JP4573840B2 - アッセイを実施するための微小機械的方法およびシステム - Google Patents

Description

（関連出願データ）
本出願は、２００３年１０月２９日に出願された米国仮特許出願番号第６０／５１５，７３１号の利益を主張し、これは、その全体が参考として本明細書中に援用される。

（発明の分野）
本発明は、サンプル中の１つ以上の選択される分析物の存在を決定するためのアッセイを実施するための微小流体システムに関する。

（背景）
定性および定量免疫アッセイならびに定性および定量免疫化学アッセイは、医療産業および食品産業における重要なツールとして承認されている。これらの方法は、疾患状態の診断、分析物の検出のため、および細菌のような微生物の検出のために用いられている。診断のこれらの方法は、確立された有効性を有し、そしてこれらの方法は、医師が、種々の形態の治療を受ける患者をモニターおよび管理することをより容易にしている。

伝統的に、これらの診断アッセイは、病院環境または臨床環境で実施されており、そして高性能かつ高価な設備の使用を含み、これは、それらの操作に特別に訓練された作業者を必要とする。さらに、これらアッセイの結果は、サンプルが患者から得られた数日後または数週間後についてはしばしば利用可能ではない。現在利用可能な診断アッセイは、それ故、費用がかかり、時間を浪費し、そして便利ではない。

より少ないコストのアッセイを開発する試みがなされている。例えば、血液構成要素を検出するための代表的な在宅自己試験は、患者が、滅菌ランセットで指を刺し、血液サンプルの滴を使い捨て可能なストリップ上のサンプル付与領域に付与し、そして次に結果を待つことを要求する。尿のようなその他の体液を使用するアッセイは、本質的に類似の様式で作用する。これらのデバイスは、代表的な在家の人が、ほとんど訓練なしで上記アッセイを正確に実施し得るように設計されている。しかし、これらのアッセイシステムは、一般に、低い正確度に苦しむか、または試験結果を損ない得る、多くの実施される調製工程を必要とし、そしてそれ故、便利ではない。

Ａｌｌｅｎ Ｍｉｃｈａｅｌによる米国特許第５，５８０，７９４号（特許文献１）は、所定のサンプル中の特定の分析物をアッセイする単一使用電子アッセイデバイスを記載している。Ｇｒｅｅｎｑｕｉｓｔによる米国特許第４，８０６，３１２号（特許文献２）は、検出可能な信号集中ゾーンを有する複数ゾーン分析要素を記載している。Ｇａｒｃｉａらによる米国特許第４，６２７，４４５号（特許文献３）は、血中グルコース、尿中窒素、ヘモグロビン、または血液成分の検査測定のためのハンドヘルドポータブル医療診断システムを記載し、ここで、使い捨て可能なニードルまたはランスプローブパッケージは、血液反応化学品のような化学的試薬ストリップ、可視的読み取り、およびコンピューターシステムを保持している。

Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇによる米国特許第４，１９７，７３４号（特許文献４）は、血液の凝固時間を測定し得る装置を記載している。この装置は、血液サンプルを含むシリンジを支持する支持フレーム、および回転するターンテーブルを含む。このシリンジからの血液は、ターンテーブル上に落ち、そこで、凝固時間が、このターンテーブル上で回転されるチャートによって自動的かつグラフによって描写される。この装置はまた、血液血漿およびその他の流体の粘度における変動を決定するために採用され得る。

Ｇｒｅｉｎｅｒらによる米国特許第３，４８６，８５９号（特許文献５）は、二重アームホルダーを有する装置を記載し、これは、小キャピラリー導管を経由して互いに連結される血液流体反応体チャンバーを備える。エアポンプが、これらチャンバーの１つに圧力変化を付与するために提供され、上記キャピラリー導管を経由して液体の定期的混合を行う。インジケーター手段が、血液の凝固に際し、上記キャピラリー導管の進行する制限を検出するために含められる。
米国特許第５，５８０，７９４号明細書 米国特許第４，８０６，３１２号明細書 米国特許第４，６２７，４４５号明細書 米国特許第４，１９７，７３４号明細書 米国特許第３，４８６，８５９号明細書

上記に記載の方法は、自宅使用のためにそれらを極度に難しくするいくつかの制限を有している。いくつかの方法は、特別の血液調製および取り扱いを必要とし、それらを、良く訓練されたスタッフをもつ中央クリニックに適切であるようにし、その一方、その他は高価であるか、または正確ではない。それ故、正確で、便利で、そして安価である、分析物を検出するためのアッセイシステムに対する必要性がある。

（要約）
本発明は、サンプル中の１つ以上の予備選択された分析物の存在を決定するためのアッセイを実施するための方法および微小技法システムを提供する。この装置は、ポータブルハンドヘルド試験分析機械中に挿入され得る使い捨て可能プラスチックストリップを含む。このストリップは、サンプルを、それが機械と接触せず、そしてサンプルが汚染されないように隔離する。

本発明の使い捨て可能なストリップは、固体支持体上に複数の規定されたウェルを有し得る。これらウェルは、キャピラリーチャネルによって連結され得る。これらウェルおよびキャピラリーチャネルの表面は、サンプルウェルから反応ウェル中に液体サンプルを引くことを支援するために試薬で被覆され得る。上記反応チャンバーの少なくとも１つの内側に、磁気により誘引され、そしてこの試験分析機械中のストリップの外側に配列された磁気移動するデバイスによって駆動され得る少なくとも１つの磁気撹拌バーがある。この磁気撹拌バーは、反応構成要素を混合し、反応構成要素を移動し、試薬を交換するか、またはカートリッジ中の標的に試薬を系統的に送達するなどの運動を実行し得る。

上記ストリップは、このストリップの反応ウェル中の分析物の存在を検出および／または定量するような形態とされるセンサーを有する、ポータブルハンドヘルド機械上に配置され得、その一方、物理的に検出可能な変化に応答し、サンプル中の選択された分析物の存在および／またはその量に相関する信号を生成する。これら試薬は、検出システムを備え得、それによって、検出可能な結果が、分析物の存在に関連して生じる。この信号は、ベースの外部部分上の視覚ディスプレイ窓上の出力に変換され得る。

サンプルを試験するために、上記使い捨て可能なストリップは、上記ベース中に挿入され得、そしてこのサンプルの液滴は、このストリップのサンプル付与ウェル中に配置され得る。このサンプルは、内部チャネルを通して、上記反応ウェル中に引かれ得る。このサンプルが反応ウェル中に引かれるとき、センサーがこの動きを検出し、そして、このサンプルウェル内で試薬を混合する適切な時間に上記磁気撹拌バーを能動化する。時限のアッセイには、上記ベース内に含められたマイクロプロセッサーが時間カウントを開始し、その一方、電気的または光学的であり得る上記センサーは、特定の分析物応答について上記ストリップの種々の部分をモニターする。検出および／または定量されるとき、これらの結果は、上記ベース上のディスプレイ窓中の適切なユニットで定性的または定量的に報告される。

上記運動およびセンサーはマイクロプロセッサーで制御され得る。ヒーターアセンブリは、凝固試験のような温度感受性アッセイのために上記ベース上で能動化され得、そしてこの温度は、一定に保たれ得るか、またはアッセイの持続時間を通じて所定の様式で変動され得る。

本発明の１つの局面では、使い捨て可能なストリップが記載され、ここで、この使い捨て可能なストリップは、サンプル収集ウェル、参照ウェル、および反応ウェルを備える第１の固形基板であって、ここで、これらウェルは、第１のキャピラリーチャネルを経由して流体連通にある第１の固形基板；および穴を備える第２の固形基板を備え、ここで、この第１の固形基板と第２の固形基板は接続され、そして上記穴は上記ウェルと連通している。

本発明の別の局面では、使い捨て可能なストリップは、サンプル付与ウェル、参照ウェル、および反応ウェルを備える第１の固形基板であって、ここで、これらウェルは、キャピラリーチャネルを経由して流体連通にあり、そしてここで、この参照ウェルは第１の溶解試薬を含み、そしてこの反応ウェルは第２の溶解試薬、抗体、および撹拌バーを含む、第１の基板；穴を備える第２の固形基板であって、ここで、この第１の固形基板と第２の固形基板は接続され、そして上記穴は、上記ウェルと連通する第２の固形基板；および捕捉ゾーンを有するメンブレンであって、ここで、このメンブレンが、第２のキャピラリーチャネルを経由して上記反応ウェルに連結される捕捉ゾーンを有するメンブレンを備える使い捨て可能なストリップが記載される。

なお別の局面では、本発明は、ＨｂＡ１ｃであるヘモグロビンの％を決定するための方法に関し、この方法は、サンプルウェル、参照ウェル、および反応ウェルを備える第１の固形基板を含む使い捨て可能なストリップであって、ここで、これらウェルは、第１のキャピラリーチャネルを経由して流体連通にあり、そしてここで、この参照ウェルは第１の溶解試薬を含み、そしてこの反応ウェルは第２の溶解試薬、ＨｂＡ１ｃ特異的抗体、および撹拌バーを含む、第１の固形基板；穴を備える第２の固形基板であって、ここで、この第１の固形基板と第２の固形基板は接続され、そして上記穴は、上記ウェルと連通する第２の固形基板；および捕捉ゾーンを有するメンブレンであって、ここで、このメンブレンが、第２のキャピラリーチャネルを経由して上記反応ウェルに連結される捕捉ゾーンを有するメンブレンを備える使い捨て可能なストリップを提供する工程；サンプルをサンプル付与ウェル中に配置する工程；希釈剤をこのサンプル付与ウェルに添加する工程；参照細胞からの総ヘモグロビンおよび捕捉ゾーンからの総ＨｂＡ１ｃを決定する工程；およびこの総ＨｂＡ１ｃを総ヘモグロビンで除し、ＨｂＡ１ｃであるヘモグロビンの％を得る工程を包含する。

本発明のこれらおよびその他の局面は、以下の詳細な説明を参照する際に明らかとなる。さらに、種々の参考文献が本明細書中に提示され、これらは、より詳細な特定の手順または組成物を記載し、そしてそれ故、それらの全体が参考として援用される。

（詳細な説明）
（Ｉ．定義）
そうでないことが陳述されていなければ、明細書および請求項を含む本出願で用いられる以下の用語は、以下で与えられる定義を有している。明細書および添付の請求項で用いられるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明確に指示していなければ複数への参照を含むことを注意しなければならない。

前述または後述であるかいずれかの、本明細書中に挙げられるすべての刊行物、特許および特許出願は、それらの全体が参考として本明細書によって援用される。

本明細書で用いられるとき、用語「被験体」は、哺乳動物および非哺乳動物を包含する。哺乳動物の例としては、哺乳動物のクラスの任意のメンバー：ヒト、チンパンジーのような非ヒト霊長類、およびその他のサルおよびモンキー種；ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタのような家畜；ウサギ、イヌ、およびネコのようなペット動物；ラット、マウスおよびモルモットのようなげっ歯類を含む実験室動物などが挙げられるが、これらに限定されない。非哺乳動物の例としては、鳥、魚などが挙げられるがこれらに限定されない。この用語は、特定の年令または性別を示さない。

本明細書で用いられるとき、用語「抗体」は、分析物（抗原）を特異的に結合し、かつ認識する、１つの免疫グロブリン遺伝子または複数の免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされるポリペプチド、またはそのフラグメントを含むが、これらに限定されない。「抗体」はまた、トリコモナス（ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）抗原（単数または複数）に曝されることに応答して宿主によって産生される抗体の抗原特異的結合領域（イディオタイプ）に特異的に結合かつ認識する、１つの免疫グロブリン遺伝子または複数の免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされるポリペプチド、またはそのフラグメントを含むがこれらに限定されない。例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、および単鎖抗体などが挙げられる。免疫グロブリンのフラグメントは、Ｆａｂフラグメント、およびファージディスプレイを含む発現ライブラリーによって産生されるフラグメントを含むが、これらに限定さない。抗体構造および用語については、例えば、Ｐａｕｌ、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３版、１９９３、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと。

用語「特異的に結合」または「特異的に免疫反応性」は、タンパク質またはその他の生物製剤の不均一集団の存在下で標的分析物の存在の決定因子である結合反応をいう。従って、指定されたアッセイ条件で、特定の結合部分は、特定の標的分析物に優先的に結合し、そして試験サンプル中に存在する顕著な量のその他の成分には結合しない。このような条件下の標的分析物への特異的結合は、特定の標的分析物に対するその特異性について選択される結合部分を必要とし得る。種々の免疫アッセイ形式が特定の抗原と特異的に免疫反応性の抗体を選択するために用いられ得る。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイは、分析物と特異的に免疫反応性のモノクローナル抗体を選択するために慣用的に用いられている。特異的免疫反応性を決定するために用いられ得る免疫アッセイフォーマットおよび条件の説明については、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｒｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと。代表的には、特異的または選択的反応は、バックグラウンドの少なくとも２倍、そしてより代表的には、バックグラウンドの１０〜１００倍以上の信号／ノイズ比を提供する。

本明細書で用いられるとき、用語「標識」および「検出可能な標識」は、検出し得る分子をいい、放射活性同位体、蛍光剤、化学発光剤、発色団、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、発色団、色素、金属イオン、金属ゾル、リガンド（例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンまたはハプテン類）などが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で用いられるとき、「固体支持体」は、プラスチックプレート、磁性ビーズ、ラテックスビーズ、マイクロタイタープレートウェル、ガラスプレート、ナイロン、アガロース、アクリルアミドなどのような固体表面をいう。

２つの分子または分子と分子の複合体の結合を参照して「特異的」は、一方の他方に対する特異的な認識、ならびにその他の分子の実質的により少ない認識およびこのような他の分子との安定な複合体の形成の欠如と比較したとき、安定な複合体の形成をいう。特異的結合の例は、抗体−抗原相互作用、酵素−基質相互作用、ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションおよび／または二本鎖の形成、細胞レセプター−リガンド相互作用などである。

（ＩＩ．総説）
本発明は、定性的ならびに定量的免疫アッセイおよび化学的アッセイを実施するために用いられ得る使い捨て可能なストリップに関する。このストリップ上には、少なくとも３つのウェルがあり、ここで、これらウェルは、キャピラリーチャネルを経由して互いと流体連通であり得る。１つのウェルには、分析のために、サンプル、好ましくは液体サンプルが配置される。このサンプル流体は、キャピラリーチャネルを経由して他の２つのウェル中に移動する。複数のウェルの１つは、サンプル中の総分析物を測定する標準として供され得る。その他のウェルは、反応ウェルとして供され得、そこでは、サンプルの個々の成分が同定され得る。上記使い捨て可能なストリップは、サンプル中の個々の成分およびサンプル中の総分析物を検出する分析器（本明細書では「ベース」とも称される）中に配置され得る。この分析器は、この分析の結果、およびアッセイの操作の間に提供される指示を表示し得る表示システムを含む。

１つの適用では、ヒト赤血球細胞中のヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）である総ヘモグロビン％が決定され得る。被験体からの血液は、サンプルウェル中に配置され得る。この血液は、キャピラリーチャネルを経由して他の２つのウェル中に移動される。参照ウェルには、細胞を溶解する試薬が配置され得、それによって、赤血球細胞からヘモグロビンを放出する。この参照細胞中のヘモグロビンの濃度は、赤外線測定または紫外線測定を用いて測定され得る。反応ウェルには、溶解物、既知量のＨｂＡ１ｃに特異的な抗体、および磁気撹拌バーが配置され得る。血液がこの反応ウェル中に移動するとき、この磁気撹拌バーは、このウェル中の液体を撹拌し、それによってそれらを良く撹拌する。上記溶解物は、細胞を溶解し、そして上記抗体は、ＨｂＡ１ｃに結合する。所定時間の後、上記表示は、オペレーターに、この反応ウェルに希釈剤を添加することを指示し得る。この希釈剤は、反応チャンバー中の液体を別のキャピラリーチャネルを通って、１つ以上の捕捉ゾーンに向かって押す。この捕捉ゾーンは、それらの上に、結合した抗体複合体のみに結合する固定化された抗原、そしてこのゾーンの別個の部分上には、すべての抗体に結合する他の抗原を有する。この抗体−ＨｂＡ１ｃ複合体は、この捕捉ゾーンの第１の部分にある抗原によって捕捉され得、そしてすべての抗体は、この捕捉ゾーンの後者の部分にある抗原によって捕捉され得る。検出システムを用いて、この捕捉ゾーンの第１の部分および第２の部分中に結合した抗体を検出するのに用いられ得る。これら２つのゾーンの比および／または合計を用いて、サンプル中に存在するＨｂＡ１ｃの量を定量し得る。参照細胞からの総ヘモグロビンに対する第１のゾーンの比は、この血液サンプル中のＨｂＡ１ｃの％を提供し得る。これらの結果は、上記表示システム上で表示され得る。

（ＩＩＩ．微小機械システム）
本発明は使い捨て可能なストリップ、ポータブルハンドヘルド機械（すなわち、ベース）、および使い捨て可能なストリップおよびベースとの組み合わせを提供する。このストリップは、アッセイを実施するため、分析物を検出するため、および指示および結果のような情報を表示するための機械上に配置され得る。この使い捨て可能なストリップの１つの局面は、図１に示される。この使い捨て可能なストリップは、少なくとも１つの支持体中に存在する溝を備えて２つ以上の固体支持体を一緒に接続することにより作製され得る。この固体支持体は、矩形、円形、卵形、または任意の形状であり得る。この支持体は、良好な熱伝導性、光学的透過のための透明性、容易な溶接のための機械的性質、均一コーティングおよび試薬の安定性を可能にする表面性質、およびアッセイの妨害を防ぐための液体媒体に対する中性度のようなその性質を基に選択される適切な材料から作製され得る。この目的のために、適切なプラスチックは、高自由表面エネルギーおよび低水吸着性のようなプラスチックを含み、ＰＥＴＧ、ポリエステル（Ｍｙｌａｒ（登録商標））、ポリカーボネート（Ｌｅｘａｎ（登録商標））、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ＳＡＮ、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン（ＡＢＳ）、特に、とりわけ、Ｃｙｃｏｌａｃの商標名の下、Ｂｏｒｇ Ｗａｒｎｅｒによって提供されるＡＢＳが挙げられる。この固体支持体が、疎水性プラスチックであるとき、それは、プラズマエッチングによる、およびコロナ処理によるような、当該技術分野で公知の方法よって処理されてこれら表面に親水性を与え得る。あるいは、または、等価に、市販され、利用可能な成形された固体支持体が、本発明の実施で用いられ得る。

例示の目的のために、本発明のこの実施形態は、２つの固形支持体を接続することにより形成される使い捨て可能なストリップを参照することにより記載される。この固形支持体の少なくとも１つは、反応チャンバー５および７として供される溝または腔、およびキャピラリーチャネル２および８を有する。この溝は、任意の幾何学的形状であり得、そして好ましくは円形である。この溝は、サンプルを保持し、そして反応が起こることを可能にするに十分な容量である寸法を有する。従って、この円形溝は、支持材料の長さおよび幅に依存して、約０．０１ｍｍ〜約１００ｍｍの間の直径を有し得、そしてこの支持材料の厚みに依存して、約０．００１ｍｍ〜約４ｍｍの高さを有し得る。この溝の直径および高さは、当業者によって容易に決定され得る。本発明の１つの局面では、支持片の１つは、ベント穴３および６として供される溝まで穿孔された穴を有する。さらに、これら穴は、サンプル付与ウェル１のような、サンプルが配置されるウェルへの接近を可能にする。これら２つの片を接続する前に、移動可能な部材４が、所望の反応チャンバー５中に挿入され得る。

成形プロセスでは、エネルギー方向付けリッジが、２つのプラスチック片の少なくとも１つの溝の周縁に隣接する輪郭上に少なくとも必要である。超音波で溶接されるとき、これら２つのプラスチック片は、エネルギーリッジに沿って一緒に接着され、これらチャンバーおよびチャネルの周りで空気密なシールを形成し、この反応チャンバーから外部へ接近は、ベント穴およびサンプル付与ウェルのみである。この反応チャンバーの表面は、移動可能な部材との使用のために、必要に応じて、わずかにテクスチャード加工され得る。このテクスチャード加工は、脱接続圧力Πを収容し得る。Πは、所定の分離を維持するためにプレート間でこの媒体に付与されなければならない、媒体に浸漬された２つのプレートの場合、外部圧力を超える圧力である。この場合、Πは、数に関しては、上記移動可能な部材と反応チャンバー表面との間の単位面積あたりの誘引または反発のまさにその力である。移動可能な部材が幅広くなるほど、上記表面間の圧力は大きくなり得、そしてテクスチャード加工は、この移動可能な部材の反応チャンバーの壁への任意の所望されないクランプ留めをなくし得る。脱接続圧力に対するより一般的な定義は、

である。

移動可能な部材４は、外部の磁気移動デバイスによって誘引および駆動され得るように、ステンレス鋼またはステンレス鋼と任意のその他の所望される材料との組み合わせの使用によって作製され得る。この材料は、腐食を防ぐためのステンレス鋼被覆との、または特定分子の結合のために特異的に被覆された任意の形態の磁化可能な合金であり得る。この移動可能な部材の厚みは、上記反応チャンバーの高さに基づく。それは、反応チャンバー中に適合され、そして自由に動くに十分小さくなければならない。高さ０．０１０インチの反応チャンバー腔には、この移動可能な部材の厚みは、約０．００７〜約０．００８インチの間であり得る。

上記サンプルを反応チャンバーに、ならびに塩および糖溶液のようなその他の試薬をキャピラリーチャネルに付与する様式は、噴霧、塗布、凍結乾燥、蒸発、吸着、共有結合などが挙げられる。大きな粒子成分をもつ試薬には、スプレー塗布または凍結乾燥が適切であり得る。ピコリットルの液滴サイズ生体試料堆積物は、液滴のサイズに起因して室温で分与されるとき即座に乾燥する。

アセンブルされた使い捨て可能なストリップは図２に示され、ここで、５は吸収パッド、７は内部参照部材ストリップ、９はキャピラリーチャネル、１１は反応チャンバー、１３はキャピラリーチャネル、１５はサンプル容器、１７はサンプル付与ポート、１９は反応チャンバー、２１は移動可能部材、２３はベース部材２５上の捕捉ゾーンである。

図３は、使い捨て可能なストリップが試験サンプルを付与する前に挿入される分析器の主要構成要素の透視図である。この使い捨て可能なストリップは、ベース上４６に位置決めされ得る。このストリップは、その中に包埋されるか、または緊密に近接するが、信号が反応チャンバーを通過するように配列されるセンサー（エミッターおよび／または検出器）を収容し得るヒーターアセンブリ４４の上部に配置され得る。エミッター、検出器、またはその両方としてまた供され得る別のセットのセンサーが、使い捨て可能なストリップの他方の側面上に位置決めされ得る（図示せず）。反射ビーム配列である検出器およびエミッターが、用いられる検出機構に依存して、このストリップの同じ側面上に存在し得ることが理解されるべきである。この検出機構は、光学的検出方法に制限されず、電気的、放射活性、および他の方法のようなその他の方法がまた、用いられ得る。電気表示窓３０としては、液晶ディスプレイ、ＬＣＤが挙げられるがこれに限定されず、２８は、このＬＣＤ上に表示されるメニューからの機能選択のためにメンブレン上のスイッチまたはキーを提示する。電気ボード３６は、この分析器の操作および機構を制御するマイクロプロセッサーを備える。電力は、バッテリー３８によって、または任意のその他の交流電源の供給源によって提供され得る。モーター４０は、磁石４２を駆動し、そしてこの２つは、ロッドによるように連結され得る。このモーターおよび磁石の規定された運動パータンは、上記使い捨て可能なストリップの１つ以上の反応チャンバー中の移動可能な部材の対応する運動を生成する原因である。３２は、外部電源へのコネクターを表し、そして３４は、データ出力のためのコネクターを表す。

本発明の使い捨て可能なストリップおよび関連する方法との使用のための自動化検出用の検出システムの例は、励起源、モノクロメーター（またはスペクトル的に光成分を解像し得る任意のデバイス、または狭バンドフィルターのセット）および検出器アレイを備える。この励起源は、赤外波長、青色波長またはＵＶ波長を含み得、そして励起波長は、検出されるべき放射波長（単数または複数）より短くあり得る。この検出システムは：前部にフィルターを備えたジュウテリウムランプのような広帯域ＵＶ光供給源；所望の波長を抽出するための、モノクロメーターを通過した後のキセノンランプまたはジュウテリウムランプのような白色光供給源の出力；または、制限されないで、任意のアルゴンイオンレーザーライン（４５７、４８８、５１４など、ｎｍ）またはＨｅＣｄレーザーを含む多くの連続波（ｃｗ）ガスレーザーのいずれか；ＧａＮおよびＧａＡｓ（二重）をベースにしたレーザーまたはＹＡＧまたはＹＬＦをベースにしたレーザーの二重または三重出力のような青色の半導体ダイオードレーザー；または青色の出力をもつ任意のパルス化レーザーであり得る。

反応ウェル中のサンプルまたは反応物から発せられる光は、基質についてのスペクトル情報を提供するデバイス、例えば、回折格子分光計、プリズム分光計、造影分光計など、または干渉（帯域通過）フィルターの使用で検出され得る。ＣＣＤカメラのような二次元領域造影具（ｉｍａｇｅｒ）を用い、多くの目的物が同時に造影され得る。スペクトル情報は、異なる帯域通過フィルター、長帯域フィルター、または短帯域フィルター（干渉フィルター、もしくは電子的に整調可能なフィルターが適切である）を経由して１つ以上のイメージを収集することにより生成され得る。１つ以上の造影具を用いて専用のフィルターを通じて同時にデータを集め得るか、または単一の造影具の前のフィルターが変更され得る。Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍのような、造影に基づくシステムは、表面を走査して蛍光信号を見出す。

このシステムのために適切なその他の実施形態は、全体のストリップシステム内で連続性および方向付けられたサンプル流れを可能にする様式で位置決めされるこのストリップの一部分として試薬でコートされたメンブレンシステムの使用を含む。この感知システムは、分析物または試験される応答についてこのストリップのメンブレン部分をモニターし得るよう位置決めされ得る。

（ＩＶ．操作）
図３に示されるデバイスの操作の一般的モードは、図１および２に示される使い捨て可能なストリップの、このストリップを１つの位置のみに可能にする容器中への挿入を含む。特異的な温度要求をもつアッセイには、ヒーターアセンブリ４４が、マイクロプロセッサーによって制御される所望の温度にこの使い捨て可能なストリップを加熱する。このストリップが挿入され、そして分析器がスイッチオンされた後、ＬＣＤは、オペレーターが従い得る単純なステップを促し、これには、サンプル容器へのサンプルの添加が含まれる。この器具は、必要に応じて、反応チャンバー中のサンプルの適切な量の存在を決定するためのセンサー、ならびにアッセイのタイミングを開始および停止するための機構を有し得る。このセンサーは、反応チャンバーの壁を通って発せられ、かつ方向付けられる光学的信号の伝達を測定することのような、反応の終了からの信号を検出する。

付与されたサンプルは、キャピラリーチャネルを経由して種々の反応チャンバー中に正確に分与される。これら反応チャンバーの位置決めは、たとえ、これらがサンプルプールからの共通のサンプルを共有しても種々の反応チャンバー中で独立の反応が起こるようであり得る。上記移動可能な部材の移動の規定されたモードは、試薬およびサンプル混合物の適正な混合を確実にし、そしてまた、チャンバー間の試薬およびサンプル交換に寄与する。分析物の定量を必要とするアッセイには、上記感知システムは、所望の終点が達成されるまで、１つ以上の反応チャンバー、メンブレンシステムまたは上記移動可能部材のいずれかにおける変化をモニターする。まさに分析物の存在の決定を要求するアッセイには、この感知システムは、適切な持続時間の間、上記ストリップの特定部分をモニターする。マイクロプロセッサーは、これらの結果を定量的または定性的に算出し、これらは、ＬＣＤ上に表示される。ストリップは、次いで、アッセイの終わりで取り出され、そして棄てられる。

従って、オペレーターは、ストリップを分析器中のストリップ容器中に挿入する。オペレーターは、次いで、スタートボタンを押し、これは、ストリップそれ自体によって自動的に起動され得、サンプルの滴を添加する催促を待ち、そして次に、アッセイのタイプに依存して、代表的には、２〜３分または秒内にディスプレイから結果を得る。

（Ｖ．ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）の検出）
糖化ヘモグロビンは、ヘモグロビン分子へのグルコースの付着を通じて形成される一連の小数のヘモグロビン成分をいう。ヒト赤血球細胞は、グルコースを自由に糖化可能である。各赤血球細胞内で、糖化ヘモグロビンは、周囲グルコース濃度に直接比例する速度で形成される。循環赤血球細胞中の総ヘモグロビンの約９７％はヘモグロビンＡである。ヘモグロビンＡは、４つのポリペプチド鎖、すなわち、２つのａ鎖および２つのｂ鎖からなる。ヘモグロビンＡの糖化は、各ｂペプチド鎖のＮ末端バリンアミノ酸とのグルコースの共有結合を通じて起こる。不安定なシッフ塩基（アルジミン）が初めに形成され、これは、次に、不可逆的なアマドリ転移を受け、安定なケトアミンであるヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）を形成する。

ヘモグロビンＡを含む赤血球細胞の寿命は、平均１２０日である。ＨｂＡ１ｃに糖化されるヘモグロビンＡの％は、赤血球細胞がグルコースに曝される時間、および遭遇する平均グルコース濃度に直接比例する。ＨｂＡ１ｃフラクションの測定は、赤血球細胞の半減期の間、すなわち、持続する６０日に亘る平均血中グルコース濃度の総合状況を与える。ＨｂＡ１ｃのレベルは、通常、総ヘモグロビンの％として現される。

通常の被験体では、ＨｂＡ１ｃは、代表的には、総ヘモグロビンの３〜６％の範囲にある。上昇したグルコースレベルをもつ患者、例えば、１型および２型糖尿病の場合では、このレベルは、通常の上限の２倍以上に上昇し得る。

糖尿病におけるグルコースレベルの長期間制御は非常に重要である。多年に亘る血液中の多過ぎるグルコースは、眼、腎臓および神経を損傷し得る。それはまた、心臓および血管の疾患のリスクを増加する。総ヘモグロビンの％としてのＨｂＡ１ｃの測定は、グルコースレベルの長期間制御を評価する価値ある手段を提供し、そしてまた、１型および２型糖尿病を識別するための重要な危険因子となる。

被験体からの血液のサンプルは、使い捨て可能なストリップのサンプルウェル１５中で堆積されて得られ得る（図２）。この血液は、キャピラリーチャネル１３を経由して反応チャンバー１１および１９に移動する。この反応チャンバー１１は、対照として供され得、そこでは、総ヘモグロビンが測定される。反応チャンバー１９は、血液サンプル中のＨｂＡ１ｃを測定する。ＨｂＡ１ｃの総ヘモグロビンに対する比は、ＨｂＡ１ｃである総ヘモグロビンの％を提供する。

反応チャンバーの両方は溶解試薬を含む。この溶解試薬は全血サンプルを溶解し、それによってヘモグロビンを放出する。この溶解試薬は、代表的には界面活性剤であり、そして好ましくは、例えば、ＴＲＩＴＯＮ^ＴＭＸ−１００のような非イオン性界面活性剤である。反応チャンバー１９は、ＨｂＡ１ｃを検出し得る抗体をさらに含む。この抗体は、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体（Ａｂ）、または抗原結合部位、または相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、Ｆ（ａｂ’）_２もしくはＦａｂフラグメントのような、Ａｂフラグメントであり得る。検出可能部分または標識は、放射活性、蛍光もしくは化学発光基質、または酵素であり得る。あるいは、一次Ａｂの種特異的Ｆｃフラグメントを認識する標識された二次Ａｂもまた用いられ得る。さらに、この抗体は、検出可能標識で標識され得る。

１つの局面では、この検出可能標識は蛍光分子である。適切な蛍光標識の例としては、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、５，６−カルボキシメチルフルオレセイン、テキサスレッド、ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル（ＮＢＤ）、クマリン、ダンシルクロライド、ローダミン、４’−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、およびシアニン色素Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７が挙げられる。好ましい蛍光標識は、フルオレセイン（５−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ローダミン（５，６−テトラメチルローダミン）、置換ローダミン化合物、およびシアニン色素Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７である。これらの蛍光発色団について最大吸収および最大放射はそれぞれ：ＦＩＴＣ（４９０ｎｍ；５２０ｎｍ）、Ｃｙ３（５５４ｎｍ；５６８ｎｍ）、Ｃｙ３．５（５８１ｎｍ；５８８ｎｍ）、Ｃｙ５（６５２ｎｍ；６７２ｎｍ）、Ｃｙ５．５（６８２ｎｍ；７０３ｎｍ）およびＣｙ７（７５５ｎｍ；７７８ｎｍ）であり、それ故、それらの同時の検出を可能にする。これら蛍光標識は、種々の商業的供給元から入手され得、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲおよびＲｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃｓ、Ｃｌｅａｖｅｌａｎｄ、Ｏｈｉｏを含む種々の商業的供給元から入手され得る。別の代替物として、付加された標識の代わりに、結合されたヘモグロビン自体が、そのペルオキシダーゼ様性質に起因して、検出可能な信号を生成し得る。これは、別の基質（例えば、イソルミノール）の添加ありまたはなしで、過酸化水素を添加することにより達成される。

上記２つの反応ウェル中の細胞は溶解される。参照ウェル１１では、ヘモグロビンの総量は、ＵＶ領域または赤外領域において測定することのような、分光学的方法によって得られ得る。分光学装置は、当該技術分野で公知であり、そして上記ポータブルハンドヘルド機械内に取り込まれる。特に、測定は、８８０ｎｍおよび５８０ｎｍでなされ得る。反応ウェル１９では、抗体がＨｂＡ１ｃに結合する。完全な反応を確実にするために、反応ウェル中の液体は、磁石によって撹拌され、そして必要に応じてより高い温度まで加熱され得る。

反応の終了に際し、希釈剤がサンプルウェル１５に添加され得る。この希釈剤は、１９中の反応物を、キャピラリーチャネル９を通って、捕捉ゾーン２３に向かって移動させる。この捕捉ゾーンは、抗原もしくは抗体−ＨｂＡ１ｃ複合体に特異的に結合し得るその他の化合物、任意の抗体など、またはその組み合わせであり得る。従って、１つの局面では、第１の捕捉ゾーンは、抗体−ＨｂＡ１ｃ複合体に特異的に結合し得る抗原を含み、その一方、第２の捕捉ゾーンは、抗体および抗体−ＨｂＡ１ｃ複合体に結合し得る抗原を含む。吸収パッド５は全ての液体を吸収し、そしてメンブレンを通ってウェルから液体を引く際に支援し得る。

各捕捉ゾーン中の物質の量は、上記に記載の検出システムを用いることにより決定され得る。較正物質または標準物質がアッセイとともに測定され、測定された信号を用い、サンプル中の上記％ＨｂＡ１ｃが決定される較正（または標準）曲線を提供する。すべての捕捉ゾーンの合計は、好ましくは、反応ウェル中に配置された抗体の量に等しく、そして生じた反応の％を決定するための内部コントロールを提供し得る。抗体−ＨｂＡ１ｃ複合体の濃度は、第１の捕捉ゾーンの読み取り値から決定され得る。血液サンプル中の％ＨｂＡ１ｃは、この抗体−ＨｂＡ１ｃ複合体の濃度をヘモグロビンの総濃度で除することによって決定され得る。

別の局面では、参照メンブレン７（図２）が使い捨て可能なストリップ中に含められ得る。この参照メンブレンは、その上に堆積された、既知濃度の抗原−抗体−ＨｂＡ１ｃ複合体、および抗原−抗体複合体を有し得る。この参照メンブレンからの分光光度法測定は、活性メンブレン２５からの読み取り値を較正するために用いられ得る。

本発明を詳細に示し、そして好ましい実施形態および種々の代替の実施形態を参照して説明したが、当業者によって、形態および詳細における種々の変更が、本発明の思想および範囲から逸脱することなくその中でなされ得ることが理解される。本出願で言及されるすべての印刷された特許および刊行物は、本明細書によって、この言及によってそれらの全体が本明細書中に援用される。

図１は、相互連結された反応チャンバーのセットおよびこれらチャンバーの１つにある移動可能な部材を備えた、使い捨て可能なストリップの斜視図を示す。 図２は、血液成分を単離するためにアセンブルされたメンブレンの複合体を備え、そして所望の分析物を適正な捕捉ゾーンに向ける使い捨て可能なストリップの別の図を示す。 図３は、明細書に詳細に記載されるようなベースデバイス中の主要構成要素の透視図を示す。

Claims (27)

1. サンプル中の選択された分析物の存在を検出または定量するための使い捨て可能なストリップであって：
   サンプル収集ウェル、参照ウェル、および反応ウェルを備え、ここで、該複数のウェルが第１のキャピラリーチャネルを経由して流体連通し、該選択された分析物に特異的な抗体が該反応ウェル中に堆積されている第１の固形基板；
   複数の穴を備える第２の固形基板であって、ここで、該第１の固形基板と該第２の固形基板が接続され、そして該複数の穴が該複数のウェルと連通する第２の固形基板；および
   少なくとも１つの捕捉ゾーンを有するメンブレンであって、該メンブレンが第２のキャピラリーチャネルを経由して該反応ウェルに連結され、該捕捉ゾーンが、該抗体、該抗体と該選択された分析物とによって形成された複合体、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する化合物を有するメンブレンを備える、使い捨て可能なストリップ。
2. 前記第１の基板および第２の基板が矩形である、請求項１に記載の使い捨て可能なストリップ。
3. 前記基板が、プラスチック、ガラス、ナイロン、金属、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の使い捨て可能なストリップ。
4. 前記基板がプラスチックである、請求項３に記載の使い捨て可能なストリップ。
5. 前記反応ウェル中に撹拌バーをさらに備える、請求項１に記載の使い捨て可能なストリップ。
6. 前記抗体がＨｂＡ１ｃに特異的である、請求項１に記載の使い捨て可能なストリップ。
7. 前記参照ウェルおよび反応ウェルが溶解試薬を含む、請求項１に記載の使い捨て可能なストリップ。
8. 前記溶解試薬が非イオン性界面活性剤である、請求項１に記載の使い捨て可能なストリップ。
9. 前記メンブレンが、吸収パッドと前記反応ウェルとの間に配置される、請求項１に記載の使い捨て可能なストリップ。
10. サンプル中の選択された分析物の存在を検出または定量するための使い捨て可能なストリップであって：
    サンプル付与ウェル、参照ウェル、および反応ウェルを備え、ここで、該複数のウェルがキャピラリーチャネルを経由して流体連通し、そしてここで、該参照ウェルが第１の溶解試薬を含み、そして該反応ウェルが第２の溶解試薬、該選択された分析物に特異的な抗体、および撹拌バーを含む第１の固形基板；
    複数の穴を備える第２の固形基板であって、ここで、該第１の固形基板と該第２の固形基板が接続され、そして該複数の穴が該複数のウェルと連通する第２の固形基板；および
    少なくとも１つの捕捉ゾーンを有するメンブレンであって、第２のキャピラリーチャネルを経由して該反応ウェルに連結され、該捕捉ゾーンが、該抗体、該抗体と該選択された分析物とによって形成された複合体、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する化合物を有するメンブレンを備える、使い捨て可能なストリップ。
11. 前記第１の基板および第２の基板が矩形である、請求項１０に記載の使い捨て可能なストリップ。
12. 前記基板が、プラスチック、ガラス、ナイロン、金属、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１０に記載の使い捨て可能なストリップ。
13. 前記基板がプラスチックである、請求項１２に記載の使い捨て可能なストリップ。
14. 前記第１および第２の溶解試薬が非イオン性界面活性剤である、請求項１０に記載の使い捨て可能なストリップ。
15. 前記抗体がＨｂＡ１ｃに特異的である、請求項１０に記載の使い捨て可能なストリップ。
16. ＨｂＡ１ｃであるヘモグロビンの％を決定するための方法であって：
    サンプルウェル、参照ウェル、および反応ウェルを備える第１の固形基板を含む使い捨て可能なストリップであって、ここで、これらウェルは、第１のキャピラリーチャネルを経由して流体連通にあり、そしてここで、該参照ウェルは第１の溶解試薬を含み、そして該反応ウェルは第２の溶解試薬、ＨｂＡ１ｃ特異的抗体、および撹拌バーを含む、第１の固形基板；穴を備える第２の固形基板であって、ここで、該第１の固形基板と第２の固形基板は接続され、そして該穴は、該ウェルと連通する第２の固形基板；および捕捉ゾーンを有するメンブレンであって、ここで、該メンブレンが、第２のキャピラリーチャネルを経由して上記反応ウェルに連結される捕捉ゾーンを有するメンブレンを備える使い捨て可能なストリップを提供する工程；
    サンプルをサンプル付与ウェル中に配置する工程；
    希釈剤をこのサンプル付与ウェルに添加する工程；
    参照細胞からの総ヘモグロビンおよび捕捉ゾーンからの総ＨｂＡ１ｃを決定する工程；および
    該総ＨｂＡ１ｃを総ヘモグロビンで除し、ＨｂＡ１ｃであるヘモグロビンの％を得る工程、を包含する方法。
17. 前記第１の基板および第２の基板が矩形である、請求項１６に記載の方法。
18. 前記基板が、プラスチック、ガラス、ナイロン、金属、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
19. 前記基板がプラスチックである、請求項１８に記載の方法。
20. 前記第１および第２の溶解試薬が非イオン性界面活性剤である、請求項１６に記載の方法。
21. 前記メンブレンが２つ以上の捕捉ゾーンを含む、請求項１６に記載の方法。
22. １つの捕捉ゾーンが、抗体−ＨｂＡ１ｃ複合体に特異的に結合する抗原を含み、そして別の捕捉ゾーンが、抗体に特異的に結合する抗原を含む、請求項２１に記載の方法。
23. 総ＨｂＡ１ｃがＵＶ測定によって決定される、請求項２２に記載の方法。
24. 総ヘモグロビンがＵＶ、ＩＲまたはそれらの組み合わせによって決定される、請求項１６に記載の方法。
25. 総ヘモグロビンが、５８０ｎｍおよび８８０ｎｍ光を用いて分光光度法により決定される、請求項１６に記載の方法。
26. 前記メンブレンが、２つ以上の捕捉ゾーンを備える、請求項１または１０に記載の使い捨て可能なストリップ。
27. １つの捕捉ゾーンが、前記抗体と前記選択された分析物とによって形成された複合体に特異的に結合する抗原を含み、そして別の捕捉ゾーンが該抗体に結合する抗原を含む、請求項２６に記載の使い捨て可能なストリップ。

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