JP4564375B2

JP4564375B2 - テアニンの製造方法

Info

Publication number: JP4564375B2
Application number: JP2005046543A
Authority: JP
Inventors: 幸隆岡田; 誠小関; 暢之青井
Original assignee: Taiyo Kagaku KK
Current assignee: Taiyo Kagaku KK
Priority date: 2004-08-18
Filing date: 2005-02-23
Publication date: 2010-10-20
Anticipated expiration: 2025-02-23
Also published as: JP2006083155A

Description

本発明はテアニンの新規な製造方法に関する。

テアニンは緑茶の旨味の主要成分として知られ、茶をはじめとする食品の香味成分として重要な物質である。また一方、テアニンを含めてγ−グルタミル誘導体は、動・植物体における生理活性物質として作用することが指摘されている。例えば、Ｃｈｅｍ．Ｐａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，１９（７）１３０１−１３０７（１９７１）には、テアニンやグルタミンがカフェインによって誘発される痙攣に拮抗することが報告されており、このことからこれらの化合物が中枢神経系に作用することが考えられ、生理活性物質としての有用性が期待されている。従来より、テアニンの製造法としては、テアニンを含有する玉露の生産用茶園において得られる茶葉乾燥物より抽出する方法が一般的である。しかし、この場合、テアニンは茶葉乾燥物あたりわずか１.５％前後程度しか蓄積されないことに加えて、一般の煎茶用茶園では光合成が活発であるため、テアニンが速やかに分解され、蓄積量が少ないのが実情である。従って、茶葉乾燥物からの抽出法では、工業的に十分な量のテアニンを生産することが難しく、実用的ではないことが指摘されている。

テアニンの化学的合成法としては、特公昭２７−３４１７号には、Ｌ−ピログルタミン酸とエチルアミンを加圧・加熱下で反応させる方法が開示されている。また、特公昭３７−１１６６１号には、上記方法でＬ−ピログルタミン酸の金属塩を用いる改良方法が開示されている。

その後、工業的製法として、例えば特開平５−７０４１９号公報等において、Ｌ−グルタミン酸のγ−カルボキシル基をベンジル化して保護すると共に、アミノ基をトリチル化して保護し、これをペプチド合成の出発原料とするテアニンの製造方法等が開示されている。
また、特開２０００−２６３８３号公報等において、Ｌ−グルタミン酸のα位のアミノ基をターシャルブチルオキシカルボニル基（ＢＯＣ）で保護し、かつカルボキシル基をターシャルブチルエステル（ＯｔＢｕ基）で保護し、これを出発原料とするテアニンの製造方法が開示されている。

特公昭２７−３４１７号公報特公昭３７−１１６６１号公報特開平５−７０４１９号公報特開２０００−２６３８３号公報

しかしながら、Ｌ−ピログルタミン酸を原料とした従来の製法は、反応時間が長く、Ｌ−グルタミン酸に保護基を導入する反応は、収率が低いという問題点があった。
本発明は上記した課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、テアニンの安全かつ高収率の製造方法を提供することにある。

本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、テアニンを製造する際に、グルタミン酸のα位のアミノ基をアダマンチルオキシカルボニル基（Ａｄｏｃ基）で保護した中間体を用いることを特徴とする。

このように本発明のテアニンの製造方法によれば、従来の化学合成法に比べて製造コストを大幅に安くすることができる。また、製造工程中に人体に有害な物質を使用しないため、得られたテアニンを食品添加物として安全に使用することができる。また、本発明の中間体を使用することにより、容易にテアニンを化学合成することができる。

次に、本発明の実施形態について、詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は、下記の実施形態によって限定されるものではなく、その要旨を変更することなく様々に改変して実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。

本発明でいうテアニンとは、茶の葉に含まれている茶の旨味の主成分であって、呈味を用途とする食品添加物として使用されている。具体的には、γ-グルタミルエチルアミド、Ｌ−グルタミン酸-γ-エチルアミド等と称する化合物である。

本発明でいうグルタミン酸誘導体とはグルタミン酸のカルボキシル基に保護基を導入したものであり、具体的な保護基としては、メチル、エチル、ｔ−ブチル、ベンジル、ニトロベンジル、アリルおよび９−フルオレニルメチルがあげられる。

グルタミン酸またはグルタミン酸誘導体のα位のアミノ基をアダマンチルオキシカルボニル基（Ａｄｏｃ基）で保護するための試薬は、塩化アダマンチルオキシカルボニル（１−Ａｄｏｃ−Ｃｌ）、フッ化アダマンチルオキシカルボニル（１−Ａｄｏｃ−Ｆ）等があげられる。

中間体からテアニンを合成する方法としては、γ-カルボキシル基とエチルアミンとを縮合剤を用いて反応させた後、脱保護によりテアニンを得ることができる。縮合剤とはペプチド合成におけるカルボキシ活性化剤のことで、具体的には、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−（３−1−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）等があげられる。脱保護も酸処理によって容易に行うことができる。具体的には、塩酸、硫酸、トリフルオロ酢酸等の処理があげられる。

本発明の方法によって合成されたテアニンを反応液から単離精製するには、公知のいかなるアミノ酸精製法を用いても良く、例えばカラムクロマトグラフィー、溶媒を用いた分配、透析、限外濾過、電気泳動、中性塩による分別塩析、アルコール、アセトンを用いる分別沈殿法、ＨＰＬＣなどを例示することができる。このうち溶媒分配および各種クロマトグラフィー、ＨＰＬＣを組み合わせることが好ましい。さらにＣＭ−セルロースカラムクロマトグラフィー、セファデックスＧ１５０カラムクロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー、ブチルトヨパールカラムクロマトグラフィーを組み合わせても良い。
なお、本発明によって製造されるテアニンは、Ｌ体に限られず、Ｄ体でもよい。

次に、本発明の実施形態について、実施例を参照しつつ詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は、下記の実施形態によって限定されるものではなく、その要旨を変更することなく、様々に改変して実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。

〔グルタミン酸誘導体〕
グルタミン酸をジオキサンに懸濁後、濃硫酸を加えて４℃に冷却した。同量のイソブチレンを加えて１２時間放置後、冷却１.５Ｍ−ＮａＯＨ中に添加、エーテル抽出を行い、エーテル層を分取後、減圧濃縮してグルタミン酸誘導体を得た。さらにジオキサン−水（２：１）に溶解後冷却し、１Ｍ−ＮａＯＨと１−Ａｄｏｃ−Ｃｌとを加えて室温で３０分混和し、その後減圧濃縮し、５％硫酸水素カリウム水溶液でｐＨ２.５にして酢酸エチルによる抽出を３回行った。酢酸エチル層を水洗し、無水硫酸ナトリウムで１２時間乾燥させた後減圧濃縮し、残留物を結晶化した後に、イソブチル基とＡｄｏｃ基で保護したグルタミン酸誘導体を得た。

〔テアニン誘導体〕
実施例１にて得られたイソブチル基とＡｄｏｃ基で保護したグルタミン酸誘導体６.０ｇをエタノール１００ｍｌに溶解し、冷却下で攪拌しつつ４−ハイドロキシフェニルジメチルスルフォニウムメチルサルフェイト（商品名：サンセラーＤＳＰ、以下ＤＳＰ）６.０ｇとジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）５.０ｇとを加えて尿素誘導体を析出、エチルアミン塩酸塩２.０ｇとジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）との混液を加えて３日間攪拌した。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で反応追跡して反応終了を確認した後、尿素誘導体（ＤＣＵｒｅａ）を濾別し、濾液を減圧濃縮し、残留物を酢酸エチルに溶解し、水で洗浄、酢酸エチル層に無水硫酸ナトリウムを加えて１２時間乾燥させた。その後硫酸ナトリウムを濾別し、濾液を減圧濃縮し、更に冷却下で石油エーテルを加えて結晶化後、イソブチル基とＡｄｏｃ基で保護したテアニン誘導体の結晶を得た（収率：９０重量％）。

ＨＰＬＣの定量条件は、下表の通りであった。

〔テアニンの精製〕
実施例２で得たテアニン誘導体０.５ｇとアニソール４０ｍｌとを冷却し、トリフルオロ酢酸２５０ｍｌを加えて混和後３０分間室温で放置した。その後濃縮してトリフルオロ酢酸を除去し、未反応物を酢酸エチルで抽出除去し、水層を強酸性陽イオン交換樹脂ＩＲ１１８Ｈ（オルガノ株式会社）に通して２％アンモニア水５０ｍｌで溶出し、エタノールで結晶化した（収率：９７重量％）。

この単離物質をアミノ酸アナライザー、ペーパークロマトグラフィーにかけたところ、テアニン標準物質と同じ挙動を示した。また、単離物質を塩酸あるいはグルタミナーゼで加水分解処理を行ったところ、１：１の割合でＬ−グルタミン酸とエチルアミンを生じた。このように、単離物質がグルタミナーゼによって加水分解されたことから、エチルアミンがＬ−グルタミン酸のγ位に結合していたことが示された。また、加水分解で生じたＬ−グルタミン酸がＬ型であることは、Ｌ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧｌｕＤＨ）により確認された。図１には、テアニン標品及び単離物質のＩＲスペクトルを示した。両物質は、共に同等のスペクトルを示した。これらのことから、単離物質がテアニンであることが確認された。また、得られたテアニンの^１Ｈ−ＮＭＲデータ、及び旋光度は以下の通りである。

^１Ｈ−ＮＭＲ（solvent，D_２O）は、δ(ppm)＝１.１６(t,3H, NHCH2CH3), ２.１８(m, 2H, CHCH2CH2COO), ２.４４(m, 2H, CHCH2CH2COO), ３.２５(quartet,2H, NHCH2CH3), ３.８１(t, 1H, CHCH2CH2CH2COO)であった。また、旋光度は、［α］_D ²⁰＋８.１°（Ｈ₂Ｏ）であった。
上記ＮＭＲ及び旋光度の結果より、得られたＬ−テアニンは、高純度品であることがわかった。

テアニン標品及び単離物質のＩＲスペクトルを示したグラフである。

Claims

グルタミン酸またはグルタミン酸のカルボキシル基にメチル、エチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ベンジル、ニトロベンジル、アリルおよび９−フルオレニルメチルからなる群から選択される一つの保護基を導入したグルタミン酸誘導体において、
α位のアミノ基を塩化アダマンチルオキシカルボニル（１−Ａｄｏｃ−Ｃｌ）およびフッ化アダマンチルオキシカルボニル（１−Ａｄｏｃ−Ｆ）からなる群から選択される一つの試薬によりアダマンチル化することでアダマンチルオキシカルボニル基（Ａｄｏｃ基）により保護した中間体を製造し、
この中間体のγ-カルボキシル基に、エチルアミンを、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）および１−（３−１−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）からなる群から選択される一つの縮合剤を用いて反応させた後、
塩酸、硫酸およびトリフルオロ酢酸からなる群から選択される一つの酸を用いて酸処理することにより脱保護してテアニンを得ることを特徴とするテアニンの製造方法。