蛋白質捕捉用の特定の一般的親和力、例えば疎水性または親水性相互作用、陰イオン交換、陽イオン交換、および金属結合蛋白質を捕捉するための固定化金属親和性基質によって得ることができる。あるいは、研究者の選択により固定化レセプター類を備えた特注のチップを得ることができる。例えば、固定化基質は、特異的抗体であってもよい。それらの市販製品は真のアレイでないが、１０ｘ１０（１００スポット）もの蛋白質相互作用アレイの製造およびＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析が実験室で実証された。

市販のＭＡＬＤＩ−ＭＳ蛋白質チップ製品の市販性は、それらが有用であることを示している。それにも関わらず、チップ読取りでＭＡＬＤＩ−ＭＳを使用するには、重大な分析上の制約がある。イオンを発生させるためにレーザービームが相互作用する特定のアレイスポットでは、いずれの小さなポイントでも被分析物の密度が小さい。これが、検出レベルに負の影響を与えている。ＭＡＬＤＩ−ＭＳの検出レベルは、分子量約１５ｋＤａに急激に低下する。これによって、直接分析し得る蛋白質の範囲が大きく限定される可能性がある。時間のかかる酵素消化法では、大きな蛋白質を分析する場合には、検出され易い低質量ペプチドを生成させる必要もある。これらの消化法は、ペプチドマッピングによって蛋白質を同定するためのペプチドを生成させる必要もある。ＭＡＬＤＩ−ＭＳの質量精度は通常、約０．０１％以下（例えば、牛アルブミン約６６０００Ｄａでは＋６Ｄａ）である。最後に、アレイの分析は、相互作用が生じるネイティブな液体環境から被分析物を取り出し、化学的マトリックスを適用して脱離及びイオン化を促進し、次に乾燥工程に入る必要がある。

エレクトロスプレーは、ＭＡＬＤＩの代替法である。エレクトロスプレーは一般に近接表面に関して絶対値で高圧に保持された小管またはキャピラリーを含むエレクトロスプレーイオン源に、試料の液体を流すことを含む。その近接表面（例えば１ｃｍ）は、一般に対向電極と呼ばれる。質量分析用の従来のＥＳシステムは、対向電極を低い近接地基準電圧（ｎｅａｒ ｇｒｏｕｄ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｖｏｌｔａｇｅ）に保持しながら、エミッター電極に高電圧（地面の参照電圧に対して）をかける。陽イオン操作モードでは、エミッターの電圧は高い正電圧であるが、陰イオンモードでは、エミッター電圧は高い負電圧となる。

管またはキャピラリーに導入された液体は、作用電極と呼ばれる高電圧に保持された管またはキャピラリーと近接表面との間に生じた電場によって、微細な帯電液滴（プルーム）として分散され放出される。

イオン化機構は一般に、微細な帯電粒子からのイオンを大気圧で脱離させることを含む。その後、エレクトロスプレー法によって生成したイオンを、質量分析で分析された質量など様々な用途に用いることができる。

典型的なＥＳ−ＭＳ法では、該当する被分析物を含有する溶液が、高電圧を保持するＥＳエミッターに送出され、その結果、帯電した溶媒液滴スプレーまたはプルームが生じる。液滴は、電場の影響下で対向電極に向かって流れる。液滴が進行するにつれ、気相イオンが液滴から遊離される。この工程で、帯電した液滴およびイオンによって準連続的定常電流が発生し、電流が生じて、直列回路が完成する。

ＥＳ−ＭＳは公知であるが、蛋白質チップアレイなどの複数のスポットを自動的に読取る場合のＥＳ−ＭＳの使用は、示されていない。これは、自動化法での液体流動システムを用いて試料の表面の小さなスポットから被分析物をサンプリングするのが技術的に困難なためであろう。具体的には、エレクトロスプレーは、運搬管を通して質量分析計のイオン源に流入される溶液に試料を溶解させることによって正常に運転する。エレクトロスプレーによって表面の分析を試みる場合、通常は固体状態の表面試料を溶液中に、その後運搬ラインに移動させるのに適したプローブを製造させることに重要な難題がある。加えて、プローブと表面の位置合わせを制御するためには精密な構造が要求され、その構造によって一般に表面に関するプローブの移動が細密に解析される。

表面アレイ上またはアレイ内に配置された被分析物を同定する方法は、少なくとも１個のスポットを含む表面アレイを用意する工程を含む。スポットは、少なくとも１種の被分析物を保持している。少なくとも１種の溶離溶媒を、スポット全体に流す。溶媒は、被分析物の少なくとも一部をスポットから送出する。被分析物の少なくとも一部は、エレクトロスプレーイオン源を用いて複数のイオン断片にイオン化される。その後、複数のイオン断片は、分析されて被分析物が同定される。被分析物としては、インタクトな蛋白質、蛋白質断片、医薬剤および抗体が挙げられる。

その方法は、少なくとも１個の他のスポットに自動的にステッピング動作する工程と、流動、イオン化および分析工程を反復する工程とを含んでもよい。本明細書で用いられる用語「ステッピング動作」は、走査という用語と同義に用いられ、１つのアレイスポットから別のアレイスポットへの移動を表す。

分析工程は質量分析を含んでもよい。質量分析はタンデム質量分析であってもよい。
流動工程は溶離溶媒を流す前に洗浄溶媒を流す工程を含んでもよい。その方法は溶離溶媒を流す前に、少なくとも１種の試薬をスポットに流す工程を含んでもよい。

プローブは液架橋を用いてスポットに接触する多軸液絡プローブであってもよい。プローブはスポットの周囲に密閉された囲いを形成するように適合されている多軸表面接触プローブであってもよい。表面接触プローブは密閉された囲いを形成するためのオーリングシールを含んでもよい。表面接触プローブは流動工程のために正圧を利用してもよく、溶離溶媒および被分析物は加えられた正圧の影響下でプローブを通して送達される。

自動ステッピング動作を含む実施形態においては、位置決め装置が、実質的に平坦な表面についてｘ、ｙおよびｚ位置制御を行い、各寸法の分解能が少なくとも１ｎｍとなり得る。位置決め装置は走査プローブ電気化学顕微鏡（ＳＥＣＭ）の圧電式トランスレータおよびコントローラであってもよい。

その方法は約０．０４ｍｍ²未満のスポット面積をサンプリングするように適合されている。表面アレイは蛋白質アレイ、薄層クロマトグラフィープレート、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、等電点電気泳動ゲル、または固相抽出材料であってもよい。

自動サンプリングシステムは分析のための複数のスポットを有する表面アレイから試料を得るためのものである。そのスポットは少なくとも１種の被分析物を、表面に配置されているか、または内部に含有されている。そのシステムは少なくとも１個のプローブを含む。プローブは少なくとも１種の溶離溶媒をスポットに流すための入口を含み、被分析物をそのスポットから送出するための出口を更に含む。スポットに対してプローブを移動させて、スポットのいずれかをサンプリングさせるために、自動位置決めシステムが設けられている。

被分析物を受けて、被分析物からイオンを発生させるために、プローブに流動連通するインプットを有するエレクトロスプレーイオン源が設けられている。そのシステムはエレクトロスプレーイオン源のために発生されたイオンを受けてイオンを分析する構造を含む。分析のための構造は質量分析計またはタンデム質量分析計を含んでもよい。

プローブは液架橋を用いてスポットに接触する多軸液絡プローブであってもよい。プローブはスポットの周囲に密閉された囲いを形成するように適合されている多軸表面接触プローブであってもよい。

自動位置決めシステムはスポットからスポットにステッピング動作する能力を付与することができる。例えばこの目的で、走査プローブ電気化学顕微鏡（ＳＥＣＭ）の圧電式トランスレータおよびコントローラが用いられてもよい。

以下の詳細な説明を添付の図面と併せて検討することによって、本発明、ならびにその特徴および利益が、より完全に理解されよう。

本発明の実施形態の表面アレイ読取りのためのサンプリングプローブ／ＥＳ−ＭＳを示す図。 （ａ）は本発明の実施形態の表面接触プローブ、（ｂ）は本発明の実施形態の液絡プローブを示す図。 ＥＳ−ＭＳマイクロアレイ読取りのための原形の液絡プローブおよび付随のシステムの写真を示す図。 ガラススライド上の４つの平行なアレイスポットからのアポミオグロビン（１６９５１Ｄａ）０．５ｐｍｏｌ／スポットについて図３で示されたサンプリングプローブおよびシステムを用いてＥＳ−ＭＳシステムによって発生されたピーク過渡信号を示す図。 タンデム質量分析を用いた蛋白質全体からの複数のアミノ酸「配列タグ」の生成を示す質量スペクトルを示す図。

表面アレイ内の複数のスポットのいずれかに配置された少なくとも１種の被分析物を検出するシステムが、少なくとも１個のサンプリングプローブを含む。自動位置決め装置は、好ましくはアレイスポットに対してサンプリングプローブを位置あわせし、他のアレイスポットにステッピング動作してその検出工程を自動的に反復し得るように設けられている。そのプローブは、少なくとも１種の溶離溶媒をアレイスポットのいずれかに流動させて被分析物を運搬するための入口と、被分析物をスポットから被分析物をイオン化させるためのエレクトロスプレーイオン源に送出するための出口とを含む。イオンを分析するための構造は、好ましくは質量分析計であり、ＥＳ源によって発生するイオンを分析することによって被分析物を同定する。したがって本発明では、一般にアレイサンプリングの従来方法にとって必要だった複雑で多くは信頼性のない外因的標識分析法が必要ない。

本発明を利用して、事実上、該当するいずれの表面をサンプリングしてもよい。したがって本発明は、広範囲の潜在的用途を有する。蛋白質マイクロアレイは、そのような用途の１つである。蛋白質マイクロアレイ技術は、急速に成長し急速に拡大する市場である。本発明の幾つかの一般的使用としては、蛋白質間相互作用および薬物発見をはじめとする蛋白質精製、蛋白質発現プロファイリングおよび蛋白質相互作用プロファイリングが挙げられる。この分野の成長の障害となるものは、アレイの感受性分子特異性検出方法の同定であり、これは複雑で多くの場合信頼性外因的標識方法を必要としない。特に、本発明は、被分析物を検出するための標識化を必要としない。

蛋白質アレイに関しては、基質表面は、捕捉材料の固定された１つ以上の領域で被覆されてもよい。例えば蛋白質アレイは、複雑な混合物から対応する抗原を捕捉する、アレイ表面に共有結合的に固定された抗体を含んでもよい。異なるスポットは表面に異なる捕捉材料を有してもよい。多くの異なる種類の捕捉材料物質を、抗体、レセプター、リガンド、核酸（例えばＤＮＡ）、炭水化物、ゲル（例えば等電点電気泳動ゲル）を含むアレイ基板、および陽イオン、陰イオン、疎水性、親水性表面などのクロマトグラフィー表面に結合させてもよい。分子刷込み材料を捕捉材料として用いてもよい。広範囲の特異性を有し、全種の蛋白質に結合するように表面を設計させることもできるが、それ以外に、特異性が高く、複雑な試料の１種または数種のみの蛋白質に結合するよう設計することもできる。

捕捉工程の後、被分析物を捕捉材料に結合させてアレイ上に配置する。その後、好ましくはアレイを適切な洗浄溶媒で洗浄して非特異的結合を減少させる。乾燥工程を利用した後、ＭＡＬＤＩのように強力なレーザー光を短時間あてて、アレイ表面の一部から残留蛋白質を脱離させるのではなく、本発明は、１種以上の溶媒を用いて一般にスポットエリア全域から残留蛋白質または他の結合した被分析物を脱離させるものであり、マトリックスの適用や付随の乾燥工程を必要としない。その後、エレクトロスプレーイオン化を利用して被分析物をイオン化し、質量分析などのいずれかの適切な分析技術を用いて発生したイオンを分析する。質量分析は一般には好ましいが、イオン移動性またはイオン移動性と質量分析の組合せが用いられてもよい。ミネソタ州セントポールのＴＳＩインコーポレーティッドから得られるＤＵＳＴＲＡＫモデル８５２０（ＩＴＩ−０４４）などの光散乱検出器を分析に用いてもよい。

図１は、本発明の実施形態による表面アレイ読取りのためのＥＳ−ＭＳサンプリングシステム１００を示している。表面アレイ１２０は、基板（図示しない）上に配置されており、基板は台１０５上に配置されている。表面アレイ１２０は複数の離れた相互作用スポット（図示しない）を含む。各スポットは一般に約１ｍｍ²未満の面積を有している。システム１００は、約０．０４ｍｍ²の小さなスポット面積、より好ましくは約０．０１ｍｍ²の小さなスポット面積をサンプリングするように適合されている。

アレイ１２０は、好ましくは表面に捕捉材料を配置させた蛋白質アレイであるが、薄層クロマトグラフィープレート、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、等電点電気泳動ゲルおよび固相抽出材料などのいずれの表面アレイであってもよい。例えばスポットは、核酸または抗体などの固定された捕捉材料を表面に有する１個以上の領域を含んでもよい。

アレイ基板（図示しない）は、典型的には不活性の無孔性材料である。例えば、シリコン、様々なプラスチックまたはアルミナなどの材料の上に配置されたＳｉＯ₂の表面層、ガラスが一般に基板材料として用いられてもよい。

システム１００は１個のサンプリングプローブ１３０を備えているように示されており、一般には連続読取りシステムとして記載されるが、システムは並列の多重化システムとして構成されてもよい。多重化プローブシステムは試料の処理量を増やすことができる。例えば市販のＥＳシステムには８個までの番号付き噴霧機（ｉｎｄｅｘｅｄ ｓｐｒａｙｅｒｓ）が設けられている。各噴霧機は各噴霧器からの試料流れを周期的に迅速にサンプリングすることによって平行して運転することができる。単一の質量分析システムが用いられると仮定すると、いずれか１つのエミッターからの噴霧がサンプリングされる時間の合計は、噴霧器の数の逆数を掛けた数に減少する。

別の実施形態においては、表面アレイ１２０の離れたアレイ位置に専用の噴霧器を設けることができる。これは、ＥＳノズルの市販された微細加工アレイによって近々可能になり、表面アレイのより迅速な完全自動化連続読取りが得られる。

トランスレータおよびコントローラ１２５は、好ましくは走査型電気化学顕微鏡（ＳＥＣＭ）１６５と一体化された圧電式トランスレータおよびコントローラであり、アレイ１２０上に含まれるアレイスポットのいずれかに対してサンプリングプローブ１３０を位置合わせして、各スポット間をステッピング動作するために設けられる。ＳＥＣＭ１６５は、走査型トンネル顕微鏡および原子力顕微鏡に関係する走査プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）の１種である。ＳＰＭは、画像化される表面の上部に小さなプローブチップを走査またはラスタ走査することによって運転される。ＳＥＣＭでは、電気化学活性チップによって電解質溶液中で画像化される。

ＳＥＣＭシステムは、実質的に平坦な表面について再現性のあるｘ、ｙおよびｚ位置制御を行うことができ、分解能が１ｎｍを超え、ｘおよびｙ走査距離が５ｃｍである。システムはテキサス州オースチンのＣＨインスツルメンツ社から得られる。この位置分解能および走査距離は、現在用いられる事実上全ての表面装置について十分なものであり、線寸法が約１００：ｍと小さなサイズの相互作用位置を備えた大きく高密な表面アレイを精密かつ完全にサンプリングすることができる。同様の仕様を持つ別の位置決め装置をＳＥＣＭの代わりに用いてもよい。

ＳＥＣＭ１６５は、好ましくはビデオ顕微鏡１６２およびビデオモニター１６０、圧電式トランスレータおよびコントローラ１２５、ならびにＳＥＣＭコンピュータ１３５を含む。ＳＥＣＭコンピュータ１３５は、サンプリングプローブ１３０とチップアレイ１２０との相互作用を管理し、アレイ表面に対してサンプリングプローブ１３０を空間的に位置決めして、被捕捉材料を得てＥＳイオン源１４５に送達する。サンプリングプローブ１３０はチップアレイ１２０に対して移動することができ、またはチップアレイ１２０は、サンプリングプローブ１３０に対して移動して、それらを接触させることができる。

溶媒送達システム１１５は、溶離溶媒を含む流体を提供するように適合されている。圧力の差が、流体を推進する。１つの実施形態において、正圧を利用して、流体を推進することができる。しかし一般には、正圧にせずに、アウトプット（ｏｕｔｐｕｔ）にかけられた真空を利用することもできる。本明細書で用いられる用語「正圧」は、システムを通過する流体を所望の流速で送達するのに必要な、大気圧を超える圧力を指す。

シリンジポンプ、ガス圧または他のポンプシステムを利用してもよい。先に示したように、真空を利用してもよい。真空を利用する１つの実施形態において、ベンチュリ真空効果によって液体を外部に引き出すよう、圧力によって生じる流れを適合させることができる。

流体は適切な流体管を通した送達システム１１５によってサンプリングプローブ１３０の入口に送達され、そこで溶離溶媒を表面アレイスポットに送出して捕捉された被分析物を離脱させる。その後、溶離溶媒と一緒の被分析物は、サンプリングプローブ１３０によって、プローブの出口に送出されてスポットを離れ、被分析物をイオン化するためのエレクトロスプレーイオンに送出される。

基板（図示しない）は、典型的には無孔性材料で形成されているが、アレイ基板は有孔性材料で形成されていて、各相互作用スポットの位置が有孔性媒体上にあってもよい。つまり、スポットの位置する表面が実質的に有孔である場合、溶媒は、溶媒送達システム１１５によってアレイを通して交互に押出されて、被分析物を適切なプローブに運搬してもよい。

ＥＳイオン源１４５は、サンプリングプローブ１３０によって供給された被分析物に由来するイオンを生成し、質量分析計１５０に供給する。質量分析計は、エレクトロスプレーインターフェース１４８を含む。質量分析計１５０は、好ましくは特定の使用目的に応じた走査速度、質量精度、イオン間化学などの必要な性能係数に基づいて選択される。質量分析計１５０は、好ましくはタンデム質量分析計である。

ＥＳイオン源１４５および質量分析計１５０は、好ましくは、ＥＳ−ＭＳコンピュータ１５５などによって、コンピュータ制御されている。ＥＳ−ＭＳコンピュータ１５５は、ＳＥＣＭコンピュータ１３５と分離されていても、またはそれと一体化されていてもよい。

本発明を利用するＥＳ−ＭＳサンプリングは、ＭＡＬＤＩ−ＭＳに比較して複数の重要な利点を付与する。ＥＳ−ＭＳは、試料を液体溶液中の質量分析計１５０に導入し、そのため表面アレイ１２０を液体環境においたままアレイ上の各ポイントで相互作用する成分をサンプリングすることができる。ＭＡＬＤＩ−ＭＳでは、アレイスポットの分析のために、相互作用が生じるネイティブな液体環境から取り出し、化学マトリックスを適用して脱離およびイオン化を促進し、その後の乾燥工程に入る必要がある。

本発明を利用して、相互作用スポット上の材料全てを回収して、質量分析計１５０に送出することが潜在的に可能であるが、ＭＡＬＤＩ−ＭＳのようにレーザービームと相互作用するフラクションが少量ではない。その上、ＥＳ−ＭＳは、分子量が増加しても、ＭＡＬＤＩ−ＭＳのように検出レベルが低下することはなかった。その上、最大で約６０ｋＤａの分子量までは、質量分解能が低いほどほどの質量分析計であっても、良好な、もしくは＋０．００２％より良好な（例えば牛アルブミンで＋１．３Ｄａ）の質量精度を得ることができる。直交イオン注入飛行時間型（Ｏ−ＴＯＦ）またはフーリエ変換質量分析計（ＦＴＭＳ）を具備したＥＳなどのより高性能の質量分析計を選択することによって、より良好な質量測定が得られる。

つまり、本発明を用いれば、蛋白質を２種の基本的方法で同定することができる。最初の例は、蛋白質の混合物が存在する場合であっても実施可能な高精度分子量測定に基づいている。適切な機器としては、ＦＴＭＳおよびＯ−ＴＯＦが挙げられる。イオン間化学および計測を利用して、比較的複雑な蛋白質混合物を分析することもできる。混合物の分析は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ法の利点と考えられる。第２の例では、蛋白質全体のタンデム質量分析から生成した配列タグに基づいて、蛋白質が同定される。ＦＴＭＳ、Ｏ−ＴＯＦまたはイオン間計測を利用して、配列タグを生成させてもよい。蛋白質同定のこの「トップダウン」アプローチは、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによるチップ読取りでの蛋白質同定で求められる時間のかかる酵素消化法を必要としない。

同定のために表面アレイの表面から脱離した被捕捉被分析物（例えば蛋白質）を運搬するサンプリングプローブ１３０は、好ましくは同軸キャピラリープローブなどのミニチュア多管プローブである。プローブは、溶離溶媒または他の流体の流れを受けるための少なくとも１本の流体管を含む。少なくとも１本の他の流体管は、プローブ１３０からの流体アウトプットを含み、流体アウトプットは被分析物および１種以上の他の流体を含む。正圧を利用して流体を移動させる場合、典型的な正圧の範囲は、流速、管の口径および長さに依存する。しかし、数ｐｓｉが一般に最小値で、２０００〜３０００ｐｓｉが、一般に最大値である。

ＥＳ−ＭＳに適合させた、２種の基本的なサンプリングプローブの設計が、図２（ａ）および２（ｂ）にそれぞれ示した表面接触プローブおよび液絡プローブである。有利には、表面接触プローブは、ほとんどの生物学的相互作用に好ましい自然な設定である液体環境に、スポットを保持させることができる。ＥＳ−ＭＳは、試料を液体溶液中の質量分析計に導入するため、表面アレイ１２０を液体環境においたまま、アレイ上の各ポイントで相互作用する成分をサンプリングすることができる。表面接触プローブは、本明細書に記載の液絡プローブなど他のプローブ設計に比較して、使用され得る溶離溶媒の範囲が拡大する。例えば、液絡プローブは一般に、表面のメニスカスを保持するために表面張力の高い液体を必要とする。表面接触プローブでは、そのような要件はない。

適切な圧力差を利用して、流体をプローブ２００のアウトプットに推進することができる。例えばアウトプットを真空に吸引しながら、プローブのインプットを大気圧に保持してもよい。あるいはプローブのインプットで正圧を利用してもよい。

表面接触プローブ２００を、単一の表面アレイスポット２１０の相対的に上の位置にある位置１と、下の位置にある位置２を図２（ａ）に示している。示されたスポット２１０は、固定された捕捉蛋白質２０６に結合した被捕捉蛋白質２０８を含み、固定された蛋白質は、ガラス基板などのマイクロアレイ基板材料２１５上に配置している。プローブ２００が位置２にある時に、読取りを実施する。読取りの後、プローブ２００がスポット２１０から離れて（例えば上昇して）位置１に達し、その後、適切な自動位置決め装置が側方に移動して、サンプリングプローブ２００を別のアレイスポットと再度、位置合わせする。プローブ２００は再度、位置２に降下し、その後次のスポットがサンプリングされる。

プローブ２００は、好ましくは寸法を合わせることによって個々のアレイスポットを完全に取り囲むのに十分大きく、表面アレイ上の隣接するスポットに達しない程度に十分小さな面積を有している。つまり、表面接触プローブ２００は、読取りの際（位置２）サンプリングされているスポットを、表面アレイ上の残余のアレイスポットから隔離させる。オーリング２２２または他のシーリング装置を用いて、サンプリングの際にひとつのスポットへの流体の流れを隔離することによって、プローブ２００に１つのスポットのみをサンプリングさせることができる。

表面サンプリングプローブ２００は、図１のシステム１１５などの適切な溶媒送達および切換えシステムから、試薬、洗浄溶媒および溶離溶媒などの流体を流すための外側の管２１２を備えた同軸プローブとして示されている。２本以上、例えば１本は試薬、１本は洗浄溶媒、そして１本は溶離溶媒とする３本の管を、プローブ２００から流体を流すための１本以上の流体管と共に用いることができる。管は事実上、いずれの形状であってもよい。

好ましくは、洗浄溶媒およびその後、溶離溶媒を外側の同軸管２１２に流すことによって、これらの流体をサンプリングプローブ内からスポット上に連続塗布する。この形態では、溶離溶媒がアレイスポット表面上とその上部を流動して、親和力または他の結合相互作用を崩壊させ、サンプリングプローブ２００の内側の管２１４を通して相互作用成分をエレクトロスプレーイオン源（図示しない）に溶離する。エレクトロスプレーイオン源（図示しない）は、好ましくは、被分析物の同定のために質量分析計（図示しない）とインターフェースによって連結している。

表面サンプリングプローブ２００は、他のプローブ設計を上回る重要な利点を有している。表面接触プローブ２００は、表面アレイ上の離れたスポットを、溶離前の外部環境と隔離することができるため、アレイの読取りは、表面アレイが溶液中にあっても実行することができる。この特徴は一般に、他のプローブ設計では混合および希釈の問題があるために得られない。更にこの設計は、アレイ上の所定のスポットを分析する際に、外部の溶媒が隣接するアレイスポットに導入されるのを防ぐ。

液絡プローブ２５０と呼ばれる第２のプローブ環境が、図２（ｂ）に示されている。このプローブ２５０は、表面接触プローブ２００と同様の正圧溶媒送達概念を利用するが、スポット表面２１０への接触は、図２（ｂ）に示されるとおりの液架橋２５５または液絡である。スポット表面２１０は、固定された捕捉蛋白質２０６に結合した被捕捉蛋白質２０８を含み、固定された蛋白質は、ガラス基板などのマイクロアレイ基板材料２１５上に配置されている。

プローブ２００と同様に、液絡プローブ２５０は、好ましくは個々のアレイスポットを取り囲む位置になり得るよう十分大きく、サンプリング時に表面アレイ上の隣接するスポットに達しない程度に十分小さくなるように寸法を合わせている。プローブ２５０への溶媒の流れと、ＥＳの空気圧噴霧化との均衡を保つことよって、所望なら溶媒が連続的に流れ得る自己吸引プローブが得られる。１つのスポットを分析する際に外部溶媒を導入すると、他のスポットが分析される時間に、他のスポットで得られた結果が影響を受ける可能性があるため、液絡プローブ２５０を使用するには、液体溶液を含まないアレイで分析を行うことを必要としてもよい。加えて、溶液中で分析すると、アレイが浸漬された溶媒が溶離溶媒を希釈する可能性がある。

サンプリングプローブ２５０は、図１のシステム１１５などの適切な溶媒送達および切換えシステムから、試薬、洗浄溶媒および溶離溶媒などの流体を流すための外側の管２６２を備えた同軸プローブとして示されている。プローブ２５０は、被分析物をエレクトロスプレーイオン源（図示しない）に送達するための内側の管２６４を含む。プローブ２００と同様に、２本以上の管を使用することができ、管は事実上、いずれの形状であってもよい。エレクトロスプレーイオン源（図示しない）は、好ましくは、被分析物の同定のために質量分析計（図示しない）とインターフェースで連結されている。１つのスポットからの読取り（例えば、個々の相互作用）の後、サンプリングプローブ２００または２５０が、コンピュータ制御（例えば図１の１３５および１５５）の下でアレイ表面から分離されて次のスポットにステッピング動作し、その工程を反復してもよい。液絡部は、適切な走査速度で、表面に保持されながらプローブ２００とともに軌道を進むようにしてもよい。これは、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレートの読取りを促進する。

プローブ２００または２５０のいずれかを用いて、サンプリングスポットを通して各スポットの試薬を工程に連続して運ぶことによって、蛋白質の相互作用、洗浄、および相互作用の崩壊／溶離工程を、それぞれ特定のアレイスポットで行うことができる。例えば、蛋白質をアレイ上に配置された捕捉材料に固定するために、最初に蛋白質が送達され、その後洗浄サイクル、その後溶離溶媒工程を行ってもよい。

各スポットは、同一または異なる相互作用物質を用いて、１回以上テストされてもよい。その上、チップを取り巻く液体環境中で容易に分析されるが、「乾燥した」アレイ上で分析を行ってもよい。

再度、図１を参照すると、好ましくはエレクトロスプレーインターフェース１４８を含む質量分析計１５０を用いて、ＥＳイオン源１４５からそこに送達される相互作用物質を同定する。これは、分子量のみに基づいて、またはタンデム質量分析によって実行することができる。高分解能の精密な質量測定またはイオン間化学の技術によって促進され得る蛋白質全体のタンデム質量分析を用い、オンラインデータベース検索による蛋白質同定のための配列タグを生成させることができる。

蛋白質溶解的消化（ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｄｉｇｅｓｔ）からのペプチド同定と次の蛋白質データベース検索との組合わせは、複雑な混合物から個々の蛋白質を同定するための強力なツールとなり得る。これは、ＭＡＬＤＩ−ＭＳチップ読取りによる陽性蛋白質同定に用いられる典型的な手順である。しかしこの手順は、１〜数時間かかる可能性がある。本明細書に記載されたアプローチは、迅速な（分析時間が１秒未満）気相アプローチによって蛋白質同定データを与える。

ＥＳ−ＭＳでの蛋白質の多重荷電によって、高分子量イオンの解離が促進され、解離生成物の分析によって構造情報が決定される。こうして、酵素消化が不要になる。インタクトな蛋白質の破砕で得られた配列情報のある生成物イオンは、マン他（Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．［１]）によって記載された「配列タグ」に類似した生成物イオンスペクトルで同定することができる。ＭＡＬＤＩ−ＭＳでは、蛋白質イオンが、ほとんど排他的に単一荷電である。それゆえ同様の手順は、一般には可能でない。

生成物イオンの電荷状態は、単一から親蛋白質イオンの電荷まで変動し得るため、親イオンの多重荷電は、タンデム質量分析の生成物イオンスペクトルを複雑にする。それゆえ生成物イオンスペクトルは、典型的には様々な質量および電荷のイオンで構成されている。２個以上のイオン間の質量電荷比の開きを測定することによって、この複雑さを克服する可能性が与えられる。これは、例えばＦＴＭＳ計測によって提供されるような高分解能の精密質量分析能か、またはイオン間プロトン移動化学のいずれかによって実施することができる、後者の場合、生成物イオン集合体全体が、イオン間反応を受け、それによって生成物イオンスペクトルが生じ、単一荷電イオンが優位を占め、ピーク間のｍ／ｚ間隔がより容易に測定される。

液絡概念２５０を用いたサンプリングプローブの試作品を組立ててテストした。実際のセットアップの図を、図３に示している。原理証明として、ガラス顕微鏡スライドの表面から、蛋白質アポミオグロビンのサンプリングに成功した。溶液中の蛋白質０．５ｐｍｏｌの試料を、ポリテトラフルオロエチレングリッドによって印付けられたスライドの正方形エリア（１ｍｍｘ１ｍｍ）にスポットし、放置して乾燥させた。サンプリングした蛋白質を、質量分析計に溶離して、ピークの過渡変化を生成させた。ピーク過渡変化の終了時に、プローブが表面から持ち上がり次のスポットに移動して、溶離を繰り返した。

図４は、スライド上の４つの異なるスポットから蛋白質を溶離するために記録されたピーク過渡変化を示している。このシグナルを生成させるためにモニタリングされたシグナルは、１５個のプロトンの電荷、即ちｍ／ｚ１１３１．２で（Ｍ＋１５Ｈ）^＋を含む多重荷電蛋白質のシグナルであった。

記載されたシステム１００を用いると、各アレイ位置の読取りは、典型的な質量分析計では約３０秒、または１０ｘ１０（１００スポット）チップアレイでは約５０秒を要すると予測される。これは、およそ図４で示された溶離の時間枠である。この読取りは、ＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いてアレイを読取る理論的時間（８．３分または約５秒／スポット）に比べ相対的に長い。しかし、ＭＡＬＤＩ−ＭＳに必要な酵素消化の時間は１〜数時間と考えられるため、この読取り時間は非常に競合的である。読取り時間は、ＥＳイオン源の電気回路に応じて異なる。試料表面から質量分析計までの移動ラインを通して試料を溶離し、そのライオンを洗浄してアレイ位置分析間のキャリーオーバーを防ぐ必要性によって、読取り時間の大部分が生じる。読取り時の試料の流速は、おそらく最低で約１．０μＬ／分であろう。

例として、図２（ｂ）に示された液絡プローブ２００の最適化のためには、内径５０μｍの１０ｃｍ長キャピラリーを組込んで、約０．２μＬの低容量を得ることになる。１．０μＬ／分では、この容量をフラッシュするのに約１２秒しかかからない。試料全体を溶離して、サンプリングキャピラリーを洗浄するには、一般に複数の溶離容量が必要となる。蛋白質が溶離されると溶媒の流動速度が上昇するため、浄化時間が減少し、そのため読取り時間も減少し得る。

先に記載したとおり、イオン間プロトン移動化学では、全体的な生成物イオン集合体がイオン間反応を受けて生成物イオンスペクトルを生成し、それによって単一荷電イオンが優位を占め、ピーク間のｍ／ｚ間隔がより容易に測定される。近年になり、蛋白質同定のためのイオン間プロトン移動化学的アプローチの実行性の証明が、大腸菌分解産物中のバクテリオファージＭＳ２の同定によって報告された［２]。複雑なマトリックス中のインタクトなウイルスコート蛋白質の多重荷電イオンの衝突活性化によって生じた配列タグを用いて（次にイオン間プロトン移動反応を行って容易に解釈される単一荷電生成物イオンの質量スペクトルを生成させると）、ＭＳ２ウイルスの存在を、データベース検索によって容易に検出することができる。これは、図５のデータに示されている。図５に示すように、異なるｍ／ｚを有するアミノ酸断片の形態の複数の溶解性配列タグが示される。本発明を利用して、チップ表面から質量分析計までの蛋白質の移動によって生じ得る過渡的な蛋白質信号によって、同質のデータを得ることができる。

サンプリングプローブ／ＥＳ ＭＳ技術は、短いペプチド、インタクトな蛋白質または蛋白質断片、医薬剤候補物質、ＤＮＡまたは抗体など、事実上いずれの種類の蛋白質捕捉アレイにも適合性がなければならない。これらは、市販されたものか、またはこのサンプリング技術を用いて社内で製造してもよい。

本発明の好ましい実施形態を例示して説明したが、それが本発明を限定するものではないことは明白であろう。当業者は、特許請求の範囲に記載されるとおり、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、多数の修正、変更、変形、代替および均等物を得るであろう。

参照文献
１．Ｍａｎｎ， Ｍ．； Ｗｉｌｍ． Ｍ． 「Ｅｒｒｏｒ−Ｔｏｌｅｒａｎｔ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅｓ ｂｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇｓ」 Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． １９９４， ６６， ４３９０−４３９９．
２．Ｃａｒｇｉｌｅ， Ｂ． Ｊ．；ＭｃＬｕｃｋｅｙ， Ｓ． Ａ．；Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ， Ｊｒ． Ｊ． Ｌ． 「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ＭＳ２ Ｃｏａｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ Ｅ． Ｃｏｉｌ Ｌｙｓａｔｅｓ ｖｉａ Ｉｏｎ Ｔｒａｐ Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎａｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｔａｃｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｏｎｓ」Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ２００１， ７３，１２７７−１２８５．

Claims (3)

1. 表面アレイ上、または表面アレイ内に配置された被分析物を分析する方法において、
   少なくとも１種の被分析物を保持するスポットを少なくとも１個含む表面アレイを用意する工程と、
   溶離溶媒が前記被分析物の少なくとも一部を前記スポットから送出するように、少なくとも１種の溶離溶媒を前記スポット全体に流動させる工程と、
   エレクトロスプレーイオン源を用いて、前記送出される被分析物の少なくとも一部を複数のイオン断片にイオン化する工程と、
   前記複数のイオン断片を分析して前記被分析物を分析する工程とを備え、
   前記スポットの周囲に密閉された囲いを形成するように適合された多軸表面接触プローブを含む少なくとも１個のプローブが前記流動工程で用いられ、
   前記表面接触プローブは前記密閉された囲いを形成するためのオーリングシールを含む方法。
2. 分析のために複数のスポットを含む表面アレイから試料を得る自動サンプリングシステムにおいて、
   少なくとも１種の被分析物を有する前記複数のスポットの内の関連するスポットに少なくとも１種の溶離溶媒を流すための入口を含む少なくとも１個のプローブであって、前記被分析物を前記スポットから送出するための出口を更に含む前記少なくとも１個のプローブと、
   前記スポットに対して前記プローブを移動させて前記スポットのいずれかをサンプリングする自動位置決めシステムと、
   前記被分析物を受けて、前記被分析物からイオンを発生するために前記プローブに流動連通するインプットを有するエレクトロスプレーイオン源と、
   前記エレクトロスプレーイオン源のために前記イオンを受けて前記イオンを分析するための構造とを備え、
   前記プローブは前記スポットの周囲に密閉された囲いを形成するように適合された多軸表面接触プローブを含み、
   前記表面接触プローブは前記密閉された囲いを形成するためのオーリングシールを含む、前記自動サンプリングシステム。
3. 分析のためにスポットの表面アレイから試料を得るための多軸サンプリングプローブであって、
   少なくとも１種の溶離溶媒を少なくとも１種の被分析物を有する複数のスポットのそれぞれに流すための入口と、前記測定物質を前記スポットから送出するための出口とを含み、前記スポットの周囲の密閉された囲いを形成するためのオーリングシールを含む前記多軸サンプリングプローブ。

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