JP4500942B2

JP4500942B2 - 核酸の転写方法及び転写装置並びに製品の真偽判別方法

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Publication number: JP4500942B2
Application number: JP2005181593A
Authority: JP
Inventors: 弓子宗像
Original assignee: 独立行政法人国立印刷局
Priority date: 2005-06-22
Filing date: 2005-06-22
Publication date: 2010-07-14
Anticipated expiration: 2025-06-22
Also published as: JP2007003257A

Description

本発明は、核酸の転写方法及び転写装置並びに製品の真偽判別方法に関するものである。

従来より、核酸（ＤＮＡ）を抽出する方法としては、核酸を含む部分を切り抜き、破断して抽出に用いる方法、吸い取り紙等による毛細管現象を利用した方法、電気泳動法などがある。

核酸を含む部分を切り抜き、破断して抽出に用いる方法では、破断のために元来の形状を保存することができない、破断のために多くの手間がかかる、また、十分に核酸が溶出できないといった問題があった。

吸い取り紙等による毛細管現象を利用した方法（例えば、特許文献1参照。）では、解析に充分な量の核酸を含んでいる場合でなければ、抽出することができないといった問題があった。

電気泳動法では、高圧電源装置と溶出転写専用の特殊装置を必要とし、また、抽出された核酸の小さな断片でなければ分離ができないので、液体法によって抽出された核酸の解析には不十分であった。

また、水平型サブマリンゲル電気泳動槽を傾斜させることにより、アガロースゲル内に、電気泳動方向に直交する方向成分を含む歪曲した電場を発生させることで核酸の分離をする方法及びその装置（例えば、特許文献２参照）がある。この装置を用いた方法では、解析に充分な量の核酸を含んでいる場合でなければ、抽出することができず、また、解析のためには長時間を要するといった問題があった。

さらに、一般的に、核酸を効率的に抽出することが困難であるため、ＩＲ発光等の副次的手段を用いて一次検知を行っていた。そのため、ＩＲ発光等の副次的材料のコストと、検出のための装備が必要になるなどの問題があった。

特許第３３６０２７０号公報特開２００１−２６４２９２号公報

本発明は、上記問題点に鑑みなされたものであり、その目的は、核酸を含む部分を破壊する必要がなく、また、多くの手間と時間と技術を必要とすることなく、効率的に核酸を溶出転写することができる方法及びその装置を提供するものである。

本発明の核酸の転写方法は、核酸含有基材から、その基材を破壊することなく、核酸を被転写材に転写する方法であって、前記核酸を含んだ基材に湿潤させた被転写材を接触させ、前記被転写材に電極を接触させ、電気泳動により、前記被転写材に核酸を溶出し、短時間で明確に転写することを特徴としている。

電極を一定の圧力で被転写材に接触させるようにする。

被転写材としては、濾紙、布、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲルである。

本発明の核酸の転写装置は、核酸含有基材から核酸を溶出し、被転写材に非破壊で転写する装置であって、電気泳動を生じさせるための一対の電極と、通電するための電源とを備えることを特徴としている。

本発明の核酸の転写装置に、核酸含有基材を載せる試料載置台と、一対の電極を支持する支持部材とを更に設けてもよい。

本発明の核酸の転写装置に、核酸含有基材のあらかじめ意図した箇所に位置合わせを行うことのできる位置合わせ部を更に設けてもよい。

本発明の核酸の真偽判別方法は、真偽を判定する対象製品を、一対の電極と電源とで構成される核酸転写装置の試料載置台に載置し、載置された対象製品に対して、真正製品のあらかじめ意図した箇所に含有させた核酸の箇所と同じ箇所に湿潤状態の被転写材を密着させて積層し、前記被転写材に前記一対の電極を接触し、電源より電気を流し、電気泳動により対象製品から核酸を溶出させ被転写材に転写し、前記核酸を転写した被転写材を破断し、バッファ液を用いて核酸を抽出し、前記核酸抽出液をＰＣＲ増幅し、得られた電気泳動パターンと、真正製品のあらかじめ意図した箇所から転写して得られた核酸の電気泳動パターンとを比較することを特徴としている。

製品の真偽判別に用いる核酸には、秘匿情報及び／又は個別情報が付与されている。

真偽判別に用いる製品としては、銀行券、パスポート、証券類又は貴重印刷物である。

本発明の核酸の転写方法により、核酸含有基材から、基材を破壊することなく、短時間で核酸を抽出することが可能となる。
また、被転写材と電極の形状を工夫することで、汎用性のある核酸転写装置とすることが可能である。
本発明に核酸の転写方法は、肉眼上検出しえないので、真偽を判定する製品に適用することで、容易に真偽判別することが可能となる。

本発明は、従来より用いられている電気泳動法を利用しているが、具体的には、核酸はマイナスに荷電しているので、電圧をかけることによりプラス極に移動し分離することが可能となることに基づいている。

以下、本発明の実施の形態について図面を参照して説明する。
核酸含有基材の基材としては、核酸を含有させることができる基材なら特にこだわらないが、基材が紙の場合には、核酸を漉き込んだ用紙、核酸を塗布した用紙、繊維にＤＮＡを付着させたＤＮＡ繊維等、また、印刷インキに核酸を含有させた印刷インキを用いて印刷した印刷物やカード用基材等をいう。本実施例では、核酸含有基材として核酸を含有させた印刷インキを用いて印刷した印刷物を、また、被転写材として濾紙を用いて説明するが、特に印刷物、濾紙にはこだわらない。図１は、核酸転写装置の一実施例をブロック図で示したものである。本実施の形態の核酸転写装置は、電極１、１’、電源２、電圧計３、電流計４、電極の支持体５及び試料載置台６から構成される。

さらに、図１に示すように、試料載置台６の下部から光を当てて、核酸含有基材の特定の位置と被転写材との位置合わせを行えるようにしてもよい。
このときの試料載置台６に光の導入路として穿つ穴の大きさは特にはこだわらないが、穴の大きさとしては１〜５ｍｍが適当であり、光源としては特にこだわらないが、本実施例では、熱をもたないＬＥＤを用いた。

核酸を含有した印刷物７を試料載置台６に載せ、この印刷物７の上に湿した濾紙８を密着させて置く。湿した濾紙８の形状はこだわらないが、印刷物７の核酸を含有した部分の一部又は全部を覆える大きさとする。また、濾紙の湿潤状態は特にはこだわらないが、転写に必要な電流が流れる程度とする。本実施例においては、５×１０ｍｍの濾紙を５μｌのバッファで湿して用いた。湿潤状態が不足の場合には、抵抗値が大きくなるために転写効率が悪くなり、過度の場合には、核酸を含有した印刷物７を損傷させるおそれもある。

次に、湿した濾紙８に電極１、１’を接触させると、電池が形成され、電流が流れる。その結果、電気泳動の原理により、湿した濾紙８に核酸が転写される。本実施例における溶出転写は短時間（１０分以内）で十分可能である。このとき、一定の直流電圧をかけると、核酸の転写効率は更に向上する。
このときの電圧は、０.１〜１００Ｖで、望ましくは１〜５０Ｖである。また、電流計４を用いて、電流で制御することも可能である。その場合は、湿した濾紙８に０.０００１〜１００ｍＡ、望ましくは０．００１〜１０ｍＡの電流が流れるようにする。接触時間としては、１０秒〜３分程度で良く、望ましくは３０秒〜１分程度で良い。

さらにまた、電極１、１’を接触させる場合に、湿した濾紙８と印刷物７とに一定の圧力がかかるように、電極の支持体５の重さを制御すると、核酸の転写効率は更に向上する。かける圧力は用いる電極により変わるが、本実施例においては、径２ｍｍの電極で、１００ｇ程度の加重をかけている。

転写終了後の湿した濾紙を破断し、バッファを用いて抽出を行い、その抽出液をＰＣＲ増幅し、増幅後のＰＣＲ産物を確認する。本実施例においては、一般的に核酸の抽出・増幅過程で必要とされる核酸のエタノール沈殿等の濃縮・クリーンアップ操作は不要である。

本実施例において、被転写材としては濾紙を用いているが、これに限るものでなく、布、アガロースゲル、ポリアクリルアミド等でもよい。

図２は、転写終了後の濾紙を破断して、濾紙に転写した核酸を抽出、増幅し、ゲル電気泳動を用いて検出を行った結果を示すものである。

レーン１、６は分子量マーカー、レーン２は印刷物に混合した核酸，レーン３は核酸を含有した印刷物から抽出した核酸のＰＣＲ増幅を行ったＰＣＲ産物、レーン４は核酸を含有した印刷物の上に湿した濾紙を置き、電極を３０秒間接触させた後に、濾紙のみを取り出し、転写された核酸を抽出してＰＣＲ増幅した後の産物、レーン５は核酸を含有した印刷物の上に湿した濾紙を置き、電極を接触させ、１０Ｖの電圧を３０秒間かけた後に、濾紙のみを取り出し、濾紙から核酸を抽出し、ＰＣＲ増幅を行ったＰＣＲ産物である。

図２から、印刷物に含まれる核酸が濾紙に転写されていることが分かる(レーン４、５)。また、その効果は、電圧をかけることでより効率的に行われていることが分かる(レーン５)。

図３は、比較対照として、転写の行われなかった例を示す図である。濾紙からの核酸の抽出・増幅は同一条件で行った。
レーン７、８は分子量マーカー、レーン９は印刷物に混合した核酸、レーン１０は印刷物から抽出した核酸をＰＣＲ増幅を行ったＰＣＲ産物、レーン１１は核酸を含有する印刷物の上に乾いた濾紙を置き、電極を３０秒間接触させた後、濾紙のみを取り出し、転写された核酸を抽出し、ＰＣＲ増幅した後の産物、レーン１２は核酸を含有する印刷物の上に湿した濾紙を置き、電極を接触させないで３０秒間放置した後に濾紙のみを取り出し、濾紙から核酸を抽出し、ＰＣＲ増幅を行ったＰＣＲ産物である。

図３から、乾いた濾紙を用いて電極を接触させた場合（レーン１１）、また、湿した濾紙を用いても電極に接触させない場合（レーン１２）には、印刷物に含まれる核酸が濾紙に転写されなかった。これは、電池が形成されないためである。

本発明の核酸の転写方法を応用して、製品の真偽判別に用いる方法の実施例を説明する。任意の図柄、模様、記号などを施し、あらかじめ意図した箇所に核酸を含有した真正印刷物を製造する。核酸には、個別情報や秘匿情報を付与しておくことにより、真偽判別を更に容易にすることが可能となる。核酸を付与した個所は肉眼上検出しえないので、製造者のみが知りえる情報である。この真正印刷物を製造する方法としては、色々な製造方法が考えられるが、本実施例において、真正印刷物は、本発明者等が先に出願した特開２００４−１５７０２１号公報に開示している印刷物のような、基材上に施される図柄の一部に、識別情報を付与した少なくとも１種類のＤＮＡを含むインキと、識別情報を付与しない少なくとも１種類の前記ＤＮＡとは異なるＤＮＡを含むインキとを用いて、任意の図柄、模様、記号などを印刷又は塗布して製造する印刷物である。

真偽を判定する対象印刷物を、一対の電極と電源とで構成される核酸転写装置の試料載置台に載置し、載置された対象印刷物が、真正印刷物のあらかじめ意図した箇所に含有させた核酸の箇所と同じ箇所に核酸があるか否かをまず確認する。確認の方法としては、湿潤状態の被転写材を対象印刷物の核酸含有位置、すなわち、真正印刷物に付与された核酸の位置と同じ位置に密着させて積層し、前記被転写材に前記一対の電極を接触し、電源より電気を流し、電気泳動により対象印刷物から核酸を溶出させ被転写材に転写し、前記核酸を転写した被転写材を破断し、バッファを用いて核酸を抽出し、前記抽出液をＰＣＲ増幅し、得られた電気泳動パターンと、前記真正印刷物のあらかじめ意図した箇所から転写して得られた核酸の電気泳動パターンとを比較し、対象印刷物が真正であるか否かの真偽判別をする。電気泳動パターンが得られない場合は、核酸が含有されていないことになる。

さらに必要ならば、ＤＮＡの塩基配列情報の解読を行ってもよい。本実施例においては、前記核酸を転写した被転写材を破断し、バッファを用いて核酸を抽出し、前記抽出液をＰＣＲ増幅し、得られた電気泳動パターンと、前記真正印刷物のあらかじめ意図した箇所から転写して得られた核酸の電気泳動パターンとを比較し、対象印刷物が真正であるか否かの真偽判別を行っているが、一例として、前記抽出液を用いて、等温遺伝子増幅法を用いてＤＮＡの増幅を行い、プローブ及び抗体を用いて増幅物を検出するなどの他の公知技術を用いても良い。

本実施の形態の核酸転写装置のブロック図である。ゲル電気泳動の結果を示す図である。比較例のゲル電気泳動の結果を示す図である。

符号の説明

１、１’ 電極
２電源
３電圧計
４電流計
５電極の支持台
６試料載置台
７核酸を含有した物
８湿した濾紙

Claims

核酸含有基材から、その基材を破壊することなく、核酸を被転写材に転写する方法であって、
前記核酸含有基材に湿潤させた被転写材を接触させて密着し、前記被転写材に電極を接触させ、電気泳動により、前記被転写材に核酸を溶出し、短時間で明確に転写することを特徴とする核酸の転写方法。
前記電極を、一定の圧力で被転写材に接触させる請求項１記載の方法。
前記被転写材が、濾紙、布、アガロースゲル又はポリアクリルアミドである請求項１又は２記載の方法。
核酸含有基材から核酸を溶出し、被転写材に非破壊で転写する装置であって、電気泳動を生じさせるための一対の電極と、通電するための電源とを備えることを特徴とする核酸の転写装置。
核酸含有基材を載せる試料載置台と、一対の電極を支持する支持部材とを更に設けた請求項４記載の転写装置。
前記支持部材の重さを制御可能とした請求項５に記載の転写装置。
前記試料載置台に位置合わせ部を設けた請求項５又は６記載の転写装置。
請求項４乃至７のいずれか一項に記載の核酸の転写装置を用いた、印刷物の真偽判別方法であって、
前記印刷物を前記転写装置の試料載置台に載置し、
載置された前記印刷物に対して、真正印刷物のあらかじめ意図した個所に含有させた核酸の箇所と同じ箇所に湿潤状態の被転写材を密着させて積層し、
前記被転写材に前記一対の電極を接触し、電源より電気を流し、電気泳動により前記印刷物から核酸を溶出させ被転写材に転写し、
前記核酸を転写した被転写材を破断し、バッファ液を用いて核酸を抽出し、
前記バッファ液に抽出した核酸をＰＣＲ増幅し、得られた電気泳動パターンと、真正印刷物のあらかじめ意図した箇所から転写して得られた核酸の電気泳動パターンとを比較することからなる印刷物の真偽判別方法。
前記核酸には、秘匿情報及び／又は個別情報が付与されている請求項８記載の印刷物の真偽判別方法。